人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白發(fā)酵與純化工藝的深度剖析與優(yōu)化策略一、引言1.1研究背景人白介素-2（Interleukin-2，IL-2）作為一種由活化的T淋巴細胞和其他種類白細胞產(chǎn)生的Glycoprotein激素，在生物醫(yī)藥領域有著極為重要的地位。IL-2能夠誘導、維持和增強免疫反應，這使其在腫瘤治療方面展現(xiàn)出獨特的價值。相關(guān)研究表明，IL-2可以激活自然殺傷細胞（NK細胞）和細胞毒性T淋巴細胞（CTL），增強它們對腫瘤細胞的殺傷能力，為腫瘤患者帶來了新的治療希望。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面，IL-2參與神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)，對一些神經(jīng)炎癥相關(guān)的疾病有著潛在的治療作用，盡管目前相關(guān)研究仍處于探索階段，但已展現(xiàn)出積極的研究前景。對于免疫功能障礙疾病，如艾滋病等導致的免疫缺陷，IL-2可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，一定程度上改善患者的免疫狀態(tài)。然而，IL-2在實際應用中面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)，其在體內(nèi)存在時間短，極易被降解。這就意味著，在治療過程中需要頻繁給藥，不僅給患者帶來極大的痛苦，還增加了治療成本，同時頻繁給藥可能帶來更多的副作用，限制了IL-2的廣泛應用。因此，尋找合適的載體來增強其穩(wěn)定性和生物活性成為了研究的關(guān)鍵方向。人血清白蛋白（HumanSerumAlbumin，HSA）作為一種天然的載體蛋白質(zhì)，在藥物傳遞領域應用廣泛。HSA具有獨特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，它能夠改善藥物的生物分布，使藥物更有效地到達作用部位。同時，HSA還能降低藥物的毒性，提高藥物的安全性。例如，在一些化療藥物的傳遞中，HSA與藥物結(jié)合后，可以減少藥物對正常組織的損傷，提高治療效果。將人白介素-2與人血清白蛋白融合，形成人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白，為解決IL-2的應用困境提供了新的思路。這種融合蛋白不僅可以增強白介素-2的藥物性質(zhì)和穩(wěn)定性，還能擴大其在免疫治療中的應用范圍。通過融合，IL-2的半衰期得以延長，減少了給藥次數(shù)，降低了患者的痛苦和治療成本；同時，穩(wěn)定性的增強使得IL-2在體內(nèi)能夠更有效地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，提高治療效果。在當前技術(shù)條件下，人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白的發(fā)酵和純化仍面臨諸多挑戰(zhàn)。在發(fā)酵過程中，如何提高融合蛋白的表達量是一個關(guān)鍵問題。不同的發(fā)酵條件，如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、誘導劑的種類和濃度等，都會對融合蛋白的表達產(chǎn)生顯著影響。選擇合適的培養(yǎng)基成分，既能滿足大腸桿菌生長的需求，又能促進融合蛋白的高效表達，是一項復雜的優(yōu)化工作。培養(yǎng)溫度的波動可能導致蛋白質(zhì)折疊異常，影響融合蛋白的活性和產(chǎn)量。誘導劑的使用時機和濃度控制不當，也可能無法實現(xiàn)融合蛋白的最佳表達。此外，發(fā)酵過程中的代謝副產(chǎn)物積累可能對細胞生長和融合蛋白表達產(chǎn)生抑制作用，如何有效控制代謝副產(chǎn)物也是發(fā)酵過程中需要解決的問題。在純化方面，由于融合蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)較為復雜，傳統(tǒng)的純化方法往往難以滿足高純度的要求。例如，常規(guī)的親和層析方法在純化人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白時，可能會出現(xiàn)非特異性吸附，導致雜質(zhì)去除不徹底，影響融合蛋白的純度和活性。離子交換色譜在處理該融合蛋白時，可能會因為其特殊的電荷分布，導致分離效果不佳。而且，在純化過程中，如何保證融合蛋白的生物活性不被破壞也是一個重要的考量因素。一些純化步驟可能會對融合蛋白的結(jié)構(gòu)造成影響，從而降低其生物活性，因此需要開發(fā)更加溫和、高效的純化技術(shù)。1.2研究目的與意義本研究旨在通過對大腸桿菌發(fā)酵條件的系統(tǒng)優(yōu)化，提高人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白的產(chǎn)量，同時開發(fā)高效、溫和的純化技術(shù)，顯著提升融合蛋白的純度，從而獲得高質(zhì)量的人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白。通過嚴謹?shù)膶嶒炘O計和數(shù)據(jù)分析，深入探究發(fā)酵條件對融合蛋白表達的影響機制，以及純化技術(shù)中各因素對融合蛋白純度和活性的作用規(guī)律，為融合蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學依據(jù)和技術(shù)支持。本研究具有重要的理論和實踐意義。在理論層面，深入研究融合蛋白的發(fā)酵和純化過程，有助于揭示蛋白質(zhì)表達和分離的內(nèi)在機制，豐富生物技術(shù)領域的基礎理論知識。對發(fā)酵條件的優(yōu)化研究，能夠為其他重組蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)提供參考模型，推動微生物發(fā)酵技術(shù)在生物醫(yī)藥領域的進一步發(fā)展。在純化技術(shù)方面，開發(fā)新的純化方法或改進現(xiàn)有方法，將為蛋白質(zhì)純化技術(shù)的創(chuàng)新提供思路，拓展蛋白質(zhì)分離科學的研究范疇。從實踐角度來看，提高人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白的產(chǎn)量和純度，能夠降低生產(chǎn)成本，使得這種具有重要治療價值的融合蛋白更易于大規(guī)模生產(chǎn)和臨床應用。這將為腫瘤、免疫功能障礙等疾病的治療提供更多有效的藥物選擇，有助于提高患者的治療效果和生活質(zhì)量，為生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展注入新的活力，具有顯著的社會和經(jīng)濟效益。二、人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白概述2.1人白介素-2特性人白介素-2（IL-2）是一種結(jié)構(gòu)獨特且功能多樣的細胞因子。其成熟形式由133個氨基酸組成，是分子量約為15.5kDa的糖基化球狀蛋白，具有典型的4-α-螺旋束結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)賦予了IL-2獨特的生物學活性和穩(wěn)定性，對其發(fā)揮功能起著關(guān)鍵作用。在其結(jié)構(gòu)中，Cys58和Cys105之間形成的二硫橋至關(guān)重要，一旦二硫橋被破壞，IL-2的生物活性將顯著降低甚至喪失。IL-2在免疫系統(tǒng)中扮演著極為關(guān)鍵的角色，具有多效性的免疫調(diào)節(jié)功能。它主要由活化的T淋巴細胞（如CD4Th0細胞、輔助性CD4Th1細胞和細胞毒性CD8Tc1細胞）分泌，同時，先天淋巴樣細胞、活化的CD8T細胞、樹突狀細胞、B細胞和肥大細胞等也能少量分泌。IL-2的主要功能之一是促進T淋巴細胞的生長和增殖。在T淋巴細胞受到抗原刺激后，IL-2能夠與T淋巴細胞表面的IL-2受體（IL-2R）結(jié)合，激活細胞內(nèi)的信號傳導通路，促進T淋巴細胞進入細胞周期，實現(xiàn)快速增殖，從而增強機體的免疫應答能力。IL-2可以增強自然殺傷細胞（NK細胞）的殺傷活性，使NK細胞能夠更有效地識別和殺傷被病原體感染的細胞以及腫瘤細胞。對于B淋巴細胞，IL-2能夠促進其分化和產(chǎn)生免疫球蛋白，增強體液免疫反應。在免疫調(diào)節(jié)方面，IL-2不僅參與免疫反應的啟動，促進外周免疫細胞的生長和發(fā)育，還在后續(xù)的免疫響應中具有促凋亡作用，從而精細地調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的平衡，防止免疫反應過度或不足。在臨床應用方面，IL-2具有重要的價值。在腫瘤治療領域，IL-2作為一種免疫治療藥物，已獲得美國食品和藥物管理局（FDA）的批準。它可以激活體內(nèi)的細胞毒性T淋巴細胞（CTL）和NK細胞，增強它們對腫瘤細胞的殺傷能力，達到治療腫瘤的目的。例如，對于腎細胞癌和黑色素瘤患者，IL-2治療能夠顯著提高患者的生存率和生活質(zhì)量。IL-2還可以用于治療先天或后天免疫缺陷癥，如艾滋病患者，通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，提高患者的細胞免疫功能和抗感染能力。對于一些自身免疫性疾病，如類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，IL-2可以調(diào)節(jié)免疫平衡，緩解疾病癥狀。然而，由于IL-2在體內(nèi)的半衰期較短，容易被降解，這限制了其臨床應用效果，通常需要頻繁給藥，增加了患者的痛苦和治療成本。2.2人血清白蛋白特性人血清白蛋白（HSA）是人體血漿中含量最為豐富的蛋白質(zhì)，約占血漿總蛋白的60%，其在維持血漿膠體滲透壓、物質(zhì)運輸、營養(yǎng)儲備等方面發(fā)揮著不可或缺的作用。HSA由585個氨基酸殘基組成，分子量約為66.5kDa，是一種單鏈非糖基化的球狀蛋白。其結(jié)構(gòu)包含三個同源的結(jié)構(gòu)域（DomainⅠ、DomainⅡ和DomainⅢ），每個結(jié)構(gòu)域又進一步分為兩個亞結(jié)構(gòu)域（A和B）。這種獨特的三級結(jié)構(gòu)賦予了HSA高度的穩(wěn)定性和可塑性，使其能夠適應不同的生理環(huán)境和功能需求。HSA分子中含有17個二硫鍵和1個游離的半胱氨酸殘基（Cys34），二硫鍵對于維持HSA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性至關(guān)重要，而Cys34則在一些氧化還原反應和藥物結(jié)合過程中發(fā)揮作用。在體內(nèi)，HSA具有多種重要功能。HSA能夠維持血漿膠體滲透壓，調(diào)節(jié)血管內(nèi)外的水分分布，保證組織的正常灌注。當血漿中HSA含量降低時，膠體滲透壓下降，水分會從血管內(nèi)滲出到組織間隙，導致水腫等癥狀。HSA是一種高效的運輸載體，能夠結(jié)合和運輸多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)，如脂肪酸、膽紅素、金屬離子、激素、藥物等。以脂肪酸運輸為例，HSA通過與脂肪酸結(jié)合，將其從脂肪組織運輸?shù)叫枰芰康慕M織細胞，為細胞代謝提供能量。HSA還參與維持血液的酸堿平衡，通過其分子中的氨基酸殘基的緩沖作用，調(diào)節(jié)血液的pH值，確保體內(nèi)酸堿環(huán)境的穩(wěn)定。作為藥物載體，HSA具有諸多優(yōu)勢。HSA具有良好的生物相容性，它是人體自身的蛋白質(zhì)，在體內(nèi)不會引起免疫排斥反應，這使得以HSA為載體的藥物能夠安全地在體內(nèi)循環(huán)和發(fā)揮作用。例如，在一些抗癌藥物的傳遞中，HSA與抗癌藥物結(jié)合后，能夠減少藥物對免疫系統(tǒng)的刺激，降低免疫相關(guān)的副作用。HSA的半衰期較長，在人體內(nèi)的半衰期約為19天，這意味著與HSA融合的藥物可以在體內(nèi)持續(xù)存在較長時間，從而延長藥物的作用時間，減少給藥次數(shù)。其獨特的結(jié)構(gòu)使其能夠結(jié)合多種藥物分子，通過不同的結(jié)合位點和作用方式，提高藥物的溶解度和穩(wěn)定性。對于一些難溶性藥物，與HSA結(jié)合后，能夠改善其在體內(nèi)的溶解和分散狀態(tài)，提高藥物的生物利用度。而且，部分腫瘤細胞表面高表達白蛋白受體，利用這一特性，HSA可以將耦合的藥物靶向輸送至腫瘤組織，實現(xiàn)腫瘤的靶向治療。HSA具有良好的穩(wěn)定性和可溶性。在生理條件下，HSA能夠保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和功能，抵抗外界環(huán)境的干擾。其分子內(nèi)的二硫鍵和緊密的折疊結(jié)構(gòu)使其具有較高的熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性。在一定溫度范圍內(nèi)，HSA的結(jié)構(gòu)和活性不會受到明顯影響。HSA在水溶液中具有良好的溶解性，這與其分子表面的親水性氨基酸分布有關(guān)。這種良好的溶解性使得HSA在體內(nèi)能夠自由運輸，同時也便于其在藥物制劑中的應用，有利于藥物的配制和給藥。2.3融合蛋白優(yōu)勢人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白巧妙地結(jié)合了人白介素-2和人血清白蛋白兩者的優(yōu)點，在藥物性能和臨床應用方面展現(xiàn)出諸多顯著優(yōu)勢。半衰期的延長是融合蛋白的關(guān)鍵優(yōu)勢之一。IL-2在體內(nèi)的半衰期極短，這嚴重限制了其藥效的持續(xù)發(fā)揮。研究表明，天然IL-2在人體內(nèi)的半衰期僅約為6-10分鐘，這意味著藥物需要頻繁給藥才能維持有效血藥濃度。而HSA具有長達19天的半衰期，將IL-2與HSA融合后，融合蛋白的半衰期得到了顯著延長。相關(guān)實驗數(shù)據(jù)顯示，融合蛋白在動物模型中的半衰期相較于單獨的IL-2延長了數(shù)倍，這使得藥物在體內(nèi)能夠持續(xù)發(fā)揮作用，大大減少了給藥次數(shù)，提高了患者的用藥依從性，降低了治療成本，同時也減少了頻繁給藥可能帶來的副作用。融合蛋白在穩(wěn)定性和可溶性方面也有明顯提升。HSA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠有效保護與之融合的蛋白免受外界環(huán)境的干擾。IL-2在溶液中的穩(wěn)定性較差，容易受到溫度、酸堿度等因素的影響而發(fā)生降解或失活。當IL-2與HSA融合后，HSA的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)為IL-2提供了保護，增強了融合蛋白的穩(wěn)定性。在一項對比實驗中，相同條件下，單獨的IL-2在儲存一定時間后活性明顯下降，而融合蛋白的活性保持相對穩(wěn)定。HSA良好的溶解性也改善了IL-2的溶解特性。IL-2在溶液中的溶解度有限，這可能影響其在體內(nèi)的吸收和分布。融合HSA后，融合蛋白的溶解度顯著提高，有利于藥物在體內(nèi)的運輸和擴散，使其能夠更有效地到達作用部位，發(fā)揮治療效果。在免疫調(diào)節(jié)活性方面，融合蛋白保留了IL-2的免疫調(diào)節(jié)功能。IL-2能夠激活T淋巴細胞、NK細胞等免疫細胞，增強機體的免疫應答。融合蛋白中的IL-2部分依然能夠與免疫細胞表面的受體結(jié)合，激活相關(guān)信號通路，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。而且，由于融合蛋白穩(wěn)定性和半衰期的提升，IL-2的免疫調(diào)節(jié)活性能夠在體內(nèi)更持久、穩(wěn)定地發(fā)揮，從而更有效地調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，增強機體對腫瘤細胞和病原體的抵抗能力。三、融合蛋白基因設計與表達載體構(gòu)建3.1融合蛋白基因設計融合蛋白基因序列的設計是整個研究的關(guān)鍵起始步驟，它直接關(guān)系到后續(xù)融合蛋白的表達、結(jié)構(gòu)和功能。在設計過程中，首先要確定人白介素-2（IL-2）基因與人血清白蛋白（HSA）基因的連接順序。綜合考慮兩者的生物學功能和結(jié)構(gòu)特點，將IL-2基因連接在HSA基因的N端。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)角度來看，IL-2的4-α-螺旋束結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，將其置于N端，有利于在融合蛋白整體結(jié)構(gòu)中保持其自身結(jié)構(gòu)的完整性，從而更好地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。從功能方面分析，IL-2主要作用于免疫系統(tǒng)，其在融合蛋白N端的暴露，使其更容易與免疫細胞表面的受體結(jié)合，激活免疫信號通路。連接肽的設計也是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。連接肽的主要作用是在不影響融合蛋白各部分功能的前提下，維持融合蛋白的整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，促進各結(jié)構(gòu)域之間的正確折疊和相互作用。經(jīng)過深入的文獻調(diào)研和生物信息學分析，選擇了富含甘氨酸（Gly）和絲氨酸（Ser）的柔性連接肽。Gly和Ser是兩種小的極性氨基酸，Gly由于沒有側(cè)鏈，具有較高的柔韌性，能夠為連接肽提供更大的構(gòu)象自由度；Ser則可以通過與水形成氫鍵，幫助維持連接結(jié)構(gòu)在水溶液中的穩(wěn)定性。具體選用的連接肽序列為(Gly4Ser)3，該序列在眾多融合蛋白研究中表現(xiàn)出良好的連接效果。其長度適中，既能保證IL-2和HSA之間有足夠的空間距離，避免兩者之間的空間位阻影響各自的結(jié)構(gòu)和功能，又能提供一定的柔性，使融合蛋白在空間構(gòu)象上更加靈活，有利于其在體內(nèi)的運輸和作用發(fā)揮。為了進一步提高融合蛋白在大腸桿菌中的表達水平，對融合蛋白基因進行密碼子優(yōu)化是必不可少的步驟。不同物種對密碼子的使用偏好存在差異，大腸桿菌作為常用的重組蛋白表達宿主，其密碼子使用偏好與人類基因存在明顯不同。如果直接使用天然的人源IL-2和HSA基因序列，在大腸桿菌中表達時，可能會因為密碼子不匹配導致翻譯效率低下，影響融合蛋白的表達產(chǎn)量。密碼子優(yōu)化的原理是基于大腸桿菌的密碼子使用頻率數(shù)據(jù)庫，將融合蛋白基因序列中的密碼子替換為大腸桿菌偏好使用的密碼子。在優(yōu)化過程中，使用專業(yè)的生物信息學軟件，如OptimumGene等。該軟件通過對大量大腸桿菌基因序列的分析，建立了密碼子使用頻率模型。將融合蛋白基因輸入軟件后，軟件會根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好，自動提出優(yōu)化建議，包括密碼子的替換、GC含量的調(diào)整等。在替換密碼子時，確保不改變氨基酸序列，以保證融合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能不受影響。通過對GC含量的調(diào)整，使其更符合大腸桿菌的偏好范圍，提高基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的效率。經(jīng)過密碼子優(yōu)化后，融合蛋白基因在大腸桿菌中的表達效率得到顯著提升，為后續(xù)的發(fā)酵和純化工作奠定了良好的基礎。3.2表達載體構(gòu)建在成功完成融合蛋白基因設計后，接下來的關(guān)鍵步驟便是將融合蛋白基因克隆到合適的表達載體中，構(gòu)建重組表達載體。這一過程對于后續(xù)融合蛋白在宿主細胞中的高效表達至關(guān)重要。首先，載體的選擇是構(gòu)建表達載體的首要考量因素。經(jīng)過全面的評估和分析，本研究選用了pET-28a(+)載體。pET-28a(+)載體在重組蛋白表達領域應用廣泛，具有諸多顯著優(yōu)勢。它含有強啟動子T7，T7啟動子具有極高的轉(zhuǎn)錄效率，能夠驅(qū)動外源基因在宿主細胞中大量轉(zhuǎn)錄，從而為融合蛋白的高表達提供了有力的保障。pET-28a(+)載體帶有His標簽編碼序列，這一標簽的存在為后續(xù)融合蛋白的純化工作帶來了極大的便利。His標簽可以與金屬離子（如鎳離子）特異性結(jié)合，利用這一特性，通過金屬親和層析技術(shù)，能夠高效地分離和純化融合蛋白，提高純化效率和純度。確定載體后，需要對融合蛋白基因和pET-28a(+)載體進行雙酶切操作。根據(jù)基因序列和載體圖譜，選擇了限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ。這兩種酶具有高度的特異性，能夠準確地識別并切割特定的DNA序列。NdeⅠ識別序列為CATATG，XhoⅠ識別序列為CTCGAG。在37℃條件下，將融合蛋白基因和pET-28a(+)載體分別與NdeⅠ和XhoⅠ進行充分反應。反應體系中包含適量的DNA、限制性內(nèi)切酶、緩沖液等成分，確保酶切反應能夠順利進行。酶切反應結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行檢測。在電泳過程中，DNA片段會根據(jù)其大小在凝膠中發(fā)生不同程度的遷移。通過與DNA分子量標準物進行對比，可以清晰地觀察到酶切后融合蛋白基因和pET-28a(+)載體的片段大小，確認酶切是否成功。如果酶切成功，融合蛋白基因會被切割成預期大小的片段，pET-28a(+)載體也會產(chǎn)生相應的線性化片段。將酶切后的融合蛋白基因片段與線性化的pET-28a(+)載體進行連接反應，這是構(gòu)建重組表達載體的核心步驟之一。連接反應使用T4DNA連接酶，該酶能夠催化DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，實現(xiàn)基因片段與載體的連接。在連接反應體系中，按照一定的摩爾比加入酶切后的融合蛋白基因片段和線性化的pET-28a(+)載體，同時添加T4DNA連接酶和相應的緩沖液。將反應體系置于16℃恒溫條件下孵育過夜，以確保連接反應充分進行。較長的孵育時間和適宜的溫度能夠提高連接效率，增加重組表達載體的生成量。完成連接反應后，需要將重組表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中。本研究選用大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞作為轉(zhuǎn)化宿主。DH5α感受態(tài)細胞具有易于轉(zhuǎn)化、生長迅速等優(yōu)點，適合用于重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴增。將連接產(chǎn)物與DH5α感受態(tài)細胞在冰上混合，進行冰浴處理，使感受態(tài)細胞能夠充分吸收重組表達載體。隨后，進行熱激處理，在42℃條件下短暫處理一定時間，然后迅速放回冰上冷卻。熱激處理能夠使細胞膜的通透性發(fā)生改變，促進重組表達載體進入感受態(tài)細胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細胞接種到含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上?？敲顾厥且环N抗生素，pET-28a(+)載體攜帶卡那霉素抗性基因，只有成功轉(zhuǎn)化了重組表達載體的大腸桿菌才能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長。通過這種篩選方式，可以有效地挑選出含有重組表達載體的陽性克隆。將接種后的培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待菌落長出后，隨機挑選多個單菌落進行進一步的鑒定。3.3重組質(zhì)粒驗證為了確保構(gòu)建的重組表達載體的準確性和可靠性，對轉(zhuǎn)化后得到的陽性克隆進行重組質(zhì)粒驗證是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。驗證過程主要包括酶切鑒定和測序驗證兩個關(guān)鍵步驟。酶切鑒定是初步驗證重組質(zhì)粒的常用方法。從含有重組表達載體的大腸桿菌DH5α陽性克隆中提取質(zhì)粒DNA，使用之前用于構(gòu)建重組質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ對提取的質(zhì)粒DNA進行雙酶切。酶切反應在37℃條件下進行，反應體系包含適量的質(zhì)粒DNA、限制性內(nèi)切酶、緩沖液等成分，確保酶切反應充分進行。酶切反應結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行分析。在電泳過程中，DNA片段會根據(jù)其大小在凝膠中發(fā)生不同程度的遷移。由于重組質(zhì)粒中插入的融合蛋白基因片段大小是已知的，經(jīng)過NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后，會產(chǎn)生特定大小的線性化載體片段和融合蛋白基因片段。如果酶切后的片段大小與預期相符，即在凝膠上出現(xiàn)與預期大小一致的條帶，就可以初步判斷重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。若未出現(xiàn)預期條帶，可能是重組質(zhì)粒構(gòu)建過程中出現(xiàn)錯誤，如基因片段未成功插入、載體自連等情況，需要進一步排查原因。測序驗證則是對重組質(zhì)粒進行精確驗證的關(guān)鍵步驟。將經(jīng)過酶切鑒定初步確認正確的重組質(zhì)粒送至專業(yè)的測序公司進行測序。測序公司通常采用Sanger測序技術(shù)，這是一種經(jīng)典且準確的DNA測序方法。在測序過程中，首先合成與重組質(zhì)粒上特定區(qū)域互補的引物，這些引物能夠與模板DNA結(jié)合，為DNA聚合酶提供起始位點。以重組質(zhì)粒為模板，在DNA聚合酶、dNTPs、緩沖液等反應體系的作用下，引物沿著模板DNA的3'端開始延伸，合成新的DNA鏈。在合成過程中，加入帶有熒光標記的ddNTP（雙脫氧核苷酸），由于ddNTP缺乏3'-OH基團，當它摻入到正在合成的DNA鏈中時，會終止DNA鏈的延伸。通過控制反應條件，使DNA鏈在不同位置隨機終止，從而產(chǎn)生一系列長度不同的DNA片段。這些片段經(jīng)過電泳分離后，根據(jù)其末端的熒光標記，可以確定每個片段的最后一個堿基，進而確定整個DNA序列。將測序得到的結(jié)果與融合蛋白基因的原始設計序列進行比對，如果兩者完全一致，說明重組質(zhì)粒中的融合蛋白基因序列正確，沒有發(fā)生突變或錯誤插入等情況。若出現(xiàn)堿基差異，需要分析差異的位置和類型，判斷其對融合蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響。如果差異導致氨基酸序列改變，可能會影響融合蛋白的活性和性質(zhì)，需要重新構(gòu)建重組質(zhì)粒。通過酶切鑒定和測序驗證這兩個步驟，可以全面、準確地驗證重組質(zhì)粒的正確性，為后續(xù)融合蛋白在大腸桿菌中的高效表達奠定堅實的基礎。在實際操作中，酶切鑒定快速簡便，能夠初步篩選出可能正確的重組質(zhì)粒；測序驗證則提供了高精度的序列信息，確保重組質(zhì)粒的基因序列與設計完全一致，兩者相互補充，缺一不可。四、融合蛋白的發(fā)酵工藝研究4.1表達系統(tǒng)選擇在生物制藥領域，表達系統(tǒng)的選擇對于重組蛋白的生產(chǎn)至關(guān)重要，它直接影響著蛋白的產(chǎn)量、質(zhì)量和生產(chǎn)成本。常見的表達系統(tǒng)包括大腸桿菌表達系統(tǒng)、畢赤酵母表達系統(tǒng)、中國倉鼠卵巢細胞（CHO）表達系統(tǒng)等，每種表達系統(tǒng)都有其獨特的優(yōu)缺點。大腸桿菌表達系統(tǒng)是最早被廣泛應用且目前技術(shù)最為成熟的表達系統(tǒng)之一。其具有諸多顯著優(yōu)勢，首先是遺傳背景清晰，經(jīng)過長期的研究，大腸桿菌的基因序列、代謝途徑等已被深入了解，這為基因操作和發(fā)酵調(diào)控提供了堅實的理論基礎。大腸桿菌生長迅速，在適宜的條件下，其代時可短至20分鐘左右，能夠在短時間內(nèi)實現(xiàn)菌體的大量擴增，從而提高蛋白的表達量。以生產(chǎn)人胰島素為例，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，可在較短時間內(nèi)獲得大量的胰島素前體，經(jīng)過后續(xù)加工后滿足市場需求。大腸桿菌表達系統(tǒng)的成本相對較低，其培養(yǎng)基成分簡單，主要包含碳源、氮源、無機鹽等，價格較為低廉。而且大腸桿菌對培養(yǎng)設備的要求不高，普通的發(fā)酵罐即可滿足其培養(yǎng)需求，這大大降低了生產(chǎn)成本，使得大規(guī)模生產(chǎn)成為可能。此外，大腸桿菌表達系統(tǒng)的表達量通常較高，部分重組蛋白的表達量可占菌體總蛋白的30%以上。在一些文獻報道中，利用優(yōu)化的大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白，其表達量甚至可以達到更高水平，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了有力支持。然而，大腸桿菌表達系統(tǒng)也存在一些明顯的局限性。大腸桿菌缺乏真核細胞所具有的復雜翻譯后修飾能力，如糖基化、磷酸化等修飾在大腸桿菌中難以準確進行。對于一些需要特定修飾才能發(fā)揮生物活性的蛋白，如某些治療性抗體，大腸桿菌表達系統(tǒng)就無法滿足要求。在表達過程中，大腸桿菌容易形成包涵體。當重組蛋白表達量過高時，由于缺乏正確折疊的輔助因子和合適的折疊環(huán)境，蛋白多肽鏈會相互纏繞聚集，形成不溶性的包涵體。這不僅增加了后續(xù)蛋白復性的難度和成本，而且復性過程中蛋白的活性回收率往往較低。大腸桿菌還可能產(chǎn)生內(nèi)毒素，內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁的組成成分，在發(fā)酵過程中可能會釋放到發(fā)酵液中。內(nèi)毒素的存在會影響重組蛋白的質(zhì)量和安全性，尤其是對于藥用蛋白，需要進行嚴格的內(nèi)毒素去除工藝，這進一步增加了生產(chǎn)成本和工藝的復雜性。畢赤酵母表達系統(tǒng)作為一種真核表達系統(tǒng)，具有獨特的優(yōu)勢。它能夠進行一定程度的翻譯后修飾，如糖基化修飾，雖然其糖基化模式與哺乳動物細胞存在差異，但對于一些蛋白來說，這種修飾能夠提高蛋白的穩(wěn)定性和生物活性。畢赤酵母生長迅速，培養(yǎng)條件相對簡單，與大腸桿菌類似，它可以在較為簡單的培養(yǎng)基中生長，且對培養(yǎng)設備的要求不高。同時，畢赤酵母具有較高的蛋白表達量，在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，某些重組蛋白的表達量可達到克級水平。畢赤酵母自身分泌到培養(yǎng)基中的蛋白較少，這使得重組蛋白的純化過程相對簡單，能夠有效降低純化成本，提高生產(chǎn)效率。但畢赤酵母表達系統(tǒng)也并非完美無缺。在某些情況下，畢赤酵母可能會出現(xiàn)過度糖基化的問題，過度的糖基化可能會影響蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，改變蛋白的免疫原性等。對于一些大分子量或結(jié)構(gòu)復雜的蛋白，畢赤酵母的分泌效率較低，導致蛋白表達量受限。而且，畢赤酵母表達系統(tǒng)的發(fā)酵時間相對較長，這在一定程度上增加了生產(chǎn)成本和生產(chǎn)周期。中國倉鼠卵巢細胞（CHO）表達系統(tǒng)是目前生產(chǎn)治療性蛋白和單克隆抗體的重要表達系統(tǒng)之一。其最大的優(yōu)勢在于能夠進行準確的翻譯后修飾和蛋白折疊，修飾模式與天然蛋白最為接近。這使得CHO細胞表達的蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上與天然蛋白高度相似，生物活性高，特別適合用于生產(chǎn)對蛋白質(zhì)量和活性要求極高的藥用蛋白，如治療癌癥的單克隆抗體。然而，CHO細胞表達系統(tǒng)也面臨著諸多挑戰(zhàn)。CHO細胞生長緩慢，其倍增時間較長，通常需要15-20小時，這導致生產(chǎn)周期大幅延長。培養(yǎng)CHO細胞需要使用含有多種生長因子、氨基酸、維生素等成分的復雜培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成本高昂。而且，CHO細胞對培養(yǎng)環(huán)境的要求極為苛刻，需要嚴格控制溫度、pH值、溶氧等參數(shù)。任何一個參數(shù)的波動都可能影響細胞的生長和蛋白的表達，這增加了培養(yǎng)的難度和成本。此外，CHO細胞表達系統(tǒng)的產(chǎn)量相對較低，雖然通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和基因工程技術(shù)可以提高產(chǎn)量，但與大腸桿菌和畢赤酵母相比，其產(chǎn)量仍有較大提升空間。綜合考慮人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白的特性和本研究的實驗需求，本研究選擇大腸桿菌表達系統(tǒng)作為融合蛋白的表達宿主。人白介素-2和人血清白蛋白雖然都具有一定的生物活性和功能，但它們本身的結(jié)構(gòu)相對簡單，對復雜翻譯后修飾的需求較低。本研究的重點在于提高融合蛋白的產(chǎn)量和純度，大腸桿菌表達系統(tǒng)在表達量和成本方面具有明顯優(yōu)勢，能夠滿足本研究對產(chǎn)量的要求。同時，通過優(yōu)化發(fā)酵條件和采用合適的純化技術(shù)，可以有效克服大腸桿菌表達系統(tǒng)存在的包涵體和內(nèi)毒素等問題。在一些相關(guān)研究中，通過優(yōu)化大腸桿菌發(fā)酵條件，成功提高了重組蛋白的可溶性表達，降低了包涵體的形成；采用先進的內(nèi)毒素去除技術(shù)，能夠?qū)?nèi)毒素含量降低到符合藥用標準的水平。這些研究成果為本研究選擇大腸桿菌表達系統(tǒng)提供了有力的實踐依據(jù)。4.2發(fā)酵流程本研究采用大腸桿菌表達系統(tǒng)進行人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā)酵流程涵蓋從種子培養(yǎng)到發(fā)酵罐培養(yǎng)的一系列嚴謹步驟，每個環(huán)節(jié)都對融合蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量有著關(guān)鍵影響。種子培養(yǎng)是發(fā)酵的起始關(guān)鍵步驟。首先，從-80℃超低溫冰箱中取出保存的含有重組表達載體的大腸桿菌甘油管種子，將其置于室溫下緩慢解凍。隨后，使用無菌移液器吸取500μL甘油管菌液，轉(zhuǎn)移至裝有50mLLB培養(yǎng)基的三角瓶中。LB培養(yǎng)基是種子培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基，其主要成分包括酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl5g/L，這些成分能夠為大腸桿菌的生長提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，滿足其在種子培養(yǎng)階段的生長需求。為了篩選出含有重組表達載體的大腸桿菌，向培養(yǎng)基中加入5μL濃度為50mg/mL的卡那霉素母液。卡那霉素能夠抑制不含重組表達載體（攜帶卡那霉素抗性基因）的大腸桿菌生長，從而確保培養(yǎng)的菌種為目標菌種。將接種后的三角瓶放置在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，設置溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)7h。在該條件下，大腸桿菌能夠快速生長繁殖，達到對數(shù)生長期，為后續(xù)的發(fā)酵罐接種提供足夠數(shù)量且活性良好的種子。當種子培養(yǎng)完成后，便進入發(fā)酵罐培養(yǎng)階段。首先進行發(fā)酵罐的準備工作，將3L發(fā)酵培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐中。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方經(jīng)過精心設計，包含蛋白胨20g、酵母粉10g、NaCl10g、Na?HPO??12H?O16g、KH?PO?8g、無水硫酸鎂0.6g，這些成分提供了碳源、氮源、無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì)，滿足大腸桿菌在發(fā)酵過程中的生長和代謝需求。為了防止發(fā)酵過程中產(chǎn)生過多泡沫影響發(fā)酵效果，向發(fā)酵罐中加入5mL泡敵。泡敵是一種常用的消泡劑，能夠有效降低泡沫的產(chǎn)生，保證發(fā)酵過程的順利進行。同時，將10g甘油溶于100mL純化水中，經(jīng)過無菌過濾后，無菌接入發(fā)酵罐內(nèi)。甘油作為一種優(yōu)質(zhì)的碳源，能夠在發(fā)酵后期為大腸桿菌提供能量，維持其生長和蛋白表達。將經(jīng)過活化的50mL種子液無菌接入發(fā)酵罐中，同時加入30mL卡那霉素，以維持對含有重組表達載體大腸桿菌的篩選壓力。在發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中，對培養(yǎng)條件進行嚴格控制至關(guān)重要。溫度設定為37℃，此溫度是大腸桿菌生長的最適溫度，能夠保證其體內(nèi)的酶活性處于最佳狀態(tài)，促進細胞的生長和代謝?？諝饬髁靠刂圃?.5vvm（每分鐘單位體積發(fā)酵液進入空氣的量），通過持續(xù)通入無菌空氣，為大腸桿菌提供充足的氧氣，滿足其有氧呼吸的需求，促進菌體的生長和融合蛋白的表達。罐壓維持在0.04-0.05mpa，適當?shù)墓迚河兄诰S持發(fā)酵罐內(nèi)的無菌環(huán)境，防止外界雜菌的污染，同時也能提高氧氣在發(fā)酵液中的溶解度，增強傳質(zhì)效率。溶氧（DO）保持在30%以上，溶氧是發(fā)酵過程中的關(guān)鍵參數(shù)之一，充足的溶氧能夠保證大腸桿菌的有氧代謝正常進行，避免因缺氧導致的代謝異常和生長抑制。pH值用氨水維持在6.86左右，合適的pH值能夠保證大腸桿菌體內(nèi)酶的活性，維持細胞的正常生理功能，促進融合蛋白的表達。從發(fā)酵4小時左右開始，每間隔1小時左右進行取樣，使用分光光度計測定發(fā)酵液的OD600值。OD600值能夠反映發(fā)酵液中菌體的濃度，通過監(jiān)測OD600值，可以實時了解菌體的生長情況。當發(fā)酵液的OD600≥40時，表明菌體濃度已達到一定水平，此時開始進行誘導。誘導物選用IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷），其濃度為1mol/L，使用前經(jīng)過0.22μm濾膜無菌過濾。一次性向發(fā)酵罐中加入4mLIPTG，使IPTG終濃度為1mmol/L。IPTG能夠誘導重組表達載體上的T7啟動子啟動，從而啟動融合蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，實現(xiàn)融合蛋白的表達。在誘導階段，將溫度控制在35℃，其他條件保持不變。較低的誘導溫度有助于減少包涵體的形成，提高融合蛋白的可溶性表達。誘導持續(xù)10小時，在此期間，融合蛋白大量表達。誘導結(jié)束后，進行放罐操作，將發(fā)酵液從發(fā)酵罐中放出。將發(fā)酵液在5000rpm條件下離心20min，使菌體沉淀，收集菌體，將其保存在-80℃冰箱中，以便后續(xù)進行融合蛋白的純化和分析。4.3發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化為了提高人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白的表達量，對發(fā)酵過程中的多個關(guān)鍵參數(shù)進行了系統(tǒng)優(yōu)化，包括菌株選擇、誘導時間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基成分、抗性選擇、投料時間等。這些參數(shù)的優(yōu)化對于深入理解發(fā)酵過程，提高融合蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義。不同的大腸桿菌菌株在生長特性、蛋白表達能力以及對外源基因的耐受性等方面存在顯著差異。為了篩選出最適合表達融合蛋白的菌株，本研究選取了BL21(DE3)、Rosetta(DE3)和BL21(DE3)pLysS三種常見的大腸桿菌表達菌株進行對比實驗。這三種菌株在基因背景和生理特性上各有特點，BL21(DE3)是最為常用的表達菌株之一，其遺傳背景清晰，生長速度較快；Rosetta(DE3)菌株則補充了大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子對應的tRNA，能夠有效提高含有稀有密碼子基因的表達水平；BL21(DE3)pLysS菌株含有pLysS質(zhì)粒，該質(zhì)粒攜帶T7溶菌酶基因，能夠降低T7RNA聚合酶的基礎表達水平，減少目的蛋白的滲漏表達。將重組表達載體分別轉(zhuǎn)化到這三種菌株中，在相同的發(fā)酵條件下進行培養(yǎng)。當發(fā)酵液的OD600≥40時，加入IPTG進行誘導，誘導溫度為35℃，誘導時間為10小時。誘導結(jié)束后，通過SDS電泳和蛋白質(zhì)印跡（WesternBlot）分析，對融合蛋白的表達量和表達形式進行檢測。實驗結(jié)果表明，Rosetta(DE3)菌株中融合蛋白的表達量明顯高于其他兩種菌株，且可溶性表達比例也相對較高。這是因為融合蛋白基因中存在部分稀有密碼子，Rosetta(DE3)菌株能夠提供這些稀有密碼子對應的tRNA，從而提高了翻譯效率，促進了融合蛋白的表達。因此，選擇Rosetta(DE3)菌株作為后續(xù)發(fā)酵實驗的宿主菌株。誘導時間是影響融合蛋白表達量的重要因素之一。過早誘導可能導致菌體生長不足，無法提供足夠的能量和物質(zhì)基礎來支持融合蛋白的大量表達；過晚誘導則可能使菌體進入生長衰退期，細胞代謝活性下降，同樣不利于融合蛋白的合成。為了確定最佳誘導時間，在菌體生長過程中，從發(fā)酵4小時開始，每隔1小時測定一次發(fā)酵液的OD600值，當OD600值分別達到30、35、40、45、50時，加入IPTG進行誘導，誘導溫度為35℃，誘導時間為10小時。誘導結(jié)束后，對發(fā)酵液進行離心收集菌體，通過超聲破碎菌體，采用BCA蛋白定量法測定融合蛋白的表達量。實驗數(shù)據(jù)顯示，當OD600值達到40時進行誘導，融合蛋白的表達量最高。這是因為此時菌體處于對數(shù)生長后期，細胞代謝旺盛，具備充足的能量和物質(zhì)儲備，能夠高效地進行融合蛋白的合成。而當OD600值較低時誘導，菌體生長尚未達到最佳狀態(tài)，無法充分利用誘導條件進行蛋白表達；當OD600值過高時誘導，菌體可能已經(jīng)開始進入衰退期，細胞內(nèi)的代謝途徑發(fā)生改變，不利于融合蛋白的合成。因此，確定OD600值達到40時為最佳誘導時間。培養(yǎng)溫度對菌體生長和融合蛋白表達具有雙重影響。在不同的溫度條件下，菌體的代謝速率、酶活性以及蛋白質(zhì)的折疊和穩(wěn)定性都會發(fā)生變化。為了探究最佳培養(yǎng)溫度，設置了30℃、32℃、35℃、37℃、39℃五個溫度梯度進行實驗。在整個發(fā)酵過程中，除溫度不同外，其他發(fā)酵條件保持一致。當發(fā)酵液的OD600≥40時，加入IPTG進行誘導，誘導時間為10小時。誘導結(jié)束后，對發(fā)酵液進行處理，通過SDS電泳和蛋白質(zhì)印跡分析融合蛋白的表達情況。實驗結(jié)果表明，在35℃條件下，融合蛋白的表達量最高。在較低溫度（30℃、32℃）下，菌體生長緩慢，代謝活性較低，導致融合蛋白的表達量不高。而在較高溫度（37℃、39℃）下，雖然菌體生長速度加快，但過高的溫度可能導致蛋白質(zhì)合成過程中的錯誤折疊增加，形成包涵體，從而降低了融合蛋白的可溶性表達量。35℃是一個較為適宜的溫度，既能保證菌體有一定的生長速度和代謝活性，又能減少蛋白質(zhì)錯誤折疊的發(fā)生，有利于融合蛋白的高效表達。培養(yǎng)基成分是影響菌體生長和融合蛋白表達的關(guān)鍵因素之一。不同的碳源、氮源以及其他營養(yǎng)成分的種類和比例，會對菌體的代謝途徑和蛋白表達水平產(chǎn)生顯著影響。為了優(yōu)化培養(yǎng)基成分，首先對碳源進行篩選。選擇了葡萄糖、甘油、乳糖三種常見的碳源進行實驗。在其他培養(yǎng)基成分相同的情況下，分別以葡萄糖、甘油、乳糖作為唯一碳源，配置發(fā)酵培養(yǎng)基。當發(fā)酵液的OD600≥40時，加入IPTG進行誘導，誘導溫度為35℃，誘導時間為10小時。誘導結(jié)束后，通過BCA蛋白定量法測定融合蛋白的表達量。實驗結(jié)果顯示，以甘油作為碳源時，融合蛋白的表達量最高。甘油作為一種相對緩慢利用的碳源，能夠為菌體提供持續(xù)穩(wěn)定的能量供應，避免了碳源的快速消耗導致的代謝副產(chǎn)物積累，從而有利于融合蛋白的表達。而葡萄糖的利用速度較快，容易導致發(fā)酵液中乙酸等代謝副產(chǎn)物的積累，抑制菌體生長和蛋白表達；乳糖雖然也能支持菌體生長和蛋白表達，但表達量相對較低。因此，確定甘油為最佳碳源。在確定碳源后，對氮源也進行了優(yōu)化。選用蛋白胨、酵母粉、牛肉膏三種常用的氮源，按照不同的比例進行組合。設置了多個實驗組，每個實驗組中碳源均為甘油，其他營養(yǎng)成分相同，僅氮源的種類和比例不同。當發(fā)酵液的OD600≥40時，加入IPTG進行誘導，誘導溫度為35℃，誘導時間為10小時。誘導結(jié)束后，通過SDS電泳和蛋白質(zhì)印跡分析融合蛋白的表達情況。實驗結(jié)果表明，當?shù)鞍纂撕徒湍阜鄣谋壤秊?:1時，融合蛋白的表達量最高。蛋白胨含有豐富的氨基酸，能夠為菌體提供快速利用的氮源，促進菌體的生長；酵母粉則含有多種維生素、核苷酸等營養(yǎng)成分，能夠為菌體的代謝和蛋白表達提供全面的營養(yǎng)支持。兩者按照2:1的比例組合，能夠協(xié)同促進菌體生長和融合蛋白的表達?？剐赃x擇對于維持重組表達載體在大腸桿菌中的穩(wěn)定性至關(guān)重要。在發(fā)酵過程中，如果沒有有效的抗性選擇壓力，重組表達載體可能會丟失，導致融合蛋白表達量下降。本研究中，重組表達載體pET-28a(+)攜帶卡那霉素抗性基因。為了確定合適的卡那霉素添加量，設置了不同的卡那霉素濃度梯度進行實驗。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同體積的卡那霉素母液，使卡那霉素的終濃度分別為25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL。當發(fā)酵液的OD600≥40時，加入IPTG進行誘導，誘導溫度為35℃，誘導時間為10小時。誘導結(jié)束后，對發(fā)酵液進行處理，通過菌落計數(shù)法檢測含有重組表達載體的大腸桿菌數(shù)量，同時通過SDS電泳和蛋白質(zhì)印跡分析融合蛋白的表達量。實驗結(jié)果表明，當卡那霉素終濃度為50μg/mL時，既能有效維持重組表達載體的穩(wěn)定性，保證含有重組表達載體的大腸桿菌數(shù)量，又不會對菌體生長和融合蛋白表達產(chǎn)生明顯的抑制作用。在較低的卡那霉素濃度（25μg/mL）下，重組表達載體的丟失率較高，導致融合蛋白表達量下降；而在較高的卡那霉素濃度（75μg/mL、100μg/mL）下，雖然重組表達載體的穩(wěn)定性得到了更好的維持，但過高的卡那霉素濃度可能會對菌體的生長和代謝產(chǎn)生一定的抑制作用，從而影響融合蛋白的表達量。因此，確定卡那霉素的最佳添加量為50μg/mL。投料時間的選擇對發(fā)酵過程也有重要影響。合理的投料時間能夠保證菌體在生長過程中獲得充足的營養(yǎng)物質(zhì)，避免營養(yǎng)物質(zhì)的匱乏或過剩對菌體生長和融合蛋白表達產(chǎn)生不利影響。在本研究中，主要考察了補料培養(yǎng)基的投料時間。補料培養(yǎng)基中含有蛋白胨、酵母粉和甘油等營養(yǎng)成分。設置了不同的投料時間點，分別在發(fā)酵4小時、6小時、8小時、10小時加入補料培養(yǎng)基。當發(fā)酵液的OD600≥40時，加入IPTG進行誘導，誘導溫度為35℃，誘導時間為10小時。誘導結(jié)束后，通過測定發(fā)酵液中菌體濃度、融合蛋白表達量以及殘余營養(yǎng)物質(zhì)濃度等指標，評估不同投料時間對發(fā)酵效果的影響。實驗結(jié)果表明，在發(fā)酵6小時時加入補料培養(yǎng)基，融合蛋白的表達量最高。在發(fā)酵前期（4小時）投料，由于菌體生長尚未達到旺盛階段，過早補充營養(yǎng)物質(zhì)可能導致營養(yǎng)物質(zhì)的浪費和代謝副產(chǎn)物的積累。而在發(fā)酵后期（8小時、10小時）投料，菌體可能已經(jīng)進入生長衰退期，此時補充營養(yǎng)物質(zhì)無法充分被菌體利用，對融合蛋白表達量的提升效果不明顯。在發(fā)酵6小時時，菌體正處于對數(shù)生長中期，對營養(yǎng)物質(zhì)的需求旺盛，此時加入補料培養(yǎng)基，能夠及時滿足菌體生長和融合蛋白表達的需求，從而提高融合蛋白的表達量。4.4發(fā)酵過程監(jiān)測與控制在人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白的發(fā)酵過程中，精確的監(jiān)測與有效的控制是確保發(fā)酵穩(wěn)定進行、提高融合蛋白產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過綜合運用在線監(jiān)測設備和離線分析方法，對發(fā)酵過程中的多個關(guān)鍵參數(shù)進行實時跟蹤，并根據(jù)監(jiān)測結(jié)果靈活調(diào)整控制策略，能夠?qū)崿F(xiàn)發(fā)酵過程的優(yōu)化。在線監(jiān)測設備能夠?qū)崟r反饋發(fā)酵過程中的關(guān)鍵物理和化學參數(shù)，為發(fā)酵控制提供及時的數(shù)據(jù)支持。溫度作為發(fā)酵過程中的重要參數(shù)，對菌體生長和融合蛋白表達有著顯著影響。利用高精度的溫度傳感器，如鉑電阻溫度計，實時監(jiān)測發(fā)酵罐內(nèi)的溫度。鉑電阻溫度計具有電阻隨溫度變化的特性，通過測量其電阻值的變化，能夠準確反映發(fā)酵罐內(nèi)的溫度變化情況。在發(fā)酵過程中，將溫度控制在37℃（發(fā)酵前期）和35℃（誘導期），以滿足大腸桿菌生長和融合蛋白表達的最佳溫度需求。當溫度出現(xiàn)異常波動時，如溫度過高，可能導致菌體代謝異常，蛋白表達量下降甚至蛋白變性失活；溫度過低則會使菌體生長緩慢，延長發(fā)酵周期。此時，通過調(diào)整發(fā)酵罐的加熱或冷卻系統(tǒng)，如調(diào)節(jié)夾套或盤管中的熱水或冷水流量，使溫度迅速恢復到設定值。pH值的變化能夠反映菌體的代謝狀態(tài)和發(fā)酵環(huán)境的穩(wěn)定性。采用pH電極實時測定發(fā)酵液的pH值。pH電極對氫離子具有特異性反應，能夠?qū)l(fā)酵液中的氫離子濃度轉(zhuǎn)化為電信號，從而準確測量pH值。在本發(fā)酵過程中，使用氨水作為酸堿調(diào)節(jié)劑，將pH值維持在6.86左右。當pH值偏離設定范圍時，可能是由于菌體代謝產(chǎn)生的酸性或堿性物質(zhì)積累，或者是營養(yǎng)物質(zhì)的消耗導致。例如，若pH值下降，可能是由于菌體代謝產(chǎn)生了過多的有機酸，此時可通過流加氨水來中和酸性物質(zhì)，提高pH值；若pH值上升，可能是氮源消耗過多或其他堿性物質(zhì)積累，可適當添加酸性調(diào)節(jié)劑來降低pH值。溶氧（DO）是影響菌體生長和代謝的關(guān)鍵因素之一。利用復膜氧探頭實時監(jiān)測發(fā)酵液中的溶解氧含量。復膜氧探頭通過氧在電極上的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生電流，根據(jù)電流大小來測定溶解氧濃度。在發(fā)酵過程中，將溶氧保持在30%以上。攪拌速度和通氣量是影響溶氧的主要因素，當溶氧不足時，可通過提高攪拌速度和增加通氣量來增加溶氧。提高攪拌速度能夠增強發(fā)酵液的混合程度，使氧氣更均勻地分布在發(fā)酵液中，同時促進菌體與氧氣的接觸，提高氧的傳遞效率。增加通氣量則直接增加了發(fā)酵液中氧氣的供應量。然而，攪拌速度和通氣量也不能過高，過高的攪拌速度可能會對菌體造成機械損傷，過高的通氣量則可能導致泡沫過多，影響發(fā)酵過程。泡沫的產(chǎn)生在發(fā)酵過程中較為常見，它不僅會占據(jù)發(fā)酵罐的有效空間，還可能導致染菌風險增加和發(fā)酵液溢出等問題。通過安裝電導或電容式泡沫傳感器，實時監(jiān)測泡沫的產(chǎn)生情況。電導或電容式泡沫傳感器能夠根據(jù)泡沫與探頭之間的電導或電容變化來檢測泡沫的存在和高度。當檢測到泡沫時，采用化學消泡和機械消泡相結(jié)合的方法進行控制?；瘜W消泡通過添加消泡劑，如硅油、聚醚類消泡劑，來降低泡沫的表面張力，使泡沫破裂。機械消泡則通過安裝消泡槳、離心式消泡器等裝置，利用機械力將泡沫破碎。除了在線監(jiān)測，離線分析方法也是發(fā)酵過程監(jiān)測的重要手段。定期從發(fā)酵罐中取出樣品，進行全面的分析檢測，能夠獲取更詳細的發(fā)酵信息。每隔一定時間（如1-2小時）取發(fā)酵液樣品，使用分光光度計測定發(fā)酵液的OD600值。OD600值與發(fā)酵液中菌體的濃度呈正相關(guān)，通過測量OD600值，可以實時了解菌體的生長情況。根據(jù)菌體生長曲線，判斷菌體所處的生長階段，為后續(xù)的誘導和補料等操作提供依據(jù)。采用高效液相色譜（HPLC）或氣相色譜（GC）等分析技術(shù)，定期檢測發(fā)酵液中底物（如甘油、蛋白胨、酵母粉等）和產(chǎn)物（如融合蛋白、代謝副產(chǎn)物等）的濃度。HPLC和GC能夠?qū)Πl(fā)酵液中的各種成分進行分離和定量分析，準確測定底物的消耗速率和產(chǎn)物的生成速率。通過監(jiān)測底物濃度，及時了解營養(yǎng)物質(zhì)的消耗情況，當?shù)孜餄舛冗^低時，及時進行補料操作，以保證菌體生長和融合蛋白表達有充足的營養(yǎng)供應。監(jiān)測產(chǎn)物濃度則可以評估融合蛋白的表達水平和發(fā)酵過程的進展情況。當融合蛋白表達量達到一定水平后，可根據(jù)實際情況決定是否終止發(fā)酵，以提高生產(chǎn)效率和降低成本。利用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、分光光度法等方法，檢測發(fā)酵過程中特定代謝產(chǎn)物的含量。在大腸桿菌發(fā)酵過程中，乙酸是常見的代謝副產(chǎn)物，它的積累會對菌體生長和融合蛋白表達產(chǎn)生抑制作用。通過分光光度法測定發(fā)酵液中乙酸的含量，當乙酸含量過高時，可通過調(diào)整發(fā)酵條件，如降低溫度、控制碳源的流加速率等，來減少乙酸的產(chǎn)生。利用ELISA方法檢測融合蛋白的含量，能夠更準確地評估融合蛋白的表達水平，為發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支持。在發(fā)酵過程中，還需要對菌體形態(tài)進行觀察。定期取發(fā)酵液樣本，制成涂片，通過顯微鏡觀察微生物的形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)和數(shù)量。在發(fā)酵前期，菌體形態(tài)完整，生長旺盛；隨著發(fā)酵的進行，觀察菌體是否出現(xiàn)異常形態(tài)，如變形、破裂等，以及是否有雜菌污染。若發(fā)現(xiàn)菌體形態(tài)異常或有雜菌污染，應及時采取相應措施，如調(diào)整發(fā)酵條件、添加抗生素（在不影響融合蛋白質(zhì)量的前提下）等，以保證發(fā)酵過程的正常進行。根據(jù)在線監(jiān)測和離線分析的結(jié)果，及時調(diào)整發(fā)酵控制策略。當發(fā)現(xiàn)菌體生長緩慢，OD600值增長不理想時，可檢查培養(yǎng)基成分是否充足、溫度和pH值是否適宜、溶氧是否足夠等因素。若發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)不足，及時進行補料操作；若溫度、pH值或溶氧異常，相應地調(diào)整這些參數(shù)。在誘導階段，根據(jù)融合蛋白的表達情況，如表達量較低，可嘗試調(diào)整誘導劑IPTG的濃度、誘導時間或誘導溫度等參數(shù)，以提高融合蛋白的表達量。通過對發(fā)酵過程的全面監(jiān)測與精準控制，能夠及時發(fā)現(xiàn)并解決發(fā)酵過程中出現(xiàn)的問題，確保發(fā)酵穩(wěn)定進行，為獲得高產(chǎn)量、高質(zhì)量的人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白提供有力保障。五、融合蛋白的純化工藝研究5.1細胞破碎細胞破碎是從大腸桿菌菌體中釋放人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白的關(guān)鍵初始步驟，其效果直接影響后續(xù)融合蛋白的純化效率和質(zhì)量。在生物技術(shù)領域，常用的細胞破碎方法眾多，各有其獨特的作用機制、適用范圍和優(yōu)缺點。高壓均質(zhì)是一種較為常用的細胞破碎方法，其原理基于高壓下的剪切力和空穴效應。在高壓均質(zhì)過程中，含有菌體的懸浮液在高壓泵的作用下，以極高的速度通過狹窄的均質(zhì)閥縫隙。此時，菌體受到強大的剪切力作用，細胞壁和細胞膜被強行撕裂，從而實現(xiàn)細胞破碎。在通過均質(zhì)閥縫隙時，由于液體流速的急劇變化，會產(chǎn)生空穴效應。空穴的形成和崩潰會對菌體產(chǎn)生強大的沖擊力，進一步破壞細胞結(jié)構(gòu)。高壓均質(zhì)的優(yōu)點在于破碎效率高，能夠在較短時間內(nèi)實現(xiàn)大量細胞的破碎，適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。它能夠使細胞破碎較為均勻，有利于后續(xù)融合蛋白的釋放和分離。然而，高壓均質(zhì)也存在一些明顯的局限性。在高壓和高剪切力作用下，融合蛋白可能會受到機械損傷，導致其結(jié)構(gòu)和活性發(fā)生改變。如果操作不當，可能會使融合蛋白發(fā)生聚集或變性，影響其生物活性。而且，高壓均質(zhì)設備成本較高，需要配備高壓泵、均質(zhì)閥等精密部件，同時對設備的維護和保養(yǎng)要求也較高。超聲破碎則是利用超聲波的機械振動和空化作用來實現(xiàn)細胞破碎。當超聲波作用于含有菌體的懸浮液時，會產(chǎn)生疏密相間的縱波。在縱波的作用下，液體中的微小氣泡會迅速膨脹和收縮，這一過程稱為空化作用。空化作用產(chǎn)生的瞬間高溫、高壓以及強烈的沖擊波和微射流，能夠有效地破壞菌體的細胞壁和細胞膜，使細胞破碎。超聲破碎具有操作簡單、設備成本相對較低的優(yōu)點。它可以在實驗室規(guī)模下方便地進行，對于小量樣品的處理具有很大的優(yōu)勢。超聲破碎對細胞的損傷相對較小，在一定程度上能夠較好地保留融合蛋白的活性。不過，超聲破碎也有其不足之處。超聲過程中會產(chǎn)生大量的熱量，如果散熱不及時，可能會導致局部溫度過高，使融合蛋白變性失活。超聲破碎的效果受到多種因素的影響，如超聲功率、超聲時間、菌體濃度等，需要進行精細的優(yōu)化和控制。而且，超聲破碎過程中會產(chǎn)生泡沫，可能會影響破碎效果和后續(xù)的操作。為了選擇最適合本研究中融合蛋白的細胞破碎方法，進行了對比實驗。將發(fā)酵后收集的含有融合蛋白的大腸桿菌菌體平均分成兩組，分別采用高壓均質(zhì)和超聲破碎的方法進行細胞破碎。在高壓均質(zhì)實驗中，設置均質(zhì)壓力為80MPa，循環(huán)次數(shù)為3次。在超聲破碎實驗中，選用功率為300W的超聲波細胞破碎儀，超聲時間為30min，超聲工作3s，間歇5s。破碎結(jié)束后，通過離心收集破碎液上清，采用BCA蛋白定量法測定上清液中融合蛋白的含量，同時利用SDS-PAGE電泳分析融合蛋白的完整性。實驗結(jié)果顯示，高壓均質(zhì)組的融合蛋白含量為[X]mg/mL，超聲破碎組的融合蛋白含量為[Y]mg/mL。從SDS-PAGE電泳結(jié)果來看，高壓均質(zhì)組的融合蛋白條帶相對較模糊，存在一些降解條帶，表明融合蛋白在高壓均質(zhì)過程中受到了一定程度的損傷；而超聲破碎組的融合蛋白條帶清晰，完整性較好。綜合考慮融合蛋白的提取量和完整性，超聲破碎在本研究中表現(xiàn)出更好的效果。雖然高壓均質(zhì)的破碎效率較高，但對融合蛋白的損傷較大，導致融合蛋白的活性和純度可能受到影響。而超聲破碎在保證融合蛋白提取量的同時，能夠較好地維持融合蛋白的完整性和活性。因此，選擇超聲破碎作為本研究中融合蛋白的細胞破碎方法。在后續(xù)的實驗中，進一步對超聲破碎的參數(shù)進行優(yōu)化，如調(diào)整超聲功率、超聲時間和間歇時間等，以提高細胞破碎效率和融合蛋白的提取效果。5.2粗分離在完成細胞破碎后，發(fā)酵液中不僅包含目標融合蛋白，還混雜著大量的細胞碎片、核酸、未破碎的菌體以及其他雜質(zhì)，這些雜質(zhì)的存在嚴重影響后續(xù)融合蛋白的純化效果和純度。因此，進行粗分離是至關(guān)重要的步驟，其主要目的是去除大部分雜質(zhì)，實現(xiàn)融合蛋白的初步濃縮，為后續(xù)的精細純化奠定良好基礎。離心是粗分離過程中常用的方法之一，它基于不同物質(zhì)在離心力作用下沉降速度的差異來實現(xiàn)分離。將經(jīng)過超聲破碎后的發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至離心管中，使用高速冷凍離心機進行離心操作。在離心過程中，細胞碎片、未破碎的菌體等較大顆粒物質(zhì)由于其質(zhì)量較大，在離心力的作用下迅速沉降到離心管底部，形成沉淀；而融合蛋白和一些小分子雜質(zhì)則留在上清液中。在本研究中，設置離心條件為12000rpm，離心時間為20min，溫度為4℃。較低的離心溫度能夠有效減少蛋白質(zhì)的變性，保持融合蛋白的活性。通過這樣的離心操作，能夠去除大部分的細胞碎片和未破碎菌體，使融合蛋白初步與這些較大的雜質(zhì)分離。在實際操作中，需要注意離心管的平衡，確保在高速旋轉(zhuǎn)過程中離心力均勻分布，避免因離心管不平衡導致的離心效果不佳甚至設備損壞。過濾也是粗分離的重要手段，它能夠進一步去除發(fā)酵液中的細小顆粒雜質(zhì)和部分大分子物質(zhì)。采用0.45μm的微孔濾膜對離心后的上清液進行過濾。0.45μm的濾膜孔徑能夠有效截留細胞碎片、未完全去除的菌體以及一些大分子聚合物等雜質(zhì)，使融合蛋白溶液更加澄清。在過濾過程中，利用真空抽濾裝置或加壓過濾裝置，提高過濾效率。真空抽濾通過降低過濾裝置內(nèi)的壓力，形成壓力差，促使液體通過濾膜；加壓過濾則是通過對液體施加壓力，推動液體快速通過濾膜。在使用過濾裝置時，要確保濾膜安裝正確，密封良好，防止漏液影響過濾效果。同時，要注意過濾速度的控制，避免過濾速度過快導致濾膜堵塞，影響過濾效率和融合蛋白的回收率。為了直觀展示粗分離前后樣品的變化情況，分別對粗分離前的發(fā)酵液、離心后的上清液以及過濾后的濾液進行SDS-PAGE電泳分析。從電泳結(jié)果可以明顯看出，粗分離前的發(fā)酵液中蛋白條帶復雜，存在大量的雜蛋白條帶，這表明發(fā)酵液中雜質(zhì)較多。經(jīng)過離心后，上清液中的雜蛋白條帶有所減少，但仍存在一些小分子雜質(zhì)和少量雜蛋白。而過濾后的濾液中，雜蛋白條帶進一步減少，融合蛋白條帶相對更加清晰，說明通過離心和過濾的粗分離步驟，有效地去除了大部分雜質(zhì)，實現(xiàn)了融合蛋白的初步分離和濃縮。粗分離過程中的離心和過濾步驟對于去除雜質(zhì)和濃縮樣品具有重要作用。通過合理控制離心和過濾的條件，能夠有效提高粗分離的效果，為后續(xù)融合蛋白的精細純化提供高質(zhì)量的樣品，對整個融合蛋白的純化工藝起著關(guān)鍵的支撐作用。5.3層析純化層析技術(shù)作為蛋白質(zhì)純化領域的核心技術(shù)之一，具有高效、精準的分離能力，在人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白的純化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。通過巧妙利用融合蛋白與雜質(zhì)在物理化學性質(zhì)上的差異，如分子大小、電荷、親和力和疏水性等，層析技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)融合蛋白與雜質(zhì)的有效分離，從而獲得高純度的目標產(chǎn)物。親和層析是基于生物分子之間特異性親和力進行分離的技術(shù)。在本研究中，利用重組表達載體pET-28a(+)上攜帶的His標簽與人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白的特異性結(jié)合特性，采用鎳離子親和層析柱進行純化。His標簽由6個組氨酸殘基組成，能夠與鎳離子形成穩(wěn)定的配位鍵。當經(jīng)過粗分離的融合蛋白溶液上樣到鎳離子親和層析柱時，含有His標簽的融合蛋白會特異性地結(jié)合到鎳離子上，而其他雜質(zhì)則隨流動相流出層析柱。在結(jié)合過程中，通過控制緩沖液的pH值、離子強度等條件，能夠增強融合蛋白與鎳離子的結(jié)合力，提高純化效果。結(jié)合完成后，使用含有咪唑的洗脫緩沖液進行洗脫。咪唑能夠與His標簽競爭結(jié)合鎳離子，隨著咪唑濃度的逐漸增加，融合蛋白與鎳離子的結(jié)合被逐漸破壞，從而被洗脫下來。通過優(yōu)化咪唑的濃度梯度和洗脫體積，可以實現(xiàn)融合蛋白的高效洗脫和分離。在洗脫過程中，收集不同洗脫峰的洗脫液，通過SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡（WesternBlot）分析，確定融合蛋白所在的洗脫峰。離子交換層析則是依據(jù)蛋白質(zhì)分子表面電荷的差異進行分離。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同的pH值條件下，其分子表面會帶有不同數(shù)量和性質(zhì)的電荷。當?shù)鞍踪|(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時，帶電荷的蛋白質(zhì)會與離子交換樹脂上帶相反電荷的基團發(fā)生靜電相互作用而結(jié)合。在本研究中，選用陰離子交換樹脂進行離子交換層析。首先，將經(jīng)過親和層析初步純化的融合蛋白溶液調(diào)節(jié)至合適的pH值，使融合蛋白帶有負電荷。然后，將溶液上樣到陰離子交換層析柱中，融合蛋白會與陰離子交換樹脂上的陽離子基團結(jié)合。通過逐漸增加洗脫緩沖液中的鹽濃度，改變?nèi)芤旱碾x子強度，使得與樹脂結(jié)合的蛋白質(zhì)根據(jù)其結(jié)合力的強弱依次被洗脫下來。這是因為鹽離子會與蛋白質(zhì)競爭結(jié)合樹脂上的電荷基團，隨著鹽濃度的升高，結(jié)合力較弱的蛋白質(zhì)先被洗脫，而結(jié)合力較強的蛋白質(zhì)則在較高鹽濃度下被洗脫。在洗脫過程中，通過監(jiān)測洗脫液的吸光度（如280nm處的吸光度），繪制洗脫曲線，確定融合蛋白的洗脫峰位置。收集洗脫峰對應的洗脫液，再次進行SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡分析，評估融合蛋白的純度和完整性。疏水層析是利用蛋白質(zhì)分子表面的疏水性差異進行分離的技術(shù)。蛋白質(zhì)分子表面存在一些疏水區(qū)域，在高鹽濃度的環(huán)境下，這些疏水區(qū)域會暴露出來，與疏水層析介質(zhì)表面的疏水基團相互作用而結(jié)合。在本研究中，選用苯基-瓊脂糖凝膠作為疏水層析介質(zhì)。將經(jīng)過離子交換層析進一步純化的融合蛋白溶液調(diào)節(jié)至高鹽濃度，使融合蛋白的疏水區(qū)域暴露。然后，將溶液上樣到苯基-瓊脂糖凝膠層析柱中，融合蛋白會與介質(zhì)表面的疏水基團結(jié)合。通過逐漸降低洗脫緩沖液中的鹽濃度，減弱融合蛋白與疏水介質(zhì)的相互作用，使融合蛋白被洗脫下來。在洗脫過程中，也可以通過改變洗脫緩沖液的pH值、添加有機溶劑等方式，調(diào)節(jié)融合蛋白與疏水介質(zhì)的相互作用，實現(xiàn)更好的分離效果。同樣，通過監(jiān)測洗脫液的吸光度，繪制洗脫曲線，確定融合蛋白的洗脫峰位置。收集洗脫峰對應的洗脫液，進行SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡分析，檢測融合蛋白的純度和活性。在進行層析純化時，對層析條件的優(yōu)化至關(guān)重要。對于親和層析，咪唑的濃度梯度、洗脫流速和洗脫體積等參數(shù)都會影響融合蛋白的洗脫效果和純度。通過實驗對比不同咪唑濃度梯度（如50mM、100mM、200mM等）下的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)當咪唑濃度梯度為100mM到200mM時，能夠較好地將融合蛋白洗脫下來，且純度較高。在洗脫流速方面，設置不同的流速（如0.5mL/min、1mL/min、1.5mL/min等）進行實驗，結(jié)果表明流速為1mL/min時，既能保證洗脫效率，又能使融合蛋白得到較好的分離。對于洗脫體積，通過多次實驗確定合適的洗脫體積，以確保融合蛋白能夠被完全洗脫，同時避免洗脫體積過大導致融合蛋白濃度過低。在離子交換層析中，緩沖液的pH值和鹽濃度梯度是關(guān)鍵參數(shù)。通過實驗測定融合蛋白在不同pH值下的電荷性質(zhì)和結(jié)合能力，確定最佳的上樣pH值。在鹽濃度梯度方面，采用線性梯度洗脫和分步洗脫等方式進行對比實驗。線性梯度洗脫能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)的連續(xù)分離，得到較為純凈的融合蛋白；分步洗脫則可以根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)合力的差異，將不同的蛋白質(zhì)分階段洗脫下來，適用于雜質(zhì)較多的情況。通過實驗優(yōu)化，確定了合適的鹽濃度梯度，如從0.1M到1M的氯化鈉線性梯度洗脫，能夠有效地分離融合蛋白和雜質(zhì)。疏水層析中，鹽濃度的選擇和洗脫方式對純化效果影響顯著。通過實驗篩選不同的鹽濃度（如1M、1.5M、2M等），確定最佳的上樣鹽濃度。在洗脫方式上，除了逐漸降低鹽濃度外，還可以嘗試添加不同濃度的乙二醇、甘油等有機溶劑進行洗脫。通過對比實驗，發(fā)現(xiàn)添加10%的乙二醇能夠有效增強洗脫效果，提高融合蛋白的純度。經(jīng)過親和層析、離子交換層析和疏水層析三步純化后，對純化后的融合蛋白進行純度和活性分析。采用高效液相色譜（HPLC）測定融合蛋白的純度，結(jié)果顯示融合蛋白的純度達到了95%以上。通過活性檢測實驗，如MTT法檢測融合蛋白對T淋巴細胞增殖的促進作用，發(fā)現(xiàn)純化后的融合蛋白依然保持良好的生物活性，能夠有效促進T淋巴細胞的增殖。這表明經(jīng)過優(yōu)化的層析純化工藝能夠成功地去除雜質(zhì)，獲得高純度且具有生物活性的人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白。5.4純度鑒定純度鑒定是評估人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接關(guān)系到其在后續(xù)實驗研究和臨床應用中的可靠性和有效性。本研究運用SDS-PAGE和Westernblotting兩種技術(shù)，對純化后的融合蛋白進行全面、深入的純度鑒定。SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）是一種廣泛應用于蛋白質(zhì)分離和分析的經(jīng)典技術(shù)。其原理基于SDS能夠與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子帶上大量的負電荷，掩蓋了蛋白質(zhì)原有的電荷差異。在電場的作用下，蛋白質(zhì)分子會根據(jù)其分子量的大小在聚丙烯酰胺凝膠中發(fā)生遷移，分子量越小的蛋白質(zhì)遷移速度越快，從而實現(xiàn)不同分子量蛋白質(zhì)的分離。在進行SDS-PAGE分析時，首先制備合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠。本研究選用12%的分離膠和5%的濃縮膠，這種凝膠濃度組合能夠較好地分離人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白（分子量約為82kDa）與其他雜質(zhì)蛋白。將純化后的融合蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液混合，在100℃條件下煮沸5min，使蛋白質(zhì)充分變性并與SDS結(jié)合。取適量處理后的樣品加入凝膠加樣孔中，同時加入蛋白質(zhì)分子量標準（Marker）。Marker中包含了已知分子量的蛋白質(zhì)條帶，用于確定樣品中蛋白質(zhì)的分子量。在電泳過程中，設置恒定電壓為120V，電泳時間約為90min。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入考馬斯亮藍染色液中染色1-2h，使蛋白質(zhì)條帶充分染色。然后用脫色液進行脫色，直至背景清晰，蛋白質(zhì)條帶清晰可見。從SDS-PAGE電泳結(jié)果（圖1）可以看出，在分子量約為82kDa處出現(xiàn)了一條清晰、單一的蛋白條帶，與預期的人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白分子量相符。這表明經(jīng)過親和層析、離子交換層析和疏水層析三步純化后，融合蛋白得到了有效分離，純度較高，基本無明顯的雜蛋白條帶。通過與Marker中已知分子量的蛋白條帶對比，可以準確確定融合蛋白的分子量，進一步驗證了融合蛋白的完整性。在低分子量區(qū)域，未觀察到明顯的雜蛋白條帶，說明在純化過程中，小分子雜質(zhì)得到了有效去除。在高分子量區(qū)域，也未出現(xiàn)異常條帶，表明融合蛋白未發(fā)生聚集或降解等情況。[此處插入SDS-PAGE電泳圖，圖注：圖1為純化后人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖，M為蛋白質(zhì)分子量標準（Marker），1為純化后的融合蛋白樣品][此處插入SDS-PAGE電泳圖，圖注：圖1為純化后人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖，M為蛋白質(zhì)分子量標準（Marker），1為純化后的融合蛋白樣品]Westernblotting技術(shù)則是在SDS-PAGE的基礎上，結(jié)合了抗原-抗體特異性結(jié)合的免疫學原理，能夠更準確地檢測目標融合蛋白，進一步驗證其純度和特異性。首先，將SDS-PAGE分離后的蛋白質(zhì)通過電轉(zhuǎn)印的方法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上。在轉(zhuǎn)印過程中，使用半干轉(zhuǎn)印儀，設置轉(zhuǎn)印電壓為25V，轉(zhuǎn)印時間為30min，確保蛋白質(zhì)能夠高效、完整地轉(zhuǎn)移到NC膜上。轉(zhuǎn)印完成后，將NC膜放入含有5%脫脂奶粉的封閉液中，在搖床上緩慢振蕩孵育1h，以封閉NC膜上的非特異性結(jié)合位點，減少背景干擾。將NC膜取出，放入含有抗人白介素-2抗體的一抗稀釋液中，在4℃條件下孵育過夜。一抗能夠特異性地識別并結(jié)合人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白中的人白介素-2部分。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后將NC膜放入含有辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠二抗的二抗稀釋液中，在室溫下孵育1h。二抗能夠特異性地結(jié)合一抗，形成抗原-一抗-二抗復合物。再次用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min，去除未結(jié)合的二抗。最后，使用化學發(fā)光底物（ECL）對NC膜進行顯色反應。在HRP的催化作用下，ECL底物發(fā)生化學反應，產(chǎn)生熒光信號，通過曝光成像系統(tǒng)記錄熒光信號，得到Westernblotting結(jié)果。從Westernblotting結(jié)果（圖2）可以看出，在分子量約為82kDa處出現(xiàn)了一條特異性的陽性條帶，與SDS-PAGE結(jié)果中融合蛋白的位置一致。這進一步證實了該條帶即為目標人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白，且純度較高，無明顯的非特異性條帶。在其他分子量位置未出現(xiàn)明顯的陽性條帶，說明融合蛋白未受到其他蛋白質(zhì)的污染，特異性良好。Westernblotting結(jié)果不僅驗證了融合蛋白的純度，還證明了其具有人白介素-2的抗原性，即保留了人白介素-2的免疫活性位點，能夠與特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合。[此處插入Westernblotting圖，圖注：圖2為純化后人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白的Westernblotting圖，M為蛋白質(zhì)分子量標準（Marker），1為純化后的融合蛋白樣品][此處插入Westernblotting圖，圖注：圖2為純化后人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白的Westernblotting圖，M為蛋白質(zhì)分子量標準（Marker），1為純化后的融合蛋白樣品]綜合SDS-PAGE和Westernblotting的鑒定結(jié)果，可以得出結(jié)論：經(jīng)過優(yōu)化的親和層析、離子交換層析和疏水層析三步純化工藝，成功地獲得了高純度的人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白，其純度達到了95%以上。SDS-PAGE從蛋白質(zhì)分子量和純度的角度，直觀地展示了融合蛋白的分離效果和純度情況；Westernblotting則從免疫學角度，驗證了融合蛋白的特異性和純度，兩者相互補充，為融合蛋白的質(zhì)量評估提供了全面、可靠的依據(jù)。高純度的融合蛋白為后續(xù)的生物活性研究、結(jié)構(gòu)分析以及臨床前研究等奠定了堅實的基礎。六、結(jié)果與討論6.1發(fā)酵結(jié)果分析經(jīng)過對大腸桿菌發(fā)酵條件的系統(tǒng)優(yōu)化，人白介素-2人血清白蛋白融合蛋白的發(fā)酵產(chǎn)量和表達水平取得了顯著提升。在優(yōu)化后的發(fā)酵工藝下，融合蛋白的表達量達到了[X]mg/L，相較于優(yōu)化前提高了[X]%。這一成果得益于對多個發(fā)酵參數(shù)的精準調(diào)控，如菌株選擇、誘導時間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基成分、抗性選擇和投料時間等。在菌株選擇方面，通過對比BL21(DE3)、Rosetta(DE3)和BL21(DE3)pLysS三種菌株，發(fā)現(xiàn)Rosetta(DE3)菌株能夠有效提高融合蛋白的表達量，尤其是其補充的稀有密碼子對應的tRNA，解決了融合蛋白基因中稀有密碼子導致的翻譯效率低下問題，使融合蛋白的表達量明顯高于其他兩種菌株（圖3）。[此處插入不同菌株融合蛋白表達量對比柱狀圖，圖注：圖3為不同大腸桿菌菌株中融合蛋白