siRNA沉默OPN基因：喉鱗癌治療的新曙光一、引言1.1研究背景與意義喉鱗狀細(xì)胞癌（簡稱喉鱗癌）是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，在全身腫瘤中占比約1%-5%，其發(fā)病率約為10萬分之2.1，病死率為10萬分之1.1。近年來，喉癌的發(fā)病率呈增多趨勢，發(fā)病年齡多集中于50-70歲，由于吸煙與喉癌的發(fā)生有明確相關(guān)性，故男性患者居多，男女比例約為4:1。喉是人體重要的發(fā)音器官，喉鱗癌的發(fā)生嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，隨著病情進(jìn)展，會(huì)出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，不僅導(dǎo)致聲音嘶啞、咽部異物感、持續(xù)咳嗽、吞咽時(shí)疼痛、吞咽食物困難、頸側(cè)或者耳后疼痛、呼吸困難等癥狀，若喉部腫瘤表面并發(fā)感染，還可出現(xiàn)惡臭味道，甚者會(huì)因聲門堵塞引發(fā)呼吸困難、窒息，危及患者生命。盡管當(dāng)前在喉鱗癌的治療方面取得了一定進(jìn)展，包括手術(shù)、放療、化療等多種手段，但患者的總體生存率和生活質(zhì)量仍有待提高。手術(shù)切除可能影響患者的發(fā)聲、吞咽等生理功能；放療和化療雖能抑制腫瘤生長，但也會(huì)帶來諸多副作用，如放射性喉炎、骨髓抑制、惡心嘔吐等，嚴(yán)重影響患者的身體狀況和生活質(zhì)量。目前，喉鱗癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，這在很大程度上限制了更有效治療方法的開發(fā)和預(yù)后評估的準(zhǔn)確性。因此，深入探究喉鱗癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的診斷和治療靶點(diǎn)具有迫切的臨床需求。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種具有多種功能的分泌型鈣結(jié)合磷酸化糖蛋白。它能與骨組織中的羥磷灰石緊密結(jié)合，參與調(diào)節(jié)骨鈣的沉積。然而，越來越多的研究表明，OPN與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在喉鱗癌中，OPN的表達(dá)水平與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后緊密相連。OPN可通過多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，例如加速細(xì)胞外基質(zhì)降解，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移開辟道路；促進(jìn)腫瘤血管形成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)供應(yīng)，從而提高腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。研究顯示，在浸潤轉(zhuǎn)移組的喉鱗癌患者中，OPN基因和蛋白的表達(dá)水平顯著高于非浸潤轉(zhuǎn)移組，且其表達(dá)水平與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期、患者預(yù)后呈正相關(guān)。這表明OPN在喉鱗癌的浸潤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，有望成為喉鱗癌治療和預(yù)后評估的重要分子標(biāo)記和靶點(diǎn)。小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）是一類長度約為20-25個(gè)核苷酸的雙鏈RNA分子，其通過RNA干擾機(jī)制抑制靶基因的表達(dá)。siRNA反義鏈可通過堿基互補(bǔ)配對原則與靶mRNA結(jié)合，介導(dǎo)mRNA的剪切，從而阻止靶mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。由于siRNA理論上能抑制任意基因的表達(dá)，因此在基礎(chǔ)研究與制藥應(yīng)用中成為熱點(diǎn)。利用siRNA沉默OPN基因，為喉鱗癌的治療提供了新的策略。通過特異性地降低OPN基因的表達(dá)，有望阻斷其促進(jìn)腫瘤發(fā)展的信號通路，從而抑制喉鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，為喉鱗癌患者帶來新的治療希望。本研究旨在通過實(shí)驗(yàn)深入探討siRNA沉默OPN基因?qū)眵[癌的治療效果及作用機(jī)制。一方面，有助于進(jìn)一步揭示喉鱗癌的發(fā)病機(jī)制，為深入理解腫瘤的生物學(xué)行為提供理論依據(jù)；另一方面，為開發(fā)基于siRNA技術(shù)的喉鱗癌靶向治療新方法奠定基礎(chǔ)，有望提高喉鱗癌的治療效果，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在喉鱗癌的研究領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者一直致力于探索其發(fā)病機(jī)制、診斷方法和治療策略。在發(fā)病機(jī)制研究方面，已明確吸煙、飲酒、人乳頭瘤病毒感染等是喉鱗癌的主要危險(xiǎn)因素。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，多種基因和信號通路的異常與喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如p53基因、Ras基因等。北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院的研究團(tuán)隊(duì)通過對大量喉鱗癌患者樣本的分析，揭示了p53基因突變在喉鱗癌發(fā)生中的關(guān)鍵作用，為深入理解喉鱗癌的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。在診斷方法上，目前臨床主要依靠喉鏡檢查、病理活檢等手段。喉鏡檢查能夠直觀地觀察喉部病變的形態(tài)和位置，但對于早期微小病變的診斷存在一定局限性；病理活檢雖為確診的金標(biāo)準(zhǔn)，但屬于有創(chuàng)檢查，且存在取材誤差的可能。近年來，隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，一些腫瘤標(biāo)志物如細(xì)胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）、鱗狀細(xì)胞癌抗原（SCCA）等在喉鱗癌診斷中的應(yīng)用逐漸受到關(guān)注。國外有研究表明，聯(lián)合檢測CYFRA21-1和SCCA可提高喉鱗癌診斷的靈敏度和特異度，為喉鱗癌的早期診斷提供了新的思路。在治療方面，手術(shù)、放療和化療是喉鱗癌的主要治療手段。對于早期喉鱗癌，手術(shù)切除或根治性放療可取得較好的療效，5年生存率可達(dá)60%左右。然而，對于中晚期喉鱗癌患者，單純的手術(shù)或放療往往難以徹底清除腫瘤細(xì)胞，需要結(jié)合化療進(jìn)行綜合治療。但化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對正常組織細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)等，影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。關(guān)于OPN基因與腫瘤的關(guān)系，國內(nèi)外研究已證實(shí)OPN在多種腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。在乳腺癌研究中，OPN通過與整合素和CD44等受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。在肝癌中，OPN能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移提供有利條件。在喉鱗癌中，國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)，OPN基因和蛋白在浸潤轉(zhuǎn)移組的表達(dá)水平顯著高于非浸潤轉(zhuǎn)移組，且其表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期呈正相關(guān)。這表明OPN在喉鱗癌的浸潤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，可能成為喉鱗癌治療和預(yù)后評估的潛在靶點(diǎn)。在siRNA技術(shù)的研究與應(yīng)用方面，近年來取得了顯著進(jìn)展。siRNA作為一種新興的基因治療工具，具有高度的序列特異性和高效的基因沉默能力，為腫瘤治療帶來了新的希望。國外已有多個(gè)siRNA藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，用于治療各種難治性疾病，如遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性、年齡相關(guān)性黃斑變性等。在腫瘤治療領(lǐng)域，siRNA技術(shù)主要用于沉默致癌基因或關(guān)鍵信號通路分子，以抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移。例如，針對肺癌中高表達(dá)的表皮生長因子受體（EGFR）基因，設(shè)計(jì)特異性的siRNA，能夠有效降低EGFR的表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。國內(nèi)的研究團(tuán)隊(duì)也在積極開展siRNA技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用研究，探索其在肝癌、胃癌等多種腫瘤中的治療效果和作用機(jī)制。盡管目前在喉鱗癌、OPN基因及siRNA技術(shù)的研究方面取得了一定成果，但仍存在諸多不足之處。對于喉鱗癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，仍有許多潛在的分子靶點(diǎn)和信號通路有待進(jìn)一步探索；現(xiàn)有的診斷方法在早期診斷的準(zhǔn)確性和敏感性方面仍需提高；傳統(tǒng)治療手段在提高患者生存率和生活質(zhì)量方面面臨瓶頸。在OPN基因的研究中，雖然已明確其與喉鱗癌浸潤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，但OPN在喉鱗癌中的具體作用機(jī)制以及其上下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全闡明。在siRNA技術(shù)應(yīng)用于喉鱗癌治療的研究中，siRNA的高效遞送、穩(wěn)定性以及降低脫靶效應(yīng)等問題仍亟待解決。本研究旨在針對這些不足，通過siRNA沉默OPN基因，深入探究其對喉鱗癌的治療效果及作用機(jī)制，為喉鱗癌的治療提供新的策略和理論依據(jù)。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究siRNA沉默OPN基因?qū)眵[癌的治療效果及作用機(jī)制，為喉鱗癌的治療提供新的策略和理論依據(jù)。具體研究目標(biāo)如下：驗(yàn)證siRNA沉默OPN基因?qū)眵[癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響，明確其在抑制喉鱗癌發(fā)展中的作用。揭示siRNA沉默OPN基因影響喉鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制，探索相關(guān)信號通路的調(diào)控作用。評估siRNA沉默OPN基因在動(dòng)物模型中的治療效果，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。圍繞上述研究目標(biāo)，本研究主要開展以下內(nèi)容的研究：siRNA的設(shè)計(jì)與合成：依據(jù)OPN基因序列，運(yùn)用生物信息學(xué)工具設(shè)計(jì)特異性針對OPN基因的siRNA序列。通過化學(xué)合成方法制備高純度的siRNA，并對其進(jìn)行質(zhì)量檢測，確保其序列準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。利用相關(guān)軟件預(yù)測siRNA與OPN基因mRNA的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合親和力，評估其潛在的干擾效果，篩選出干擾效率高、脫靶效應(yīng)低的siRNA序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用人喉鱗癌細(xì)胞系，如Hep-2細(xì)胞，將合成的siRNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方法導(dǎo)入細(xì)胞。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中OPN基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證siRNA對OPN基因的沉默效果。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）法、5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）法等細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，觀察沉默OPN基因后喉鱗癌細(xì)胞增殖能力的變化；采用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變；利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況，明確siRNA沉默OPN基因?qū)眵[癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。分子機(jī)制研究：利用生物信息學(xué)分析，預(yù)測OPN基因可能參與的信號通路和相關(guān)分子。通過Westernblot、免疫熒光等技術(shù)檢測相關(guān)信號通路關(guān)鍵分子的表達(dá)和活化水平，如PI3K/AKT、MAPK等信號通路中的蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子，探究siRNA沉默OPN基因影響喉鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制。進(jìn)行基因過表達(dá)或敲低實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)鍵信號通路和分子在OPN基因調(diào)控喉鱗癌細(xì)胞過程中的作用。例如，構(gòu)建OPN基因過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到已沉默OPN基因的喉鱗癌細(xì)胞中，觀察細(xì)胞生物學(xué)行為和相關(guān)信號通路的回復(fù)情況；或者針對預(yù)測的關(guān)鍵分子設(shè)計(jì)特異性的siRNA或抑制劑，聯(lián)合OPN-siRNA處理細(xì)胞，分析細(xì)胞表型和信號通路的變化，深入揭示其調(diào)控機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：建立人喉鱗癌裸鼠移植瘤模型，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染OPN-siRNA的喉鱗癌細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞接種到裸鼠皮下。定期測量腫瘤體積和重量，觀察腫瘤生長情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行病理學(xué)檢查，如蘇木精-伊紅（HE）染色觀察腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，免疫組化檢測OPN基因及相關(guān)分子的表達(dá)，評估siRNA沉默OPN基因在動(dòng)物體內(nèi)的治療效果。檢測裸鼠的血常規(guī)、肝腎功能等指標(biāo)，觀察siRNA對裸鼠全身狀況的影響，評估其安全性。利用小動(dòng)物活體成像技術(shù)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況，直觀評價(jià)siRNA沉默OPN基因?qū)眵[癌的治療效果。同時(shí)，對腫瘤組織進(jìn)行基因測序和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，全面了解治療過程中基因和蛋白表達(dá)的變化，為深入研究其作用機(jī)制提供更多信息。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)方法，從細(xì)胞水平、分子機(jī)制和動(dòng)物模型等多個(gè)層面展開研究，以全面深入地探究siRNA沉默OPN基因?qū)眵[癌的治療效果及作用機(jī)制，具體研究方法如下：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用人喉鱗癌細(xì)胞系，如Hep-2細(xì)胞，將合成的siRNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方法導(dǎo)入細(xì)胞。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中OPN基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證siRNA對OPN基因的沉默效果。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）法、5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）法等細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，觀察沉默OPN基因后喉鱗癌細(xì)胞增殖能力的變化；采用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變；利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況，明確siRNA沉默OPN基因?qū)眵[癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。分子機(jī)制研究：利用生物信息學(xué)分析，預(yù)測OPN基因可能參與的信號通路和相關(guān)分子。通過Westernblot、免疫熒光等技術(shù)檢測相關(guān)信號通路關(guān)鍵分子的表達(dá)和活化水平，如PI3K/AKT、MAPK等信號通路中的蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子，探究siRNA沉默OPN基因影響喉鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制。進(jìn)行基因過表達(dá)或敲低實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)鍵信號通路和分子在OPN基因調(diào)控喉鱗癌細(xì)胞過程中的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：建立人喉鱗癌裸鼠移植瘤模型，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染OPN-siRNA的喉鱗癌細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞接種到裸鼠皮下。定期測量腫瘤體積和重量，觀察腫瘤生長情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行病理學(xué)檢查，如蘇木精-伊紅（HE）染色觀察腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，免疫組化檢測OPN基因及相關(guān)分子的表達(dá)，評估siRNA沉默OPN基因在動(dòng)物體內(nèi)的治療效果。檢測裸鼠的血常規(guī)、肝腎功能等指標(biāo)，觀察siRNA對裸鼠全身狀況的影響，評估其安全性。利用小動(dòng)物活體成像技術(shù)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況，直觀評價(jià)siRNA沉默OPN基因?qū)眵[癌的治療效果。同時(shí)，對腫瘤組織進(jìn)行基因測序和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，全面了解治療過程中基因和蛋白表達(dá)的變化，為深入研究其作用機(jī)制提供更多信息。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示，首先進(jìn)行siRNA的設(shè)計(jì)與合成，并對其進(jìn)行質(zhì)量檢測和干擾效果評估。隨后將siRNA轉(zhuǎn)染至喉鱗癌細(xì)胞，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，同時(shí)進(jìn)行分子機(jī)制研究，探索相關(guān)信號通路。最后建立動(dòng)物模型，評估siRNA沉默OPN基因在動(dòng)物體內(nèi)的治療效果和安全性，全面深入地探究其治療喉鱗癌的作用及機(jī)制。圖1-1技術(shù)路線圖二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1喉鱗癌概述2.1.1喉鱗癌的發(fā)病機(jī)制與流行病學(xué)喉鱗癌的發(fā)病是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程，其確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。目前研究認(rèn)為，喉鱗癌的發(fā)生與多種因素密切相關(guān)，這些因素主要包括環(huán)境因素、生活方式以及遺傳易感性等。吸煙是喉鱗癌最重要的危險(xiǎn)因素之一。煙草燃燒時(shí)會(huì)產(chǎn)生多種致癌物質(zhì)，如多環(huán)芳烴、亞硝胺等，這些物質(zhì)可直接損傷喉部黏膜上皮細(xì)胞的DNA，導(dǎo)致基因突變和細(xì)胞異常增殖。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約80%-90%的喉鱗癌患者有長期吸煙史，吸煙量越大、吸煙時(shí)間越長，患喉鱗癌的風(fēng)險(xiǎn)就越高。飲酒也與喉鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)，酒精可作為致癌物質(zhì)的溶劑，促進(jìn)致癌物質(zhì)進(jìn)入喉部組織，同時(shí)還會(huì)損傷喉部黏膜，降低局部免疫力，從而增加喉鱗癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。吸煙和飲酒具有協(xié)同致癌作用，既吸煙又飲酒的人群患喉鱗癌的風(fēng)險(xiǎn)比單純吸煙者或飲酒者更高。人乳頭瘤病毒（HPV）感染也是喉鱗癌的重要致病因素之一。尤其是高危型HPV，如HPV16、HPV18等，其感染喉部上皮細(xì)胞后，病毒基因可整合到宿主細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控紊亂、細(xì)胞增殖失控，進(jìn)而引發(fā)癌變。研究表明，在部分喉鱗癌患者中可檢測到HPVDNA，且HPV陽性的喉鱗癌患者在臨床病理特征和預(yù)后方面與HPV陰性患者存在差異。此外，空氣污染、職業(yè)暴露（如長期接觸石棉、芥子氣、鎳等化學(xué)物質(zhì)）、營養(yǎng)不良（如缺乏維生素A、C、E等抗氧化維生素）以及遺傳因素等也可能增加喉鱗癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。遺傳易感性在喉鱗癌的發(fā)生中起著一定作用，某些基因的多態(tài)性可能影響個(gè)體對致癌因素的敏感性，使部分人群更容易患喉鱗癌。喉鱗癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出一定的地區(qū)差異。總體而言，喉鱗癌在男性中的發(fā)病率明顯高于女性，男女比例約為3-9:1。在地區(qū)分布上，歐美國家的發(fā)病率相對較高，而亞洲和非洲國家的發(fā)病率相對較低。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球喉癌新發(fā)病例約為17.7萬例，死亡病例約為9.5萬例。其中，男性喉癌新發(fā)病例約為15.5萬例，發(fā)病率為4.1/10萬；女性喉癌新發(fā)病例約為2.2萬例，發(fā)病率為0.7/10萬。在我國，喉癌的發(fā)病率也呈上升趨勢，特別是在一些大城市和工業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)。根據(jù)中國國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)，2015年我國喉癌新發(fā)病例約為2.5萬例，死亡病例約為1.4萬例，發(fā)病率為1.8/10萬，死亡率為1.0/10萬。城市地區(qū)的發(fā)病率略高于農(nóng)村地區(qū)，這可能與城市居民的生活方式、環(huán)境污染等因素有關(guān)。不同地區(qū)的發(fā)病率差異可能與當(dāng)?shù)氐奈鼰熉?、HPV感染率、環(huán)境污染程度以及醫(yī)療水平等多種因素有關(guān)。了解喉鱗癌的發(fā)病機(jī)制和流行病學(xué)特征，對于制定有效的預(yù)防策略和治療方案具有重要意義。2.1.2喉鱗癌的臨床癥狀與診斷方法喉鱗癌的臨床癥狀因腫瘤的部位、大小、生長方式以及分期的不同而有所差異。早期喉鱗癌患者的癥狀往往不明顯，或僅表現(xiàn)出一些輕微的喉部不適，容易被忽視。隨著腫瘤的進(jìn)展，患者會(huì)逐漸出現(xiàn)一系列典型的癥狀。聲音嘶啞是喉鱗癌最常見的早期癥狀之一，尤其是聲門型喉鱗癌，由于腫瘤位于聲帶，早期即可影響聲帶的振動(dòng)和閉合，導(dǎo)致聲音嘶啞。這種聲音嘶啞通常呈進(jìn)行性加重，且經(jīng)保守治療（如休息、藥物治療等）后無明顯改善。咽喉疼痛也是常見癥狀，多表現(xiàn)為咽部異物感、吞咽時(shí)疼痛，疼痛可放射至耳部。當(dāng)腫瘤侵犯喉部神經(jīng)或周圍組織時(shí)，疼痛會(huì)加劇。咳嗽和咯血也是喉鱗癌患者可能出現(xiàn)的癥狀，腫瘤刺激喉部黏膜可引起刺激性咳嗽，若腫瘤表面破潰出血，則可出現(xiàn)痰中帶血或咯血。隨著病情的進(jìn)一步發(fā)展，腫瘤體積增大，可導(dǎo)致呼吸困難。這是因?yàn)槟[瘤阻塞了喉部氣道，影響了氣體的正常交換，嚴(yán)重時(shí)可危及生命。吞咽困難也是晚期喉鱗癌的常見癥狀，腫瘤侵犯下咽或食管入口，會(huì)導(dǎo)致吞咽食物困難。此外，當(dāng)腫瘤發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，患者可在頸部觸及腫大的淋巴結(jié)，質(zhì)地較硬，活動(dòng)度差。目前，喉鱗癌的診斷主要依靠多種檢查手段的綜合應(yīng)用。喉鏡檢查是診斷喉鱗癌的重要方法之一，包括間接喉鏡、纖維喉鏡和電子喉鏡等。間接喉鏡操作簡單、經(jīng)濟(jì)，但對于喉部隱蔽部位的觀察存在一定局限性；纖維喉鏡和電子喉鏡具有圖像清晰、可彎曲、能深入喉部各個(gè)部位觀察等優(yōu)點(diǎn)，能夠直觀地觀察喉部病變的形態(tài)、大小、位置以及表面情況等，并可在直視下取組織進(jìn)行病理活檢。病理活檢是確診喉鱗癌的金標(biāo)準(zhǔn)，通過對活檢組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，可明確腫瘤的組織學(xué)類型、分化程度以及有無浸潤等情況。在喉鏡檢查發(fā)現(xiàn)可疑病變后，應(yīng)及時(shí)取組織進(jìn)行病理活檢，以確保準(zhǔn)確診斷。影像學(xué)檢查在喉鱗癌的診斷和分期中也起著重要作用，常用的影像學(xué)檢查方法包括頸部超聲、CT、MRI等。頸部超聲可用于檢查頸部淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移，CT和MRI能夠清晰地顯示喉部腫瘤的大小、范圍、侵犯深度以及與周圍組織的關(guān)系，有助于腫瘤的分期和治療方案的制定。此外，腫瘤標(biāo)志物檢測也可作為喉鱗癌診斷的輔助手段。一些腫瘤標(biāo)志物，如鱗狀細(xì)胞癌抗原（SCCA）、細(xì)胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）等，在喉鱗癌患者的血清中可能會(huì)升高。但這些腫瘤標(biāo)志物的特異性和敏感性有限，不能單獨(dú)用于診斷喉鱗癌，通常需要結(jié)合臨床癥狀、喉鏡檢查和病理活檢等結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。通過對臨床癥狀的仔細(xì)觀察和多種檢查手段的合理應(yīng)用，能夠提高喉鱗癌的早期診斷率，為患者的治療和預(yù)后提供有力保障。2.1.3喉鱗癌的現(xiàn)有治療方法與局限性目前，喉鱗癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療以及綜合治療等，每種治療方法都有其各自的原理、效果和局限性。手術(shù)治療是喉鱗癌的主要治療方法之一，適用于早期和部分中期喉鱗癌患者。手術(shù)的目的是徹底切除腫瘤組織，根據(jù)腫瘤的部位、大小和分期，可選擇不同的手術(shù)方式，如喉部分切除術(shù)、全喉切除術(shù)等。喉部分切除術(shù)能夠保留部分喉功能，對患者的發(fā)聲、吞咽等生理功能影響較小，術(shù)后患者的生活質(zhì)量相對較高；全喉切除術(shù)則適用于腫瘤范圍廣泛、無法保留喉功能的患者。然而，手術(shù)治療也存在一定的局限性，如手術(shù)創(chuàng)傷較大，可能會(huì)引起出血、感染、喉瘺等并發(fā)癥。對于一些晚期喉鱗癌患者，手術(shù)難以徹底切除腫瘤，容易導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。放射治療是利用放射線殺死腫瘤細(xì)胞的一種治療方法，可分為根治性放療和姑息性放療。根治性放療適用于早期喉鱗癌患者，尤其是那些不適合手術(shù)或拒絕手術(shù)的患者，其治療效果與手術(shù)相當(dāng)，能夠保留喉功能。姑息性放療則主要用于晚期喉鱗癌患者，目的是緩解癥狀、減輕痛苦、延長生存期。放療的局限性在于可能會(huì)引起放射性喉炎、放射性肺炎、吞咽困難、口干等副作用，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。長期放療還可能導(dǎo)致喉部組織纖維化、軟骨壞死等遠(yuǎn)期并發(fā)癥?；瘜W(xué)治療是通過使用化學(xué)藥物殺死腫瘤細(xì)胞或抑制其生長，常用于中晚期喉鱗癌患者的綜合治療中，可與手術(shù)、放療聯(lián)合應(yīng)用?；熕幬锟赏ㄟ^血液循環(huán)到達(dá)全身各處，對潛在的轉(zhuǎn)移病灶也有一定的治療作用。然而，化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對正常組織細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致骨髓抑制、惡心、嘔吐、脫發(fā)等副作用，降低患者的身體抵抗力和生活質(zhì)量。此外，腫瘤細(xì)胞對化療藥物可能會(huì)產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療效果不佳。綜合治療是將手術(shù)、放療、化療等多種治療方法有機(jī)結(jié)合，根據(jù)患者的具體情況制定個(gè)性化的治療方案，以提高治療效果，降低復(fù)發(fā)率，改善患者的生活質(zhì)量。例如，對于局部晚期喉鱗癌患者，可采用術(shù)前誘導(dǎo)化療聯(lián)合手術(shù)治療，或同步放化療等綜合治療模式。綜合治療雖然在一定程度上提高了喉鱗癌的治療效果，但也增加了治療的復(fù)雜性和患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時(shí)多種治療方法的副作用疊加，可能會(huì)給患者帶來更大的身體和心理負(fù)擔(dān)。盡管目前喉鱗癌的治療取得了一定的進(jìn)展，但仍存在許多挑戰(zhàn)和局限性，如腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、治療后的并發(fā)癥以及對患者生活質(zhì)量的影響等。因此，尋找新的治療方法和靶點(diǎn)，提高治療效果，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量，是當(dāng)前喉鱗癌研究的重點(diǎn)和方向。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.2OPN基因相關(guān)研究2.2.1OPN基因的結(jié)構(gòu)與功能骨橋蛋白（osteopontin，OPN）基因在人體生物學(xué)進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色。人OPN基因定位于染色體4q13，基因結(jié)構(gòu)包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。其轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生的OPN蛋白是一種含314個(gè)氨基酸的磷酸化糖蛋白，帶有負(fù)離子電荷，具有親水性。OPN蛋白最為顯著的結(jié)構(gòu)特征之一是含有Arg-Gly-Asp（RGD）三肽序列。這一序列高度保守，是OPN發(fā)揮細(xì)胞黏附功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞外環(huán)境中存在適當(dāng)?shù)男盘柎碳r(shí)，OPN的RGD序列能夠與細(xì)胞表面的整合素家族受體，如αvβ3、αvβ5等特異性結(jié)合。以腫瘤細(xì)胞為例，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞表面的整合素αvβ3與OPN的RGD序列結(jié)合后，會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)一系列與遷移相關(guān)的信號通路，如FAK-Src信號通路。FAK（粘著斑激酶）被激活后，會(huì)進(jìn)一步磷酸化下游的Src激酶，促使細(xì)胞骨架重排，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。若RGD序列發(fā)生變異或缺失，OPN則無法與整合素受體正常結(jié)合，其促細(xì)胞黏附功能將喪失。除RGD序列外，OPN分子在RGD序列附近區(qū)域（離RGD序列僅有6個(gè)氨基酸殘基處有1個(gè)RSK位點(diǎn)結(jié)構(gòu)）存在凝血酶裂解位點(diǎn)。當(dāng)機(jī)體處于凝血等生理或病理過程中，凝血酶被激活，會(huì)作用于OPN的這一裂解位點(diǎn)，將OPN分子裂解成大小不同的一個(gè)氨基末端片段和一個(gè)羧基末端片段。研究發(fā)現(xiàn)，裂解后的OPN氨基端片段因包含RGD結(jié)構(gòu)域，相較于完整的OPN分子，具有更強(qiáng)的粘附功能。其構(gòu)像的改變使得它與整合素受體的親和力提高，在細(xì)胞黏附、遷移等過程中發(fā)揮更顯著的作用。例如在傷口愈合過程中，凝血酶裂解產(chǎn)生的OPN氨基端片段能夠更有效地促進(jìn)成纖維細(xì)胞的遷移和黏附，加速傷口的修復(fù)。而羧基末端片段則主要與黏附分子CD44結(jié)合，在細(xì)胞的生長、分化及免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮作用。OPN廣泛分布于人體多種組織和細(xì)胞中，如骨組織、腎臟、免疫系統(tǒng)細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞等，并參與眾多生理和病理過程。在骨組織代謝中，OPN起著不可或缺的調(diào)節(jié)作用。成骨細(xì)胞分泌的OPN能夠與骨組織中的羥磷灰石緊密結(jié)合，一方面調(diào)節(jié)骨鈣的沉積和釋放，維持骨礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)；另一方面，OPN可通過與破骨細(xì)胞表面的整合素αvβ3等受體結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞的黏附、遷移和骨吸收活性，在骨重塑過程中協(xié)調(diào)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活動(dòng)。在腎臟中，OPN參與維持腎小管的正常功能和腎臟的免疫防御。當(dāng)腎臟受到損傷時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞會(huì)高表達(dá)OPN。OPN可以招募免疫細(xì)胞到損傷部位，增強(qiáng)局部免疫反應(yīng)，同時(shí)抑制腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)其修復(fù)。在免疫系統(tǒng)中，OPN是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子。它可以由活化的T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞分泌。OPN能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，加強(qiáng)Th1細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-2等的表達(dá)，抑制Th2細(xì)胞因子如IL-4、IL-10等的表達(dá)，從而影響機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。例如在感染性疾病中，巨噬細(xì)胞分泌的OPN能夠激活T淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，幫助機(jī)體清除病原體。2.2.2OPN基因在喉鱗癌中的表達(dá)及作用機(jī)制眾多研究表明，OPN基因在喉鱗癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與喉鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。通過對大量喉鱗癌患者的組織樣本進(jìn)行檢測分析，發(fā)現(xiàn)OPN基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平在喉鱗癌組織中顯著高于癌旁正常組織。在一項(xiàng)納入了100例喉鱗癌患者的研究中，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，喉鱗癌組織中OPN基因mRNA的表達(dá)量是癌旁正常組織的3.5倍，OPN蛋白的陽性表達(dá)率在喉鱗癌組織中達(dá)到75%，而在癌旁正常組織中僅為15%。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，OPN基因的高表達(dá)與喉鱗癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)。在浸潤深度較深、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期較晚的喉鱗癌患者中，OPN基因的表達(dá)水平明顯更高。OPN基因在喉鱗癌中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，其作用機(jī)制涉及多個(gè)方面。在細(xì)胞增殖方面，OPN可以通過激活PI3K/AKT信號通路來促進(jìn)喉鱗癌細(xì)胞的增殖。當(dāng)OPN與喉鱗癌細(xì)胞表面的整合素αvβ3等受體結(jié)合后，會(huì)激活受體相關(guān)的酪氨酸激酶，進(jìn)而激活PI3K（磷脂酰肌醇-3激酶）。PI3K將磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，招募并激活A(yù)KT（蛋白激酶B）?；罨腁KT可以磷酸化下游的多種底物，如mTOR（雷帕霉素靶蛋白）等。mTOR被激活后，會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)喉鱗癌細(xì)胞的增殖。研究表明，使用PI3K抑制劑LY294002處理高表達(dá)OPN的喉鱗癌細(xì)胞后，AKT的磷酸化水平明顯降低，細(xì)胞增殖能力受到顯著抑制，細(xì)胞周期停滯在G1期。在細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面，OPN通過多種途徑發(fā)揮作用。一方面，OPN可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的降解。OPN能夠誘導(dǎo)喉鱗癌細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），如MMP-2、MMP-9等。MMP-2和MMP-9可以降解ECM中的主要成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白等，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開辟道路。研究發(fā)現(xiàn)，在OPN高表達(dá)的喉鱗癌細(xì)胞系中，MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高，通過RNA干擾技術(shù)沉默OPN基因后，MMP-2和MMP-9的表達(dá)明顯降低，細(xì)胞的侵襲能力也隨之減弱。另一方面，OPN可以增強(qiáng)喉鱗癌細(xì)胞的遷移能力。OPN與整合素或CD44等受體結(jié)合后，會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的Rho家族小GTP酶，如RhoA、Rac1等。這些小GTP酶可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化，促使細(xì)胞形成偽足和絲狀偽足，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力。在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，高表達(dá)OPN的喉鱗癌細(xì)胞穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量明顯多于低表達(dá)OPN的細(xì)胞，而加入RhoA抑制劑后，細(xì)胞的遷移能力顯著下降。此外，OPN還可以通過促進(jìn)腫瘤血管生成來為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供有利條件。OPN能夠刺激腫瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子，VEGF可以作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、遷移和管腔形成，從而促進(jìn)腫瘤血管生成。豐富的腫瘤血管不僅為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，還為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供了途徑。2.3siRNA基因沉默技術(shù)2.3.1siRNA的作用機(jī)制RNA干擾（RNAinterference，RNAi）現(xiàn)象是一種在生物體內(nèi)廣泛存在的保守機(jī)制，它是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，從而導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失的現(xiàn)象。這一現(xiàn)象最早在秀麗隱桿線蟲中被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向線蟲中導(dǎo)入與內(nèi)源基因同源的dsRNA時(shí)，能夠特異性地抑制該基因的表達(dá)。此后，RNAi現(xiàn)象在植物、果蠅、哺乳動(dòng)物等多種生物中均被證實(shí)存在，表明其在生物進(jìn)化過程中具有重要意義。小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）正是RNAi機(jī)制中的關(guān)鍵效應(yīng)分子。siRNA通常是長度為20-25個(gè)核苷酸的雙鏈RNA分子，其兩條鏈分別為正義鏈（sensestrand）和反義鏈（antisensestrand）。siRNA的形成過程起始于長鏈dsRNA，這些dsRNA可以來自病毒感染、轉(zhuǎn)座子活動(dòng)或人工導(dǎo)入等。在細(xì)胞內(nèi)，長鏈dsRNA首先被核酸酶Dicer識別并結(jié)合。Dicer屬于RNaseⅢ家族，具有兩個(gè)RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域、一個(gè)解旋酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PAZ結(jié)構(gòu)域。Dicer通過其結(jié)構(gòu)域與長鏈dsRNA相互作用，將長鏈dsRNA逐步切割成多個(gè)長度約為21-23bp的雙鏈RNA片段，即siRNA。這些siRNA雙鏈兩端各有2-3個(gè)核苷酸的3’端突出，5’端為磷酸基團(tuán)，3’端為羥基，這種結(jié)構(gòu)特征對于siRNA的功能發(fā)揮至關(guān)重要。形成的siRNA隨后會(huì)與體內(nèi)的一些蛋白質(zhì)結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。RISC是一個(gè)多蛋白復(fù)合體，其核心組分為核酸內(nèi)切酶Argonaute（AGO）蛋白。在RISC組裝過程中，siRNA雙鏈逐漸解旋，其中的反義鏈（也稱為引導(dǎo)鏈，guidestrand）會(huì)被AGO蛋白特異性識別并結(jié)合，而正義鏈（也稱為過客鏈，passengerstrand）則被降解。結(jié)合了反義鏈的RISC被激活，具有了識別和切割靶mRNA的能力。激活后的RISC在細(xì)胞內(nèi)通過堿基互補(bǔ)配對原則，識別并結(jié)合與siRNA反義鏈序列互補(bǔ)的靶mRNA。當(dāng)RISC與靶mRNA結(jié)合后，AGO蛋白會(huì)發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性，在靶mRNA與siRNA反義鏈互補(bǔ)配對區(qū)域的中間位置，對靶mRNA進(jìn)行切割。切割后的mRNA片段失去了翻譯能力，會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的核酸外切酶進(jìn)一步降解，從而實(shí)現(xiàn)了對靶基因的轉(zhuǎn)錄后水平的沉默，即基因沉默。整個(gè)過程精確且高效，使得細(xì)胞能夠特異性地調(diào)控基因表達(dá)，應(yīng)對各種生理和病理變化。2.3.2siRNA在基因治療中的應(yīng)用siRNA技術(shù)因其能夠特異性地沉默靶基因表達(dá)，在基因治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力，已廣泛應(yīng)用于多種疾病的研究和治療探索中。在癌癥治療方面，siRNA可針對致癌基因或腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行靶向沉默。例如，在乳腺癌中，針對人表皮生長因子受體2（HER2）基因設(shè)計(jì)的siRNA，能夠有效降低HER2的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。通過脂質(zhì)體等載體將HER2-siRNA導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞后，細(xì)胞中HER2蛋白的表達(dá)水平顯著下降，細(xì)胞的增殖活性明顯降低，在裸鼠移植瘤模型中，腫瘤的生長也受到明顯抑制。在肝癌研究中，以血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）為靶點(diǎn)的siRNA，能夠抑制腫瘤血管生成，從而抑制肝癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。VEGF是促進(jìn)腫瘤血管生成的關(guān)鍵因子，使用siRNA沉默VEGF基因后，腫瘤組織中的微血管密度明顯降低，腫瘤細(xì)胞因缺乏充足的營養(yǎng)供應(yīng)而生長受限。對于遺傳性疾病，siRNA也為其治療帶來了新的希望。如在亨廷頓舞蹈癥中，致病基因是由于HTT基因的CAG重復(fù)序列異常擴(kuò)增導(dǎo)致。通過設(shè)計(jì)針對HTT基因的siRNA，可降低突變HTT蛋白的表達(dá)，減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，將siRNA遞送至大腦后，能夠有效減少突變HTT蛋白的水平，改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能障礙和神經(jīng)病理癥狀。在家族性高膽固醇血癥中，針對低密度脂蛋白受體（LDLR）基因突變導(dǎo)致的LDLR表達(dá)缺陷，利用siRNA技術(shù)可以調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，提高LDLR的水平，降低血液中的膽固醇含量。盡管siRNA在基因治療中展現(xiàn)出諸多優(yōu)勢，如高度的序列特異性，能夠精準(zhǔn)地靶向目標(biāo)基因，避免對其他無關(guān)基因的影響；高效的基因沉默能力，能夠顯著降低靶基因的表達(dá)水平。然而，其臨床應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)。siRNA的遞送是一個(gè)關(guān)鍵問題，由于siRNA是帶負(fù)電荷的大分子，細(xì)胞膜滲透性差，且易被血清內(nèi)切酶降解，如何將siRNA高效、安全地遞送至靶細(xì)胞是亟待解決的難題。目前雖已開發(fā)了多種遞送系統(tǒng)，如納米載體、脂質(zhì)體、病毒載體等，但每種遞送系統(tǒng)都存在一定的局限性，如納米載體可能存在體內(nèi)代謝途徑不明確、潛在的毒性等問題；病毒載體則可能引發(fā)免疫反應(yīng)。此外，siRNA還可能存在脫靶效應(yīng)，即siRNA與非靶mRNA發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致非預(yù)期的基因沉默，從而產(chǎn)生副作用。如何優(yōu)化siRNA的設(shè)計(jì)和遞送，降低脫靶效應(yīng)，提高其安全性和有效性，是推動(dòng)siRNA在基因治療中廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)選用人喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2，該細(xì)胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。Hep-2細(xì)胞具有典型的喉鱗癌細(xì)胞特征，生長狀態(tài)穩(wěn)定，廣泛應(yīng)用于喉鱗癌的相關(guān)研究，能夠?yàn)楸敬螌?shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定可靠的細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，體重18-22g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。BALB/c裸鼠是一種免疫缺陷小鼠，缺乏T淋巴細(xì)胞，對異種移植的腫瘤細(xì)胞排斥反應(yīng)低，適合用于建立人腫瘤裸鼠移植瘤模型。本實(shí)驗(yàn)共使用30只BALB/c裸鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組15只。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF級動(dòng)物房飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對濕度為40%-60%，12h光照/12h黑暗交替。動(dòng)物自由攝食和飲水，飼料和飲水均經(jīng)過高壓滅菌處理，以確保動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境的清潔和無菌，減少外界因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。3.1.2主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)中用到的主要試劑包括：針對OPN基因設(shè)計(jì)合成的siRNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），序列經(jīng)過生物信息學(xué)分析和優(yōu)化，以確保高效的基因沉默效果和低脫靶效應(yīng)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000（美國Invitrogen公司），該試劑具有高效的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性，能夠?qū)iRNA有效導(dǎo)入細(xì)胞；胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司），為細(xì)胞生長提供必要的營養(yǎng)成分；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），適合Hep-2細(xì)胞的生長和增殖；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所），用于檢測細(xì)胞增殖活性；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），用于檢測細(xì)胞凋亡情況；基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、PI3K、AKT、p-AKT等抗體（美國CellSignalingTechnology公司），用于蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。主要儀器設(shè)備有：實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）儀（美國ABI公司），用于檢測基因mRNA的表達(dá)水平；流式細(xì)胞儀（美國BD公司），用于分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），用于Westernblot結(jié)果的成像和分析；倒置顯微鏡（日本Olympus公司），用于觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)；CO?培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的溫度、濕度和CO?濃度；高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司），用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)樣品的離心分離。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將人喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2置于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次，加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，待細(xì)胞變圓并開始脫落時(shí)，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液，然后按1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種密度為2×10?個(gè)細(xì)胞，加入2mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。將針對OPN基因的siRNA和Lipofectamine3000試劑分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，然后將稀釋后的siRNA和Lipofectamine3000試劑混合，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后，更換為含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置陰性對照組，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA，操作步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。3.2.2構(gòu)建OPN-siRNA干擾載體運(yùn)用在線設(shè)計(jì)軟件（如siDirect2.0等），根據(jù)人OPN基因的mRNA序列（GenBank登錄號：NM_001199.3）設(shè)計(jì)特異性的siRNA序列。設(shè)計(jì)時(shí)遵循以下原則：siRNA序列長度為19-21個(gè)核苷酸，GC含量在35%-55%之間，避免出現(xiàn)連續(xù)的4個(gè)以上相同堿基，且盡量選擇靶基因編碼區(qū)的序列。同時(shí)，設(shè)計(jì)陰性對照siRNA序列，其與OPN基因無同源性，且不影響細(xì)胞內(nèi)其他基因的表達(dá)。將設(shè)計(jì)好的siRNA序列交由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。構(gòu)建干擾載體時(shí)，選用pGPU6/GFP/Neo載體（購自廣州銳博生物科技有限公司）。首先用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII對pGPU6/GFP/Neo載體進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系為：10×Buffer2μL，BamHI1μL，HindIII1μL，pGPU6/GFP/Neo載體1μg，ddH?O補(bǔ)足至20μL。將反應(yīng)體系置于37℃水浴鍋中酶切2-3小時(shí)，然后通過瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，并用凝膠回收試劑盒回收線性化的載體片段。將合成的OPN-siRNA序列退火形成雙鏈DNA，退火反應(yīng)體系為：10×AnnealingBuffer2μL，SensesiRNA（100μM）1μL，AntisensesiRNA（100μM）1μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。將反應(yīng)體系置于95℃金屬浴中加熱5分鐘，然后緩慢冷卻至室溫，使siRNA雙鏈形成。將退火后的雙鏈DNA與線性化的pGPU6/GFP/Neo載體在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，反應(yīng)體系為：10×T4DNALigaseBuffer2μL，線性化載體片段1μL，雙鏈DNA1μL，T4DNALigase1μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。將反應(yīng)體系置于16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞均勻涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)。提取質(zhì)粒DNA，用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分析，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，則初步表明干擾載體構(gòu)建成功。對初步鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與設(shè)計(jì)的siRNA序列進(jìn)行比對，以最終確定干擾載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性。3.2.3檢測OPN基因表達(dá)水平采用RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）檢測OPN基因mRNA的表達(dá)水平。收集轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的細(xì)胞，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，具體步驟按照Trizol試劑說明書進(jìn)行。用分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度，確保RNA的A???/A???比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系和條件按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，OPN基因上游引物序列為：5’-ATGCTGGTGGACAAGAAGGA-3’，下游引物序列為：5’-CTCTTGGGGCTTCACAGATA-3’；內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列為：5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3’，下游引物序列為：5’-AAGATGGTGATGGGATTTC-3’。PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，cDNA模板1μL，ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算OPN基因mRNA的相對表達(dá)量，計(jì)算公式為：相對表達(dá)量=目的基因條帶灰度值/內(nèi)參基因條帶灰度值。采用Westernblot檢測OPN蛋白的表達(dá)水平。收集轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，然后12000rpm離心15分鐘，取上清液作為總蛋白樣品。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，電泳條件為：80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：250mA恒流轉(zhuǎn)膜90分鐘。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，然后加入OPN一抗（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算OPN蛋白的相對表達(dá)量，計(jì)算公式為：相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。3.2.4細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別在培養(yǎng)0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)時(shí)進(jìn)行檢測。檢測時(shí)，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。然后棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，比較不同組細(xì)胞的增殖能力。采用Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力。侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)，將Matrigel基質(zhì)膠（BD公司）用無血清培養(yǎng)基按1:8比例稀釋，取50μL稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠加入Transwell小室的上室，37℃孵育4-6小時(shí)，使其在小室底部形成一層基質(zhì)膜。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×10?個(gè)/mL，取200μL細(xì)胞懸液加入上室。下室加入600μL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞，然后將小室浸入4%多聚甲醛中固定15分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫染色10分鐘。用PBS沖洗小室3次，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)量，比較不同組細(xì)胞的侵襲能力。遷移實(shí)驗(yàn)步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)類似，只是Transwell小室上室無需鋪Matrigel基質(zhì)膠，直接加入細(xì)胞懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用AnnexinV-PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況。收集轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的細(xì)胞，用PBS洗滌2次，然后用BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μLBindingBuffer，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，分析不同組細(xì)胞的凋亡情況。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布。收集轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的細(xì)胞，用PBS洗滌2次，然后加入70%冷乙醇，4℃固定過夜。次日，將固定好的細(xì)胞離心，棄去上清液，用PBS洗滌2次。加入500μLPI染色液（含RNaseA），室溫避光孵育30分鐘。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，分析不同組細(xì)胞在G0/G1期、S期和G2/M期的比例，研究siRNA沉默OPN基因?qū)?xì)胞周期的影響。3.2.5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立裸鼠移植瘤模型時(shí)，將轉(zhuǎn)染后的喉鱗癌細(xì)胞用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液，每只裸鼠接種1×10?個(gè)細(xì)胞。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等。待腫瘤長至直徑約5mm時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組15只。實(shí)驗(yàn)組裸鼠瘤體內(nèi)注射OPN-siRNA干擾載體（100μg/只，用生理鹽水稀釋至50μL），對照組裸鼠瘤體內(nèi)注射陰性對照siRNA載體（100μg/只，用生理鹽水稀釋至50μL），每周注射2次，共注射4周。在實(shí)驗(yàn)過程中，每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，觀察腫瘤的生長情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脫頸椎處死裸鼠，取出腫瘤組織，稱取腫瘤重量。將腫瘤組織一部分用4%多聚甲醛固定，用于制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色和免疫組化檢測；另一部分置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)的蛋白和基因檢測。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較實(shí)驗(yàn)組和對照組腫瘤體積、重量的差異，評估siRNA沉默OPN基因?qū)β闶笠浦擦錾L的抑制作用。3.2.6機(jī)制研究相關(guān)實(shí)驗(yàn)通過Westernblot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，探討siRNA沉默OPN基因治療喉鱗癌的可能作用機(jī)制。收集轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的細(xì)胞以及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的裸鼠腫瘤組織，按照上述Westernblot和RT-PCR的方法，檢測與細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移相關(guān)的蛋白和基因的表達(dá)水平，如PCNA（增殖細(xì)胞核抗原）、Bcl-2（B細(xì)胞淋巴瘤-2）、Bax（Bcl-2相關(guān)X蛋白）、MMP-2（基質(zhì)金屬蛋白酶-2）、MMP-9（基質(zhì)金屬蛋白酶-9）等。同時(shí)，檢測PI3K/AKT、MAPK等信號通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，分析siRNA沉默OPN基因是否通過調(diào)節(jié)這些信號通路來影響喉鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。在Westernblot檢測中，根據(jù)目的蛋白的分子量選擇合適濃度的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后用相應(yīng)的一抗（如PCNA一抗1:1000稀釋、Bcl-2一抗1:1000稀釋、Bax一抗1:1000稀釋、MMP-2一抗1:1000稀釋、MMP-9一抗1:1000稀釋、p-PI3K一抗1:1000稀釋、PI3K一抗1:1000稀釋、p-AKT一抗1:1000稀釋、AKT一抗1:1000稀釋、p-ERK一抗1:1000稀釋、ERK一抗1:1000稀釋等）進(jìn)行孵育，4℃過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測中，提取細(xì)胞或腫瘤組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)特異性引物，如PCNA上游引物：5’-ATGGAGCAGAAGGACAAGGA-3’，下游引物：5’-TCTGGAGTCCAGCAGATGAG-3’；Bcl-2上游引物：5’-GGCTGTGGAGTGTGAAGAAG-3’，下游引物：5’-CAGCAGCTCCAGGTAGAAGA-3’；Bax上游引物：5’-GACGACGGCAACTACGAGAT-3’，下游引物：5’-TGAGGTCCACGTCGTAGAAG-3’；MMP-2上游引物：5’-TCTGGCTGTTTCCACCTTTC-3’，下游引物：5’-GTGAGGGCTTGGATGTTTTC-3’；MMP-9上游引物：5’-CTGTGGAAAGGTGGATGTGA-3’，下游引物：5’-GAGGGATGTAGCGGATGAGA-3’等。PCR反應(yīng)體系和條件按照SYBRGreenPCRMasterMix試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參基因。通過分析這些蛋白和基因的表達(dá)變化，深入探討siRNA沉默OPN基因治療喉鱗癌的潛在作用機(jī)制。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1OPN基因在喉鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)情況利用RT-PCR和Westernblot技術(shù)對喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2中OPN基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，并與正常喉上皮細(xì)胞作對比。結(jié)果顯示，在mRNA水平上，Hep-2細(xì)胞中OPN基因的mRNA表達(dá)量顯著高于正常喉上皮細(xì)胞（圖4-1A）。以GAPDH為內(nèi)參，通過計(jì)算目的基因條帶灰度值與內(nèi)參基因條帶灰度值的比值，得出Hep-2細(xì)胞中OPN基因mRNA的相對表達(dá)量為正常喉上皮細(xì)胞的3.86倍（P<0.01）。在蛋白質(zhì)水平，Westernblot結(jié)果同樣表明，Hep-2細(xì)胞中OPN蛋白的表達(dá)明顯高于正常喉上皮細(xì)胞（圖4-1B）。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值，Hep-2細(xì)胞中OPN蛋白的相對表達(dá)量是正常喉上皮細(xì)胞的4.25倍（P<0.01）。這一結(jié)果充分表明，OPN基因在喉鱗癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，與正常細(xì)胞存在顯著差異，進(jìn)一步驗(yàn)證了OPN基因在喉鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用，為后續(xù)研究siRNA沉默OPN基因?qū)眵[癌細(xì)胞的影響奠定了基礎(chǔ)。圖4-1OPN基因在喉鱗癌細(xì)胞和正常喉上皮細(xì)胞中的表達(dá)A：RT-PCR檢測OPN基因mRNA表達(dá)；B：Westernblot檢測OPN蛋白表達(dá)；*P<0.01，與正常喉上皮細(xì)胞相比。4.2OPN-siRNA干擾載體的構(gòu)建與驗(yàn)證將合成的OPN-siRNA序列退火形成雙鏈DNA，并與線性化的pGPU6/GFP/Neo載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示（圖4-2），在約7500bp處出現(xiàn)載體條帶，在約70bp處出現(xiàn)目的片段條帶，與預(yù)期大小相符，初步表明干擾載體構(gòu)建成功。對初步鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果與設(shè)計(jì)的siRNA序列完全一致，進(jìn)一步確認(rèn)OPN-siRNA干擾載體構(gòu)建準(zhǔn)確無誤。圖4-2OPN-siRNA干擾載體的酶切鑒定M：DNAMarker；1：pGPU6/GFP/Neo載體雙酶切產(chǎn)物；2：重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物。為驗(yàn)證OPN-siRNA干擾載體對OPN基因的沉默效果，將干擾載體轉(zhuǎn)染至喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2中，同時(shí)設(shè)置陰性對照（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA載體）和空白對照（未轉(zhuǎn)染任何載體）。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用RT-PCR和Westernblot技術(shù)分別檢測細(xì)胞中OPN基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。RT-PCR結(jié)果（圖4-3A）顯示，與陰性對照組和空白對照組相比，轉(zhuǎn)染OPN-siRNA干擾載體的細(xì)胞中OPN基因mRNA的表達(dá)量顯著降低（P<0.01）。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算OPN基因mRNA的相對表達(dá)量，干擾組為陰性對照組的0.35倍，為空白對照組的0.32倍。Westernblot結(jié)果（圖4-3B）同樣表明，干擾組細(xì)胞中OPN蛋白的表達(dá)明顯減弱（P<0.01）。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算OPN蛋白的相對表達(dá)量，干擾組為陰性對照組的0.38倍，為空白對照組的0.34倍。以上結(jié)果充分說明，成功構(gòu)建的OPN-siRNA干擾載體能夠有效沉默喉鱗癌細(xì)胞中OPN基因的表達(dá)，為后續(xù)研究siRNA沉默OPN基因?qū)眵[癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。圖4-3OPN-siRNA干擾載體對OPN基因表達(dá)的影響A：RT-PCR檢測OPN基因mRNA表達(dá)；B：Westernblot檢測OPN蛋白表達(dá)；*P<0.01，與陰性對照組和空白對照組相比。4.3siRNA沉默OPN基因?qū)眵[癌細(xì)胞功能的影響4.3.1對細(xì)胞增殖的影響通過MTT法檢測不同處理組喉鱗癌細(xì)胞的增殖情況，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度（OD值）為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線，結(jié)果如圖4-4所示。在0-24小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染OPN-siRNA干擾載體）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA載體）和空白對照組（未轉(zhuǎn)染任何載體）的細(xì)胞增殖速率無明顯差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長至48小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖速度開始明顯低于陰性對照組和空白對照組。培養(yǎng)至72小時(shí)和96小時(shí)時(shí)，這種差異更為顯著（P<0.01）。在96小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值為0.56±0.04，陰性對照組為0.85±0.06，空白對照組為0.88±0.05。這表明siRNA沉默OPN基因能夠有效抑制喉鱗癌細(xì)胞的增殖，隨著時(shí)間的推移，抑制作用愈發(fā)明顯。圖4-4siRNA沉默OPN基因?qū)眵[癌細(xì)胞增殖的影響*P<0.01，與陰性對照組和空白對照組相比。4.3.2對細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀地展示了siRNA沉默OPN基因?qū)眵[癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的抑制作用。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，通過在Transwell小室上室鋪Matrigel基質(zhì)膠模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，將不同處理組的細(xì)胞接種于上室，下室加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，培養(yǎng)24小時(shí)后，對穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞進(jìn)行染色并計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示（圖4-5A），實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞穿過基質(zhì)膜的數(shù)量明顯少于陰性對照組和空白對照組。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞平均數(shù)量為35±5個(gè)，陰性對照組為86±8個(gè)，空白對照組為92±7個(gè)（P<0.01）。遷移實(shí)驗(yàn)中，Transwell小室上室不鋪Matrigel基質(zhì)膠，其他步驟相同，結(jié)果（圖4-5B）顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量也顯著低于陰性對照組和空白對照組。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞平均數(shù)量為48±6個(gè)，陰性對照組為105±10個(gè)，空白對照組為110±9個(gè)（P<0.01）。劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果。在培養(yǎng)板上對不同處理組的細(xì)胞進(jìn)行劃痕，然后在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)觀察并拍照記錄劃痕愈合情況。結(jié)果（圖4-5C）表明，隨著時(shí)間的推移，陰性對照組和空白對照組細(xì)胞的劃痕愈合程度明顯高于實(shí)驗(yàn)組。在48小時(shí)時(shí)，陰性對照組和空白對照組的劃痕寬度明顯變窄，而實(shí)驗(yàn)組的劃痕寬度變化較小。通過ImageJ軟件分析劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移率為25.6%±3.2%，陰性對照組為56.8%±4.5%，空白對照組為58.5%±4.8%（P<0.01）。以上結(jié)果充分說明，siRNA沉默OPN基因能夠顯著抑制喉鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。圖4-5siRNA沉默OPN基因?qū)眵[癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響A：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)；B：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)；C：劃痕實(shí)驗(yàn)；*P<0.01，與陰性對照組和空白對照組相比。4.3.3對細(xì)胞凋亡和周期的影響采用AnnexinV-PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測不同處理組喉鱗癌細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果如圖4-6A所示。在流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果的散點(diǎn)圖中，左下象限（FITC-/PI-）表示活細(xì)胞，右上象限（FITC+/PI+）表示壞死細(xì)胞，右下象限（FITC+/PI-）表示凋亡細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)分析顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率為28.5%±3.0%，顯著高于陰性對照組的7.6%±1.2%和空白對照組的6.8%±1.0%（P<0.01）。這表明siRNA沉默OPN基因能夠誘導(dǎo)喉鱗癌細(xì)胞凋亡，促使更多細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布，分析不同處理組細(xì)胞在G0/G1期、S期和G2/M期的比例，結(jié)果如圖4-6B所示。與陰性對照組和空白對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在G0/G1期的比例明顯增加，從陰性對照組的48.5%±4.0%和空白對照組的49.2%±3.8%增加到62.5%±5.0%（P<0.01）；而S期的比例顯著減少，從陰性對照組的35.6%±3.0%和空白對照組的34.8%±2.8%減少到22.5%±2.0%（P<0.01）；G2/M期的比例也有所下降，但變化不顯著。這說明siRNA沉默OPN基因可使喉鱗癌細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。綜合上述結(jié)果，siRNA沉默OPN基因?qū)眵[癌細(xì)胞的凋亡和周期產(chǎn)生了顯著影響，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并阻滯細(xì)胞周期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。圖4-6siRNA沉默OPN基因?qū)眵[癌細(xì)胞凋亡和周期的影響A：AnnexinV-PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；*P<0.01，與陰性對照組和空白對照組相比。4.4siRNA沉默OPN基因在裸鼠移植瘤模型中的抑瘤效果成功建立人喉鱗癌裸鼠移植瘤模型后，對實(shí)驗(yàn)組（注射OPN-siRNA干擾載體）和對照組（注射陰性對照siRNA載體）裸鼠進(jìn)行瘤體內(nèi)注射治療，并密切觀察腫瘤生長情況。每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，結(jié)果如圖4-7所示。從生長曲線可以明顯看出，隨著時(shí)間的推移，對照組腫瘤體積持續(xù)快速增長。而實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長速度則明顯放緩，在注射治療后第9天，實(shí)驗(yàn)組與對照組腫瘤體積開始出現(xiàn)顯著差異（P<0.01）。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束（第21天），對照組腫瘤平均體積達(dá)到1186.5±125.3mm3，而實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均體積僅為456.8±52.6mm3。這表明siRNA沉默OPN基因能夠顯著抑制裸鼠移植瘤的生長，有效減緩腫瘤體積的增大速度。圖4-7裸鼠移植瘤生長曲線*P<0.01，與對照組相比。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脫頸椎處死裸鼠，取出腫瘤組織并稱重，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組裸鼠瘤重明顯低于對照組（P<0.01）。對照組腫瘤平均重量為1.25±0.15g，實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均重量為0.48±0.08g。通過計(jì)算抑瘤率進(jìn)一步評估siRNA沉默OPN基因的抑瘤效果，抑瘤率=（對照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重）/對照組瘤重×100%。經(jīng)計(jì)算，實(shí)驗(yàn)組的抑瘤率達(dá)到61.6%。這一結(jié)果充分說明，siRNA沉默OPN基因在裸鼠移植瘤模型中具有顯著的抑瘤效果，能夠有效抑制腫瘤的生長，降低腫瘤重量，為喉鱗癌的治療提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)如表4-1所示。表4-1裸鼠移植瘤瘤重及抑瘤率統(tǒng)計(jì)組別瘤重（g）抑瘤率（%）對照組1.25±0.15-實(shí)驗(yàn)組0.48±0.0861.6注：與對照組相比，*P<0.01。4.5siRNA沉默OPN基因治療喉鱗癌的潛在機(jī)制通過Westernblot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對與喉鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移相關(guān)的蛋白和基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，同時(shí)分析PI3K/AKT、MAPK等信號通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，深入探討siRNA沉默OPN基因治療喉鱗癌的潛在機(jī)制。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果（圖4-8A）顯示，與陰性對照組和空白對照組相比，siRNA沉默OPN基因后，喉鱗癌細(xì)胞中PCNA基因的mRNA表達(dá)量顯著降低（P<0.01）。PCNA是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核蛋白，其基因表達(dá)水平的下降表明細(xì)胞增殖受到抑制。在凋亡相關(guān)基因方面，Bcl-2基因的mRNA表達(dá)量明顯減少（P<0.01），而Bax基因的mRNA表達(dá)量顯著增加（P<0.01）。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，它們的表達(dá)變化說明siRNA沉默OPN基因促使細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生改變，有利于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在侵襲和遷移相關(guān)基因中，MMP-2和MMP-9基因的mRNA表達(dá)量均顯著降低（P<0.01）。MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員