ICS07.080CCSB44GDPMAAStandardforestablishmentofanimalmodelsforcerebralischemicstrokePart2:Nonhumanpr（本文件完成時間：2025.07.29）IT/GDPMAA0021—2025 2規(guī)范性引用文件 3術語和定義 4動物質量及飼養(yǎng)要求 5動物模型制備方法 5.1電凝法 5.2栓塞法 5.3光化學法 6評價方法 6.1腦損傷磁共振掃描評價 6.2神經功能評價 6.3運動功能評價 6.4延遲記憶評價 6.5組織病理診斷 7結果判定 7.1磁共振成像病變特征 7.2腦梗死體積 7.3神經功能 7.4運動功能 7.5延遲記憶 7.6組織病理 T/GDPMAA0021—2025本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由廣東省生物技術研究院（廣東省實驗動物監(jiān)測中心）提出。本文件由廣東省精準醫(yī)學應用學會歸口。本文件起草單位：廣東省生物技術研究院（廣東省實驗動物監(jiān)測中心）、中山大學附屬第一醫(yī)院、廣西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院、深圳市藥品檢驗研究院（深圳市醫(yī)療器械檢測中心）。本文件主要起草人：張鈺，關雅倫，范玉華，劉競麗，黃忠強，張健，黨超，葉子明，陳相任，劉堯，李韻峰，李舸，金毅，秦超，曾進勝。T/GDPMAA0021—2025缺血性腦卒中（cerebralischemicstroke,CIS），是指腦組織局部因血液循環(huán)障礙，導致缺血缺氧發(fā)生，進而引起腦組織壞死的一類疾病。流行病學調查顯示，CIS是我國排名第二的致死性疾病，年發(fā)病率約為247/10萬人，死亡率約為115/10萬人，未來隨著人口結構的老齡化，我國CIS的發(fā)病率將持續(xù)升高，高致死和致殘率將給社會和家庭造成嚴重負擔，因此，近年來CIS已經成為重大慢性非傳染性疾病研究的熱點方向之一。非人靈長類腦結構與人類高度相似是開展腦疾病研究最理想的模式動物。非人靈長類構建的缺血性腦卒中動物模型在國內外已被廣泛應用于CIS發(fā)病機制研究和藥物評價，因此，本標準將依據(jù)經典的非人靈長類CIS模型，對缺血性腦卒中動物模型制備及評價技術進行規(guī)范。1T/GDPMAA0021—2025缺血性腦卒中動物模型評價技術規(guī)范第2部分：非人靈長類動物本文件規(guī)定了非人靈長類缺血性腦卒中模型制備的動物質量和飼養(yǎng)要求、制備方法、評價方法和結果判定。本文件適用于非人靈長類缺血性模型的制備及應用評價。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T14924.2實驗動物配合飼料衛(wèi)生標準GB14924.3實驗動物配合飼料營養(yǎng)成分GB14925實驗動物環(huán)境及設施T/CALAS104-2021實驗動物實驗猴神經行為評價規(guī)范3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1缺血性腦卒中cerebralischemicstroke是指各種原因導致的腦組織血液供應障礙，并由此產生的缺血缺氧性壞死，進而出現(xiàn)神經功能障礙的一類臨床綜合征。3.2神經功能評價量表neurologicalfunctionassessmentscale用于評估動物模型神經功能缺損程度和恢復情況的工具，評價內容包括意識水平、感覺系統(tǒng)、運動系統(tǒng)和骨骼肌協(xié)調等。3.3運動能力評價motorfunctionassessment利用不同動物運動評價設備，如步態(tài)分析系統(tǒng)等，觀察動物在不同情境下的運動行為變化，用于測試和評價動物的運動能力。3.4延遲記憶評價long-termmemoryassessment利用動物認知測試設備，如威斯康辛通用測試裝置等，觀察動物辨別物體能力以及對刺激信號的反應，用于測試和評價動物的工作記憶行為學變化。3.5核磁共振成像magneticResonanceImaging（MRI）利用原子核在磁場中產生的磁共振信號來生成動物組織器官內部結構變化的圖像。4動物質量及飼養(yǎng)要求4.1非人靈長類質量應符合GB14922的要求。2T/GDPMAA0021—20254.2飼養(yǎng)環(huán)境應符合GB14925的要求。4.3飼料應符合GB/T14924.2和GB14924.3的要求。5動物模型制備方法5.1電凝法非人靈長類動物缺血性腦卒中模型構建的常用方法，手術操作簡單。通過電凝器永久性阻斷實驗猴的大腦中動脈，造成腦缺血損傷。具體方法如下：5.1.1術前準備非人靈長類動物術前禁食12小時，自由飲水。進行麻醉、備皮、消毒等準備工作。5.1.2麻醉術前注射麻醉劑進行誘導麻醉，術中采用呼吸麻醉機進行維持麻醉，手術過程中保溫，同時給予適量的鎮(zhèn)痛藥物。5.1.3手術非人靈長類動物側放固定在手術臺上，頭固定于立體定位儀上。通過開顱手術暴露大腦中動脈。使用電凝器對大腦中動脈進行電凝處理，阻斷其血流，造成腦缺血損傷。電凝的位置和程度需要根據(jù)實驗需求進行精確控制。術后，依次縫合肌肉和皮膚，并對傷口皮膚消毒處理。動物蘇醒后，放入飼養(yǎng)籠中進行護理。5.1.4術后護理術后動物比較虛弱，需注射抗生素3-5天，給予流質食物。必要時，注射甘露醇降低顱內壓，減少動物死亡，給予鎮(zhèn)痛，減輕動物的疼痛和痛苦。術后6小時后可通過MRI掃描確定腦梗死情況。5.2栓塞法非人靈長類動物缺血再灌注模型構建的常用方法。利用X射線成像設備或數(shù)字減影血管造影設備的精確成像能力，結合微導管技術，將栓塞材料精準地送入目標血管（如大腦中動脈從而實現(xiàn)血管的閉塞。具體方法如下：5.2.1術前準備非人靈長類動物術前禁食12小時，自由飲水。進行麻醉、備皮、消毒等準備工作。5.2.2麻醉術前注射麻醉劑進行誘導麻醉，術中采用呼吸麻醉機進行維持麻醉，手術過程中需保溫，同時給予適量的鎮(zhèn)痛藥物。5.2.3手術非人靈長類動物仰臥固定在手術臺上，通過X射線成像設備或數(shù)字減影血管造影設備對腦血管進行造影檢查，明確大腦中動脈的位置、形態(tài)及血流情況。根據(jù)動物血管大小選擇合適的導管，在X射線成像設備或數(shù)字減影血管造影設備的引導下，將微導管經股動脈穿刺置入，并引導至大腦中動脈的預定位置。通過微導管向大腦中動脈注入栓塞材料（如自體血栓凝塊、彈簧圈、球囊等觀察成像圖像以確認栓塞效果。缺血60分鐘后撤除球囊、彈簧等實現(xiàn)再灌注模型制備。手術過程中去除部分顱瓣降低顱內壓，減少動物死亡。5.2.4術后護理術后動物比較虛弱，需注射抗生素3-5天，給予流質食物。必要時，注射甘露醇降低顱內壓，減少動物死亡，給予鎮(zhèn)痛，減輕動物的疼痛和痛苦。術后6小時后可通過MRI掃描確定腦梗死情況。5.3光化學法3T/GDPMAA0021—2025非人靈長類缺血性腦卒中模型構建的常用方法，創(chuàng)傷面小，可精準定位。利用光敏劑（如玫瑰紅）在特定強度光照下發(fā)生光化學反應，在大腦的照射局部產生腦水腫和血小板微血栓，進而形成局灶性腦梗死。具體方法如下：5.3.1術前準備非人靈長類動物術前禁食12小時，自由飲水。進行麻醉、備皮、消毒等準備工作。5.3.2麻醉術前注射麻醉劑進行誘導麻醉，術中采用呼吸麻醉機進行維持麻醉，手術過程中需保溫，同時給予適量的鎮(zhèn)痛藥物。5.3.3手術選定大腦中動脈遠端或其他需要模擬卒中的腦區(qū)作為照射部位，插入光纖，靜脈注射玫瑰紅（35mg/kg）3分鐘，使用激光（15mW）光源對選定的部位進行連續(xù)照射30分鐘，移去光源，縫合骨膜、皮膚，并對傷口皮膚消毒處理。5.3.4術后護理術后動物比較虛弱，需注射抗生素3-5天，給予流質食物。必要時，注射甘露醇降低顱內壓，減少動物死亡，給予鎮(zhèn)痛，減輕動物的疼痛和痛苦。術后6小時后可通過MRI掃描確定腦梗死情況。6評價方法6.1腦損傷磁共振掃描評價6.1.1非人靈長類腦缺血性卒中模型可分為4期，超急性期（0-6小時），急性期（6-72小時），亞急性期（3-10天），慢性期（10天以后）。6.1.2檢測腦水腫變化可采用彌散加權成像。6.1.3檢測腦梗死損傷變化可采用掃描T1加權成像和T2加權成像。6.1.4檢測腦梗死體積可采用T2加權成像圖像測量，在每個腦冠狀切片上圈選出腦梗死灶邊界及對側正常半腦邊界，利用ImageJ軟件計算梗死面積，將所有切面梗死灶面積和對側正常半腦面積相加后乘以切片厚度，得到梗死灶體積及對側正常半腦體積。式中：CIVR——Cerebralinfarctionvolumeratio，腦梗死體積比；IIV——Ipsilateralhemisphereinfarctzonevolume，患側半腦梗死組織體積；CBV——Contralateralhemispherebrainvolume，對側正常半腦體積。6.2神經功能評價參照T/CALAS104-2021中6.1和7.1進行。6.3運動功能評價6.3.1利用步態(tài)分析設備評價動物四肢行走及協(xié)調能力。實驗應在獨立安靜的環(huán)境中開展，測試前動物需禁食。造模前對動物進行訓練，確保動物在勻速運動的跑步機上正常行走。造模后動物可以正常飲食和運動后，連續(xù)3天對動物進行步態(tài)視頻錄制，錄制時長不少于10s。利用運動軌跡分析軟件，對錄制視頻中動物各個標記關節(jié)進行分析，獲得動物行走過程中的步頻、步幅、步長、步間隔等數(shù)據(jù)，評價動物的運動功能。6.3.2運動感知行為評價參照T/CALAS104-2021中6.4和7.4進行。6.4延遲記憶評價參照T/CALAS104-2021中6.2和7.2進行。4T/GDPMAA0021—20256.5組織病理診斷動物安樂死后，對腦組織進行灌注固定，分離腦組織，在4%多聚甲醛中進行固定保存，經梯度酒精脫水、二甲苯透明后進行石蠟包埋制成蠟塊，切成4μm厚度切片，然后結合評價需要，選擇進行蘇木素-伊紅、尼氏或Fluoro-JadeC等染色并封片。組織切片應包含梗死灶及周邊半暗帶組織，觀察梗死灶和半暗帶組織神經元壞死及炎癥細胞活化情況。7結果判定7.1磁共振成像病變特征腦缺血后的磁共振成像病變特征包括：超急性期、急性期、亞急性期、慢性期。7.1.1超急性期在梗死區(qū)域彌散加權成像可顯示明顯的高信號，病變區(qū)表現(xiàn)為腦回部腫脹、腦溝部變淺、灰白質界限不清晰。7.1.2急性期T1加權成像呈低信號、T2加權成像呈高信號、彌散加權成像高信號，腦室由于受壓會出現(xiàn)變形、移位，中線結構向對側移位，表現(xiàn)為局部的腦溝和腦裂消失。7.1.3亞急性期表現(xiàn)T1加權成像低信號、T2加權成像高信號、梗死區(qū)彌散加權成像低信號。增強掃描可出現(xiàn)腦回狀強化，顯影逐漸變淡。7.1.4慢性期病灶逐漸液化，周邊膠質增生帶呈高信號、彌散加權成像呈低信號。梗死區(qū)域局灶性腦萎縮，形成軟化灶，類似于腦脊液的信號。7.2腦梗死體積磁共振成像計算動物腦梗死體積比，評價造模后梗死體積大小。7.3神經功能神經功能評分由意識水平（0-28分），感覺系統(tǒng)（0-22分），運動系統(tǒng)（0-32分），骨骼肌協(xié)調性（0-18分）組成，總分越高表明神經功能損傷越嚴重。7.4運動功能7.4.1利用步態(tài)分析設備進行步態(tài)評價，連續(xù)3天評價的平均數(shù)作為實驗結果，造模后的各肢體采集數(shù)據(jù)與造模前相比出現(xiàn)統(tǒng)計學上的顯著性差異時可判定動物出現(xiàn)四肢行走及協(xié)調功能損傷。7.4.2利