15Real-timePCRmethodforde2022-12-08發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件主要起草人：王伊琴、陳少博、楊帆、郝靜云、包勇敢、荊文魁、張志峰、常鴻、趙治國。I旱獺源性成分檢測實(shí)時熒光PCR法本文件規(guī)定了動物源性產(chǎn)品中旱獺源性成分實(shí)時熒光PCR檢本文件適用于動物源性產(chǎn)品（肉制品、皮毛制品、飼料等）中旱獺源性成分的鑒定，靈敏度為GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒CTAB：十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrithylammoniumbromiDNA:脫氧核糖核酸（deoxyribonuleicaEDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticaFAM:6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescePCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreactioTAMRA:羧基四甲基羅丹明(carboxy-tetramethyl-rhodamTris：三（羥甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethan125.1水：符合GB/T6682的要求。a)上游：5′-CCCTATTAATCTTAACAGCA-3′;b)下游：5′-GGGATTAGAGTAGCTTCA-3′;c)探針序列：5′-(FAM)-TATAGCAAGCCAAGGTCACTTAACTCA-(TAMRA)-3′。5.8蛋白酶K溶液(20mg/mL)。5.13陽性對照樣品：采用已知含有旱獺源性成分樣品的DNA,或經(jīng)測序確認(rèn)的陽性質(zhì)粒。見附錄B。5.14陰性對照樣品：采用已知不含有旱獺源性成分樣品的DNA。6.2高速臺式離心機(jī)(最高轉(zhuǎn)速12000rpm)。6.3旋渦振蕩器(最高轉(zhuǎn)速3000rpm)。6.4核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。6.6天平(感量0.01g)。6.7單孔道微量移液器：0.5μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、100μL～1000μL。參照附錄A中提取樣品DNA的方法提取DNA,也可采用等效商品化的組織基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行。當(dāng)DNA濃度吸光度值A(chǔ)26o/Azo在1.7～1.9之間時，適宜于PCR擴(kuò)增。設(shè)置至少兩個平行樣品且需設(shè)立陰性、陽性及空白提取對照。反應(yīng)體系體積為25.0μL,見表1?！猘)空白對照：無熒光對數(shù)增長，相應(yīng)的Ct值大于等于40.0；b)陰性對照：無熒光對數(shù)增長，相應(yīng)的Ct值大于等于40.0；c)陽性對照：有熒光對數(shù)增長，且熒光曲線，可判定被檢樣品為陽性；再次檢測結(jié)果Ct值大于等于40.0，可判定被檢樣品為陰性。8.3.1結(jié)果為陽性者，表述為“檢出旱獺檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的規(guī)定3A.1溶液配制及提取方法將5gCTAB，20.45gNaCl，3.03gTris，1.86gNa2-EDTA溶于200mL后，定容至250mL，115℃高壓A.2CTAB-沉淀液稱0.2gCTAB,0.234gN稱取28gNaCl，定容至400mL，115℃高壓15A.4.1稱取樣品0.5g～1g加入1.5mL～3.5mLCTAB提取液中，再加入12L～20L蛋白酶K樣品膨脹，則可再多加CTAB,每次多1mL，最多A.4.24000rpm/min～5000r/min離心10A.4.4取上清600L～650L加入無菌EP管中，加入2倍體積的CTAB沉淀液，旋渦混勻，室溫靜置1A.4.6加入350L氯仿，渦旋30min，12000rpm離in，12000rpm離心10min，去上清，沉淀用500L75%的乙醇洗滌，再12000rpm離心10A.4.9將沉淀溶于100L滅菌水或TEbuffer或DEPC水中。4CCCTATTAATCTTAACAGCATGACTTCTACCCCTTATAATTATAGCAAGCCAAGGTCACTTAACTCAAGAGCCATCG