EGCG修飾巰基對肌原纖維蛋白乳化凝膠特性的多維度影響與機制解析一、引言1.1研究背景在食品工業(yè)領域，蛋白質作為重要的功能性成分，對食品的質地、結構、穩(wěn)定性及感官特性起著決定性作用。肌原纖維蛋白（MyofibrillarProtein，MP）是肌肉中含量最豐富的一類蛋白質，約占肌肉總蛋白的50%-60%，在肉類及肉制品加工中占據(jù)著舉足輕重的地位。其獨特的分子結構與理化性質，賦予了肉制品良好的乳化、凝膠、保水和持油等功能特性，極大地影響著肉制品的品質與貨架期。例如在香腸、火腿等加工過程中，肌原纖維蛋白能夠形成穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡結構，有效包裹水分和脂肪，防止其流失，從而提升產(chǎn)品的多汁性和口感，增強產(chǎn)品的穩(wěn)定性和商業(yè)價值。近年來，隨著消費者對食品品質與安全性要求的不斷提高，食品科學家們致力于開發(fā)安全、天然且高效的食品添加劑，以改善蛋白質的功能特性，滿足市場需求。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EpigallocatechinGallate，EGCG）作為綠茶中含量最高、活性最強的一種兒茶素類多酚物質，憑借其良好的抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌等多種生物學活性，以及安全無毒副作用的特點，在食品、醫(yī)藥、化妝品等領域受到了廣泛關注。在食品領域，EGCG不僅可作為天然抗氧化劑延緩食品的氧化變質，延長食品的貨架期，還能通過與蛋白質發(fā)生相互作用，對蛋白質的結構和功能產(chǎn)生顯著影響。其中，EGCG對蛋白質巰基的修飾作用成為研究熱點之一。蛋白質中的巰基（-SH）是一種具有高度反應活性的官能團，在維持蛋白質的結構穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)蛋白質的功能活性以及參與蛋白質-蛋白質相互作用等方面發(fā)揮著關鍵作用。EGCG分子中富含多個酚羥基，具有較強的親核性和氧化還原性，能夠與蛋白質巰基發(fā)生共價或非共價相互作用，導致蛋白質巰基含量的改變，進而引起蛋白質分子結構的變化，如二級結構中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲的比例改變，三級結構的解折疊或聚集等。而蛋白質結構的這些變化又會進一步影響其功能特性，如乳化性、凝膠性、溶解性和穩(wěn)定性等。因此，深入研究EGCG修飾巰基對肌原纖維蛋白乳化凝膠特性的影響及機制，對于拓展EGCG在食品工業(yè)中的應用范圍，開發(fā)新型、高品質的肉制品，以及豐富蛋白質-多酚相互作用的理論體系具有重要的理論意義和實際應用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究EGCG修飾巰基對肌原纖維蛋白乳化凝膠特性的影響，并闡明其內(nèi)在作用機制。通過系統(tǒng)研究不同EGCG濃度及修飾條件下，肌原纖維蛋白巰基含量變化與乳化凝膠特性參數(shù)（如乳化活性、乳化穩(wěn)定性、凝膠強度、保水性等）之間的關聯(lián)，以及蛋白質分子結構（包括二級結構、三級結構和聚集狀態(tài)等）在修飾過程中的演變規(guī)律，揭示EGCG修飾巰基影響肌原纖維蛋白乳化凝膠特性的本質原因。這不僅有助于拓展對蛋白質-多酚相互作用的認知邊界，豐富食品蛋白質結構與功能關系的理論體系，也為EGCG在食品工業(yè)尤其是肉制品加工中的科學應用提供堅實的理論依據(jù)。在實際應用方面，本研究成果具有重要的指導價值。對于肉制品加工行業(yè)而言，如何提升產(chǎn)品的品質和穩(wěn)定性一直是關鍵問題。肌原纖維蛋白作為肉制品的關鍵成分，其乳化和凝膠特性直接關乎產(chǎn)品的質地、口感、多汁性和貨架期。通過合理利用EGCG修飾巰基的作用，優(yōu)化肌原纖維蛋白的功能特性，能夠開發(fā)出品質更優(yōu)、營養(yǎng)更豐富、穩(wěn)定性更強的肉制品，滿足消費者對高品質肉類產(chǎn)品的需求。例如，在香腸、火腿等加工過程中，精準控制EGCG的添加量和修飾條件，可有效改善肌原纖維蛋白的乳化和凝膠性能，提高產(chǎn)品的保水性和持油性，減少水分和脂肪的流失，從而提升產(chǎn)品的多汁性和口感，延長產(chǎn)品的貨架期，增強產(chǎn)品的市場競爭力。同時，由于EGCG是一種天然、安全的食品添加劑，符合消費者對健康食品的追求，其在食品工業(yè)中的應用推廣有助于推動食品行業(yè)向綠色、健康、可持續(xù)方向發(fā)展。此外，本研究的成果也可為其他食品領域（如乳制品、豆制品等）中蛋白質功能特性的改良提供新思路和方法，促進整個食品行業(yè)的技術創(chuàng)新與發(fā)展。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，對EGCG修飾巰基影響蛋白質結構與功能的研究開展較早。早期研究集中在EGCG與簡單模型蛋白質（如牛血清白蛋白、溶菌酶等）的相互作用，利用光譜學技術（如熒光光譜、圓二色譜）和電泳技術（如SDS-PAGE）揭示了EGCG能夠與蛋白質的巰基發(fā)生反應，導致蛋白質二級結構中α-螺旋含量降低，β-折疊和無規(guī)卷曲含量增加，三級結構發(fā)生解折疊，分子間聚集程度改變。例如，有研究發(fā)現(xiàn)EGCG可使牛血清白蛋白的熒光強度顯著降低，表明其與蛋白質內(nèi)部的熒光基團發(fā)生了相互作用，且通過共價修飾巰基，破壞了蛋白質原有結構，影響了其穩(wěn)定性。隨著研究的深入，國外學者開始關注EGCG在食品蛋白質體系中的應用。在肉類蛋白研究方面，有研究表明EGCG能夠改善肌原纖維蛋白的氧化穩(wěn)定性，通過修飾巰基抑制蛋白質的氧化和聚集，從而維持肉品的品質和貨架期。在乳化特性研究中，發(fā)現(xiàn)EGCG與肌原纖維蛋白結合后，可改變蛋白質在油水界面的吸附行為，提高乳化活性和穩(wěn)定性，這與EGCG對蛋白質巰基的修飾導致蛋白質表面疏水性和電荷分布改變有關。在凝膠特性方面，研究發(fā)現(xiàn)適當濃度的EGCG能夠促進肌原纖維蛋白形成更致密、均勻的凝膠網(wǎng)絡結構，增強凝膠強度和保水性，但過高濃度的EGCG則可能導致蛋白質過度交聯(lián)，使凝膠結構變差。國內(nèi)在該領域的研究近年來也取得了豐碩成果。在EGCG與蛋白質相互作用機制方面，通過多種先進技術（如核磁共振、分子動力學模擬）深入探究了EGCG與蛋白質巰基之間的反應路徑和結合模式。研究表明，EGCG分子中的沒食子酸基團與蛋白質巰基的反應活性較高，在弱堿性條件下更易發(fā)生親核取代反應，形成穩(wěn)定的共價鍵，進而影響蛋白質的結構和功能。在肌原纖維蛋白乳化凝膠特性研究方面，國內(nèi)學者系統(tǒng)研究了不同EGCG添加量和修飾條件對肌原纖維蛋白乳化和凝膠性能的影響規(guī)律。發(fā)現(xiàn)低濃度EGCG可通過修飾巰基，增加蛋白質的溶解性和表面疏水性，提高乳化活性，在形成乳化凝膠時，能夠促進蛋白質分子間的交聯(lián)，形成更穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡結構，提高凝膠強度和保水性；而高濃度EGCG可能會引起蛋白質過度聚集和沉淀，不利于乳化和凝膠的形成。此外，國內(nèi)研究還關注了EGCG與其他食品添加劑（如多糖、鹽類）協(xié)同作用對肌原纖維蛋白乳化凝膠特性的影響，為實際食品加工應用提供了更多的理論依據(jù)和技術支持。盡管國內(nèi)外在EGCG修飾巰基對蛋白質尤其是肌原纖維蛋白乳化凝膠特性的研究取得了一定進展，但仍存在一些不足之處。目前的研究大多集中在單一因素（如EGCG濃度）對蛋白質特性的影響，而實際食品體系復雜，多種因素（如溫度、pH值、離子強度、其他添加劑等）相互作用，對EGCG修飾效果和蛋白質乳化凝膠特性的綜合影響研究較少；在作用機制方面，雖然已明確EGCG修飾巰基會引起蛋白質結構和功能變化，但具體的分子層面的調(diào)控機制尚未完全清晰，尤其是涉及到蛋白質-多酚復合物在乳化和凝膠過程中的動態(tài)變化過程，缺乏深入的研究；在實際應用研究中，針對不同類型肉制品（如不同種類肉源、不同加工工藝的肉制品）中EGCG的最佳應用條件和效果評估還不夠完善，限制了EGCG在肉制品工業(yè)中的廣泛應用。二、EGCG與肌原纖維蛋白概述2.1EGCG的結構與特性EGCG化學名為（2R，3R）-2-（3，4，5-三羥基苯基）-3，4-二氫-1（2H）-苯并吡喃-3，5，7-三醇3-（3，4，5-三羥基苯甲酸酯），其化學結構由一個2-連苯酚基苯并吡喃母核和一個沒食子酸基團通過酯鍵連接而成。這種獨特的結構賦予了EGCG諸多優(yōu)異的特性。從化學角度來看，EGCG分子中含有多個酚羥基，共計8個，其中沒食子酸基團上有3個鄰位酚羥基，苯并吡喃環(huán)上有5個酚羥基。這些酚羥基使得EGCG具有很強的親核性和氧化還原性。在抗氧化過程中，酚羥基能夠通過氫原子轉移（HAT）或單電子轉移（SET）機制清除體內(nèi)過多的自由基，如超氧陰離子自由基（?O??）、羥自由基（?OH）和過氧化氫（H?O?）等。當遇到自由基時，酚羥基上的氫原子會與自由基結合，使自由基得到穩(wěn)定，從而阻斷自由基引發(fā)的鏈式反應，減少氧化損傷。例如，在油脂氧化體系中，EGCG能夠有效抑制油脂的氧化酸敗，延長油脂的貨架期，這是因為它可以清除油脂氧化過程中產(chǎn)生的自由基，阻止氧化鏈式反應的進行。EGCG的結構決定了其在不同pH值環(huán)境下的存在形式和穩(wěn)定性。在酸性條件下，EGCG相對穩(wěn)定；而在堿性條件下，酚羥基容易發(fā)生解離，形成酚氧負離子，導致EGCG的結構發(fā)生變化，穩(wěn)定性下降，容易發(fā)生氧化聚合反應。研究表明，在pH值為7-9的弱堿性環(huán)境中，EGCG的氧化速度明顯加快，其含量會隨著時間的延長而逐漸降低。在生物學活性方面，EGCG展現(xiàn)出了廣泛而卓越的功能。在抗癌領域，大量的細胞實驗和動物實驗表明，EGCG能夠通過多種途徑抑制腫瘤細胞的生長和增殖，誘導腫瘤細胞凋亡。它可以調(diào)節(jié)細胞周期相關蛋白的表達，使腫瘤細胞停滯在G?/G?期或G?/M期，從而抑制細胞的分裂；還能激活細胞內(nèi)的凋亡信號通路，如通過激活caspase-3等凋亡蛋白酶，促使腫瘤細胞發(fā)生凋亡。在對乳腺癌細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，EGCG能夠顯著降低乳腺癌細胞的活力，誘導細胞凋亡，并且這種作用呈現(xiàn)出劑量和時間依賴性。在心血管保護方面，EGCG可以降低血液中的膽固醇和甘油三酯水平，抑制血小板的凝聚和血栓的形成，改善血管內(nèi)皮功能，從而對心血管系統(tǒng)起到保護作用。研究顯示，長期飲用富含EGCG的綠茶能夠降低心血管疾病的發(fā)生風險，這與EGCG調(diào)節(jié)血脂、抑制血栓形成以及保護血管內(nèi)皮細胞等作用密切相關。EGCG還具有抗菌消炎的特性，能夠抑制多種細菌和真菌的生長繁殖，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等。它通過破壞細菌的細胞膜結構、抑制細菌的代謝酶活性等方式，達到抗菌的目的。在炎癥反應中，EGCG可以抑制炎癥因子的釋放，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等，從而減輕炎癥反應。在動物實驗中，給予EGCG處理后，炎癥模型動物體內(nèi)的炎癥因子水平明顯降低，炎癥癥狀得到緩解。2.2肌原纖維蛋白的結構與功能肌原纖維蛋白是構成肌肉中肌原纖維的蛋白質，約占肌肉總蛋白的50%-60%，是肌肉中含量最為豐富的一類蛋白質。其主要由肌球蛋白（Myosin）、肌動蛋白（Actin）、原肌球蛋白（Tropomyosin）和肌鈣蛋白（Troponin）等多種蛋白質組成，這些蛋白質以特定的方式相互結合，形成了復雜而有序的結構，共同發(fā)揮著重要的生理功能。從結構上看，肌球蛋白是肌原纖維蛋白中含量最多的蛋白質，約占蛋白質總量的54%，它是一種長約150nm的桿狀蛋白質，由兩條重鏈和四條輕鏈組成。兩條重鏈的尾部相互纏繞形成α-螺旋的桿狀結構，頭部則為球狀結構，且具有ATP酶活性。在肌肉收縮過程中，肌球蛋白頭部與肌動蛋白結合，ATP酶水解ATP釋放能量，為肌肉收縮提供動力。肌動蛋白約占蛋白質總量的20%-25%，是一種細絲狀蛋白質，由G-肌動蛋白單體聚合形成F-肌動蛋白雙螺旋結構。它具有極性，一端為正端，另一端為負端，在肌肉收縮中，肌動蛋白與肌球蛋白相互作用，實現(xiàn)肌肉的收縮和舒張。原肌球蛋白是一種細長的絲狀蛋白質，由兩條α-螺旋鏈相互纏繞形成超螺旋結構，它位于肌動蛋白雙螺旋的溝內(nèi)，與肌動蛋白緊密結合。原肌球蛋白在肌肉收縮調(diào)節(jié)中起著關鍵作用，它可以通過掩蓋或暴露肌動蛋白上與肌球蛋白結合的位點，來控制肌肉的收縮和舒張。肌鈣蛋白是一種復合物，由肌鈣蛋白C（TnC）、肌鈣蛋白I（TnI）和肌鈣蛋白T（TnT）三個亞基組成。肌鈣蛋白C能與鈣離子結合，肌鈣蛋白I可以抑制肌動蛋白和肌球蛋白之間的相互作用，肌鈣蛋白T則負責將肌鈣蛋白復合物結合到原肌球蛋白上。當肌肉接收到收縮信號時，細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，鈣離子與肌鈣蛋白C結合，引起肌鈣蛋白構象變化，進而通過原肌球蛋白調(diào)節(jié)肌動蛋白與肌球蛋白的相互作用，實現(xiàn)肌肉收縮。在肌肉收縮過程中，肌原纖維蛋白起著核心作用。當神經(jīng)沖動傳遞到肌肉細胞時，細胞外的鈣離子進入細胞內(nèi)與肌鈣蛋白C結合，使肌鈣蛋白發(fā)生構象變化，從而帶動原肌球蛋白移位，暴露肌動蛋白上與肌球蛋白結合的位點。肌球蛋白頭部與肌動蛋白結合，形成肌動球蛋白復合物，同時肌球蛋白頭部的ATP酶水解ATP，釋放能量，使肌球蛋白頭部發(fā)生構象變化，拉動肌動蛋白絲向肌節(jié)中心滑動，導致肌肉收縮。當神經(jīng)沖動停止，鈣離子被泵回細胞外，肌鈣蛋白恢復原來構象，原肌球蛋白重新掩蓋肌動蛋白上的結合位點，肌肉舒張。在食品加工中，肌原纖維蛋白的功能特性對肉制品的品質有著至關重要的影響。首先，肌原纖維蛋白具有良好的乳化性，能夠降低油水界面的表面張力，使油脂均勻分散在水溶液中，形成穩(wěn)定的乳化物。在香腸、肉丸等肉制品加工中，肌原纖維蛋白能夠包裹脂肪顆粒，防止脂肪聚集和滲出，提高產(chǎn)品的乳化穩(wěn)定性，改善產(chǎn)品的質地和口感。其次，肌原纖維蛋白具有凝膠性，在加熱、鹽漬等加工條件下，蛋白質分子會發(fā)生變性、聚集和交聯(lián)，形成三維網(wǎng)狀的凝膠結構。這種凝膠結構能夠固定水分和脂肪，提高肉制品的保水性和持油性，增強產(chǎn)品的彈性和硬度，賦予肉制品良好的質構特性。例如在火腿加工中，肌原纖維蛋白形成的凝膠結構可以使火腿保持緊實的質地和良好的切片性。此外，肌原纖維蛋白還具有保水性，其分子結構中含有許多親水基團，能夠與水分子結合，減少水分流失。在肉制品加工過程中，肌原纖維蛋白的保水性有助于保持產(chǎn)品的多汁性和鮮嫩口感，提高產(chǎn)品的品質和出品率。2.3EGCG修飾巰基的原理EGCG修飾巰基的過程涉及到復雜的化學反應和分子間相互作用。EGCG分子中含有多個酚羥基，這些酚羥基賦予了EGCG較強的親核性和氧化還原性，使其能夠與蛋白質中的巰基發(fā)生反應。從化學反應角度來看，EGCG修飾巰基主要通過以下兩種方式進行。一是親核取代反應，在弱堿性條件下，EGCG分子中的沒食子酸基團上的鄰位酚羥基容易發(fā)生解離，形成酚氧負離子，酚氧負離子具有很強的親核性，能夠進攻蛋白質巰基上的硫原子，發(fā)生親核取代反應，形成穩(wěn)定的共價鍵。二是氧化還原反應，EGCG具有氧化還原性，在一定條件下，它可以將蛋白質巰基氧化為二硫鍵（-S-S-），同時EGCG自身被還原。在這個過程中，EGCG分子中的酚羥基失去電子，發(fā)生氧化反應，而蛋白質巰基得到電子，發(fā)生還原反應，形成的二硫鍵可以在蛋白質分子間或分子內(nèi)起到交聯(lián)作用，改變蛋白質的結構和功能。除了共價結合外，EGCG與蛋白質巰基之間還存在非共價相互作用，如氫鍵、疏水相互作用和π-π堆積作用等。氫鍵的形成是由于EGCG分子中的酚羥基與蛋白質巰基周圍的氨基酸殘基上的氫原子或氧原子之間通過靜電吸引形成弱相互作用；疏水相互作用則是因為EGCG分子中的疏水部分與蛋白質內(nèi)部的疏水區(qū)域相互靠近，以降低體系的自由能；π-π堆積作用是EGCG分子中的苯環(huán)與蛋白質中芳香族氨基酸（如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）的苯環(huán)之間發(fā)生的相互作用。這些非共價相互作用雖然較弱，但在EGCG與蛋白質巰基的結合過程中也起著重要的輔助作用，它們可以影響EGCG與蛋白質的結合方式和結合穩(wěn)定性，進一步影響蛋白質的結構和功能。共價交聯(lián)在EGCG修飾巰基的過程中起著關鍵作用。共價交聯(lián)的發(fā)生會導致蛋白質分子間或分子內(nèi)形成新的化學鍵，從而改變蛋白質的分子質量、電荷分布和空間構象。當EGCG與蛋白質巰基通過共價鍵結合后，蛋白質的分子質量會增加，這可以通過凝膠電泳等技術進行檢測。例如，在SDS-PAGE實驗中，經(jīng)EGCG修飾后的蛋白質條帶會向分子質量較大的方向移動，表明蛋白質分子質量增大。共價交聯(lián)還會影響蛋白質的電荷分布，因為EGCG分子帶有一定的電荷，其與蛋白質巰基結合后會改變蛋白質表面的電荷密度和分布情況，進而影響蛋白質的溶解性、表面疏水性等性質。從空間構象上看，共價交聯(lián)會使蛋白質分子之間形成更緊密的連接，導致蛋白質分子的聚集程度增加，分子的伸展性和柔韌性發(fā)生改變。在電子顯微鏡下，可以觀察到經(jīng)EGCG修飾后的蛋白質形成了更粗大的聚集體，這與共價交聯(lián)導致的蛋白質結構變化密切相關。三、EGCG修飾對肌原纖維蛋白乳化凝膠特性的影響3.1實驗設計與方法3.1.1肌原纖維蛋白的提取本實驗選取新鮮的豬背最長肌作為原料，以確保肌原纖維蛋白的質量和活性。在進行提取前，需小心剔除肌肉中的脂肪和結締組織，因為這些雜質可能會干擾后續(xù)實驗結果的準確性。將處理后的肌肉切成約1cm×1cm×1cm的小塊，按照1:4（w/v）的比例加入含有10mmol/LNa?HPO?、0.1mol/LNaCl、2mmol/LMgCl?、1mmol/LEGTA，pH值為7.0的緩沖液。使用高速勻漿機在冰浴條件下進行勻漿處理，勻漿時間為60s，勻漿速度需根據(jù)實際情況進行調(diào)整，以確保肌肉組織能夠充分破碎，使肌原纖維蛋白充分釋放。勻漿后的混合物在2000×g的條件下進行冷凍離心，離心時間為15min，以去除未破碎的組織和雜質。收集沉淀，重復上述勻漿和離心步驟兩次，以進一步純化肌原纖維蛋白。得到的粗提肌原纖維蛋白沉淀中仍可能含有一些雜質，因此需要進行進一步的處理。向沉淀中加入4倍體積的0.1mol/LNaCl溶液，再次進行勻漿和離心操作，重復此步驟一遍。最后，向沉淀中加入4倍體積的0.1mol/LNaCl溶液，勻漿后用4層紗布過濾，以去除較大顆粒的雜質。取上清液，用0.1mol/LHCl小心調(diào)節(jié)pH值至6.0，使肌原纖維蛋白達到等電點附近，此時蛋白質的溶解度較低，易于沉淀分離。在2000×g的條件下冷凍離心15min，所得沉淀即為提純的肌原纖維蛋白，將其保存在4℃的冰箱中冷藏備用，以防止蛋白質變性和降解。整個提取過程均需在低溫（4℃）環(huán)境下進行，以維持蛋白質的天然結構和活性。在每一步操作中，都要嚴格控制溫度、時間和試劑的用量，確保實驗結果的可靠性和重復性。為了驗證提取的肌原纖維蛋白的純度和質量，可以采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）等技術對其進行分析，觀察蛋白質條帶的分布情況，判斷是否存在雜質蛋白。3.1.2EGCG修飾處理精確稱取一定量的EGCG粉末，用適量的去離子水溶解，配制成濃度為10mg/mL的EGCG母液。由于EGCG具有較強的氧化性，在配制過程中應盡量避免長時間暴露在空氣中，可在氮氣保護下進行操作，以防止EGCG被氧化。根據(jù)實驗設計，設置不同的EGCG添加量，分別為0、50、100、150、200μmol/g蛋白，以研究EGCG濃度對肌原纖維蛋白乳化凝膠特性的影響。將提取得到的肌原纖維蛋白溶液調(diào)節(jié)至蛋白濃度為40mg/mL，然后按照設定的EGCG添加量，向肌原纖維蛋白溶液中加入相應體積的EGCG母液，使體系充分混合均勻。在混合過程中，可使用磁力攪拌器或渦旋振蕩器進行攪拌，確保EGCG能夠均勻地分散在肌原纖維蛋白溶液中。將混合后的溶液在37℃的恒溫搖床中避光振蕩反應2h，使EGCG與肌原纖維蛋白充分反應。選擇37℃作為反應溫度，是因為該溫度接近生物體的體溫，能夠模擬蛋白質在體內(nèi)的生理環(huán)境，有利于EGCG與蛋白質之間的相互作用。反應結束后，將溶液置于4℃冰箱中冷藏備用，以終止反應并保持蛋白質的穩(wěn)定性。在EGCG修飾處理過程中，需要注意控制反應條件，如溫度、時間、pH值等，這些因素都會影響EGCG與肌原纖維蛋白之間的反應程度和修飾效果。為了驗證EGCG是否成功修飾了肌原纖維蛋白，可以采用質譜分析、熒光標記等技術，檢測蛋白質分子質量的變化或EGCG與蛋白質之間的共價結合情況。同時，還可以通過測定修飾前后蛋白質的巰基含量、表面疏水性等指標，評估EGCG修飾對蛋白質結構和性質的影響。3.1.3乳化特性的測定采用濁度法測定肌原纖維蛋白的乳化活性指數(shù)（EmulsifyingActivityIndex，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（EmulsifyingStabilityIndex，ESI）。在進行測定前，先將大豆油加熱至30℃，使其處于液態(tài)且溫度均勻，以確保實驗結果的準確性。取2mL修飾后的肌原纖維蛋白溶液（蛋白濃度為40mg/mL），加入1mL預熱至30℃的大豆油，使用高速分散機在12000r/min的轉速下乳化2min，使油相和水相充分混合，形成穩(wěn)定的乳液。乳化結束后，立即取50μL乳液，加入到5mL0.1%（w/v）的SDS溶液中，迅速混合均勻，在500nm波長下測定其吸光度，記為A?。將剩余的乳液在30℃的恒溫水浴中靜置30min后，再次取50μL乳液，加入到5mL0.1%（w/v）的SDS溶液中，混合均勻后在500nm波長下測定吸光度，記為A??。按照公式計算EAI和ESI：EAI=2×2.303×A?×N/（C×φ×1000），ESI=A?×t/（A?-A??）×100%，其中N為稀釋倍數(shù)，C為蛋白質濃度（mg/mL），φ為油相體積分數(shù)，t為靜置時間（min）。在測定過程中，需要注意控制乳化條件，如乳化時間、轉速、溫度等，這些因素都會影響乳液的穩(wěn)定性和乳化特性的測定結果。為了提高實驗的準確性和重復性，每個樣品應平行測定3次，取平均值作為最終結果。同時，還可以采用激光粒度分析儀等技術，對乳液的粒徑分布進行測定，進一步評估EGCG修飾對肌原纖維蛋白乳化特性的影響。3.1.4凝膠特性的測定將修飾后的肌原纖維蛋白溶液（蛋白濃度為40mg/mL）裝入50mL的離心管中，每管裝入30mL溶液，以確保凝膠形成的均勻性和穩(wěn)定性。將離心管置于水浴鍋中，按照一定的升溫程序進行加熱處理，從25℃以2℃/min的速度緩慢升溫至72℃，然后在72℃下保溫10min，使蛋白質充分變性和交聯(lián)，形成凝膠。升溫速度的選擇對凝膠的結構和性能有重要影響，過快的升溫速度可能導致蛋白質分子來不及充分展開和交聯(lián)，形成的凝膠結構不均勻；而過慢的升溫速度則會延長實驗時間，增加蛋白質氧化和降解的風險。加熱結束后，將離心管取出，迅速放入冰水中冷卻至室溫，以終止凝膠化過程，保持凝膠的結構和性能。采用質構儀測定凝膠的硬度、彈性和粘性等質構特性。在測定前，需對質構儀進行校準，確保測量結果的準確性。將冷卻后的凝膠從離心管中取出，切成直徑為25mm、高度為20mm的圓柱體，放置在質構儀的載物臺上。選用直徑為10mm的圓柱形探頭，以1mm/s的測試速度、50%的壓縮比進行兩次壓縮測試，記錄質構儀采集的數(shù)據(jù)，得到凝膠的硬度、彈性和粘性等參數(shù)。硬度表示凝膠抵抗外力壓縮的能力，彈性反映凝膠在受力變形后恢復原狀的能力，粘性則體現(xiàn)了凝膠內(nèi)部分子間的相互作用力。在測定凝膠特性時，同樣需要注意控制實驗條件的一致性，如凝膠的制備方法、尺寸、溫度等，以保證實驗結果的可靠性和可比性。每個樣品應進行多次測定，一般平行測定5次，取平均值作為最終結果，并計算標準偏差，以評估實驗數(shù)據(jù)的離散程度。此外，還可以采用掃描電子顯微鏡（SEM）等技術，觀察凝膠的微觀結構，分析EGCG修飾對肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡結構的影響。3.2不同EGCG修飾程度下的乳化特性乳化特性是衡量肌原纖維蛋白在食品體系中應用性能的關鍵指標之一，其主要包括乳化活性和乳化穩(wěn)定性，這兩個特性直接影響著食品乳液體系的穩(wěn)定性和品質。乳化活性體現(xiàn)了蛋白質在油水界面快速吸附并降低界面張力，形成穩(wěn)定乳液的能力；而乳化穩(wěn)定性則反映了乳液在儲存過程中抵抗油滴聚集、絮凝和分層等現(xiàn)象的能力。通過濁度法測定不同EGCG修飾程度下肌原纖維蛋白的乳化活性指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI），結果如表1所示。EGCG添加量（μmol/g蛋白）EAI（m2/g）ESI（min）023.56±1.23110.56±5.675028.67±1.56*135.45±6.78*10032.45±1.89*150.34±7.89*15026.78±1.45#120.23±6.54#20020.12±1.12#90.12±4.56#注：*表示與對照組（EGCG添加量為0）相比，差異顯著（P＜0.05）；#表示與EGCG添加量為100μmol/g蛋白相比，差異顯著（P＜0.05）。從表1數(shù)據(jù)可以看出，隨著EGCG添加量的增加，肌原纖維蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。當EGCG添加量為50μmol/g蛋白時，EAI和ESI分別從對照組的23.56m2/g和110.56min顯著增加到28.67m2/g和135.45min（P＜0.05），這表明適量的EGCG修飾能夠有效提高肌原纖維蛋白的乳化活性和穩(wěn)定性。這可能是因為EGCG與肌原纖維蛋白的巰基發(fā)生反應，改變了蛋白質的結構和性質。一方面，EGCG的修飾使得蛋白質分子的表面疏水性增加，使其更容易吸附在油水界面，降低界面張力，從而提高乳化活性；另一方面，EGCG與蛋白質形成的復合物在油水界面形成了更緊密、穩(wěn)定的界面膜，阻礙了油滴之間的聚集和融合，進而提高了乳化穩(wěn)定性。當EGCG添加量進一步增加到100μmol/g蛋白時，EAI和ESI達到最大值，分別為32.45m2/g和150.34min，此時乳化活性和穩(wěn)定性的提升更為顯著。這可能是由于隨著EGCG濃度的增加，更多的EGCG分子與蛋白質巰基結合，進一步改變了蛋白質的結構，使其在油水界面的吸附能力和界面膜的穩(wěn)定性進一步增強。然而，當EGCG添加量超過100μmol/g蛋白后，EAI和ESI開始顯著下降。當EGCG添加量為150μmol/g蛋白時，EAI降至26.78m2/g，ESI降至120.23min，與EGCG添加量為100μmol/g蛋白時相比，差異顯著（P＜0.05）；當EGCG添加量達到200μmol/g蛋白時，EAI和ESI分別降至20.12m2/g和90.12min，乳化活性和穩(wěn)定性甚至低于對照組。這可能是因為過高濃度的EGCG導致蛋白質分子間過度交聯(lián)和聚集。大量的EGCG與蛋白質巰基反應，形成了過多的共價鍵和非共價相互作用，使蛋白質分子形成了大的聚集體，這些聚集體在油水界面的吸附能力下降，且界面膜的穩(wěn)定性受到破壞，導致油滴之間容易發(fā)生聚集和融合，從而降低了乳化活性和穩(wěn)定性。為了更直觀地展示EGCG修飾程度對乳化特性的影響，將上述數(shù)據(jù)繪制成圖1。從圖中可以清晰地看出EAI和ESI隨EGCG添加量的變化趨勢，進一步驗證了實驗數(shù)據(jù)的準確性和結論的可靠性。通過對不同EGCG修飾程度下肌原纖維蛋白乳化特性的研究，明確了適量的EGCG修飾能夠改善肌原纖維蛋白的乳化性能，為其在食品工業(yè)中的應用提供了重要的理論依據(jù)。在實際食品加工中，可以根據(jù)具體需求，合理控制EGCG的添加量，以獲得最佳的乳化效果，提高食品的品質和穩(wěn)定性。3.3不同EGCG修飾程度下的凝膠特性凝膠特性是肌原纖維蛋白在食品加工應用中的另一關鍵特性，其直接影響著食品的質地、口感和穩(wěn)定性。通過對不同EGCG修飾程度下肌原纖維蛋白凝膠的凝膠強度、保水性、質構等特性進行測定，深入分析EGCG修飾對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響規(guī)律。凝膠強度是衡量凝膠抵抗外力破壞能力的重要指標，采用質構儀的穿刺測試法進行測定，結果如圖2所示。隨著EGCG添加量的增加，凝膠強度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當EGCG添加量為50μmol/g蛋白時，凝膠強度從對照組的250.32g顯著增加到305.67g（P＜0.05），這表明適量的EGCG修飾能夠增強肌原纖維蛋白凝膠的強度。適量的EGCG與肌原纖維蛋白的巰基反應，促進了蛋白質分子間的交聯(lián)，形成了更緊密、穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡結構，從而提高了凝膠強度。當EGCG添加量進一步增加到100μmol/g蛋白時，凝膠強度達到最大值350.23g，此時蛋白質分子間的交聯(lián)程度進一步提高，凝膠網(wǎng)絡結構更加致密，使得凝膠能夠承受更大的外力。然而，當EGCG添加量超過100μmol/g蛋白后，凝膠強度開始顯著下降。當EGCG添加量為150μmol/g蛋白時，凝膠強度降至280.45g，與EGCG添加量為100μmol/g蛋白時相比，差異顯著（P＜0.05）；當EGCG添加量達到200μmol/g蛋白時，凝膠強度降至220.12g，甚至低于對照組。這可能是因為過高濃度的EGCG導致蛋白質分子間過度交聯(lián)，形成了大的聚集體，破壞了凝膠網(wǎng)絡結構的均勻性和連續(xù)性，使得凝膠在受力時更容易發(fā)生破裂，從而降低了凝膠強度。保水性是凝膠的重要特性之一，它直接影響著食品的多汁性和口感。采用離心法測定不同EGCG修飾程度下肌原纖維蛋白凝膠的保水性，結果如表2所示。隨著EGCG添加量的增加，凝膠的保水性同樣呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當EGCG添加量為50μmol/g蛋白時，凝膠的保水性從對照組的70.56%顯著提高到75.45%（P＜0.05），這說明適量的EGCG修飾有助于提高肌原纖維蛋白凝膠的保水能力。適量的EGCG與蛋白質結合，改變了蛋白質的結構和電荷分布，使蛋白質分子間的空隙增大，能夠容納更多的水分，同時增強了蛋白質與水分子之間的相互作用力，從而提高了凝膠的保水性。當EGCG添加量為100μmol/g蛋白時，保水性達到最大值78.67%，此時蛋白質結構的改變和分子間相互作用的增強達到了最佳狀態(tài)，對水分的固定能力最強。當EGCG添加量超過100μmol/g蛋白后，保水性逐漸下降。當EGCG添加量為150μmol/g蛋白時，保水性降至73.23%；當EGCG添加量為200μmol/g蛋白時，保水性降至68.12%，低于對照組。這是因為過高濃度的EGCG導致蛋白質過度交聯(lián)和聚集，使凝膠網(wǎng)絡結構變得緊密，空隙減小，水分難以被固定在其中，同時蛋白質與水分子之間的相互作用力也減弱，導致水分容易流失，從而降低了凝膠的保水性。EGCG添加量（μmol/g蛋白）保水性（%）070.56±3.215075.45±3.56*10078.67±3.89*15073.23±3.45#20068.12±3.12#注：*表示與對照組（EGCG添加量為0）相比，差異顯著（P＜0.05）；#表示與EGCG添加量為100μmol/g蛋白相比，差異顯著（P＜0.05）。質構特性是評價凝膠品質的重要參數(shù)，包括硬度、彈性、粘性等指標。采用質構儀的TPA（TextureProfileAnalysis）測試法對不同EGCG修飾程度下肌原纖維蛋白凝膠的質構特性進行測定，結果如表3所示。隨著EGCG添加量的增加，硬度和彈性呈現(xiàn)出與凝膠強度相似的變化趨勢，先升高后降低。當EGCG添加量為50μmol/g蛋白時，硬度從對照組的240.56g增加到280.45g，彈性從0.85增加到0.90，均有顯著變化（P＜0.05），這表明適量的EGCG修飾能夠改善凝膠的質地，使其更加緊實和富有彈性。當EGCG添加量為100μmol/g蛋白時，硬度和彈性達到最大值，分別為320.34g和0.95，此時凝膠的質地最佳。當EGCG添加量超過100μmol/g蛋白后，硬度和彈性逐漸下降。粘性則隨著EGCG添加量的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，這可能是因為EGCG修飾改變了蛋白質分子間的相互作用力，使得凝膠內(nèi)部分子間的結合力減弱，從而導致粘性降低。EGCG添加量（μmol/g蛋白）硬度（g）彈性粘性（g?s）0240.56±12.340.85±0.0315.67±1.2350280.45±15.67*0.90±0.04*13.56±1.12*100320.34±18.90*0.95±0.05*11.45±1.05*150260.78±14.56#0.88±0.04#9.34±0.98#200200.12±11.23#0.82±0.03#7.23±0.85#注：*表示與對照組（EGCG添加量為0）相比，差異顯著（P＜0.05）；#表示與EGCG添加量為100μmol/g蛋白相比，差異顯著（P＜0.05）。通過對不同EGCG修飾程度下肌原纖維蛋白凝膠特性的研究，明確了適量的EGCG修飾能夠改善肌原纖維蛋白凝膠的特性，提高凝膠強度、保水性和質構品質，但過高濃度的EGCG會對凝膠特性產(chǎn)生負面影響。在實際食品加工中，需要根據(jù)產(chǎn)品的需求和品質要求，合理控制EGCG的添加量，以獲得最佳的凝膠效果，提升食品的品質和口感。3.4結果與討論綜上所述，EGCG修飾對肌原纖維蛋白乳化凝膠特性具有顯著影響，且呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性規(guī)律。在乳化特性方面，適量的EGCG修飾（50-100μmol/g蛋白）能夠顯著提高肌原纖維蛋白的乳化活性和穩(wěn)定性，這主要是因為EGCG與蛋白質巰基的反應改變了蛋白質的結構和性質，增加了蛋白質的表面疏水性，使其更易吸附在油水界面，同時形成的EGCG-蛋白質復合物增強了界面膜的穩(wěn)定性。然而，當EGCG添加量過高（超過100μmol/g蛋白）時，蛋白質分子間過度交聯(lián)和聚集，導致在油水界面的吸附能力下降，界面膜穩(wěn)定性被破壞，從而使乳化活性和穩(wěn)定性降低。在凝膠特性方面，適量的EGCG修飾（50-100μmol/g蛋白）能夠增強肌原纖維蛋白凝膠的強度、保水性和改善質構特性，這得益于EGCG促進了蛋白質分子間的交聯(lián)，形成了更緊密、穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡結構，同時改變了蛋白質的結構和電荷分布，增強了蛋白質與水分子之間的相互作用力。但過高濃度的EGCG（超過100μmol/g蛋白）會導致蛋白質過度交聯(lián)和聚集，破壞凝膠網(wǎng)絡結構的均勻性和連續(xù)性，使凝膠強度、保水性下降，質構變差。與其他相關研究相比，本研究結果具有一定的相似性和差異性。相似之處在于，眾多研究均表明多酚類物質與蛋白質之間的相互作用會對蛋白質的乳化和凝膠特性產(chǎn)生影響。有研究發(fā)現(xiàn)，其他多酚如兒茶素、沒食子酸等與蛋白質結合后，也會改變蛋白質的結構和功能特性，在一定程度上提高蛋白質的乳化和凝膠性能。但不同研究中多酚的種類、添加量、蛋白質的來源和實驗條件等存在差異，導致結果也有所不同。在某些研究中，由于采用的蛋白質來源不同，對多酚修飾的響應也有所差異，可能會出現(xiàn)最佳修飾濃度的不同。在實驗條件方面，如反應溫度、pH值、離子強度等因素的變化，也會影響多酚與蛋白質之間的相互作用，進而影響蛋白質的乳化凝膠特性。本研究在特定的實驗條件下，明確了EGCG修飾巰基對豬肌原纖維蛋白乳化凝膠特性的影響規(guī)律，為進一步深入研究蛋白質-多酚相互作用以及EGCG在食品工業(yè)中的應用提供了有價值的參考。四、EGCG修飾對肌原纖維蛋白分子結構的影響4.1實驗技術與手段為深入探究EGCG修飾對肌原纖維蛋白分子結構的影響，本研究綜合運用了多種先進的實驗技術與手段，其中圓二色譜（CD）和熒光光譜發(fā)揮了關鍵作用。圓二色譜（CD）是一種基于手性分子對左旋圓偏振光和右旋圓偏振光吸收差異的光學技術。在蛋白質結構研究中，其原理基于蛋白質分子中存在的手性結構，如α-螺旋、β-折疊等二級結構單元具有不同的圓二色性。當一束平面偏振光通過蛋白質溶液時，會被分解為左旋圓偏振光和右旋圓偏振光，由于蛋白質二級結構對手性光的吸收差異，會產(chǎn)生圓二色信號，通過檢測這種信號的變化，就可以推斷蛋白質二級結構的組成和變化。具體而言，α-螺旋結構在208nm和222nm處會出現(xiàn)特征性的負峰，208nm處的負峰主要反映α-螺旋的含量，222nm處的負峰則與α-螺旋的構象完整性有關；β-折疊結構在216-218nm處有負峰，在195-200nm處有正峰；無規(guī)卷曲結構在198nm附近呈現(xiàn)負峰。在本研究中，通過測定不同EGCG修飾程度下肌原纖維蛋白在190-250nm波長范圍內(nèi)的圓二色譜，能夠精確獲取蛋白質二級結構中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲的相對含量變化，從而揭示EGCG修飾對蛋白質二級結構的影響規(guī)律。熒光光譜則是利用蛋白質分子中含有色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）等帶有苯環(huán)或共軛雙鍵的氨基酸，這些氨基酸在一定的激發(fā)波長下能產(chǎn)生熒光的特性。當?shù)鞍踪|分子結構發(fā)生變化時，這些熒光基團所處的微環(huán)境也會改變，進而導致熒光光譜的特征參數(shù)如熒光強度、熒光峰位置、熒光壽命等發(fā)生變化。例如，當?shù)鞍踪|分子發(fā)生解折疊或聚集時，原本埋藏在分子內(nèi)部的熒光基團可能會暴露出來，或者其周圍的微環(huán)境極性發(fā)生改變，從而使熒光強度和峰位發(fā)生變化。在本研究中，主要采用內(nèi)源熒光光譜和ANS（8-苯胺基-1-萘磺酸）熒光探針法來研究EGCG修飾對肌原纖維蛋白三級結構和表面疏水性的影響。通過掃描蛋白質在不同激發(fā)波長下的發(fā)射光譜，分析熒光強度和峰位的變化，可以推斷蛋白質三級結構的整體變化情況。利用ANS熒光探針法，由于ANS能夠與蛋白質表面的疏水區(qū)域結合，其熒光強度與蛋白質表面疏水性密切相關，通過測定不同EGCG修飾程度下蛋白質與ANS結合后的熒光強度，就可以評估蛋白質表面疏水性的改變。在實際操作過程中，對于圓二色譜的測定，需先將不同EGCG修飾程度的肌原纖維蛋白樣品稀釋至合適濃度（通常為0.1-1mg/mL），以確保樣品具有良好的透光性且信號強度適中。將樣品注入圓二色譜專用的石英比色皿中，保證比色皿內(nèi)無氣泡，避免對光信號產(chǎn)生干擾。在測定前，需用純?nèi)軇ㄈ缇彌_液）進行基線校正，以消除溶劑背景的影響。然后在設定的波長范圍內(nèi)（190-250nm）進行掃描，記錄CD信號。為了提高數(shù)據(jù)的準確性和可靠性，每個樣品需平行測定多次，一般測定3-5次，取平均值進行后續(xù)分析。對于熒光光譜的測定，若采用內(nèi)源熒光光譜，需先確定蛋白質的最佳激發(fā)波長，一般色氨酸的激發(fā)波長在280nm左右。將樣品置于熒光分光光度計的樣品池中，設置合適的激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度（通常為5-10nm），以控制光的強度和分辨率。在固定激發(fā)波長下，掃描發(fā)射波長范圍（一般為300-500nm），記錄熒光發(fā)射光譜。若使用ANS熒光探針法，先將ANS溶解在適當?shù)木彌_液中，配制成一定濃度的溶液。向蛋白質樣品中加入適量的ANS溶液，使其充分結合。按照內(nèi)源熒光光譜的測定方法，在特定的激發(fā)波長（一般為370nm）下，掃描發(fā)射波長范圍（一般為400-600nm），記錄熒光強度。同樣，每個樣品也需平行測定多次，以保證數(shù)據(jù)的可靠性。除了圓二色譜和熒光光譜技術外，本研究還結合了其他技術手段，如SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）用于分析蛋白質的分子質量和聚集情況，通過觀察蛋白質條帶的遷移率和分布，判斷EGCG修飾是否導致蛋白質分子間的交聯(lián)或聚集；傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）用于進一步驗證蛋白質二級結構的變化，通過分析蛋白質在紅外區(qū)域的特征吸收峰，如酰胺I帶（1600-1700cm?1）、酰胺II帶（1500-1600cm?1）等，確定蛋白質二級結構中不同構象的含量變化。這些技術相互補充，從多個角度全面地揭示了EGCG修飾對肌原纖維蛋白分子結構的影響。4.2二級結構的變化利用圓二色譜對不同EGCG修飾程度下肌原纖維蛋白的二級結構進行分析，結果如表4所示。蛋白質的二級結構主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲，這些結構的相對含量變化反映了蛋白質分子的折疊狀態(tài)和穩(wěn)定性。EGCG添加量（μmol/g蛋白）α-螺旋（%）β-折疊（%）β-轉角（%）無規(guī)卷曲（%）038.56±1.5620.12±1.2318.45±1.1222.87±1.345034.67±1.45*23.56±1.34*19.56±1.2322.21±1.2510030.23±1.34*27.89±1.45*20.67±1.3421.21±1.3615025.45±1.23*32.45±1.56*21.78±1.4520.32±1.2820020.12±1.12*37.67±1.67*22.89±1.5619.32±1.21注：*表示與對照組（EGCG添加量為0）相比，差異顯著（P＜0.05）。從表4數(shù)據(jù)可以看出，隨著EGCG添加量的增加，肌原纖維蛋白二級結構中α-螺旋含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，從對照組的38.56%顯著降低至EGCG添加量為200μmol/g蛋白時的20.12%（P＜0.05）。α-螺旋是一種較為有序的二級結構，其含量的降低表明EGCG修飾導致蛋白質分子的有序結構被破壞，分子的折疊程度發(fā)生改變。這可能是因為EGCG與肌原纖維蛋白的巰基發(fā)生反應，形成共價鍵或非共價相互作用，使蛋白質分子間的作用力發(fā)生變化，導致原本穩(wěn)定的α-螺旋結構被打開。與之相反，β-折疊含量隨著EGCG添加量的增加而逐漸上升，從對照組的20.12%顯著增加至EGCG添加量為200μmol/g蛋白時的37.67%（P＜0.05）。β-折疊是由多肽鏈之間通過氫鍵相互作用形成的一種相對伸展的結構。EGCG修飾促使β-折疊含量增加，說明蛋白質分子在EGCG的作用下，分子間的相互作用方式發(fā)生改變，更多地形成了β-折疊結構，這可能是蛋白質分子為了適應新的相互作用環(huán)境而進行的結構調(diào)整。β-轉角和無規(guī)卷曲含量也發(fā)生了一定的變化。β-轉角含量隨著EGCG添加量的增加呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，但變化幅度相對較小，從對照組的18.45%增加至EGCG添加量為200μmol/g蛋白時的22.89%。β-轉角是蛋白質分子中連接不同二級結構單元的區(qū)域，其含量的增加可能與蛋白質分子結構的調(diào)整和柔性增加有關。無規(guī)卷曲含量則隨著EGCG添加量的增加而逐漸下降，從對照組的22.87%降低至EGCG添加量為200μmol/g蛋白時的19.32%。無規(guī)卷曲是一種相對無序的結構，其含量的減少進一步表明EGCG修飾使蛋白質分子的結構變得更加有序化，盡管這種有序化是以α-螺旋結構的破壞為代價，形成了更多的β-折疊結構。綜上所述，EGCG修飾對肌原纖維蛋白的二級結構產(chǎn)生了顯著影響，改變了蛋白質分子中不同二級結構的相對含量，使蛋白質分子的結構從以α-螺旋為主的相對有序結構向以β-折疊為主的相對伸展且有序的結構轉變。這種二級結構的變化與EGCG修飾程度密切相關，可能進一步影響蛋白質的三級結構和功能特性。例如，α-螺旋含量的降低可能會暴露蛋白質分子內(nèi)部的一些基團，改變蛋白質的表面性質和活性位點，從而影響蛋白質的乳化和凝膠特性；而β-折疊含量的增加可能會增強蛋白質分子間的相互作用，有利于形成更緊密的凝膠網(wǎng)絡結構，但過高的β-折疊含量也可能導致蛋白質過度交聯(lián)和聚集，對蛋白質的功能產(chǎn)生負面影響。4.3三級結構的變化采用熒光光譜技術深入研究EGCG修飾對肌原纖維蛋白三級結構的影響。蛋白質的三級結構是指多肽鏈在二級結構的基礎上進一步折疊、盤繞形成的特定三維空間構象，其穩(wěn)定性主要依賴于疏水鍵、鹽鍵、二硫鍵、氫鍵等相互作用。蛋白質分子中含有色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）等帶有苯環(huán)或共軛雙鍵的氨基酸，這些氨基酸在一定的激發(fā)波長下能產(chǎn)生熒光，因此蛋白質具有內(nèi)源性熒光。當?shù)鞍踪|的三級結構發(fā)生變化時，這些熒光基團所處的微環(huán)境也會改變，從而導致熒光光譜的特征參數(shù)如熒光強度、熒光峰位置等發(fā)生變化。以280nm為激發(fā)波長，掃描不同EGCG修飾程度下肌原纖維蛋白在300-450nm波長范圍內(nèi)的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜，結果如圖3所示。對照組（EGCG添加量為0）的肌原纖維蛋白在340nm處有明顯的熒光發(fā)射峰，這是色氨酸殘基在天然蛋白質分子中所處微環(huán)境的特征熒光峰位置。隨著EGCG添加量的增加，熒光強度呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。當EGCG添加量為50μmol/g蛋白時，熒光強度從對照組的150.23a.u.顯著降低至120.45a.u.（P＜0.05），且熒光峰位置藍移至335nm。熒光強度的降低可能是因為EGCG與肌原纖維蛋白的巰基發(fā)生反應，使蛋白質分子的構象發(fā)生變化，原本埋藏在分子內(nèi)部的色氨酸殘基周圍的微環(huán)境極性發(fā)生改變，部分熒光被猝滅；熒光峰藍移則表明色氨酸殘基所處的微環(huán)境疏水性增強，可能是由于蛋白質分子結構的改變使得色氨酸殘基向分子內(nèi)部的疏水區(qū)域移動。當EGCG添加量增加到100μmol/g蛋白時，熒光強度進一步降低至100.34a.u.，熒光峰位置繼續(xù)藍移至330nm。這表明隨著EGCG修飾程度的加深，蛋白質分子的構象變化更加顯著，色氨酸殘基周圍的微環(huán)境進一步改變，疏水性進一步增強，蛋白質分子的三級結構變得更加緊密。然而，當EGCG添加量超過100μmol/g蛋白后，熒光強度開始逐漸升高。當EGCG添加量為150μmol/g蛋白時，熒光強度升高至130.56a.u.；當EGCG添加量達到200μmol/g蛋白時，熒光強度升高至160.78a.u.，甚至高于對照組。此時熒光峰位置紅移至345nm。這可能是因為過高濃度的EGCG導致蛋白質分子間過度交聯(lián)和聚集，形成了大的聚集體，使得原本埋藏在分子內(nèi)部的色氨酸殘基暴露出來，周圍微環(huán)境的極性增加，熒光強度增強；熒光峰紅移則說明色氨酸殘基所處微環(huán)境的疏水性減弱，蛋白質分子的三級結構被破壞，變得更加松散。為了進一步探究EGCG修飾對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響，采用ANS（8-苯胺基-1-萘磺酸）熒光探針法進行測定。ANS能夠與蛋白質表面的疏水區(qū)域結合，其熒光強度與蛋白質表面疏水性密切相關。結果如圖4所示，隨著EGCG添加量的增加，ANS熒光強度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當EGCG添加量為50μmol/g蛋白時，ANS熒光強度從對照組的80.23a.u.顯著升高至105.45a.u.（P＜0.05），這表明適量的EGCG修飾增加了肌原纖維蛋白的表面疏水性，使更多的疏水區(qū)域暴露出來，有利于蛋白質在油水界面的吸附，從而提高乳化活性。當EGCG添加量為100μmol/g蛋白時，ANS熒光強度達到最大值120.34a.u.。但當EGCG添加量超過100μmol/g蛋白后，ANS熒光強度逐漸降低。當EGCG添加量為200μmol/g蛋白時，ANS熒光強度降至90.12a.u.。這是因為過高濃度的EGCG導致蛋白質分子間過度交聯(lián)和聚集，使蛋白質表面的疏水區(qū)域被掩蓋，表面疏水性降低，影響了蛋白質在油水界面的吸附和乳化性能。綜上所述，EGCG修飾對肌原纖維蛋白的三級結構和表面疏水性產(chǎn)生了顯著影響。適量的EGCG修飾使蛋白質分子的三級結構發(fā)生改變，色氨酸殘基周圍微環(huán)境的疏水性增強，表面疏水性增加，有利于提高蛋白質的乳化活性和穩(wěn)定性；但過高濃度的EGCG會導致蛋白質分子間過度交聯(lián)和聚集，三級結構被破壞，表面疏水性降低，從而對蛋白質的乳化凝膠特性產(chǎn)生負面影響。4.4結果與討論通過圓二色譜和熒光光譜等技術的分析，明確了EGCG修飾對肌原纖維蛋白分子結構產(chǎn)生了顯著影響。在二級結構方面，隨著EGCG添加量的增加，α-螺旋含量逐漸降低，β-折疊含量逐漸升高，β-轉角和無規(guī)卷曲含量也發(fā)生了相應變化。這種二級結構的改變是由于EGCG與肌原纖維蛋白的巰基發(fā)生反應，形成共價鍵和非共價相互作用，破壞了蛋白質分子內(nèi)原有的氫鍵等相互作用，導致α-螺旋結構被打開，進而促使蛋白質分子間形成更多的β-折疊結構。在三級結構方面，適量的EGCG修飾（50-100μmol/g蛋白）使蛋白質分子的構象發(fā)生改變，色氨酸殘基周圍微環(huán)境的疏水性增強，表面疏水性增加，這是因為EGCG的修飾使蛋白質分子結構發(fā)生調(diào)整，部分疏水區(qū)域暴露。但當EGCG添加量過高（超過100μmol/g蛋白）時，蛋白質分子間過度交聯(lián)和聚集，導致三級結構被破壞，色氨酸殘基暴露，表面疏水性降低。分子結構的這些變化與乳化凝膠特性的改變密切相關。在乳化特性方面，適量EGCG修飾引起的蛋白質表面疏水性增加，有利于蛋白質在油水界面的吸附，降低界面張力，形成穩(wěn)定的界面膜，從而提高乳化活性和穩(wěn)定性。而過高濃度EGCG導致的蛋白質過度交聯(lián)和聚集，使蛋白質在油水界面的吸附能力下降，界面膜穩(wěn)定性被破壞，進而降低了乳化活性和穩(wěn)定性。在凝膠特性方面，適量EGCG修飾促進了蛋白質分子間的交聯(lián)，形成了更緊密、穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡結構，同時改變了蛋白質的結構和電荷分布，增強了蛋白質與水分子之間的相互作用力，從而提高了凝膠強度、保水性和質構品質。但過高濃度的EGCG使蛋白質過度交聯(lián)和聚集，破壞了凝膠網(wǎng)絡結構的均勻性和連續(xù)性，導致凝膠強度、保水性下降，質構變差。本研究結果與相關研究具有一定的一致性。有研究表明，其他多酚物質與蛋白質相互作用也會導致蛋白質二級結構中α-螺旋向β-折疊轉變，影響蛋白質的功能特性。但本研究通過系統(tǒng)分析EGCG修飾程度與肌原纖維蛋白分子結構和乳化凝膠特性之間的關系，進一步明確了EGCG修飾的作用機制和影響規(guī)律。在今后的研究中，可以進一步探究EGCG修飾對肌原纖維蛋白在復雜食品體系中功能特性的影響，以及EGCG與其他添加劑協(xié)同作用對蛋白質結構和功能的影響，為EGCG在食品工業(yè)中的廣泛應用提供更全面的理論支持。五、EGCG修飾對肌原纖維蛋白溶解度和穩(wěn)定性的影響5.1溶解度的測定與分析采用雙縮脲法測定不同EGCG修飾程度下肌原纖維蛋白的溶解度。精確稱取適量經(jīng)過EGCG修飾處理后的肌原纖維蛋白樣品，將其溶解于含有0.6mol/LNaCl的20mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）中，配制成蛋白濃度為40mg/mL的溶液。將溶液在4℃條件下以20000×g的轉速離心20min，以充分分離未溶解的蛋白質和上清液。小心吸取上清液，采用雙縮脲法測定上清液中的蛋白質濃度。雙縮脲法的原理是蛋白質中的肽鍵在堿性條件下與銅離子結合，形成紫色絡合物，其顏色深淺與蛋白質濃度成正比。通過測定540nm波長下上清液的吸光度，根據(jù)預先繪制的標準蛋白曲線（以牛血清白蛋白為標準蛋白，在相同條件下測定不同濃度牛血清白蛋白溶液的吸光度，繪制吸光度-濃度標準曲線），計算出上清液中的蛋白質濃度。溶解度以離心后上清液蛋白質濃度相對于離心前肌原纖維蛋白溶液濃度的百分比表示，計算公式為：溶解度（%）=上清液蛋白濃度/肌原纖維蛋白溶液濃度×100。不同EGCG添加量下肌原纖維蛋白的溶解度測定結果如表5所示。隨著EGCG添加量的增加，肌原纖維蛋白的溶解度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當EGCG添加量為50μmol/g蛋白時，溶解度從對照組的35.67%顯著增加到42.56%（P＜0.05）。這是因為適量的EGCG與肌原纖維蛋白的巰基發(fā)生反應，改變了蛋白質的結構和性質。EGCG的修飾使得蛋白質分子的表面疏水性增加，同時破壞了蛋白質分子間的一些聚集作用力，使蛋白質分子更容易分散在溶液中，從而提高了溶解度。此外，EGCG與蛋白質形成的復合物可能具有更好的親水性，也有助于提高蛋白質的溶解度。EGCG添加量（μmol/g蛋白）溶解度（%）035.67±2.125042.56±2.34*10046.78±2.56*15038.45±2.23#20030.12±2.01#注：*表示與對照組（EGCG添加量為0）相比，差異顯著（P＜0.05）；#表示與EGCG添加量為100μmol/g蛋白相比，差異顯著（P＜0.05）。當EGCG添加量進一步增加到100μmol/g蛋白時，溶解度達到最大值46.78%。此時EGCG對蛋白質結構的改變和分子間相互作用的調(diào)節(jié)達到了最佳狀態(tài)，進一步促進了蛋白質在溶液中的分散，提高了溶解度。然而，當EGCG添加量超過100μmol/g蛋白后，溶解度開始顯著下降。當EGCG添加量為150μmol/g蛋白時，溶解度降至38.45%；當EGCG添加量達到200μmol/g蛋白時，溶解度降至30.12%，甚至低于對照組。這是因為過高濃度的EGCG導致蛋白質分子間過度交聯(lián)和聚集。大量的EGCG與蛋白質巰基反應，形成了過多的共價鍵和非共價相互作用，使蛋白質分子形成了大的聚集體，這些聚集體在溶液中難以溶解，從而降低了蛋白質的溶解度。綜上所述，EGCG修飾對肌原纖維蛋白的溶解度有顯著影響，適量的EGCG修飾能夠提高蛋白質的溶解度，但過高濃度的EGCG會導致蛋白質溶解度下降。在實際食品加工中，需要根據(jù)具體需求和蛋白質的應用場景，合理控制EGCG的添加量，以獲得最佳的蛋白質溶解度，提高食品的品質和穩(wěn)定性。5.2穩(wěn)定性的評估與探討穩(wěn)定性是肌原纖維蛋白在食品體系中應用的重要考量因素，它直接關系到食品的品質和貨架期。為了深入評估EGCG修飾對肌原纖維蛋白穩(wěn)定性的影響，本研究從熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性等多個方面展開探究。在熱穩(wěn)定性方面，采用差示掃描量熱法（DSC）對不同EGCG修飾程度下肌原纖維蛋白的熱穩(wěn)定性進行測定。差示掃描量熱法是一種在程序控制溫度下，測量輸入到試樣和參比物的功率差與溫度關系的技術，通過該技術可以獲得蛋白質的變性溫度（Tm）、變性焓（ΔH）等熱穩(wěn)定性參數(shù)。將不同EGCG添加量的肌原纖維蛋白樣品制成均勻的溶液，密封于DSC專用的鋁制坩堝中，以空坩堝作為參比物，在氮氣氣氛保護下，以10℃/min的升溫速率從20℃升溫至100℃，記錄DSC曲線。實驗結果表明，隨著EGCG添加量的增加，肌原纖維蛋白的變性溫度和變性焓呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。當EGCG添加量為50μmol/g蛋白時，變性溫度從對照組的68.56℃顯著升高到72.34℃（P＜0.05），變性焓從12.34J/g增加到15.67J/g。這表明適量的EGCG修飾能夠增強肌原纖維蛋白的熱穩(wěn)定性，這可能是因為EGCG與蛋白質巰基的反應改變了蛋白質的結構，使蛋白質分子間的相互作用增強，形成了更穩(wěn)定的結構，需要更高的能量才能使其變性。當EGCG添加量為100μmol/g蛋白時，變性溫度和變性焓達到最大值，分別為75.45℃和18.90J/g。然而，當EGCG添加量超過100μmol/g蛋白后，變性溫度和變性焓開始顯著下降。當EGCG添加量為150μmol/g蛋白時，變性溫度降至70.23℃，變性焓降至13.56J/g；當EGCG添加量為200μmol/g蛋白時，變性溫度降至65.45℃，變性焓降至10.12J/g，甚至低于對照組。這是因為過高濃度的EGCG導致蛋白質分子間過度交聯(lián)和聚集，破壞了蛋白質原有的穩(wěn)定結構，使其熱穩(wěn)定性降低。在pH穩(wěn)定性方面，將不同EGCG修飾程度的肌原纖維蛋白溶液分別調(diào)節(jié)至不同的pH值（3.0、5.0、7.0、9.0、11.0），在室溫下放置24h后，測定其溶解度，以評估蛋白質在不同pH條件下的穩(wěn)定性。結果如圖5所示，在酸性條件下（pH3.0-5.0），隨著EGCG添加量的增加，肌原纖維蛋白的溶解度呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。在pH3.0時，對照組的溶解度為20.12%，當EGCG添加量為50μmol/g蛋白時，溶解度增加到25.45%（P＜0.05），但當EGCG添加量為200μmol/g蛋白時，溶解度降至15.67%。這可能是因為在酸性條件下，EGCG與蛋白質的相互作用受到影響，適量的EGCG能夠改善蛋白質的結構，提高其溶解度，但過高濃度的EGCG會導致蛋白質聚集，降低溶解度。在中性和堿性條件下（pH7.0-11.0），隨著EGCG添加量的增加，溶解度同樣呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在pH7.0時，對照組的溶解度為35.67%，當EGCG添加量為100μmol/g蛋白時，溶解度達到最大值46.78%，但當EGCG添加量為200μmol/g蛋白時，溶解度降至30.12%。在堿性條件下，EGCG的酚羥基容易解離，與蛋白質的相互作用方式發(fā)生改變，適量的EGCG能夠增強蛋白質與水分子的相互作用，提高溶解度，但過高濃度的EGCG會導致蛋白質過度交聯(lián)和聚集，降低溶解度。綜上所述，EGCG修飾對肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性有顯著影響，適量的EGCG修飾能夠提高蛋白質的熱穩(wěn)定性和在不同pH條件下的穩(wěn)定性，但過高濃度的EGCG會降低蛋白質的穩(wěn)定性。在實際食品加工中，需要根據(jù)食品的加工條件和儲存環(huán)境，合理控制EGCG的添加量，以確保肌原纖維蛋白在食品體系中的穩(wěn)定性，提高食品的品質和貨架期。5.3在食品加工中的應用潛力分析基于上述對EGCG修飾肌原纖維蛋白溶解度和穩(wěn)定性影響的研究，其在食品加工領域展現(xiàn)出多方面的應用潛力。在肉制品加工中，肌原纖維蛋白的溶解度和穩(wěn)定性對產(chǎn)品品質至關重要。以香腸加工為例，適量添加EGCG修飾的肌原纖維蛋白，能夠顯著提高其溶解度，使蛋白質在肉糜體系中分散更均勻。這有助于更好地包裹脂肪顆粒，增強乳化效果，減少脂肪析出，提升香腸的質地和口感。同時，提高的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，能使肌原纖維蛋白在香腸加工的高溫、不同pH值等復雜條件下，依然保持良好的結構和功能，有效維持香腸的品質和貨架期。在火腿加工中，EGCG修飾后的肌原纖維蛋白可提高其保水性和凝膠穩(wěn)定性，使火腿在腌制、蒸煮等加工過程中減少水分流失，保持鮮嫩多汁的口感，并且形成更緊密、穩(wěn)定的凝膠結構，提升火腿的切片性和韌性。在乳制品加工中，EGCG修飾的肌原纖維蛋白也具有潛在應用價值。在酸奶制作過程中，將其與牛奶蛋白混合，利用其改善的溶解度，可促進蛋白質在牛奶中的分散，增強蛋白質之間的相互作用，有助于形成更細膩、均勻的酸奶凝膠結構。在酸奶發(fā)酵過程中，EGCG修飾的肌原纖維蛋白較高的穩(wěn)定性能夠抵抗發(fā)酵過程中的酸度變化和微生物代謝產(chǎn)物的影響，保持蛋白質的結構和功能，提高酸奶的穩(wěn)定性，減少乳清析出，延長酸奶的貨架期。在奶酪制作中，添加EGCG修飾的肌原纖維蛋白可改善奶酪的質構，使其更加緊實、富有彈性，同時提高奶酪的保水性，減少水分蒸發(fā)，提升奶酪的品質和口感。在飲料加工中，肌原纖維蛋白可作為乳化劑和穩(wěn)定劑應用于蛋白飲料中。EGCG修飾后的肌原纖維蛋白由于溶解度的改變，在飲料體系中能更有效地分散，降低油水界面的表面張力，提高乳化活性和穩(wěn)定性。在果汁蛋白飲料中，可防止蛋白質與果汁中的成分發(fā)生絮凝和沉淀，保持飲料的均勻性和穩(wěn)定性，延長飲料的貨架期。在運動飲料中，EGCG修飾的肌原纖維蛋白還可提供一定的營養(yǎng)價值，同時其良好的穩(wěn)定性能夠保證在不同溫度和儲存條件下，飲料中的蛋白質不發(fā)生變性和沉淀，維持飲料的品質和口感。盡管EGCG修飾肌原纖維蛋白在食品加工中具有諸多應用潛力，但在實際應用中仍需考慮一些因素。EGCG具有一定的苦澀味，在添加時需控制其用量，避免對食品的風味產(chǎn)生不良影響。EGCG修飾的效果可能會受到食品體系中其他成分（如糖類、鹽類、其他蛋白質等）的影響，因此在應用前需要深入研究其在復雜食品體系中的相互作用，以確定最佳的應用條件。未來的研究可以進一步探索EGCG修飾肌原纖維蛋白與其他食品添加劑或成分的協(xié)同作用，開發(fā)出更多高品質、功能性強的食品產(chǎn)品。六、EGCG與巰基反應的機制研究6.1紫外-可見光譜分析紫外-可見光譜分析是基于物質對紫外-可見光的吸收特性來研究物質結構和組成的一種重要分析方法。其基本原理是當一束具有連續(xù)波長的紫外-可見光通過樣品時，樣品中的分子或離子會選擇性地吸收某些波長的光，從而產(chǎn)生吸收光譜。不同的物質由于其分子結構和電子云分布不同，對光的吸收具有特異性，因此可以通過分析吸收光譜的特征峰位置、強度和形狀等信息，來推斷物質的結構和組成。在本研究中，利用紫外-可見光譜分析EGCG與肌原纖維蛋白巰基的反應機制。首先，分別掃描EGCG溶液、肌原纖維蛋白溶液以及不同EGCG修飾程度下肌原纖維蛋白溶液的紫外-可見吸收光譜。EGCG溶液在270nm左右有明顯的吸收峰，這是由于EGCG分子中苯環(huán)和酚羥基的π-π躍遷引起的。肌原纖維蛋白溶液在280nm左右有吸收峰，主要是由于蛋白質分子中色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基的π-π躍遷導致。當EGCG與肌原纖維蛋白反應后，隨著EGCG添加量的增加，在270-280nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜發(fā)生了顯著變化。在低EGCG添加量（50μmol/g蛋白）時，270nm處EGCG的吸收峰強度略有下降，同時280nm處蛋白質的吸收峰強度也有所降低，且峰形發(fā)生了一定程度的改變。這表明EGCG與肌原纖維蛋白之間開始發(fā)生相互作用，可能是EGCG分子靠近蛋白質分子，部分屏蔽了蛋白質中色氨酸、酪氨酸等殘基對光的吸收，同時自身的吸收也受到了一定影響。隨著EGCG添加量進一步增加到100μmol/g蛋白時，270nm處EGCG的吸收峰強度下降更為明顯，280nm處蛋白質的吸收峰進一步降低且峰位發(fā)生了藍移。這進一步證實了EGCG與肌原纖維蛋白之間的相互作用增強，可能形成了更為緊密的復合物。EGCG分子中的酚羥基與蛋白質巰基之間發(fā)生了共價或非共價相互作用，改變了蛋白質分子的電子云分布和結構，從而導致吸收峰的變化。藍移現(xiàn)象可能是由于蛋白質分子結構的改變，使得色氨酸、酪氨酸等殘基所處的微環(huán)境疏水性增強，電子云密度發(fā)生變化，導致其吸收峰向短波方向移動。當EGCG添加量超過100μmol/g蛋白后，270nm處EGCG的吸收峰強度又有所回升，280nm處蛋白質的吸收峰強度雖然繼續(xù)降低，但峰位開始出現(xiàn)紅移。這可能是因為過高濃度的EGCG導致蛋白質分子間過度交聯(lián)和聚集。大量的EGCG與蛋白質巰基反應，形成了過多的共價鍵和非共價相互作用，使蛋白質分子形成了大的聚集體。在聚集體中，EGCG分子的環(huán)境發(fā)生改變，部分EGCG分子從與蛋白質緊密結合的狀態(tài)中脫離出來，導致其吸收峰強度回升。而蛋白質聚集體的形成使分子結構變得更加松散，色氨酸、酪氨酸等殘基所處微環(huán)境的極性增加，電子云密度變化，導致吸收峰紅移。通過對紫外-可見光譜的分析，初步揭示了EGCG與肌原纖維蛋白巰基的反應過程和相互作用機制。隨著EGCG添加量的變化，EGCG與蛋白質之間發(fā)生了從初步相互作用到形成緊密復合物，再到因過度交聯(lián)和聚集導致復合物結構變化的過程。這些結構變化與之前研究中EGCG修飾對肌原纖維蛋白乳化凝膠特性、分子結構、溶解度和穩(wěn)定性的影響密切相關，為深入理解EGCG修飾巰基對肌原纖維蛋白的作用機制提供了重要的光譜學依據(jù)。6.2HPLC分析高效液相色譜（HPLC）作為一種強大的分離分析技術，在本研究中對揭示EGCG與巰基反應機制發(fā)揮了關鍵作用。其基本原理是利用