2025年生物技術(shù)應(yīng)用職業(yè)資格考試題及答案一、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共30分）1.關(guān)于CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的描述，錯(cuò)誤的是：A.Cas9蛋白通過PAM序列識(shí)別靶位點(diǎn)B.sgRNA由crRNA和tracrRNA融合而成C.編輯效率受細(xì)胞周期影響，G1期活性最高D.脫靶效應(yīng)可通過高保真Cas9變體降低答案：C解析：CRISPR-Cas9的編輯效率與細(xì)胞周期密切相關(guān)，研究表明S期和G2期細(xì)胞的同源重組修復(fù)（HDR）活性更高，因此編輯效率在S/G2期通常高于G1期。2.下列哪種微生物是工業(yè)生產(chǎn)青霉素的常用菌株？A.大腸桿菌（Escherichiacoli）B.枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）C.產(chǎn)黃青霉（Penicilliumchrysogenum）D.黑曲霉（Aspergillusniger）答案：C解析：產(chǎn)黃青霉是青霉素工業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)典菌株，通過誘變育種已獲得高產(chǎn)突變株；大腸桿菌主要用于重組蛋白表達(dá)，枯草芽孢桿菌用于酶制劑生產(chǎn)，黑曲霉用于檸檬酸生產(chǎn)。3.單克隆抗體制備過程中，雜交瘤細(xì)胞篩選的關(guān)鍵培養(yǎng)基是：A.RPMI-1640培養(yǎng)基B.HAT培養(yǎng)基C.DMEM培養(yǎng)基D.無血清培養(yǎng)基答案：B解析：HAT培養(yǎng)基（次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷）通過阻斷從頭合成途徑，篩選出同時(shí)具有骨髓瘤細(xì)胞無限增殖能力和B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的雜交瘤細(xì)胞。4.關(guān)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）的Ct值，正確的描述是：A.Ct值與初始模板量呈正相關(guān)B.Ct值是熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)C.擴(kuò)增效率為100%時(shí)，模板量每增加1倍，Ct值增加1D.內(nèi)參基因的Ct值應(yīng)顯著高于目的基因答案：B解析：Ct值（CycleThreshold）是熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，與初始模板量呈負(fù)相關(guān)（模板越多，Ct值越?。?；擴(kuò)增效率100%時(shí)，模板量每增加1倍，Ct值減少1；內(nèi)參基因需穩(wěn)定表達(dá)，Ct值與目的基因接近或根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)整。5.以下不屬于合成生物學(xué)核心技術(shù)的是：A.基因組合成與編輯B.代謝途徑重構(gòu)C.單細(xì)胞測序D.生物正交系統(tǒng)構(gòu)建答案：C解析：合成生物學(xué)聚焦于設(shè)計(jì)與構(gòu)建人工生物系統(tǒng)，核心技術(shù)包括基因組合成、代謝途徑工程、生物正交系統(tǒng)等；單細(xì)胞測序?qū)儆诠δ芑蚪M學(xué)研究工具，不直接參與人工系統(tǒng)構(gòu)建。二、多項(xiàng)選擇題（每題3分，共15分，少選得1分，錯(cuò)選不得分）1.基因治療中腺相關(guān)病毒（AAV）載體的優(yōu)勢包括：A.無致病性B.可整合至宿主染色體C.感染分裂和非分裂細(xì)胞D.免疫原性低答案：ACD解析：AAV為非致病性病毒，天然不整合至宿主染色體（僅部分血清型可隨機(jī)整合），可感染分裂與非分裂細(xì)胞（如神經(jīng)元），免疫原性顯著低于腺病毒載體。2.發(fā)酵過程中需監(jiān)測的關(guān)鍵參數(shù)包括：A.溶氧（DO）B.二氧化碳釋放率（CER）C.菌體干重（DCW）D.剪切力答案：ABCD解析：溶氧影響好氧微生物代謝；CER反映細(xì)胞呼吸強(qiáng)度；DCW直接表征生物量；剪切力過高會(huì)損傷動(dòng)物細(xì)胞或菌絲體，均為發(fā)酵過程控制的關(guān)鍵參數(shù)。3.生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-3）的防護(hù)要求包括：A.實(shí)驗(yàn)人員需穿戴正壓防護(hù)服B.實(shí)驗(yàn)室保持負(fù)壓（相對(duì)于走廊）C.所有廢棄物需高壓滅菌后處理D.入口處設(shè)置生物危害標(biāo)識(shí)答案：BCD解析：BSL-3實(shí)驗(yàn)室要求負(fù)壓（-10～-15Pa），廢棄物需經(jīng)高壓或化學(xué)消毒，入口有明確標(biāo)識(shí)；正壓防護(hù)服為BSL-4實(shí)驗(yàn)室要求（如埃博拉病毒研究）。4.關(guān)于mRNA疫苗的特點(diǎn)，正確的有：A.需依賴宿主細(xì)胞翻譯抗原蛋白B.無需整合至宿主基因組C.熱穩(wěn)定性高于滅活疫苗D.可通過脂質(zhì)納米顆粒（LNP）遞送答案：ABD解析：mRNA疫苗進(jìn)入細(xì)胞后，通過宿主核糖體翻譯產(chǎn)生抗原；因不涉及DNA，無整合風(fēng)險(xiǎn)；LNP是常用遞送載體；但mRNA易降解，熱穩(wěn)定性低于滅活疫苗（需低溫保存）。5.工業(yè)酶制劑生產(chǎn)中，提高酶活的常用策略包括：A.定向進(jìn)化改造酶基因B.優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮比C.添加表面活性劑促進(jìn)分泌D.降低發(fā)酵溫度延長對(duì)數(shù)期答案：ABC解析：定向進(jìn)化可提高酶的催化效率或穩(wěn)定性；優(yōu)化碳氮比（如高氮源促進(jìn)蛋白酶合成）可提升產(chǎn)量；表面活性劑（如吐溫-80）可增加細(xì)胞膜通透性，促進(jìn)胞外酶分泌；降低溫度可能減緩代謝，通常需根據(jù)菌種特性調(diào)整。三、簡答題（每題8分，共40分）1.簡述植物組織培養(yǎng)中“脫分化”與“再分化”的概念及關(guān)鍵調(diào)控因素。答案：脫分化指已分化的植物細(xì)胞（如葉肉細(xì)胞）在離體條件下失去原有形態(tài)和功能，恢復(fù)分裂能力形成愈傷組織的過程；再分化指愈傷組織在特定條件下重新分化為根、芽等器官或胚狀體的過程。關(guān)鍵調(diào)控因素：（1）植物激素：生長素（如IAA）與細(xì)胞分裂素（如6-BA）的比例是核心，高生長素/細(xì)胞分裂素促進(jìn)生根，高細(xì)胞分裂素/生長素促進(jìn)生芽；（2）營養(yǎng)條件：培養(yǎng)基中碳源（蔗糖）、氮源（NH4+/NO3-）及微量元素（如鐵、鋅）的濃度影響細(xì)胞代謝；（3）環(huán)境條件：光照（光質(zhì)、光強(qiáng)）影響葉綠體發(fā)育，溫度（25±2℃）影響酶活性，pH（5.8～6.0）維持細(xì)胞滲透壓穩(wěn)定。2.說明單克隆抗體制備中“有限稀釋法”的目的及操作要點(diǎn)。答案：目的：從雜交瘤細(xì)胞群中篩選出分泌單一特異性抗體的克隆，確保單克隆性（每個(gè)克隆由單個(gè)細(xì)胞增殖而來）。操作要點(diǎn)：（1）細(xì)胞懸液稀釋：將雜交瘤細(xì)胞稀釋至理論密度為0.5～1個(gè)/孔（96孔板），確保多數(shù)孔含單個(gè)細(xì)胞；（2）培養(yǎng)基添加：使用含飼養(yǎng)細(xì)胞（如小鼠腹腔巨噬細(xì)胞）的培養(yǎng)基，提供生長因子支持單細(xì)胞存活；（3）陽性孔篩選：培養(yǎng)7～10天后，通過ELISA檢測各孔上清液的抗體活性，標(biāo)記陽性孔；（4）亞克隆驗(yàn)證：對(duì)陽性孔細(xì)胞重復(fù)有限稀釋2～3次，確認(rèn)單克隆性（所有子代孔均陽性）。3.列舉3種基因編輯技術(shù)（除CRISPR外）并簡述其原理。答案：（1）鋅指核酸酶（ZFN）：由鋅指蛋白（ZFP）DNA結(jié)合域與FokI核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域融合而成，ZFP識(shí)別3bp靶序列，多個(gè)鋅指模塊串聯(lián)識(shí)別長靶序列（18～36bp），F(xiàn)okI二聚化后切割DNA雙鏈，誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)（NHEJ或HDR）。（2）轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）：TALE蛋白的重復(fù)單元（每個(gè)單元識(shí)別1個(gè)堿基）組裝成靶序列識(shí)別模塊，與FokI連接形成核酸酶，原理與ZFN類似，但TALE的堿基識(shí)別特異性更高，設(shè)計(jì)更靈活。（3）歸巢內(nèi)切酶（Meganuclease）：天然存在的DNA內(nèi)切酶，識(shí)別12～40bp長序列（特異性極高），通過蛋白質(zhì)工程改造其識(shí)別序列，可用于基因組定點(diǎn)切割，但改造難度大，應(yīng)用受限。4.分析動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中“微載體培養(yǎng)”的優(yōu)缺點(diǎn)及適用場景。答案：優(yōu)點(diǎn)：（1）比表面積大，單位體積細(xì)胞密度高（可達(dá)107～108cells/mL）；（2）模擬體內(nèi)貼壁環(huán)境，支持錨定依賴性細(xì)胞（如CHO細(xì)胞、Vero細(xì)胞）生長；（3）操作可控，可通過攪拌均勻分布微載體，便于取樣和監(jiān)測；（4）易于放大，適用于生物反應(yīng)器（500～5000L規(guī)模）。缺點(diǎn)：（1）微載體成本高（如Cytodex系列），需預(yù)處理（清洗、滅菌）；（2）攪拌剪切力可能損傷細(xì)胞，需優(yōu)化攪拌轉(zhuǎn)速（50～100rpm）；（3）細(xì)胞收獲時(shí)需消化（胰酶處理），可能影響細(xì)胞活性或產(chǎn)物質(zhì)量；（4）微載體殘留可能干擾下游純化（需增加過濾步驟）。適用場景：主要用于生產(chǎn)治療性蛋白（如單克隆抗體、病毒載體）、疫苗（如流感疫苗、新冠疫苗）等需貼壁細(xì)胞表達(dá)的生物制品，尤其適用于需高細(xì)胞密度、大規(guī)模生產(chǎn)的場景。5.簡述生物信息學(xué)在基因功能研究中的主要應(yīng)用（至少4項(xiàng)）。答案：（1）序列比對(duì)與同源性分析：通過BLAST等工具比對(duì)目標(biāo)基因與已知基因的序列相似性，預(yù)測其功能（如同源基因可能具有相似功能）；（2）結(jié)構(gòu)預(yù)測：利用SWISS-MODEL、AlphaFold等工具預(yù)測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，分析活性位點(diǎn)、結(jié)合域等功能區(qū)域；（3）表達(dá)譜分析：通過RNA-seq數(shù)據(jù)挖掘差異表達(dá)基因（DEGs），結(jié)合GO（基因本體）和KEGG（代謝通路）富集分析，揭示基因參與的生物學(xué)過程和信號(hào)通路；（4）單核苷酸多態(tài)性（SNP）關(guān)聯(lián)分析：通過全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）識(shí)別與表型相關(guān)的SNP位點(diǎn)，定位功能基因；（5）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：整合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（如JASPAR數(shù)據(jù)庫）、miRNA靶基因預(yù)測（如TargetScan）等數(shù)據(jù)，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。四、案例分析題（共15分）某生物制藥公司計(jì)劃開發(fā)一款基于重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）的注射劑，用于治療腎性貧血。請(qǐng)結(jié)合生物技術(shù)應(yīng)用知識(shí)，回答以下問題：（1）選擇大腸桿菌（E.coli）還是中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）作為表達(dá)宿主？說明理由（5分）。（2）簡述上游發(fā)酵過程中需控制的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）及監(jiān)測方法（5分）。（3）下游純化中，若發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白存在脫酰胺化（Asn→Asp）修飾，可能的原因及解決措施（5分）。答案：（1）應(yīng)選擇CHO細(xì)胞作為宿主。理由：rhEPO是糖基化蛋白（含3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和1個(gè)O-糖基化位點(diǎn)），糖基化直接影響其在體內(nèi)的半衰期和生物活性（如唾液酸含量不足會(huì)導(dǎo)致被肝細(xì)胞清除）。大腸桿菌為原核表達(dá)系統(tǒng)，缺乏真核細(xì)胞的糖基化修飾能力，表達(dá)的rhEPO無正確糖型，無法滿足治療需求；CHO細(xì)胞為常用真核表達(dá)系統(tǒng)，可進(jìn)行復(fù)雜糖基化修飾，且已通過FDA認(rèn)證，適合生產(chǎn)治療性糖蛋白。（2）上游發(fā)酵的關(guān)鍵質(zhì)量屬性及監(jiān)測方法：①細(xì)胞活率：直接影響產(chǎn)物得率，通過臺(tái)盼藍(lán)染色法（顯微鏡計(jì)數(shù)）或流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測；②目標(biāo)蛋白表達(dá)量：通過ELISA或WesternBlot定量，實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測目的基因mRNA水平；③糖基化修飾（如唾液酸含量）：影響藥物半衰期，通過高效液相色譜（HPLC）結(jié)合熒光標(biāo)記（如2-AB衍生化）或質(zhì)譜（LC-MS）分析；④代謝副產(chǎn)物（如乳酸、氨）：積累過多會(huì)抑制細(xì)胞生長，通過生物傳感器（如Nova生化分析儀）在線監(jiān)測；⑤病毒污染：CHO細(xì)胞可能攜帶內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，需通過PCR檢測病毒基因或電鏡觀察病毒顆粒。（3）脫酰胺化的可能原因及解決措施：可能原因：①pH過高（>8.0）或過低（<5.0）：Asn殘基在中性或弱堿性條件下易發(fā)生脫酰胺反應(yīng)；②溫度過高（>37℃）：高溫加速酰胺鍵水解；③發(fā)酵時(shí)間過長：對(duì)數(shù)期后細(xì)胞自溶釋放蛋白酶或酰胺酶，促進(jìn)脫酰胺；④緩沖液成分：某些緩沖劑（如Tris）可能催化脫酰胺反應(yīng)。