臨床基因擴(kuò)增檢驗質(zhì)量保證湖北省臨床檢驗中心黃鵬臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室常規(guī)測定可大概分為：

1、樣本收集

2、樣本處理（核酸提取）

3、核酸擴(kuò)增

4、產(chǎn)物檢測

5、結(jié)果報告

6、報告解釋臨床基因擴(kuò)增檢驗各項步驟及其與質(zhì)量保證的關(guān)系

IQCEQAQA

患者

↓標(biāo)本收集選擇測定項目患者準(zhǔn)備標(biāo)本采集標(biāo)本保存

↓

實驗室標(biāo)本接收貼標(biāo)簽標(biāo)本測定測定的有效性

↓報告和解釋報告發(fā)出結(jié)果解釋結(jié)果管理標(biāo)本收集、運(yùn)送、保存及其質(zhì)量控制

室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）

IQC主要包括三個方面：

①測定前的質(zhì)量控制；②分析中的質(zhì)量控制；③分析后的質(zhì)量控制。

一、測定前的質(zhì)量控制

（一）實驗室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理

1、合理的空間：儀器設(shè)備、實驗臺放置空間；實驗操作人員的活動空間。舒適的心情?。?！

2、設(shè)備：保養(yǎng)良好；

3、實驗用品：達(dá)到相應(yīng)要求。

例如：加樣器、帶濾芯吸頭、高速冷凍離心機(jī)、熱循環(huán)儀、擴(kuò)增儀、酶標(biāo)儀、洗板機(jī)、生物安全柜、冰箱、空調(diào)、可移動紫外燈、振動器等。表1基因擴(kuò)增檢驗儀器設(shè)備的質(zhì)控

儀器設(shè)備

質(zhì)控方法頻度失控標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增儀儀器校驗實驗當(dāng)儀器移動時實驗失敗熱電偶監(jiān)測溫度每月一次如靶溫度或溫度差異超出允許范圍擴(kuò)增功能檢測每4個月一次程序打印每次測定時待測孔未出現(xiàn)擴(kuò)增，檢測溫度打印程序不對加樣器校準(zhǔn)每年2次不符合要求水浴箱溫度檢測每次實驗

不符合要求酶標(biāo)儀預(yù)防性維護(hù)及校準(zhǔn)每年2次不符合要求

（二）理想的試劑和操作方法

1、試劑盒：每批質(zhì)檢和評價；

2、理想的操作方法：條件變化不大、測定結(jié)果影響最小。

質(zhì)檢包括兩個方面：一是看：是否污染，即是否有假陽性存在。二是看：使用弱陽性質(zhì)控物檢測試劑的擴(kuò)增檢測效果。

國家級參考實驗室采用相同及不同廠家試劑檢測結(jié)果一覽表包裝批號試劑對數(shù)值定值范圍1104進(jìn)口A4.57E3(3.66)1.45E3—1.45E4(3.16—4.16)1104進(jìn)口A4.43E3(3.65)1.40E3—1.40E4(3.15—4.15)1104國產(chǎn)B1.04E3（3.01）

3.27E2～3.27E3(2.51—3.51)

二、分析中質(zhì)量控制（一）理想的室內(nèi)質(zhì)控樣本的條件

1、基質(zhì)與待測標(biāo)本一致:

不同的基質(zhì)可能含有不同的抑制物。

2、待測物濃度應(yīng)接近試驗的決定性水平

定性測定：測定的陽性判斷值（cut-off）；

定量測定：方法測定濃度范圍的下限和上限。

待測物濃度接近試驗決定性水平的室內(nèi)質(zhì)控物，能最靈敏地反映測定的變異。

3、有很好的穩(wěn)定性。

4、靶值或預(yù)期結(jié)果已定。

5、無已知的生物傳染危險性。

6、單批可大量獲得。（二）測定中質(zhì)控樣本的設(shè)置、數(shù)量及排列順序

定性測定：一份弱陽性（接近c(diǎn)ut-off）、一份陰性質(zhì)控樣本。

定量測定：采用高、中、低三種濃度的質(zhì)控樣本。

排列順序：標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)品之后，臨床樣本之前。

（三）統(tǒng)計質(zhì)控方法

1、基線測定：

最佳條件下的變異（OCV）：均值（x）、s和變異系數(shù)（OCV）。所有測定數(shù)據(jù)不管其是否超出3s，均應(yīng)用于上述統(tǒng)計計算。

常規(guī)條件下的變異（RCV）：均值（x）、s和變異系數(shù)（RCV）。所有測定數(shù)據(jù)不管其是否超出3s，均應(yīng)用于上述統(tǒng)計計算。

當(dāng)OCV＜RCV＜2OCV時，RCV可接受，否則，就需要對常規(guī)條件下的操作水平采取措施予以改進(jìn)。

在進(jìn)行基線測定時，既可使用質(zhì)控樣本擴(kuò)增后的IU/ml來進(jìn)行統(tǒng)計計算，也可用其對數(shù)值進(jìn)行。

表2常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義

定義12S一個質(zhì)控測定值超出x±2s控制限。13S一個質(zhì)控測定值超出x±3s控制限。22S兩個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出x+2s或x-2s控制限。R4S同一批測定中，兩個不同濃度質(zhì)控物的測定值之間的差值超出4s控制限。31S三個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出x+1s或x-1s控制限。41S四個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出x+1s或x-1s控制限。7X七個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值（x）的同一側(cè)。7T七個連續(xù)的質(zhì)控測定值呈現(xiàn)一個向上或向下的趨勢變化。8X八個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值（x）的同一側(cè)。9X九個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值（x）的同一側(cè)。10X十個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值（x）的同一側(cè)。

2、Levey-Jennings質(zhì)控圖方法的基本特點(diǎn)①根據(jù)RCV計算中的平均值和SD確定質(zhì)控限，一般以x±2s為告警限，x±3s為失控限；②x±2s為失控限，假失控的概率太高，通常不能接受；

以x±3s為失控限，假失控的概率低，但誤差檢出能力不強(qiáng)。

舉例

Levey-Jennings質(zhì)控圖的使用及分析方法。表3為一組HBVDNA室內(nèi)質(zhì)控血清（含量為2.0×104IU/ML

）的測定數(shù)據(jù)，繪制的質(zhì)控圖如圖2所示。圖2Levey-Jennings質(zhì)控圖0123567891011121314151617181920

+3SD+2SD+1SDΧ-1SD-2SD-3SD測定批（次）表3HBVDNA定量PCR測定室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)測定批測定結(jié)果測定批測定結(jié)果原始數(shù)據(jù)原始數(shù)據(jù)（IU/ML）對數(shù)值（IU/ML

）對數(shù)值基線測定均值2.3×104

標(biāo)準(zhǔn)差(s)6.9×104

141.6×1044.2011.8×104

4.26151.5×1044.1823.4×1044.53161.1×1044.0432.0×1044.30171.7×1044.2343.0×1044.48181.0×1044.0051.7×1044.23191.5×1044.1862.6×1044.41203.6×1044.5673.2×1044.51211.3×1044.1181.9×1044.28224.5×1044.6592.6×1044.41231.2×1044.08101.6×1044.20244.0×1044.60112.9×1044.46251.7×1044.23122.2×1044.34264.1×1044.61131.9×1044.28275.3×1044.72●01235678910111213

141516171819

20212223242526274.37×104+3SD3.68×104+2SD2.99×104+1SD2.3×104Χ1.61×104-1SD0.92×104-2SD0.23×104-3SD●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●測定批（次）●●●圖3根據(jù)表4數(shù)據(jù)得到的Levey-Jennings質(zhì)控圖

第1----13批，為正常的波動；第14----19批，可能存在準(zhǔn)確性問題，有系統(tǒng)誤差存在；第20----第27批，波動幅度過大，精密度不好，存在隨機(jī)誤差，第27批結(jié)果甚至超出了3s，處于失控狀態(tài)。

3、累積和（CUSUM）質(zhì)控方法

累積和（CUSUM）質(zhì)控方法于1977年由Westgard等提出，對系統(tǒng)誤差有較好的測出能力。質(zhì)控規(guī)則是以均值（x）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）為基礎(chǔ)確定，常用質(zhì)控規(guī)則及其含義，如表5所示。表4常用的累積和（CUSUM）質(zhì)控規(guī)則

質(zhì)控規(guī)則

起動累積和計算的閾值（k）

質(zhì)控限（h）

CS1.0S2.7S1.0S3.0SCSCS0.5S5.1SX±1.0SX±1.0SX±0.5S±2.7S±3.0S±5.1S

具體質(zhì)控步驟如下：

①先求測定均值（x）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）；②計算閾值（k）和質(zhì)控限（h）；③確定質(zhì)控規(guī)則；④繪制質(zhì)控圖；⑤累積和計算。⑥判斷是否失控，采取措施予以糾正。

下面以使用質(zhì)控規(guī)則舉例說明。CS1.0S2.7S

根據(jù)在不同時間10次（批）測定HBVDNA（含量為3.0×104IU/ml）質(zhì)控血清所得的均值及標(biāo)準(zhǔn)差為：

X=2.5×104S=0.5×104ku=3.0×104（ku=x+1.0s）

kl=2.0×104（Kl=x-1.0s）

h=±1.35×104（h=±2.7s）

閾值（k）和質(zhì)控限（h）；X+2.7s(hu)hu=3.85×104（hu=x+h）X+1.0s(Ku)ku上限=3.0×104

（ku=x+1.0s）X

X

=2.5×104S=0.5×104X-1.0s(Kl)kl下限=2.0×104

（Kl=x-1.0s）X-2.7s(hl)hl=1.15×104（hl=x-h）圖4累積和質(zhì)控圖質(zhì)控限h=±1.35×104

（h=±2.7s）

說明：

di：

為第i批質(zhì)控測定值與k值之差；

CSi：

為第i批質(zhì)控測定時的累積和；

ku和kl：

分別為閾值上限和閾值下限，當(dāng)質(zhì)控物測定值超出k值時，即開始累積和計算。表5HBVDNA定量PCR測定累積和（CUSUM）質(zhì)控

測定批測定值*104di*104Csi*104結(jié)果解釋測定批測定值*104di*104Csi*104結(jié)果解釋12.8111.5-0.5-0.722.1122.80.80.1停止累積和計算32.6132.343.30.30.3起始累積和計算142.953.60.60.9153.80.80.8起始累積和計算63.10.11.0163.40.41.271.9-1.1-0.1停止累積和計算171.9-1.10.182.9183.80.80.992.1193.30.31.2101.8-0.2-0.2起始累積和計算203.60.61.8失控（X

=2.5×104,s=0.5×104,ku上限=3.0×104,k1下限=2.0×104,質(zhì)控限h=±1.35×104)

4、即刻法質(zhì)控的計算及評價方法

1）依據(jù)：美國CLIA’88關(guān)于《臨床實驗室（定量測定）室內(nèi)質(zhì)控工作指南》。

2）適用于：不是每天開展且標(biāo)本量少的項目；試劑盒有效期較短；各級各類醫(yī)院實驗室，特別是基層衛(wèi)生院。

3）方法：只需連續(xù)測定3次，即可對第三次檢驗結(jié)果進(jìn)行檢驗和控制。A、從測定值中，找出最大值和最小值；B、計算測定均值χ和s。C、計算SI上限值和SI下限值，見公式

SI上限=（最大值

χ）/s；SI下限=（χ

最小值）/sD、將SI上限、SI下限值與SI值表中的數(shù)字比較。nn3sn2snn3sn2s31.151.15122.552.5541.151.15132.612.6151.491.49142.332.3361.461.46152.662.6671.751.75162.372.3782.222.22172.712.7192.032.03182.822.82102.322.32192.502.50112.112.11202.852.85

當(dāng)SI上限值和SI下限值

n2s時，表示在控；當(dāng)SI上限和SI下限有一值處于n2s和n3s值之間時，處于“告警”狀態(tài)；當(dāng)SI上限值和SI下限值

n3s時，說明該值已在3s范圍之外，屬“失控”。當(dāng)檢測的數(shù)字超過20次以后，可轉(zhuǎn)入使用常規(guī)質(zhì)控方法進(jìn)行質(zhì)控。

即刻法質(zhì)控原始數(shù)據(jù)記錄表（資料參考）日期次數(shù)nn2sn3sS/COxsSI上限值SI下限值結(jié)果1/4111.712/4221.813/4331.151.151.901.810.100.91.0√4/4441.491.461.811.810.081.131.25√7/4551.751.671.091.660.330.731.73╳7/4651.751.672.101.870.151.531.07√8/4761.941.821.431.790.221.411.64√9/4872.101.941.621.770.211.571.62√10/4982.222.032.141.820.241.351.60√11/41092.322.111.431.770.261.421.62√日期次數(shù)nn2sn3sS/COxsSI上限值SI下限值結(jié)果1411102.412.181.901.780.241.501.79√1512112.482.231.351.740.271.481.59√1613122.552.292.001.770.261.421.62√1714132.612.331.521.750.261.501.54√1815142.662.371.711.740.251.601.56√-----------------------------------------------------------2419182.822.502.001.770.251.481.68√2520192.852.531.431.750.261.501.54√2821202.882.561.521.760.251.521.64√

20次在控數(shù)據(jù)測定為：

X=1.76s=0.25cv=14.2%

說明：1、S為樣本測定OD值，CO為Cut--off值，X為均值，s為標(biāo)準(zhǔn)差。2、結(jié)果在控以“√”表示；失控“╳”表示。3、失控數(shù)據(jù)及原因要填寫“室內(nèi)質(zhì)控失控報告單”。4、當(dāng)獲取20個在控數(shù)據(jù)以后，可將X=1.76作為常用靶值，s=0.25作為常用控制限作圖。質(zhì)控規(guī)則主要采用2S、3S規(guī)則。5、具體作圖方法參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第二版）P316頁。

繪制質(zhì)控圖（利用20次在控數(shù)據(jù)作X--S圖）

X=1.76s=0.25cv%=14.2%

1.761.511.261.012.012.262.51次數(shù)

21222324252627282930313233343536373839404142

●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●本日期段的X：1.78SD：0.23CV：15.2%S/co值

●質(zhì)控規(guī)則①

2s：1質(zhì)控點(diǎn)落在±2s之外；②

R4s：連續(xù)2個質(zhì)控點(diǎn)相差超出4s范圍；③

41s：連續(xù)4個質(zhì)控點(diǎn)落在同一側(cè)±1s之外；④7χ：連續(xù)7個質(zhì)控點(diǎn)落在均值之一側(cè)；⑤7↑/↓：連續(xù)7個質(zhì)控點(diǎn)呈連續(xù)上升或下降；或周期性波動變化。

室內(nèi)質(zhì)控失控報告單

編號：單位名稱：日期：試驗項目：方法：測定儀器：使用波長：試劑廠家、批號及失效期：質(zhì)控物生產(chǎn)單位：批號失效期：失控質(zhì)控物批號：當(dāng)日測試質(zhì)控次數(shù)：

次；當(dāng)日第

次失控失控原因：

失控處理及結(jié)果：

操作者簽名：質(zhì)量負(fù)責(zé)人簽名：

5、幾點(diǎn)說明1）開展室內(nèi)質(zhì)控的前提條件是什么？

試劑：同一廠家，同一批號；質(zhì)控物：同一含量，同一廠家，同一批號

2）質(zhì)控物更換了批號如何操作？即刻法前3個點(diǎn)是怎樣做出來的？應(yīng)將“新”批號質(zhì)控品在“舊”批號質(zhì)控品使用結(jié)束前與“舊”批號質(zhì)控品一起測定，“新”批號質(zhì)控品的3個在控測定數(shù)據(jù)為即刻法前3個質(zhì)控點(diǎn)，且3個測定點(diǎn)的變異系數(shù)必須小于30%，再用這3個點(diǎn)來控制“新”批號質(zhì)控品所發(fā)生的數(shù)據(jù)。

3）試劑更換了批號如何操作？

將“新”批號試劑測定的質(zhì)控值標(biāo)于“舊”批號試劑框架圖，看其有無系統(tǒng)誤差。如沒有，則繼續(xù)使用原框架；如有，計算“新”批號試劑測定質(zhì)控值的x與s，再在原框架基礎(chǔ)上移動橫軸即可。

（四）室內(nèi)質(zhì)量控制數(shù)據(jù)實驗室間比對評價組織者不同實驗室同一批號質(zhì)控物檢測并提交每月原始室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)評價結(jié)果相同方法、不同方法不準(zhǔn)確度和不精密度分析比較方法：

1、匯總所有數(shù)據(jù)或單個數(shù)據(jù)點(diǎn),剔除顯著性離群值。

2、對每一批號質(zhì)控物、每一項目、使用每一分析方法的所有實驗室計算其平均值、中位數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

3、每月定期評價，對于相同方法組可評價自己方法的不準(zhǔn)確度和不精密度。

比對計劃對每一分析項目和每一批號質(zhì)控物提供下列信息

1、當(dāng)前月份：均值、標(biāo)準(zhǔn)差（s）和結(jié)果個數(shù)（N）。

2、計劃開始至現(xiàn)在該質(zhì)控物的累積：均值、s、N。

3、本方法組：方法均值、s（或CV）和所有室個數(shù)。

4、每一分析項目所有實驗室：所有實驗室均值、s（或CV）、實驗室個數(shù)。

5、本方法組SDI=(本室均值-本方法組均值)/本方法組s6、所有實驗室SDI=(本室均值-所有實驗室均值)/所有實驗室s

●SDI在±2之間是“可接受的”

7、本方法組CVI=本室s/本方法組s=本室CV/本方法組CV8、所有實驗室CVI=本室s/所有實驗室s=本室CV/所有實驗室CV

●CVI

1.5表示“可接受的”

●

SDI和CVI是表示方法不準(zhǔn)確度和不精密度的指標(biāo)。

●

SDI是本室均值與相同方法均值比較其接近程度的指標(biāo)。HBVDNA定量PCR室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)實驗室間比對的統(tǒng)計量實例項目本室本方法組所有實驗室對數(shù)均值3.533.653.72標(biāo)準(zhǔn)差0.540.640.72變異系數(shù)15.3%17.5%19.4%結(jié)果或?qū)嶒炇覕?shù)5045120本方法SDI（3.53-3.65）/0.64=-0.19接受所有實驗室SDI（3.53-3.72）/0.72=-0.26接受本方法CVI0.54/0.64=0.84接受所有實驗室CVI0.54/0.72=0.75接受1、與相同方法實驗室的比對作用：評估總的分析過程、評價特定的儀器是否準(zhǔn)確

本室的均值與本方法組的均值：顯著性地偏離要檢查或校準(zhǔn)：特定的試劑批號、儀器設(shè)置或分析過程的其它部分。

HBVDNA定量PCR室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)實驗室間比對的統(tǒng)計量實例項目本室本方法組所有實驗室組對數(shù)均值3.255.973.25標(biāo)準(zhǔn)差0.481.310.92變異系數(shù)14.7%21.9%28.4%結(jié)果或?qū)嶒炇覕?shù)5045120本方法SDI（3.25-5.97）/1.31=-2.08不接受所有實驗室SDI（3.25-3.25）/0.92=0接受本方法CVI0.48/1.31=0.37接受所有實驗室CVI0.48/0.92=0.52接受2、與所有實驗室的比對

上表顯示HBVDNA本方法SDI（-2.08）<-2.0實驗室間比對報告的實例。注意：本室均值與所有室均值一樣，但是與本方法組均值比較不太好，這樣，我們需要問兩個問題：

1、是否報告了正確的方法；是否處在正確的方法組？2、本方法組比對數(shù)據(jù)是否有效？有多少實驗室報告？是否可能由于一個或兩個異常結(jié)果使得數(shù)據(jù)發(fā)生偏離？

HBVDNA定量PCR室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)實驗室間比對的統(tǒng)計量實例項目本室本方法組所有實驗室對數(shù)均值5.395.423.21標(biāo)準(zhǔn)差0.791.180.56變異系數(shù)14.7%21.9%17.4%結(jié)果或?qū)嶒炇覕?shù)5045120本方法SDI（5.39-5.42）/1.18=-0.03接受所有實驗室SDI（5.39-3.21）/0.56=3.89不接受本方法CVI0.79/1.18=0.67接受所有實驗室CVI0.79/0.56=1.41接受

上表顯示：本室相對所有實驗室SDI為3.89，高于所有室均值2倍標(biāo)準(zhǔn)差以上。

本室均值與本方法組均值比較一致，與所有室的均值有差異，偏倚可能是由于質(zhì)控樣本產(chǎn)生的緣故。當(dāng)只與使用特定方法的實驗室相比對時，有關(guān)質(zhì)控物的性能會顯示很好的一致。

使用本方法組的結(jié)果不同于所有實驗室組的均值，是因為質(zhì)控物的基質(zhì)效應(yīng)或本分析過程固有的特征所引起。比對評價——運(yùn)行方式(湖北）開始時間：2013年3月比對材料：使用統(tǒng)一質(zhì)控物專用的CLInet-IQC系統(tǒng)軟件（基于web方式室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)實時監(jiān)控系統(tǒng)（北京科臨易檢））通過互聯(lián)網(wǎng)交換數(shù)據(jù)評價方式：每月一次，一年十二次。評價項目：乙肝五項、丙肝抗體、艾滋病抗體及梅毒抗體。

參加單位數(shù)：142家三、分析后的質(zhì)量控制

1、弱陽性質(zhì)控常見的失控原因①核酸提取中的隨機(jī)誤差：核酸提取的丟失；有機(jī)溶劑去除不徹底；標(biāo)本中擴(kuò)增抑制物的殘留。②儀器的問題：擴(kuò)增儀孔間溫度的不均一；孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致等。③試劑的問題：

Taq酶和/或反轉(zhuǎn)錄酶的失活；探針的純度；標(biāo)記效率和核酸提取試劑的效率等。

2、陰性質(zhì)控常見失控原因：

①以前擴(kuò)增產(chǎn)物的“污染”；

②核酸提取過程中標(biāo)本間的交叉“污染”；

③試劑的污染。

測定結(jié)果的報告

結(jié)果報告必須簡單清楚。

1、定性測定：