(19)國家知識產(chǎn)權(quán)局(12)發(fā)明專利(45)授權(quán)公告日2025.06.27(21)申請?zhí)?02011617053.X(22)申請日2019.08.2262/722,1002018.08.23US地址瑞士盧塞恩司72001通常無法穿過血腦屏障的某些物質(zhì)(例如大分21.一種用于治療受試者身體內(nèi)的腫瘤并促進(jìn)物質(zhì)遞送穿過所述受試者身體的血腦屏交流電壓發(fā)生器，其能夠在50kHz至190kHz之間的第一頻率和50kHz至500kHz之間的第二頻率下生成交變電場，并且具有控制輸入端，所述第二頻率與所述第一頻率不同，其中所述交流電壓發(fā)生器被配置為當(dāng)所述控制輸入端處于第一狀態(tài)中時輸出所述第一頻率下的所述交變電場，并且當(dāng)所述控制輸入端處于第二狀態(tài)中時輸出所述第二頻率下的所述交變控制器，其被編程為(a)將所述控制輸入端置于所述第二狀態(tài)中，使得所述交流電壓發(fā)生器輸出所述第二頻率下的所述交變電場，(b)接收將所述交變電場切換到所述第一頻率的請求，(c)在接收所述請求之后，將所述控制輸入端置于所述第一狀態(tài)中，使得所述交流電壓發(fā)生器在一段時間間隔內(nèi)輸出所述第一頻率下的所述交變電場，并且(d)在已經(jīng)經(jīng)過所述時間間隔之后，將所述控制輸入端置于所述第二狀態(tài)中，使得所述交流電壓發(fā)生器輸出所述第二頻率下的所述交變電場。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，還包括：導(dǎo)線，其將所述交流電壓發(fā)生器的輸出端連接到所述電極組。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述第一頻率在75kHz至125kHz之間，并且所述第二頻率在150kHz至250kHz之間。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述第一頻率在75kHz至125kHz之間。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述第二頻率在190kHz至210kHz之間。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述交變電場在所述受試者腦的至少一部分中的場強(qiáng)為至少1V/cm。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述時間間隔為至少24小時。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述時間間隔包括至少一周長的單個不間斷的時間間隔。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述控制器還被編程為，在所述接收所述請求之后，在所述第一狀態(tài)和所述第二狀態(tài)之間來回切換所述控制輸入端。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述交流電壓發(fā)生器能夠在50kHz至500kHz之間的至少一個附加頻率下生成交變電場，并且被配置為當(dāng)所述控制輸入端處于至少一個附加狀態(tài)中時輸出所述至少一個附加頻率，并且所述控制器被編程為在接收所述請求之前使所述控制輸入端循環(huán)通過所述第二狀態(tài)和所述至少一個附加狀態(tài)，并且在已經(jīng)經(jīng)過所述時間間隔之后使所述控制輸入端循環(huán)通過所述第二狀態(tài)和所述至少一個附加狀態(tài)。用戶界面，其中所述請求經(jīng)由所述用戶界面被接收；或者其中所述請求經(jīng)由RF被接收。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述物質(zhì)的分子量為至少4kDa。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述物質(zhì)包括用于治療疾病的藥物。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述物質(zhì)用于監(jiān)測腦活動。15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述時間間隔為至少48小時。2/2頁2/2頁316.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述物質(zhì)的分子量為至少69kDa。17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的裝置，其中所述藥物包括癌癥治療藥物、傳染病治療藥物、神經(jīng)退行性疾病治療藥物、自身免疫疾病治療藥物、抗癲癇藥物、腦積水藥物、中風(fēng)干預(yù)藥物或精神科藥物。18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述物質(zhì)是腦染料、報告分子或標(biāo)記物。4使用交變電場來提高血腦屏障的通透性201980039088.9;發(fā)明名稱“使用交變電場來提高血腦屏障的通透性”。技術(shù)領(lǐng)域[0002]本申請要求2018年8月23日提交的美國臨時申請62/722,100的權(quán)益，其以全文引用的方式并入本文。背景技術(shù)[0003]通常，腦微血管嚴(yán)格調(diào)節(jié)物質(zhì)在血液和腦組織之間的轉(zhuǎn)移。腦微血管的此調(diào)節(jié)稱為血腦屏障(BBB),且是由于腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間形成的細(xì)胞間緊密連接(TJ)。在腦毛細(xì)血管中，TJ蛋白的表達(dá)是外周微血管中的50-100倍。TJ是由跨膜蛋白(密封蛋白和閉合蛋白)與細(xì)胞質(zhì)輔助蛋白(Z0-1和-2、扣帶蛋白、AF-6和7H6)的復(fù)雜復(fù)合體形成。通過與肌動蛋白細(xì)胞骨架的連接，這些蛋白質(zhì)形成牢固的細(xì)胞間連接。形成腦微血管內(nèi)皮的腦內(nèi)皮細(xì)胞負(fù)責(zé)約75-80%的BBB對物質(zhì)的抗性，而其他細(xì)胞如星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞提供其余的抗性。[0004]BBB由毛細(xì)血管周圍的緊密連接蛋白組成，且其通常限制微觀物體和大分子或親水分子擴(kuò)散進(jìn)入腦，同時允許疏水分子擴(kuò)散(跨細(xì)胞而不是旁細(xì)胞運(yùn)輸)。[0005]在健康人中，BBB起著非常重要的作用，因為及可能有害的大分子或親水分子)進(jìn)入腦。然而，在某些情況下，BBB的作如，可能希望遞送大或親水藥物分子來治療患者腦中的疾病。但是當(dāng)BBB正常工作時，BBB阻止這些藥物進(jìn)入腦。發(fā)明內(nèi)容[0006]本發(fā)明的一個方面涉及用于將物質(zhì)遞送穿過受試者腦的血腦屏障的第一方法。在此第一方法中，通過將交變電場施加到受試者腦達(dá)一段時間，可將相關(guān)物質(zhì)遞送穿過受試者腦的血腦屏障。將交變電場施加到受試者腦達(dá)一段時間提高受試者腦的血腦屏障的通透性。在經(jīng)過一段時間之后，將物質(zhì)施用于受試者，并且血腦屏障的提高的通透性允許物質(zhì)穿過血腦屏障。[0007]在第一方法的一些情況下，交變電場以75kHz至125kHz之間的頻率施加。在第一方法的一些情況下，一段時間為至少24小時。在第一方法的一些情況下，一段時間為至少48小時。在第一方法的一些情況下，交變電場在受試者腦的至少一部分中的場強(qiáng)為至少1V/cm。在第一方法的一些情況下，交變電場以75kHz至125kHz之間的頻率施加，一段時間為至少24小時，并且交變電場在受試者腦的至少一部分中的場強(qiáng)為至少1V/cm。[0008]在第一方法的一些情況下，施用物質(zhì)經(jīng)靜脈內(nèi)執(zhí)行。在第一方法的一些情況下，施用物質(zhì)經(jīng)口服執(zhí)行。在第一方法的一些情況下，受試者腦沒有腫瘤。[0009]在第一方法的一些情況下，物質(zhì)包括用于治療疾病的藥物。這些情況的實例包括5癌癥治療藥物、傳染病治療藥物、神經(jīng)退行性疾病治療藥物或自身免疫疾病治療藥物、抗癲癇藥物、腦積水藥物、中風(fēng)干預(yù)藥物或精神科藥物。在第一方法的一些情況下，物質(zhì)用于監(jiān)測腦活動。這些情況的實例包括腦染料、報告分子或標(biāo)記物。[0010]在上述第一方法的情況中的任一種下，可停止施加交變電場，以允許恢復(fù)血腦屏[0011]本發(fā)明的另一方面涉及用于將物質(zhì)遞送穿過受試者腦的血腦屏障的第二方法。在此第二方法中，通過將第一頻率下的交變電場施加到受試者腦達(dá)一段時間，可將相關(guān)物質(zhì)遞送穿過受試者腦的血腦屏障，其中第一頻率小于190kHz,并且一段時間為至少24小時，其中將第一頻率下的交變電場施加到受試者腦達(dá)一段時間提高受試者腦中的血腦屏障的通透性。在經(jīng)過一段時間之后，將物質(zhì)施用于受試者，并且血腦屏障的提高的通透性允許物質(zhì)穿過血腦屏障。[0012]在第二方法的一些情況下，交變電場以75kHz至125kHz之間的頻率施加。在第二方法的一些情況下，一段時間為至少48小時。在第二方法的一些情況下，交變電場在受試者腦的至少一部分中的場強(qiáng)為至少1V/cm。在第二方法的一些情況下，交變電場以75kHz至125kHz之間的頻率施加，并且交變電場在受試者腦的至少一部分中的場強(qiáng)為至少1V/cm。[0013]在上述第二方法的情況中的任一種下，可停止施加交變電場，以允許恢復(fù)血腦屏[0014]本文所述的方法可用于將物質(zhì)遞送穿過腦沒有腫瘤的受試者的血腦屏障。在這種情況下，本發(fā)明的另一方面涉及用于將物質(zhì)遞送穿過受試者腦的血腦屏障的第三方法。在此第三方法中，通過將第一頻率下的交變電場施加到受試者腦達(dá)第一時間段，可將相關(guān)物質(zhì)遞送穿過不包括腫瘤的受試者腦的血腦屏障。將第一頻率下的交變電場施加到受試者腦達(dá)第一時間段提高受試者腦中的血腦屏障的通透性。在經(jīng)過一段時間之后，將物質(zhì)施用于受試者，并且血腦屏障的提高的通透性允許物質(zhì)穿過血腦屏障。[0015]在第三方法的一些情況下，交變電場以75kHz至125kHz之間的頻率施加。在第三方法的一些情況下，一段時間為至少24小時。在第三方法的一些情況下，一段時間為至少48小時。在第三方法的一些情況下，交變電場在受試者腦的至少一部分中的場強(qiáng)為至少1V/cm。在第三方法的一些情況下，交變電場以75kHz至125kHz之間的頻率施加，一段時間為至少24小時，并且交變電場在受試者腦的至少一部分中的場強(qiáng)為至少1V/cm。[0016]在上述第三方法的情況中的任一種下，可停止施加交變電場，以允許恢復(fù)血腦屏[0017]本文所述的方法可用于將物質(zhì)遞送穿過患有腦腫瘤的受試者的血腦屏障。在這種情況下，本發(fā)明的另一方面涉及用于治療受試者腦中的腫瘤并將物質(zhì)遞送穿過受試者腦的血腦屏障的第四方法。在此第四方法中，將第一交變電場在第一頻率下施加到受試者腦達(dá)第一時間段。將第一頻率下的第一交變電場施加到受試者腦達(dá)第一時間段提高受試者腦中的血腦屏障的通透性。在經(jīng)過第一時間段之后，將物質(zhì)施用于受試者，并且血腦屏障的提高的通透性允許物質(zhì)穿過血腦屏障。將第二頻率下的第二交變電場施加到受試者腦達(dá)至少一周長的第二時間段。第二頻率與第一頻率不同，并且第二頻率下的第二交變電場具有足夠大的強(qiáng)度以抑制腫瘤。[0018]在第四方法的一些情況下，第一頻率在75kHz至125kHz之間。6[0019]在第四方法的一些情況下，第一頻率在50kHz至190kHz之間。在這些情況中的一些[0020]在第四方法的一些情況下，第一時間段為至少24小時。在第四方法的一些情況中，第二時間段包括至少一周長的單個不間斷的時間間隔。在第四方法的其他情況下，第二時間段包括多個不連續(xù)的時間間隔，在該多個不連續(xù)的時間間隔期間，將第二頻率下的第二交變電場施加到受試者腦，其中多個不連續(xù)的時間間隔總計至少一周。[0021]在上述第四方法的情況中的任一種下，可停止施加交變電場，以允許恢復(fù)血腦屏[0022]在一些情況下，上述方法中的任一種均用于將分子量為至少4kDa的物質(zhì)遞送穿過受試者腦的血腦屏障。[0023]在一些情況下，上述方法中的任一種均用于將分子量為至少69kDa的物質(zhì)遞送穿過受試者腦的血腦屏障。[0024]在一些情況下，上述方法中的任一種均用于將物質(zhì)遞送穿過受試者腦的血腦屏障，其中物質(zhì)具有至少一種通常阻礙物質(zhì)穿過非泄漏BBB的特征。[0025]本發(fā)明的另一方面涉及用于治療受試者身體內(nèi)的腫瘤并促進(jìn)物質(zhì)遞送穿過受試者身體的血腦屏障的第一裝置。第一裝置包括交流電壓發(fā)生器，其能夠在50至190kHz之間的第一頻率和50至500kHz之間的第二頻率下工作。第二頻率與第一頻率不同。交流電壓發(fā)生器具有控制輸入端，并且交流電壓發(fā)生器被配置為當(dāng)控制輸入端處于第一狀態(tài)時輸出第一頻率，并且當(dāng)控制輸入端處于第二狀態(tài)時輸出第二頻率。第一裝置還包括控制器，其被編程為(a)將控制輸入端置于第二狀態(tài)，使得交流電壓發(fā)生器輸出第二頻率，(b)接受切換到第一頻率的請求，(c)在接收請求之后，將控制輸入端置于第一狀態(tài)，使得交流電壓發(fā)生器在一段時間間隔內(nèi)輸出第一頻率，并且(d)在經(jīng)過該時間間隔之后，將控制輸入端置于第二狀態(tài)，使得交流電壓發(fā)生器輸出第二頻率。[0026]第一裝置的一些實施例還包括電極組，其被配置為附著到受試者身體；以及導(dǎo)線，其將交流電壓發(fā)生器的輸出端連接到電極組。[0027]在第一裝置的一些實施例中，第一頻率在75kHz至125kHz之間，并且第二頻率在150kHz至250kHz之間。在第一裝置的一些實施例中，時間間隔為至少24小時。在第一裝置的一些實施例中，時間間隔為至少72小時。在第一裝置的一些實施例中，控制器還被編程為在接收請求之后，在第一狀態(tài)和第二狀態(tài)之間來回切換控制輸入端。[0028]在第一裝置的一些實施例中，交流電壓發(fā)生器能夠在50至500kHz之間的至少一個附加頻率下工作，并且交流電壓發(fā)生器被配置為當(dāng)控制輸入端處于至少一個附加頻率時輸出至少一個附加頻率，并且控制器被編程為在接收請求之前使控制輸入端循環(huán)通過第二狀態(tài)和至少一個附加狀態(tài)，并且在經(jīng)過時間間隔之后使控制輸入端循環(huán)通過第二狀態(tài)和至少一個附加狀態(tài)。[0029]第一裝置的一些實施例還包括用戶界面，并且請求經(jīng)由用戶界面被接受。在第一裝置的一些實施例中，請求經(jīng)由射頻(RF)被接受。附圖說明[0030]圖1描繪用于體外實驗的示例性設(shè)定，其中經(jīng)固定的鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞7(cerebEND)在蓋玻片和跨孔(transwell)插入物上生長以產(chǎn)生人工體外形式的BBB。[0031]圖2A和2B分別描繪在人[0032]圖3A和3B描繪顯示人工BBB的通透性提高不由細(xì)胞死亡引起的數(shù)據(jù)。[0033]圖4描繪將大鼠腦切片以用于體內(nèi)實驗的位置。[0034]圖5描繪在此體內(nèi)實驗中在大鼠腦不同部位的EB累積。[0035]圖6描繪在此體內(nèi)實驗中在所有部位上平均的在大鼠腦中的平均EB累積。[0036]圖7描繪由體內(nèi)交變電場誘導(dǎo)的在大鼠腦的三個不同部位的BBB通透性的提高，如使用造影劑增強(qiáng)MRI所確定。[0037]圖8描繪由體內(nèi)交變電場誘導(dǎo)的在大鼠皮質(zhì)中的BBB通透性的提高，如使用造影劑增強(qiáng)MRI所確定。[0038]圖9描繪在向受試者施加交變電場與施用物質(zhì)之間的合適定時關(guān)系。[0039]圖10是產(chǎn)生用于誘導(dǎo)BBB通透性的第一頻率和用于誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的第二頻率的雙頻率裝置的框圖。具體實施方式[0040]本申請描述新穎的方法，其使用交變電場暫時提高BBB的通透性，使得通常被BBB[0041]進(jìn)行一組體外實驗，其中經(jīng)固定的鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(cerebEND)在蓋玻片和跨孔(transwell)插入物上生長以產(chǎn)生人工體外形式的BBB,且圖1描繪這些實驗的設(shè)定。然后用交變電場(100-300kHz)處理細(xì)胞24小時、48小時和72小時。交變電場的方向在兩個垂直方向之間每1秒切換一次(即，在重復(fù)序列中，在一個方向上為1秒，隨后在另一個方向上為1秒)。然后分析以下效用：(a)細(xì)胞形態(tài)(緊密連接蛋白Claudin5和Z0-1的免疫熒光染色);(b)BBB完整性(使用跨內(nèi)皮電阻(TEER));和(c)BBB通透性(使用與葡聚糖(FITC)偶聯(lián)的異硫氰酸熒光素用于流式細(xì)胞術(shù))。[0042]第一組實驗涉及細(xì)胞形態(tài)和方向的可視化，以及染色蛋白定位的可視化。此實驗被設(shè)計成確定交變電場的頻率如何影響人工BBB。此處，細(xì)胞在蓋玻片上生長，并且交變電變電場的方向在兩個垂直方向之間每1秒切換一次。還存在對照，其中不施加交變電場。然后獲得描繪Claudin5、Z0-1和4,6-二-2-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)(其中每一種均被染成不同的顏色)的存在的細(xì)胞形態(tài)圖像。Claudin5和Z0-1指示存在完整BBB。這組細(xì)胞形態(tài)圖像展示，交變電場通過緊密連接蛋白從細(xì)胞邊界到細(xì)胞質(zhì)的脫位來干擾人工BBB,其中在100kHz下效用最明顯。[0043]第二組實驗還涉及細(xì)胞形態(tài)的可視化。此實驗被設(shè)計成確定在其期間施加交變電場的持續(xù)時間如何影響人工BBB。內(nèi)皮細(xì)胞在蓋玻片上生長，并且交變電場以100kHz的頻率施加達(dá)三個不同的持續(xù)時間(24小時、48小時、72小時),存在對照。交變電場的方向在兩個垂直方向之間每1秒切換一次。然后獲得描繪Claudin5和DAPI(其中每一種均被染成不同的顏色)的存在的細(xì)胞形態(tài)圖像。這組細(xì)胞形態(tài)圖像展示，與第一組實驗相關(guān)的上述現(xiàn)象在24小時之后已可見，并且在72小時之后效用最明顯。[0044]第三組實驗還涉及細(xì)胞形態(tài)的可視化。此實驗類似于第二組實驗，除了內(nèi)皮細(xì)胞8生長在跨孔插入物上而不是蓋玻片上。結(jié)果類似于第二組實驗的結(jié)果。TJ蛋白的離域在24小時之后可見，而在72小時之后效用最明顯。上述三個實驗支持以下結(jié)論：交變電場使得細(xì)[0045]圖2A和圖2B分別描繪在人工BBB上在使其經(jīng)受100kHz頻率下的交變電場(交變電場的方向在兩個垂直方向之間每1秒切換一次)達(dá)72小時之后的完整性和通透性測試的結(jié)果，且存在對照。更具體地，圖2A描繪跨內(nèi)皮電阻(TEER)測試的結(jié)果，其展示交變電場將人工BBB的完整性降低到對照的35%。圖2B描繪異硫氰酸熒光素(FITC)通透性測試的結(jié)果，其展示交變電場將人工BBB對分子量為4kDa的FITC-葡聚糖的通透性提高到對照的110%。這些實驗進(jìn)一步支持結(jié)論：交變電場提高BBB對通常無[0046]總的來說，這些體外實驗展示，交變電場以一定頻率施加達(dá)足夠長持續(xù)時間引起緊密連接蛋白(Claudin5、Z0-1)從細(xì)胞邊界到細(xì)胞質(zhì)的離域(在100kHz下具有最明顯的效用),并提高BBB的通透性。交變電場的效用在24小時之后已出現(xiàn)，并且在72小時之后最明[0047]然后進(jìn)行附加體外實驗，以確定在關(guān)閉交變電場之后BBB發(fā)生什么。這些實驗使用細(xì)胞形態(tài)的可視化來顯示人工BBB在停止交變電場之后如何恢復(fù)。在這些實驗中，內(nèi)皮細(xì)胞在蓋玻片上生長，并在100kHz交變電場下以1.7V/cm的場強(qiáng)處理72小時。交變電場的方向在兩個垂直方向之間每1秒切換一次。然后關(guān)閉交變電場，并且在停止交變電場之后追蹤細(xì)胞96小時。在24小時、48小時、72小時和96小時時獲得描繪Claudin5(經(jīng)染色)存在的細(xì)胞形細(xì)胞質(zhì)之間的定位發(fā)生逐步變化。此外，將這四個圖像與對照的相應(yīng)圖像(在最初72小時或最后96小時期間未施加交變電場)進(jìn)行比較，展示內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)在停止交變電場48小時之后已部分恢復(fù)，并且在停止交變電場96小時之后，BBB已完全恢復(fù)(即，與對照相當(dāng))。[0048]圖3A和3B描繪體外實驗的結(jié)果，該實驗被設(shè)計成確定上述人工BBB的所觀察通透性變化是否可歸因于細(xì)胞死亡。此實驗通過比較以下項來測試細(xì)胞分裂：(a)當(dāng)施加交變電場72小時隨后96小時無交變電場的細(xì)胞計數(shù)，和(b)從未施加交變電場的對照的細(xì)胞計數(shù)。內(nèi)皮細(xì)胞在蓋玻片上生長，并在100kHz交變電場下以1.7V/cm的場強(qiáng)處理72小時。交變電場的方向在兩個垂直方向之間每1秒切換一次。然后，關(guān)閉交變電場，并且在停止交變電場之后追蹤細(xì)胞96小時。對交變電場和對照的每毫升細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)，且結(jié)果描繪在圖3A和3B(分別用于對照和交變電場)。這些結(jié)果展示，在施加交變電場期間或之后，細(xì)胞數(shù)目沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著增加，這表明上述BBB通透性的變化不可歸因于細(xì)胞死亡。[0049]另一個體外實驗使用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，以確定上述人工BBB的所觀察通透性變化是否可歸因于細(xì)胞死亡。在此實驗中，內(nèi)皮細(xì)胞在蓋玻片上生長，并在100kHz交變電場下以1.7V/cm的場強(qiáng)處理72小時。交變電場的方向在兩個垂直方向之間每1秒切換一次。在對照中，未施加交變電場。在24、48和72小時之后，獲得描繪細(xì)胞凋亡(TUNEL)和細(xì)胞核(DAPI)(其中每一種均被染成不同的顏色)的細(xì)胞形態(tài)圖像。這些圖像均未展示凋亡的附加證據(jù)，表明交變電場不引起細(xì)胞死亡。這證實上述BBB通透性的變化并非歸因于細(xì)胞死亡。[0050]還對大鼠進(jìn)行一組體內(nèi)實驗，以定量由于暴露于交變電場而引起的血管通透性提高。這些實驗使用的是伊文思藍(lán)(EB)染料，其是一種對血清白蛋白(分子大小約為69kDa)具有很高親和力的偶氮染料。由于其大分子大小，血清白蛋白通常將9BBB的通透性已充分提高，則血清白蛋白分子(連同結(jié)合到其上的EB染料)中的一些將使其穿過BBB,且然后可通過在大鼠腦中尋找EB來檢測。[0051]在這組實驗中，將100kHz的交變電場施加到大鼠腦達(dá)72小時，并且交變電場的方向在兩個垂直方向之間每1秒切換一次。這通過剃除每個大鼠頭部，在大鼠頭部的頂部和底部放置第一對電容耦合電極，以及在大鼠頭部的左側(cè)和右側(cè)放置第二對電容耦合電極來實現(xiàn)。然后以重復(fù)序列，在頂部和底部電極之間施加100kHz交流電壓1秒鐘，隨后在左和右電極之間施加100kHz交流電壓1秒鐘。[0052]在表1所指示的條件下和表1中所指示的時間內(nèi)，在麻醉下將EB靜脈注射到尾靜脈中(一旦注射，EB立即與白蛋白結(jié)合),并且在所有情況下允許EB循環(huán)2小時。然后執(zhí)行以下步驟：(a)用鹽水進(jìn)行心內(nèi)灌注；(b)用腦切片機(jī)將腦切成四塊；(c)對切片拍照，以定位染色并加權(quán)；(d)在用TCA50%(1:3)和離心機(jī)將組織勻漿之后進(jìn)行EB提取，以及(e)在610nm下組號處理大鼠號EB注射時間172小時100kHz電場372小時周期結(jié)束之前2小時272小時100kHz電場+休息2小時372小時周期結(jié)束之后2小時3使用假電極加熱72小時3加熱結(jié)束之前2小時4對照(無電場+無加熱)3與第1組同時[0055]在實驗期間，排除第2組的兩只動物和第4組的一只動物(中斷處理，未能將EB注射到尾靜脈中)。用交變電場處理的動物(第1組和第2組)之間沒有差異，且因此將這些動物分組在一起。同樣，假熱和對照動物(第3組和第4組)之間也沒有差異，且因此將這些動物分組在一起。[0056]使用腦切片機(jī)在圖4中所示的位置將大鼠腦切成四塊。然后測量這四個特定部位中的EB累積。另外，執(zhí)行計算機(jī)仿真以確定這四個部位中的每一個的場強(qiáng)。表2具體說明在這四個部位中的每一個中通過仿真獲得的場強(qiáng)，所有值均以V/cmRMS為單位給出。部位1部位1234平均場強(qiáng)介質(zhì)場強(qiáng)[0059]圖5中描繪在第1至第4部位中的EB累積的結(jié)果。這些結(jié)果的總結(jié)如下：(1)在場強(qiáng)最高的第1、2部位(額葉大腦)中觀察到統(tǒng)計學(xué)上的顯著增加；和在場強(qiáng)較低的更靠后部位[0060]圖6描繪在所有四個部位1-4上平均的在大鼠腦中的平均EB累積。此結(jié)果展示在用交變電場處理72小時的大鼠腦中更高的EB的累積，且此結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。[0061]上述體內(nèi)實驗證實：(1)施加交變電場允許平均分子大小約為69kDa的分子通過通透性提高在腦的不同部位之間有所不同。后者可能是由于腦的各個部位施加的不同場強(qiáng)的結(jié)果。這些實驗進(jìn)一步支持我們的結(jié)論：交變電場提高BBB對通常無法穿過非泄漏BBB的分子的通透性。[0062]在另一組體內(nèi)實驗中，將5只大鼠以100kHz下的交變電場處理72小時，而將4只對照大鼠不以交變電場處理相同的時間。在72小時的時間結(jié)束時，在麻醉下將4kDa的熒光化合物TRITC-葡聚糖靜脈內(nèi)注射到尾靜脈中，并允許在所有情況下循環(huán)2分鐘。然后將腦去除、冷凍、切片并用熒光掃描儀掃描。在相同條件下掃描所有載玻片。所得圖像展示經(jīng)受交變電場的大鼠腦組織中熒光4kDATRITC-葡聚糖的累積水平顯著較高(與對照相比),再次[0063]使用動態(tài)對比增強(qiáng)MRI(DCE-MRI)與靜脈注射釓造影劑(Gd-DTPA,Magnetol,MW547)執(zhí)行另一組體內(nèi)實驗。在這些實驗中，將對測試大鼠以100kHz交變電場處理72小時，而將對照大鼠不以交變電場處理相同的時間段。在此72小時時間之后，關(guān)閉交變電場，麻醉大鼠，并獲取一系列60次T1wMRI掃描(每次掃描持續(xù)時間為28秒)。在這60次掃描的第7次掃描期間，將釓造影劑注射到大鼠的尾靜脈中。[0064]每只大鼠的圖像分析包括：(1)通過計算每只體素的前六次T1wMRI掃描(即注射釓之前的掃描)的平均值確定每只體素的基線；(2)逐體素計算相對于基線的隨時間的信號變化百分比(即，釓累積);(3)將腦分為前、中和后段；(4)為三個段中的每一個生成在相應(yīng)段中所有體素上相對于基線的平均信號變化百分比，和然后(5)將4個連續(xù)時間點(即，4次掃描)取平均值。最后，將來自任何給定組中所有大鼠的數(shù)據(jù)取平均值。[0065]圖7中描繪對腦的三個段(即前、中和后)中的每一個的此DCE-MRI實驗的結(jié)果。此數(shù)據(jù)展示，在用交變電場處理的的大鼠腦組織(示蹤標(biāo)記的TTFields;n=6)中的造影劑累積顯著高于對照大鼠(示蹤標(biāo)記的對照；n=3)。此外，此區(qū)別在后腦中最明顯，這是交變電場具有最高場強(qiáng)的腦部分。由此我們可得出結(jié)論，交變電場成功地提高體內(nèi)BBB的通透性。[0066]為了測試BBB的通透性的這種提高是否是暫時的，重復(fù)相同測試條件，但隨后在無交變電場的情況下下進(jìn)行另外96小時測試。在這96小時之后，使用與上述相同的程序(包括釓注射),獲取一系列60次T1wMRI掃描(每次掃描持續(xù)時間為28秒)。圖8中還描繪對腦的三個段中的每一個的DCE-MRI實驗的此部分的結(jié)果。此數(shù)據(jù)展示，在用交變電場處理72小時，隨后在無交變電場的情況下處理96小時的大鼠腦組織(示蹤標(biāo)記的TTFields+96h;n=7)中的造影劑累積與對照大鼠(示蹤標(biāo)記的對照+96h;n=3)無顯著差異。由此我們可得出結(jié)論，[0067]在將交變電場施加到大鼠(n=2)之前，也使用相同的程序獲取一系列附加60次TlwMRI掃描(每次掃描持續(xù)時間為28秒)。圖8中還描繪對腦的三個段(即，前、中和后)中的[0068]圖8顯示72個小時的TTFields(n=6)和72個小時的無TTFields的對照(n=3)的腦[0069]我們注意到，尚未確定在施加交變電場之后可通過BBB的分子大小上限。但是基于(a)本文所述的使用分子量為4kDa的FITC-葡聚糖的體外實驗，以及(b)本文所述的使用EB11(其與分子大小約為69kDa的血清白蛋白結(jié)合)的體內(nèi)實驗，上限似乎至少約為69kDa,且最確定的為至少4kDa。[0070]能夠隨意可逆地提高BBB的通透性的意義是深遠(yuǎn)的，因為現(xiàn)在有可能將許多物質(zhì)遞送穿過受試者的BBB,盡管這些物質(zhì)具有至少一種通常阻礙物質(zhì)穿過非泄漏BBB的特征。這些意義中的許多涉及將物質(zhì)(包括但不限于治療劑和診斷劑)遞送穿過受試者腦的血腦屏障。[0071]實例包括但不限于以下：將化療劑遞送穿過BBB以治療癌癥(在這種情況下，有可能基于藥物對腦的通透性提高，降低用于治療腦腫瘤和在身體其他部位具有嚴(yán)重副作用的轉(zhuǎn)移瘤的藥物劑量);將基于抗體和/或細(xì)胞的療法遞送穿過BBB以用于免疫治療；將造影劑染料、報告分子和標(biāo)志物遞送穿過BBB以用于診斷和研究(例如，監(jiān)測腦活動);將抗菌劑遞送穿過BBB以治療傳染病；將抗病毒劑或病毒中和抗體遞送穿過BBB以治療病毒感染；將抗寄生蟲劑遞送穿過BBB以治療寄生蟲；將治療神經(jīng)退行性疾病和自身免疫疾病的藥物遞送穿過BBB;遞送精神病藥物；遞送抗癲癇藥物；遞送腦積水藥物；遞送中風(fēng)干預(yù)和恢復(fù)藥物；將腦中缺乏的化合物遞送穿過BBB,以治療缺乏這些化合物的疾病(例如，用于治療帕金森氏病等)。[0072]盡管上述測試是在體外和活體大鼠中進(jìn)行的，但預(yù)計對其他動物和人類也將獲得類似的結(jié)果。[0073]本文所述的方法還可通過將交變電場施加到活體受試者腦而在體內(nèi)應(yīng)用。在受試者腦中施加電場將提高BBB的通透性，這將使得通常被BBB阻止或阻礙的分子能夠通過。例如，這可通過例如將電極放置在受試者皮膚上或下方來實現(xiàn)，使得在這些電極的選定子集之間施加交流電壓將在受試者腦中施加交變電場。[0074]例如，一對電極可放置在受試者頭部的前后側(cè)，而第二對電極可放置在受試者頭部的左右側(cè)。在一些實施例中，將電極電容耦合到受試者身體(導(dǎo)電板并且還具有設(shè)置在導(dǎo)電板和受試者身體之間的介電層)。但在替代實施例中，可省略介電層，在這種情況下，導(dǎo)電板直接接觸受試者身體。在另一個實施例中，可將電極皮下插入患者皮膚。[0075]交流電壓發(fā)生器在左和右電極之間以選定頻率(例如100kHz,或50至190kHz之間)施加交流電壓達(dá)第一時間段(例如1秒),這誘導(dǎo)出場線的最重要分量平行于受試者頭部橫軸的交變電場。然后，交流電壓發(fā)生器在前和后電極之間以相同頻率(或不同頻率)施加交流電壓達(dá)第二時間段(例如1秒),這誘導(dǎo)出場線的最重要分量平行于受試者頭部的矢狀軸的交變電場。然后在治療期間重復(fù)執(zhí)行這兩個步驟。任選地，可在電極處包括熱傳感器，并且如果在電極處感測的溫度變得過高，則交流電壓發(fā)生器可被配置為減小施加到電極的交流電壓的幅度。在一些實施例中，可添加一對或更多對附加電極，并將其包括在序列中。在任何參數(shù)(例如，頻率、場強(qiáng)、持續(xù)時間、方向轉(zhuǎn)換速率和電極的放置)可如上文結(jié)合體外實施例所述而變化。但是在體內(nèi)環(huán)境中必須注意，以確保電場始終對受試者保持安全。[0076]在體內(nèi)環(huán)境中，可很容易地想到提高BBB的通透性的各種應(yīng)用。在一個實例中，在施用化療劑或其他抗腫瘤劑之前和期間，通過將交變電場施加到腦達(dá)一段時間(例如72小時或至少24小時),可誘導(dǎo)腦中腫瘤細(xì)胞(例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞)對藥物攝取的局部增強(qiáng)。[0077]圖9描繪在向活體患者施加交變電場與施用物質(zhì)之間的合適定時關(guān)系。基于上述數(shù)據(jù)，并假設(shè)在給定的時間t=0處引入或施用物質(zhì)，交變電場可在給定時間之前(例如，t=0之前的72小時)開始，并且在給定時間之后持續(xù)一定時間間隔(例如，直到t=0之后的12小時)。在這種情況下，BBB的通透性將在施用物質(zhì)之前和物質(zhì)到達(dá)BBB之前開始提高。這將使時之后施用化療劑，隨后施加交變電場一段附加時間間隔(例如，直到在施用化療劑之后的間隔可由單個不間斷塊的12小時來滿足。另選地，12小時間隔可通過施加交變電場6小時，隨后間歇1小時，隨后施加交變電場另外6小時來滿足。類似的間歇時間也可任選中斷施用物質(zhì)之前的72小時間隔。還要注意，在圖9的上下文中，當(dāng)將物質(zhì)施用[0079]在一些優(yōu)選實施例中，交變電場的頻率小于190kHz(例如，在50至190kHz之間或在25至190kHz之間)?；谏厦嬲撌龅膶嶒?，使用小于190kHz的頻率并結(jié)合至少24小時的時間段將提高通透性的變化(與在這些范圍之外工作相比)。[0080]本文所述的方法可用于當(dāng)受試者腦包括腫瘤時將物質(zhì)遞送穿過受試者腦的血腦屏障。一種現(xiàn)有的治療腦腫瘤(例如，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)的方法是通過將50至500kHz之間，優(yōu)選100至300kHz之間的頻率下的交變電場施加到腫瘤。對于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，200kHz是最優(yōu)選的頻率。在這些頻率下的交變電場稱為TTFields,并在美國專利6,868,289和7,565,205中被描述，這些專利中的每一個均以全文引用的方式并入本文。簡而言之，這兩個應(yīng)用描述在有絲分裂期間破壞分裂細(xì)胞。當(dāng)周期性地切換電場方向時，當(dāng)腫瘤的至少一部分中的電場強(qiáng)度為至少1V/cm,以及當(dāng)電場在盡可能少間歇的情況下長時間(例如，數(shù)周或數(shù)月)施加時，TTFields的有效性得以提高。將物質(zhì)遞送穿過相同患者的血腦屏障(例如，以幫助獲得治療有效量的化療藥物穿過BBB,以提供針對腫瘤的附加攻擊路線)。在一些情況下，可使用單一頻率的交變電場來治療腫瘤并提高BBB的通透性。在其他情況下，可希望使用具有不同頻率的交變電場：選擇第一頻率以提供提高BBB的通透性的改進(jìn)結(jié)果，且選擇第二頻率以提供TTFields的腫瘤作用的改進(jìn)[0082]圖10是產(chǎn)生用于誘導(dǎo)BBB通透性的第一頻率和用于誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的第二頻率的裝置的框圖。裝置包括交流電壓發(fā)生器44,其類似于常規(guī)的OptuneR場發(fā)生器單元，但是具有在兩個不同頻率下工作的能力。第一頻率在50至190kHz之間，并且第二頻率在50至500kHz之間。在一些實施例中，第一頻率在75kHz至125kHz之間，并且第二頻率在150kHz至[0083]可實施在兩個不同頻率下工作的能力，例如，使用繼電器將第一組組件或第二組組件切換到生成交流電壓的常規(guī)電路中，并調(diào)節(jié)振蕩器的工作頻率。交流電壓發(fā)生器44被配置為取決于控制輸入端的狀態(tài)來輸出第一頻率或第二頻率。當(dāng)控制輸入端處于第一狀態(tài)時，交流電壓發(fā)生器44輸出第一頻率，而當(dāng)控制輸入端處于第二狀態(tài)時，交流電壓發(fā)生器44輸出第二頻率?？刂破?2被編程為將控制輸入端置于第二狀態(tài)，使得交流電壓發(fā)生器44輸出第二頻率?？刂破?2還被編程為接受切換到第一頻率的請求。在圖10所示的實施例中，請求經(jīng)由用戶界面40到達(dá)，該用戶界面可使用多種常規(guī)方法中的任一種來實施，包括但不限[0084]在接收請求之后，控制器42將控制輸入端置于第一狀態(tài)，使得交流電壓發(fā)生器44