細胞培養(yǎng)技術第一頁，共79頁。一、光學顯微鏡二、電子顯微鏡三、顯微操作技術顯微鏡及顯微技術第二頁，共79頁?！?、光學顯微鏡第三頁，共79頁。1.構成：①照明系統(tǒng)②光學放大系統(tǒng)③機械裝置2.原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡放大成虛像。（一）普通光學顯微鏡第四頁，共79頁。第五頁，共79頁。顯微鏡的幾個光學特點：介質折射率越接近鏡頭玻璃的（1.7）越好；sinα/2的最大值小于1；油鏡介質為香柏油，鏡口率可接近1.5；普通光線的波長為400~700nm，光鏡分辨力約為0.2μm，人眼的分辨力為0.2mm，因此顯微鏡的最大有效倍數(shù)為1000X。第六頁，共79頁。（二）熒光顯微鏡Fluorescencemicroscope特點：光源為短波光；有兩個特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。第七頁，共79頁。Fluorescenceimage,DNAinblueandMicrotubulesingreen用于觀察能激發(fā)出熒光的結構。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。第八頁，共79頁。（三）激光共聚焦掃描顯微境

Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描；能顯示細胞樣品的立體結構；分辨力是普通光學顯微鏡的3倍；用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。第九頁，共79頁。laserconfocalscanningmicroscope,LCSM第十頁，共79頁。LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)/第十一頁，共79頁。（四）暗視野顯微鏡darkfieldmicroscope聚光鏡中央有擋光片，視野背景是黑的，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，物體邊緣是亮的?？捎^察4~200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。第十二頁，共79頁。把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。在構造上，相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處。環(huán)形光闌（annulardiaphragm）：位于光源與聚光器之間。相位板（annularphaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。（五）相差顯微鏡第十三頁，共79頁。用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標本。第十四頁，共79頁。（六）偏光顯微鏡polarizingmicroscope用于檢測具有雙折射性的物質，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等。光源前有偏振片（起偏器），進入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器（與起偏器方向垂直的偏振片）。載物臺可以旋轉。淀粉第十五頁，共79頁。（七）微分干涉差顯微鏡Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）1952年Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強影像的明暗效果，能顯示結構的三維立體投影。標本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。第十六頁，共79頁。（八）倒置顯微鏡inversemicroscope

物鏡與照明系統(tǒng)顛倒；用于觀察培養(yǎng)的活細胞，通常具有相差或DIC物鏡，有的還具有熒光裝置。

第十七頁，共79頁。（九）當代顯微鏡的發(fā)展趨勢采用組合方式，集普通光鏡、相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體；自動化與電子化。第十八頁，共79頁。二、電子顯微鏡（一）透射電子顯微鏡transmissionelectronmicroscope,TEM第十九頁，共79頁。以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束波長與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比；由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構成；分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達百萬倍；用于觀察超微結構（小于0.2μm）。1.原理第二十頁，共79頁。表二、不同光線的波長第二十一頁，共79頁。透射電子顯微鏡TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM第二十二頁，共79頁。人類紅細胞第二十三頁，共79頁。酵母第二十四頁，共79頁。人類精子第二十五頁，共79頁。（三）掃描隧道顯微鏡

scanningtunnelingmicroscope，STM原理：根據(jù)隧道效應設計，當原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV~2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關系，將掃描過程中電流的變化轉換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。分辨率：橫向為0.1~0.2nm，縱向可達0.01nm。用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質均可進行觀察。第二十六頁，共79頁。STMimageofaDNAmolecule第二十七頁，共79頁。三、顯微操作技術

micromanipulationtechnique是在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進行細胞或早期胚胎操作的一種方法。包括細胞核移植、顯微注射、嵌合體技術、胚胎移植以及顯微切割等。細胞核移植技術已有幾十年的歷史，1952年，Briggs和King等將不同階段的蛙胚細胞核注入去核的蛙卵，構建核移植胚。Gordon（1962）證明原腸胚以后的細胞核移植能發(fā)育到成體。1997年，Wilmut等克隆了綿羊Dolly。第二十八頁，共79頁。顯微操作儀第二十九頁，共79頁。轉基因顯微操作過程

第三十頁，共79頁。小結一、細胞培養(yǎng)的必備設施無菌實驗室、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、其他設備二、細胞培養(yǎng)常用器材及處理方法玻璃器材、塑料器材、橡皮器材、金屬器材、其他用品三、顯微技術及設備第三十一頁，共79頁。細胞培養(yǎng)用液和培養(yǎng)基第三十二頁，共79頁。水：平衡鹽溶液（BBS）：消化液：維生素液：染色液：一、細胞培養(yǎng)用液第三十三頁，共79頁。（一）水第三十四頁，共79頁。（二）平衡鹽溶液維持滲透壓、調節(jié)PH值細胞生存能量、無機離子第三十五頁，共79頁。（三）消化液原代培養(yǎng)分散組織細胞胰蛋白酶液：使細胞間蛋白質水解，細胞分散EDTA（二乙烯四乙酸二鈉）：吸取Ca2＋，Mg2＋，使細胞分離膠原酶原代培養(yǎng)分散組織細胞聯(lián)用第三十六頁，共79頁。細胞培養(yǎng)用容器及培養(yǎng)基Culturevesselsandmediumforanimalcellculture二、培養(yǎng)基（液）第三十七頁，共79頁。培養(yǎng)基（液）是維持體外細胞生存和生長的溶液天然培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基：氨基酸、維生素、糖類無機離子、其它成分無血清培養(yǎng)基：

第三十八頁，共79頁。（一）天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基有生物性液體（血清），組織浸液（胚胎浸液），凝固劑（血漿）優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。成分復雜，影響對某些實驗產物的提取和實驗結果的分析。易發(fā)生支原體污染第三十九頁，共79頁。血清(serum)：一般常用為小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它動物血清。外觀：透明淡黃色，無溶血，無沉淀。滅活：56度，30min消除補體活性。成分：總蛋白3.5-4.5g/100ml球蛋白不高于2g/100ml第四十頁，共79頁。第四十一頁，共79頁。①多種PR（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子③激素④促貼附物質，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉移蛋白⑦不明成分第四十二頁，共79頁。關于血清的幾個問題血清必須貯存于–20～-70℃，若存放于4℃，請勿超過一個月。如果一次無法用完一瓶，可將40～45ml分裝于無菌50ml離心管中，由于血清結凍時體積會增加約10%，必須預留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。

一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內一起過濾，勿直接過濾血清。第四十三頁，共79頁。

瓶裝(500ml)血清解凍步驟(逐步解凍法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50ml無菌離心管可分裝40～45ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質凝結而發(fā)生沈淀。第四十四頁，共79頁。血漿：1907年Harrison首次使用優(yōu)點：支持培養(yǎng)組織塊，供給細胞生長物質。缺點：易于液化。第四十五頁，共79頁。（二）合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基：根據(jù)細胞生存所需物質的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。主要成分：氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質。優(yōu)點：標準化生產，組分和含量相對固定。成本低缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。

第四十六頁，共79頁。199液：成分多達69種，單獨使用只能維持細胞生長數(shù)天，應用不多。在生理鹽水的基礎上加入氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶、膽固醇、ATP等。Eagle培養(yǎng)液：MEM（Eagle’sminimumessentialmedium）BME（BasalEagleMedium）DMEM（DulbeccoMEM）RPMI1640培養(yǎng)液：應用最廣泛。組成簡單，適宜多種細胞生長。Ham培養(yǎng)液：加入了一些微量元素、無機離子，在低血清濃度下使用，適于單細胞培養(yǎng)和克隆化培養(yǎng)。高糖型—生長快、附著性差的腫瘤細胞低糖型第四十七頁，共79頁。干粉培養(yǎng)基商品培養(yǎng)液第四十八頁，共79頁?？股?

在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。青霉素（50~100IU/ml培養(yǎng)液）鏈霉素（50~100ug/ml培養(yǎng)液）第四十九頁，共79頁。完全培養(yǎng)基的組成:基礎培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青霉素50~100IU/ml培養(yǎng)液鏈霉素50~100ug/ml培養(yǎng)液第五十頁，共79頁。配制:RPMI-1640培養(yǎng)粉1袋碳酸氫鈉2.0g青、鏈霉素各100IU/ml加三蒸水至1000ml,過濾除菌,調節(jié)pH值至7.2,加血清（終濃度10％）.第五十一頁，共79頁。（三）無血清培養(yǎng)基第五十二頁，共79頁。

血清中不僅存在促細胞生長因子，同對也存在細胞生長抑制因子或毒性因子，故在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞所反映的生物學特性是細胞和復雜血清因子的綜合反應。在生長因子、蛋白質工程、基因表達調控等研究領域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞．第五十三頁，共79頁。1975年，Sato首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細胞株，近20多年來已報道了幾十種細胞系在無血清培養(yǎng)基中成功地生長和增殖。無血清細胞培養(yǎng)基的使用保證了實驗結果的準確性、可重復性和穩(wěn)定性，減少了細胞污染，簡化了提純和鑒定各種細胞產物的程序。第五十四頁，共79頁。

向無清培養(yǎng)液中能促進細胞系生長的補加物都是獨特的。適用于某種細胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細胞株的生長。即使同源組織的不同細胞株，所需補加物也不同。商品化的無血清培養(yǎng)液供應。如：

Sigma公司的MCDB131可用于培養(yǎng)內皮細胞Biofluids公司的LHC-9用于氣管上皮細胞提高制品安全性和/或產量.第五十五頁，共79頁。

無血清培養(yǎng)基替代血清的補充成分

優(yōu)點：增加確定性；

?性能更一致；容易進行純化和下游加工；缺點：無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段難以推廣。

基礎培養(yǎng)基第五十六頁，共79頁。附加成分培養(yǎng)基質營養(yǎng)成分酶抑制劑第五十七頁，共79頁。培養(yǎng)基質的配制纖維粘連素用1mol/L的尿素PBS，配成1mg/ml的母液。多聚賴氨酸用PBS配成1mg/ml的母液。膠原用0.1mol/L鹽酸或0.1mol/L醋酸配成1-3mg/ml母液。均于-20度保存。第五十八頁，共79頁。培養(yǎng)基質的使用步驟可直接加入培養(yǎng)基中，或先涂布于培養(yǎng)瓶表面。涂布于培養(yǎng)瓶表面步驟：1.稀釋母液：用高純度的蒸餾水稀釋成0.1mg/ml;2.過濾除菌0.22微米微孔過濾；3.均勻涂于培養(yǎng)瓶表面，室溫，靜置5min.第五十九頁，共79頁。營養(yǎng)成分目的：補加各種不同細胞生長所需以及血清中已知促細胞生長物質。如：胰島素、轉鐵蛋白、氫化可的松、維生素A、生長因子、生長激素、胰高血糖素、牛血清白蛋白等。第六十頁，共79頁。酶抑制劑目的：替代血清的保護作用。用于無血清培養(yǎng)基。常用：0.1%-0.5%的大豆胰酶抑制劑，用基礎培養(yǎng)基配制，過濾后-20度保存。使用：在酶消化后；或直接加入培養(yǎng)基。第六十一頁，共79頁。細胞周期及其調控第六十二頁，共79頁。細胞周期基本概念細胞周期：指由細胞分裂結束到下一次細胞分裂結束所經(jīng)歷的過程，所需的時間叫細胞周期時間。分為四個階段：①G1期(gap1)，指從有絲分裂完成到期DNA復制之前的間隙時間；②S期(synthesisphase)，指DNA復制的時期，只有在這一時期H3-TDR才能摻入新合成的DNA中；③G2期(gap2)，指DNA復制完成到有絲分裂開始之前的一段時間；④M期又稱D期(mitosisordivision)，細胞分裂開始到結束。第六十三頁，共79頁。第六十四頁，共79頁。高等動物細胞的分類從增殖的角度來看，可將高等動物的細胞分為三類：①連續(xù)分裂細胞，在細胞周期中連續(xù)運轉因而又稱為周期細胞，如表皮生發(fā)層細胞、部分骨髓細胞。②休眠細胞暫不分裂，但在適當?shù)拇碳は驴芍匦逻M入細胞周期，稱G0期細胞，如淋巴細胞、肝、腎細胞等。③不分裂細胞，指不可逆地脫離細胞周期，不再分裂的細胞，又稱終端細胞，如神經(jīng)、肌肉、多形核細胞等等。第六十五頁，共79頁。細胞周期差異的主要原因細胞周期的時間長短與物種的細胞類型有關。如：小鼠十二指腸上皮細胞的周期為10小時，人類胃上皮細胞24小時，骨髓細胞18小時，培養(yǎng)的人成纖維細胞18小時，CHO細胞14小時，HeLa細胞21小時。不同類型細胞的G1長短不同，是造成細胞周期差異的主要原因。第六十六頁，共79頁。細胞周期測定測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法、細胞計數(shù)法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測定細胞周期的方法。BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細胞DNA復制的原料，經(jīng)過兩個細胞周期后，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經(jīng)歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。第六十七頁，共79頁。細胞同步化細胞同步化(synchronization)：是指在自然過程中發(fā)生或經(jīng)人為處理造成的細胞周期同步化。自然同步化人工同步化第六十八頁，共79頁。（一）自然同步化1．多核體如粘菌只進行核分裂，而不發(fā)生胞質分裂，形成多核體。瘧原蟲也具有類似的情況。2．某些水生動物的受精卵如海膽卵可以同時授精，最初的3次細胞分裂是同步的，再如大量海參卵受精后，前9次細胞分裂都是同步化進行的。3．增殖抑制解除后的同步分裂如真菌的休眠孢子移入適宜環(huán)境后，它們一起發(fā)芽，同步分裂。不存在于動物及人體第六十九頁，共79頁。（二）人工同步化選擇同步化誘導同步化有絲分裂選擇法細胞沉降分離法DNA合成阻斷法中期阻斷法第七十頁，共79頁。1．選擇同步化1）有絲分裂選擇法：使單層培養(yǎng)的細胞處于對數(shù)增殖期，此時分裂活躍，MI高。有絲分裂細胞變圓隆起，與培養(yǎng)皿的附著性低，此時輕輕振蕩，M期細胞脫離器壁，懸浮于培養(yǎng)液中，收集培養(yǎng)液，再加入新鮮培養(yǎng)液，依法繼續(xù)收集，則可獲得一定數(shù)量的中期細胞。其優(yōu)點是，操作簡單，同步化程度高，細胞不受藥物傷害，缺點是獲得的細胞數(shù)量較少。（分裂細胞約占1%～2%）2）細胞沉降分離法：不同時期的細胞體積不同，而細胞在給定離心場中沉降的速度與其半徑的平方成正比，因此可用離心的方法分離。其優(yōu)點是可用于任何懸浮培養(yǎng)的細胞，缺點是同步化程度較低。第七十一頁，共79頁。2、誘導同步化1）DNA合成陰斷法：DNA合成的抑制劑：可逆地抑制DNA合成，而不影響其他時期細胞的運轉，將細胞群阻斷在S期或G/S交界處。如：5-氟脫氧尿嘧啶、羥基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高濃度ADR、GDR和TDR。高濃度TDR——細胞毒性較小，常用TDR雙阻斷法誘導細胞同步化。如：對數(shù)生長期的細胞，＊加入過量TDR，（Hela，2mol/L；CHO，7.5mol/L）。＊移去TDR洗滌加入新鮮培養(yǎng)液細胞開始分裂當釋放時間大于TS時，所有細胞均脫離S期＊再次加入過量TDR，細胞繼續(xù)運轉至G1/