卡介苗介導(dǎo)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞活化與凋亡的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性氣道疾病，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有3億哮喘患者，且發(fā)病率仍在逐年增加。在中國(guó)，哮喘患者人數(shù)也相當(dāng)可觀，約有3000萬(wàn)左右，且兒童哮喘發(fā)病率增長(zhǎng)迅速。哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境、免疫等多個(gè)因素，其中免疫調(diào)節(jié)失衡被認(rèn)為是哮喘發(fā)病的核心機(jī)制之一。在哮喘的免疫發(fā)病機(jī)制中，T淋巴細(xì)胞扮演著關(guān)鍵角色。T淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，根據(jù)其功能和分泌細(xì)胞因子的不同，可分為T(mén)h1、Th2、Th17和Treg等多個(gè)亞群。正常情況下，機(jī)體的Th1/Th2細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，共同維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)。然而，在哮喘患者中，這種平衡被打破，表現(xiàn)為T(mén)h2細(xì)胞功能亢進(jìn)，分泌大量的Th2型細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5、IL-13等，這些細(xì)胞因子可促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的活化、增殖和浸潤(rùn)，從而導(dǎo)致氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和哮喘癥狀的發(fā)生。同時(shí)，Th1細(xì)胞功能相對(duì)不足，分泌的Th1型細(xì)胞因子如IFN-γ等減少，無(wú)法有效抑制Th2細(xì)胞的功能。此外，Th17/Treg細(xì)胞失衡也在哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用。Th17細(xì)胞分泌的IL-17等細(xì)胞因子可促進(jìn)氣道炎癥和組織損傷，而Treg細(xì)胞具有免疫抑制功能，能夠抑制過(guò)度的免疫反應(yīng)。在哮喘患者中，Th17細(xì)胞增多，Treg細(xì)胞減少，導(dǎo)致免疫抑制功能減弱，炎癥反應(yīng)加劇。因此，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的平衡，糾正免疫調(diào)節(jié)失衡，成為哮喘治療的重要靶點(diǎn)。目前，臨床上治療哮喘的主要藥物是糖皮質(zhì)激素，雖然糖皮質(zhì)激素能夠有效控制哮喘癥狀，但長(zhǎng)期使用會(huì)帶來(lái)一系列不良反應(yīng)，如骨質(zhì)疏松、感染風(fēng)險(xiǎn)增加等。因此，尋找一種安全有效的治療方法，成為哮喘研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。卡介苗（BCG）是一種減毒活疫苗，廣泛用于預(yù)防結(jié)核病。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，卡介苗不僅具有預(yù)防結(jié)核病的作用，還具有免疫調(diào)節(jié)功能，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，對(duì)多種過(guò)敏性疾病，如哮喘、過(guò)敏性鼻炎等具有一定的防治作用?？ń槊鐚?duì)哮喘的防治作用可能與其調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的平衡有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，卡介苗可以促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化和功能，增加Th1型細(xì)胞因子的分泌，抑制Th2細(xì)胞的功能，減少Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而糾正Th1/Th2細(xì)胞失衡。此外，卡介苗還可以調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞的平衡，增加Treg細(xì)胞的數(shù)量和功能，抑制Th17細(xì)胞的活化，減輕氣道炎癥。然而，目前關(guān)于卡介苗調(diào)節(jié)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞活化凋亡的具體機(jī)制尚不完全清楚，仍需要進(jìn)一步深入研究。因此，本研究旨在通過(guò)建立哮喘小鼠模型，觀察卡介苗對(duì)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞活化凋亡的影響，探討其作用機(jī)制，為卡介苗在哮喘治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。1.2研究目的本研究旨在深入探究卡介苗對(duì)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞活化和凋亡的影響及其潛在機(jī)制，具體研究目標(biāo)如下：明確卡介苗干預(yù)后，哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞亞群（Th1、Th2、Th17和Treg）的比例變化，以及這些變化與哮喘病情改善之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步闡明卡介苗調(diào)節(jié)哮喘免疫失衡的作用靶點(diǎn)。觀察卡介苗對(duì)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞活化相關(guān)分子（如共刺激分子B7-CD28/CD152等）表達(dá)的影響，從分子層面揭示卡介苗調(diào)控T淋巴細(xì)胞活化的機(jī)制。分析卡介苗對(duì)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（如Fas、Bcl-2等）表達(dá)及凋亡率的影響，探討卡介苗通過(guò)誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡改善哮喘病情的分子機(jī)制。通過(guò)對(duì)上述指標(biāo)的綜合分析，構(gòu)建卡介苗調(diào)節(jié)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞活化凋亡的作用網(wǎng)絡(luò)，為卡介苗在哮喘臨床治療中的應(yīng)用提供全面、深入的理論依據(jù)。二、哮喘與T淋巴細(xì)胞的理論基礎(chǔ)2.1哮喘的發(fā)病機(jī)制哮喘作為一種復(fù)雜的慢性炎癥性氣道疾病，其發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)層面，是多種因素相互作用的結(jié)果。目前認(rèn)為，哮喘的本質(zhì)是氣道慢性非特異性炎癥，這種炎癥并非由細(xì)菌或病毒感染引起，而是由過(guò)敏因素導(dǎo)致的氣道高反應(yīng)狀態(tài)。在哮喘發(fā)病過(guò)程中，多種炎癥細(xì)胞，如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，以及它們分泌的炎癥介質(zhì)共同參與，導(dǎo)致氣道出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、氣道高反應(yīng)性和重塑等病理變化。T淋巴細(xì)胞在哮喘發(fā)病中占據(jù)關(guān)鍵地位，是調(diào)控氣道炎癥的核心免疫細(xì)胞之一。T淋巴細(xì)胞根據(jù)其功能和分泌細(xì)胞因子的差異，可分為多個(gè)亞群，其中Th1、Th2、Th17和Treg亞群在哮喘發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著尤為重要的作用。正常生理狀態(tài)下，Th1和Th2細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，共同維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活性，促進(jìn)其對(duì)病原體的吞噬和殺傷作用，同時(shí)抑制Th2細(xì)胞的功能。Th2細(xì)胞則主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子，主要參與體液免疫應(yīng)答，在抗寄生蟲(chóng)感染和過(guò)敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在哮喘患者中，這種Th1/Th2平衡被打破，表現(xiàn)為T(mén)h2細(xì)胞功能亢進(jìn)，而Th1細(xì)胞功能相對(duì)不足，即所謂的Th1/Th2失衡。Th2細(xì)胞分泌的IL-4可誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，IgE與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE受體結(jié)合，使這些細(xì)胞致敏。當(dāng)再次接觸過(guò)敏原時(shí)，過(guò)敏原與致敏細(xì)胞表面的IgE結(jié)合，導(dǎo)致肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯等炎癥介質(zhì)，引起氣道平滑肌收縮、血管通透性增加、黏液分泌增多等病理變化，從而引發(fā)哮喘癥狀。IL-5是嗜酸性粒細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和活化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，它能夠促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的增殖、趨化和存活，使其在氣道內(nèi)大量浸潤(rùn)，釋放多種毒性蛋白和炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步加重氣道炎癥和組織損傷。IL-13可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生黏蛋白，增加氣道黏液分泌，導(dǎo)致氣道阻塞，還能促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖和氣道重塑。而Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ減少，無(wú)法有效抑制Th2細(xì)胞的功能，使得Th2型細(xì)胞因子的作用進(jìn)一步增強(qiáng)，從而加劇了哮喘的炎癥反應(yīng)。近年來(lái)，Th17/Treg細(xì)胞失衡在哮喘發(fā)病中的作用也逐漸受到關(guān)注。Th17細(xì)胞分泌的IL-17等細(xì)胞因子具有強(qiáng)大的促炎作用，能夠招募中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞到炎癥部位，促進(jìn)它們釋放多種炎癥介質(zhì)，如基質(zhì)金屬蛋白酶、細(xì)胞因子和趨化因子等，導(dǎo)致氣道炎癥和組織損傷。在哮喘患者中，Th17細(xì)胞數(shù)量增多，分泌的IL-17水平升高，與哮喘的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。Treg細(xì)胞則具有免疫抑制功能，能夠抑制過(guò)度的免疫反應(yīng)，維持機(jī)體的免疫平衡。Treg細(xì)胞可以通過(guò)直接接觸或分泌抑制性細(xì)胞因子，如IL-10和TGF-β等，抑制Th1、Th2和Th17細(xì)胞的活化和增殖，從而減輕氣道炎癥。在哮喘患者中，Treg細(xì)胞數(shù)量減少或功能缺陷，導(dǎo)致其對(duì)Th17細(xì)胞等的抑制作用減弱，使得炎癥反應(yīng)難以得到有效控制，進(jìn)而促進(jìn)哮喘的發(fā)生發(fā)展。綜上所述，T淋巴細(xì)胞亞群失衡，尤其是Th1/Th2失衡以及Th17/Treg失衡，在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。深入了解這些細(xì)胞亞群在哮喘發(fā)病中的作用機(jī)制，對(duì)于尋找新的哮喘治療靶點(diǎn)和開(kāi)發(fā)更有效的治療方法具有重要意義。2.2T淋巴細(xì)胞的活化與凋亡2.2.1T淋巴細(xì)胞活化機(jī)制T淋巴細(xì)胞的活化是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)的過(guò)程，需要多種信號(hào)的協(xié)同作用，其中雙信號(hào)模型是目前被廣泛認(rèn)可的T淋巴細(xì)胞活化機(jī)制。該模型指出，T淋巴細(xì)胞的完全活化需要兩個(gè)獨(dú)立且協(xié)同的信號(hào)刺激。第一信號(hào)來(lái)源于T細(xì)胞受體（TCR）與抗原呈遞細(xì)胞（APC）表面的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）-抗原肽復(fù)合物的特異性結(jié)合。TCR是T淋巴細(xì)胞識(shí)別抗原的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，它由α和β兩條鏈組成，其可變區(qū)能夠特異性識(shí)別APC表面MHC分子所呈遞的抗原肽。當(dāng)TCR與MHC-抗原肽復(fù)合物結(jié)合后，會(huì)引發(fā)TCR的構(gòu)象變化，進(jìn)而激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。在這個(gè)過(guò)程中，CD3分子起著至關(guān)重要的作用。CD3分子由γ、δ、ε、ζ四種鏈組成，與TCR緊密結(jié)合形成TCR-CD3復(fù)合物。TCR識(shí)別抗原后，CD3分子的免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM）會(huì)發(fā)生酪氨酸磷酸化，招募并激活蛋白酪氨酸激酶（PTK），如Lck、Fyn和ZAP-70等。這些激酶會(huì)依次磷酸化下游的信號(hào)分子，如磷脂酶Cγ1（PLCγ1）、接頭蛋白（如LAT和SLP-76）等，從而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使T淋巴細(xì)胞進(jìn)入活化的初始階段。然而，僅有第一信號(hào)的刺激，T淋巴細(xì)胞并不能完全活化，反而可能進(jìn)入無(wú)反應(yīng)狀態(tài)或發(fā)生凋亡。第二信號(hào)，也稱(chēng)為共刺激信號(hào)，主要由APC表面的共刺激分子與T淋巴細(xì)胞表面相應(yīng)受體相互作用產(chǎn)生。其中，最為重要的共刺激分子對(duì)是B7家族（包括B7-1和B7-2）與T淋巴細(xì)胞表面的CD28/CD152（細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4，CTLA-4）。B7-1（CD80）和B7-2（CD86）通常在靜息狀態(tài)下的APC表面低表達(dá)或不表達(dá)，但當(dāng)APC受到病原體相關(guān)分子模式（PAMP）、細(xì)胞因子等刺激后，其表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)。CD28是T淋巴細(xì)胞表面組成性表達(dá)的共刺激分子，與B7分子具有較高的親和力。當(dāng)CD28與B7分子結(jié)合后，會(huì)激活PI3K等信號(hào)通路，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖、存活和細(xì)胞因子的分泌。CD28信號(hào)還可以調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞中多種基因的表達(dá)，如IL-2、IL-2受體（IL-2R）、CD40L等，這些基因產(chǎn)物對(duì)于T淋巴細(xì)胞的活化和免疫應(yīng)答的啟動(dòng)至關(guān)重要。IL-2是一種重要的T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)因子，CD28信號(hào)可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌IL-2，并上調(diào)IL-2R的表達(dá)，使T淋巴細(xì)胞能夠?qū)L-2產(chǎn)生應(yīng)答，從而進(jìn)入細(xì)胞周期，實(shí)現(xiàn)增殖和分化。與CD28相反，CTLA-4在T淋巴細(xì)胞活化后誘導(dǎo)性表達(dá)，且與B7分子的親和力比CD28更高。CTLA-4與B7分子結(jié)合后，會(huì)傳遞抑制性信號(hào)，抑制T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，從而對(duì)免疫應(yīng)答起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，能夠防止過(guò)度的免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷。當(dāng)T淋巴細(xì)胞活化后，CTLA-4逐漸表達(dá)并與B7分子結(jié)合，抑制T淋巴細(xì)胞的進(jìn)一步活化，使免疫應(yīng)答在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候得到控制。如果CTLA-4功能缺陷或表達(dá)異常，可能會(huì)導(dǎo)致免疫過(guò)度活化，引發(fā)自身免疫性疾病等病理狀態(tài)。除了B7-CD28/CD152信號(hào)通路外，還有其他共刺激分子對(duì)也參與T淋巴細(xì)胞的活化過(guò)程，如ICAM-1（細(xì)胞間黏附分子1）與LFA-1（淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1）、CD40與CD40L等。ICAM-1與LFA-1的相互作用可以增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞與APC之間的黏附，穩(wěn)定免疫突觸的形成，為T(mén)CR識(shí)別抗原和共刺激信號(hào)的傳遞提供良好的環(huán)境。CD40主要表達(dá)于APC表面，CD40L則在活化的T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)。CD40與CD40L的結(jié)合可以激活A(yù)PC，促進(jìn)其表達(dá)更多的共刺激分子和細(xì)胞因子，進(jìn)一步增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的活化和免疫應(yīng)答。CD40-CD40L信號(hào)還可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的活化和抗體產(chǎn)生，在體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。綜上所述，T淋巴細(xì)胞的活化是一個(gè)依賴雙信號(hào)模型的復(fù)雜過(guò)程，第一信號(hào)賦予免疫應(yīng)答的特異性，第二信號(hào)則調(diào)控免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。共刺激分子在T淋巴細(xì)胞活化中起著關(guān)鍵作用，它們通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，影響T淋巴細(xì)胞的增殖、分化和功能，維持機(jī)體的免疫平衡。深入了解T淋巴細(xì)胞活化機(jī)制，對(duì)于揭示免疫相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的免疫治療策略具有重要意義。2.2.2T淋巴細(xì)胞凋亡機(jī)制細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，在維持機(jī)體細(xì)胞數(shù)量平衡、免疫穩(wěn)態(tài)和清除異常細(xì)胞等方面發(fā)揮著重要作用。T淋巴細(xì)胞的凋亡同樣受到嚴(yán)格調(diào)控，其凋亡機(jī)制主要包括內(nèi)源性和外源性兩條途徑。內(nèi)源性凋亡途徑，也稱(chēng)為線粒體途徑，主要由細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激信號(hào)觸發(fā)，如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長(zhǎng)因子缺乏等。在這個(gè)過(guò)程中，線粒體起著核心作用。當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激刺激時(shí)，線粒體的外膜通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放出多種促凋亡因子，如細(xì)胞色素C（CytochromeC）、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）、Smac/DIABLO等。其中，細(xì)胞色素C的釋放是內(nèi)源性凋亡途徑的關(guān)鍵事件。在正常情況下，細(xì)胞色素C位于線粒體的內(nèi)膜間隙，與線粒體膜結(jié)合。當(dāng)線粒體受到損傷時(shí)，線粒體膜上的Bcl-2家族蛋白發(fā)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開(kāi)放，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。釋放到細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體。Apaf-1是一種含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，它與細(xì)胞色素C結(jié)合后，發(fā)生自身寡聚化，形成一個(gè)具有七個(gè)輻條的輪狀結(jié)構(gòu)，即凋亡小體。凋亡小體中的Apaf-1能夠招募并激活procaspase-9，使其發(fā)生自身切割和活化?；罨腸aspase-9作為起始caspase，進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase-3、caspase-6和caspase-7等。這些效應(yīng)caspase可以切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，如細(xì)胞骨架蛋白、核酸酶抑制劑等，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡形態(tài)學(xué)變化，如細(xì)胞核濃縮、染色質(zhì)邊緣化、細(xì)胞膜起泡等，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)內(nèi)源性凋亡途徑中起著至關(guān)重要的作用。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak、Bid、Bad等）?？沟蛲龅鞍字饕ㄎ挥诰€粒體膜上，通過(guò)抑制線粒體膜通透性的改變，阻止促凋亡因子的釋放，從而發(fā)揮抗凋亡作用。Bcl-2和Bcl-XL可以直接與Bax和Bak相互作用，抑制它們的促凋亡活性。促凋亡蛋白則可以通過(guò)多種方式促進(jìn)細(xì)胞凋亡。其中，Bax和Bak是內(nèi)源性凋亡途徑中關(guān)鍵的促凋亡蛋白。在正常情況下，Bax主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，以非活性的單體形式存在。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，Bax發(fā)生構(gòu)象變化，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，并與Bak一起在線粒體外膜上形成寡聚體，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，促凋亡因子釋放。Bid是一種BH3-only蛋白，它可以被caspase-8切割成截短的tBid，tBid能夠轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，激活Bax和Bak，從而連接內(nèi)源性和外源性凋亡途徑。外源性凋亡途徑，也稱(chēng)為死亡受體途徑，主要由細(xì)胞表面的死亡受體與相應(yīng)的配體結(jié)合所啟動(dòng)。死亡受體是一類(lèi)屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族的跨膜蛋白，其胞外區(qū)含有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)區(qū)含有死亡結(jié)構(gòu)域（DD）。常見(jiàn)的死亡受體包括Fas（CD95）、TNFR1、DR4和DR5等。以Fas/FasL系統(tǒng)為例，F(xiàn)as配體（FasL）是一種II型跨膜蛋白，主要表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等免疫細(xì)胞表面。當(dāng)FasL與靶細(xì)胞表面的Fas受體結(jié)合后，F(xiàn)as受體發(fā)生三聚化，其胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域相互聚集，招募一種帶有死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白（FADD）。FADD通過(guò)其死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED）與procaspase-8的DED相互作用，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，procaspase-8發(fā)生自身切割和活化，形成具有活性的caspase-8?；罨腸aspase-8可以直接激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase-3、caspase-6和caspase-7等，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，caspase-8還可以切割Bid，產(chǎn)生tBid，tBid轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，激活內(nèi)源性凋亡途徑，進(jìn)一步放大凋亡信號(hào)，這種現(xiàn)象被稱(chēng)為凋亡的“放大環(huán)”。Fas/FasL系統(tǒng)在免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用。它可以介導(dǎo)活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（AICD），即活化的T淋巴細(xì)胞在免疫應(yīng)答后期，通過(guò)Fas/FasL相互作用，誘導(dǎo)自身凋亡，從而限制免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，防止過(guò)度免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷。Fas/FasL系統(tǒng)還參與清除體內(nèi)受病毒感染的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等異常細(xì)胞，維持機(jī)體的免疫平衡。如果Fas/FasL系統(tǒng)功能異常，可能會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞過(guò)度增殖，引發(fā)自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等；或者導(dǎo)致異常細(xì)胞不能被及時(shí)清除，增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。綜上所述，T淋巴細(xì)胞的凋亡是一個(gè)由多種信號(hào)通路和調(diào)控因子參與的復(fù)雜過(guò)程，內(nèi)源性和外源性凋亡途徑相互關(guān)聯(lián)、相互影響，共同調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能，維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)。深入研究T淋巴細(xì)胞凋亡機(jī)制，對(duì)于理解免疫相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的治療策略具有重要意義。2.3卡介苗的免疫學(xué)作用卡介苗（BCG）是由減毒牛型結(jié)核桿菌懸浮液制成的活菌苗，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和廣泛的免疫學(xué)作用。自1921年首次應(yīng)用于人體預(yù)防結(jié)核病以來(lái)，卡介苗在全球范圍內(nèi)得到了廣泛接種，為控制結(jié)核病的傳播發(fā)揮了重要作用。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)卡介苗不僅能夠預(yù)防結(jié)核病，還具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，對(duì)多種疾病，尤其是過(guò)敏性疾病的防治具有重要意義?？ń槊缱鳛橐环N非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，能夠激活機(jī)體的先天性免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在先天性免疫方面，卡介苗可以被巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞（APC）識(shí)別和攝取。APC表面的模式識(shí)別受體（PRR），如Toll樣受體（TLR）等，能夠識(shí)別卡介苗表面的病原體相關(guān)分子模式（PAMP），如脂多糖（LPS）、肽聚糖等。這種識(shí)別過(guò)程會(huì)觸發(fā)APC的活化，使其表達(dá)多種共刺激分子和細(xì)胞因子。巨噬細(xì)胞在攝取卡介苗后，會(huì)被激活并釋放大量的炎癥細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等。這些細(xì)胞因子可以招募和活化其他免疫細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等，增強(qiáng)先天性免疫應(yīng)答，對(duì)病原體進(jìn)行早期的防御和清除。樹(shù)突狀細(xì)胞攝取卡介苗后，會(huì)遷移到淋巴結(jié)，將抗原信息呈遞給T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在適應(yīng)性免疫方面，卡介苗能夠調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的活化、增殖和分化?？ń槊缈乖?jīng)APC加工處理后，以MHC-抗原肽復(fù)合物的形式呈遞給T淋巴細(xì)胞，提供T淋巴細(xì)胞活化的第一信號(hào)。同時(shí)，活化的APC表面高表達(dá)的共刺激分子，如B7-1、B7-2等，與T淋巴細(xì)胞表面的CD28等受體結(jié)合，提供共刺激信號(hào)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的完全活化?；罨腡淋巴細(xì)胞會(huì)發(fā)生增殖和分化，產(chǎn)生不同功能的T淋巴細(xì)胞亞群?？ń槊鐚?duì)Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)是其免疫調(diào)節(jié)作用的重要方面。在正常情況下，Th1和Th2細(xì)胞相互制衡，維持機(jī)體的免疫平衡。然而，在哮喘等過(guò)敏性疾病中，Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)，分泌大量的Th2型細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5、IL-13等，導(dǎo)致免疫失衡和過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生。卡介苗可以通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，使其向Th1型免疫應(yīng)答偏移。一方面，卡介苗刺激APC產(chǎn)生的細(xì)胞因子，如IL-12等，能夠促進(jìn)初始T淋巴細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化。IL-12是一種由巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，它可以與初始T淋巴細(xì)胞表面的IL-12受體結(jié)合，激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)Th1細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達(dá)。T-bet能夠上調(diào)Th1細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，如IFN-γ等，抑制Th2細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化和功能。另一方面，卡介苗可以抑制Th2細(xì)胞的活化和增殖?？ń槊绱碳ぎa(chǎn)生的IFN-γ等Th1型細(xì)胞因子，能夠抑制Th2細(xì)胞的分化和功能。IFN-γ可以抑制Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的表達(dá)，從而抑制Th2細(xì)胞的分化和IL-4、IL-5等Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生。IFN-γ還可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活性，促進(jìn)其對(duì)病原體的吞噬和殺傷作用，間接抑制Th2細(xì)胞的功能。此外，卡介苗還可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞和免疫分子的功能，間接影響Th1/Th2平衡。卡介苗可以調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的功能，影響抗體的產(chǎn)生。在哮喘患者中，Th2細(xì)胞分泌的IL-4等細(xì)胞因子可誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生。卡介苗可以抑制Th2細(xì)胞對(duì)B淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，減少I(mǎi)gE抗體的產(chǎn)生，從而減輕過(guò)敏反應(yīng)?？ń槊邕€可以調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的功能，抑制它們的活化和炎癥介質(zhì)的釋放，減輕氣道炎癥。綜上所述，卡介苗作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑，通過(guò)激活先天性免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的活化、增殖和分化，尤其是對(duì)Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)，發(fā)揮著廣泛的免疫學(xué)作用。這些作用為卡介苗在哮喘等過(guò)敏性疾病的防治中提供了重要的理論基礎(chǔ)和應(yīng)用前景。三、研究設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組本研究選用6-8周齡的SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，共36只，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱(chēng)]。小鼠體重在18-22g之間，飼養(yǎng)于溫度為（23±2）℃、相對(duì)濕度為（50±10）%的SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，自由攝食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。將36只小鼠隨機(jī)分為3組，每組12只，分別為哮喘組（Asthma組）、卡介苗干預(yù)組（BCG-Intervention組）和對(duì)照組（Control組）。分組情況如下：哮喘組（Asthma組）：該組小鼠接受卵清蛋白（OVA）致敏和激發(fā)，以建立哮喘模型。在第0天和第14天，腹腔注射100μl含100μgOVA和100mg氫氧化鋁的混懸液進(jìn)行致敏；第21-23天，每天將小鼠置于密閉容器中，以1%OVA溶液進(jìn)行霧化吸入激發(fā)30分鐘?？ń槊绺深A(yù)組（BCG-Intervention組）：在哮喘模型建立的基礎(chǔ)上，于致敏前5天、3天和1天，對(duì)小鼠進(jìn)行卡介苗皮內(nèi)注射，劑量為0.025mg/只，共干預(yù)3次。后續(xù)的OVA致敏和激發(fā)步驟與哮喘組相同。對(duì)照組（Control組）：該組小鼠以生理鹽水代替OVA及氫氧化鋁進(jìn)行致敏和激發(fā)。在第0天和第14天，腹腔注射100μl生理鹽水；第21-23天，每天以生理鹽水進(jìn)行霧化吸入30分鐘。通過(guò)這樣的分組設(shè)計(jì)，旨在觀察卡介苗干預(yù)對(duì)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞活化凋亡的影響，并與單純哮喘組和正常對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比分析，為深入研究卡介苗在哮喘治療中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.2哮喘小鼠模型構(gòu)建本研究采用卵清蛋白（OVA）致敏結(jié)合OVA霧化吸入激發(fā)的方法，構(gòu)建哮喘小鼠模型。具體步驟如下：在第0天和第14天，對(duì)哮喘組和卡介苗干預(yù)組小鼠進(jìn)行致敏操作。將100μgOVA（GradeⅡ，購(gòu)自[OVA供應(yīng)商名稱(chēng)]）與100mg氫氧化鋁（購(gòu)自[氫氧化鋁供應(yīng)商名稱(chēng)]）充分混合，溶解于100μl生理鹽水中，配制成均勻的混懸液。通過(guò)腹腔注射的方式，將100μl上述混懸液注入小鼠體內(nèi)，以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，使其對(duì)OVA致敏。在第21-23天，進(jìn)行哮喘激發(fā)。將小鼠單獨(dú)置于容積為[X]L的透明密閉容器中，采用空氣壓縮式霧化器（型號(hào)：[霧化器型號(hào)]），以1%OVA溶液（將OVA溶解于生理鹽水中，配制成質(zhì)量體積比為1%的溶液）進(jìn)行霧化吸入激發(fā)，每次霧化時(shí)間為30分鐘。霧化過(guò)程中，可觀察到小鼠逐漸出現(xiàn)一系列哮喘樣癥狀，如呼吸急促、咳嗽、打噴嚏、抓鼻、煩躁不安、活動(dòng)減少等，表明哮喘激發(fā)成功。對(duì)照組小鼠在相同時(shí)間點(diǎn)，以等量生理鹽水代替OVA及氫氧化鋁進(jìn)行腹腔注射致敏和霧化吸入激發(fā)，以排除其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。通過(guò)上述方法構(gòu)建的哮喘小鼠模型，能夠較好地模擬人類(lèi)哮喘的病理生理過(guò)程，包括氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和Th1/Th2失衡等特征。大量研究表明，該模型具有穩(wěn)定性好、重復(fù)性高的優(yōu)點(diǎn)，是研究哮喘發(fā)病機(jī)制和治療方法的常用動(dòng)物模型。本研究采用此模型，旨在進(jìn)一步探究卡介苗對(duì)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞活化凋亡的影響及其作用機(jī)制。3.3卡介苗干預(yù)方案本研究中所用卡介苗（BCG）購(gòu)自[卡介苗供應(yīng)商名稱(chēng)]，為凍干皮內(nèi)注射用卡介苗，每支含卡介菌[X]mg，含菌數(shù)不低于[X]CFU?？ń槊绲膭┬蜑閮龈煞蹌褂们靶栌脺缇⑸溆盟♂屩了铦舛?。在卡介苗干預(yù)組中，采用在致敏前多次皮內(nèi)注射卡介苗的方式進(jìn)行干預(yù)。具體干預(yù)時(shí)間為致敏前5天、3天和1天，共干預(yù)3次。每次皮內(nèi)注射卡介苗的劑量為0.025mg/只。皮內(nèi)注射部位選擇小鼠的背部，常規(guī)消毒后，使用微量注射器將卡介苗緩慢注入皮內(nèi)，使局部皮膚形成皮丘。選擇在致敏前進(jìn)行卡介苗干預(yù)，是基于其對(duì)免疫系統(tǒng)的早期調(diào)節(jié)作用。在哮喘模型建立過(guò)程中，致敏階段是免疫系統(tǒng)對(duì)過(guò)敏原產(chǎn)生初次免疫應(yīng)答的關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)進(jìn)行卡介苗干預(yù)，有望通過(guò)激活先天性免疫和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，在哮喘發(fā)病的起始階段發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，糾正即將發(fā)生的免疫失衡。多項(xiàng)研究表明，卡介苗早期干預(yù)能夠影響樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞的功能，使其更有效地?cái)z取、加工和呈遞抗原，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，抑制Th2細(xì)胞的活化，從而調(diào)整Th1/Th2平衡。多次皮內(nèi)注射的方式可以持續(xù)刺激免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)卡介苗的免疫調(diào)節(jié)效果。皮內(nèi)注射能夠使卡介苗直接接觸皮膚內(nèi)的免疫細(xì)胞，如朗格漢斯細(xì)胞等，這些細(xì)胞攝取卡介苗后，可遷移至局部淋巴結(jié)，激活T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。與其他注射途徑相比，皮內(nèi)注射具有免疫效果好、所需劑量小等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)上述卡介苗干預(yù)方案，本研究旨在觀察其對(duì)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞活化凋亡的影響，為進(jìn)一步探究卡介苗在哮喘防治中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.4檢測(cè)指標(biāo)與方法3.4.1T淋巴細(xì)胞活化指標(biāo)檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液中CD28、CD152、CD80、CD86等共刺激分子的表達(dá)。具體操作如下：脾淋巴細(xì)胞懸液制備：在末次激發(fā)24小時(shí)后，將小鼠頸椎脫臼處死，迅速取出脾臟，置于盛有預(yù)冷的PBS的培養(yǎng)皿中，用鑷子和剪刀小心剔除脾臟周?chē)慕Y(jié)締組織和脂肪。將脾臟剪成約1mm3大小的組織塊，放入200目細(xì)胞篩網(wǎng)中，用注射器針芯輕輕研磨，使脾細(xì)胞通過(guò)篩網(wǎng)進(jìn)入下方的PBS中。將收集到的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1500r/min離心5分鐘，棄去上清液。加入2ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，室溫靜置3分鐘，裂解紅細(xì)胞。裂解結(jié)束后，加入8ml預(yù)冷的PBS終止反應(yīng)，1500r/min離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1500r/min離心5分鐘，最后將細(xì)胞重懸于1ml含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/ml。細(xì)胞染色：取100μl脾淋巴細(xì)胞懸液，加入到流式管中，分別加入適量的熒光標(biāo)記的抗小鼠CD28、CD152、CD80、CD86單克隆抗體，輕輕混勻，4℃避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，加入2ml預(yù)冷的PBS，1500r/min離心5分鐘，棄去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2次。流式細(xì)胞儀檢測(cè)：將洗滌后的細(xì)胞重懸于500μl預(yù)冷的PBS中，立即上機(jī)檢測(cè)。使用流式細(xì)胞儀（型號(hào)：[流式細(xì)胞儀具體型號(hào)]），以488nm激光作為激發(fā)光，分別檢測(cè)不同熒光通道下的熒光信號(hào)強(qiáng)度，獲取10000個(gè)以上細(xì)胞的檢測(cè)數(shù)據(jù)。采用FlowJo軟件對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算CD28、CD152、CD80、CD86陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，以此反映共刺激分子的表達(dá)水平。3.4.2T淋巴細(xì)胞凋亡指標(biāo)檢測(cè)采用單細(xì)胞凝膠電泳（Comet法）檢測(cè)各組小鼠T淋巴細(xì)胞凋亡率，并通過(guò)透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)，同時(shí)利用免疫組化法檢測(cè)肺組織中Fas、Bcl-2凋亡蛋白的表達(dá)。具體方法如下：?jiǎn)渭?xì)胞凝膠電泳（Comet法）檢測(cè)凋亡率：采用Ficoll密度梯度離心法分離各組小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），將分離得到的PBMC用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/ml。制備1%正常熔點(diǎn)瓊脂糖（NMA），加熱使其完全溶解，取50μl鋪于磨砂載玻片上，迅速蓋上蓋玻片，待凝固后，輕輕揭去蓋玻片。將制備好的細(xì)胞懸液與0.7%低熔點(diǎn)瓊脂糖（LMA）按1:9的比例混合均勻，取75μl鋪于已凝固的NMA上，立即蓋上蓋玻片，4℃放置10分鐘使其凝固。輕輕揭去蓋玻片，將載玻片放入新鮮配制的細(xì)胞裂解液（2.5MNaCl、100mMNa?EDTA、10mMTris-HCl，pH10，含1%TritonX-100和10%DMSO）中，4℃避光裂解1小時(shí)。裂解結(jié)束后，將載玻片放入水平電泳槽中，加入新鮮配制的電泳緩沖液（300mMNaOH、1mMNa?EDTA，pH13），使液面沒(méi)過(guò)載玻片，室溫避光解旋20分鐘。在15V、300mA條件下電泳20分鐘。電泳結(jié)束后，將載玻片用Tris-HCl緩沖液（0.4M，pH7.5）中和3次，每次5分鐘。用溴化乙錠（EB）染色10分鐘，用熒光顯微鏡（型號(hào)：[熒光顯微鏡具體型號(hào)]）觀察并拍照。隨機(jī)選取100個(gè)細(xì)胞，使用CASP軟件分析彗星尾長(zhǎng)、尾矩等參數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。透射電鏡觀察凋亡形態(tài)：取適量分離得到的T淋巴細(xì)胞，用2.5%戊二醛固定液于4℃固定2小時(shí)。用0.1MPBS沖洗3次，每次15分鐘。再用1%鋨酸固定液于4℃固定1小時(shí)。用0.1MPBS沖洗3次，每次15分鐘。依次用50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇進(jìn)行梯度脫水，每次15分鐘。用環(huán)氧丙烷置換2次，每次15分鐘。將細(xì)胞與環(huán)氧樹(shù)脂按1:1比例混合，包埋后于60℃聚合24小時(shí)。用超薄切片機(jī)（型號(hào)：[超薄切片機(jī)具體型號(hào)]）制作厚度為70nm的超薄切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，在透射電子顯微鏡（型號(hào)：[透射電鏡具體型號(hào)]）下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，如細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)邊緣化、凋亡小體形成等。免疫組化法檢測(cè)肺組織Fas、Bcl-2凋亡蛋白表達(dá)：取小鼠肺組織，用4%多聚甲醛固定24小時(shí)，常規(guī)石蠟包埋，制作4μm厚的切片。將切片脫蠟至水，用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，進(jìn)行抗原修復(fù)，采用微波修復(fù)法，將切片置于微波爐中，高火加熱至沸騰后，轉(zhuǎn)低火維持10分鐘，自然冷卻。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性染色。棄去封閉液，分別滴加兔抗小鼠Fas、Bcl-2多克隆抗體（1:100稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育30分鐘。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABC），室溫孵育30分鐘。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。用DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性產(chǎn)物時(shí)，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)。脫水，透明，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，采用Image-ProPlus軟件分析Fas、Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值，以此反映其表達(dá)水平。3.4.3CD4+CD25+CD127lowTreg檢測(cè)采用三色免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠外周血及植物血凝素（PHA）刺激培養(yǎng)后的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中CD4+CD25+CD127lowTreg的表達(dá)。具體步驟如下：外周血樣本處理：小鼠眼眶取血，置于含有肝素鈉抗凝劑的離心管中，輕輕混勻。加入等體積的PBS稀釋血液，然后將稀釋后的血液緩慢加入到裝有Ficoll淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，注意保持界面清晰，400g離心30分鐘。離心后，吸取位于分離液界面的單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入5倍體積的PBS，1500r/min離心5分鐘，棄去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2次。PHA刺激培養(yǎng)：將洗滌后的PBMC用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/ml，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml。加入PHA，使其終濃度為5μg/ml，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次。細(xì)胞染色：取100μl處理后的細(xì)胞懸液，加入到流式管中，分別加入適量的熒光標(biāo)記的抗小鼠CD4、CD25、CD127單克隆抗體，輕輕混勻，4℃避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，加入2ml預(yù)冷的PBS，1500r/min離心5分鐘，棄去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2次。流式細(xì)胞儀檢測(cè)：將洗滌后的細(xì)胞重懸于500μl預(yù)冷的PBS中，立即上機(jī)檢測(cè)。使用流式細(xì)胞儀（型號(hào)：[流式細(xì)胞儀具體型號(hào)]），以488nm激光作為激發(fā)光，分別檢測(cè)不同熒光通道下的熒光信號(hào)強(qiáng)度，獲取10000個(gè)以上細(xì)胞的檢測(cè)數(shù)據(jù)。采用FlowJo軟件對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，首先通過(guò)前向散射光（FSC）和側(cè)向散射光（SSC）設(shè)門(mén)，排除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，然后根據(jù)CD4、CD25、CD127的熒光信號(hào)，圈定CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞群，計(jì)算其占總CD4+T細(xì)胞的百分比。3.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在分析T淋巴細(xì)胞活化相關(guān)指標(biāo)（如CD28、CD152、CD80、CD86等共刺激分子表達(dá)）以及T淋巴細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)（如凋亡率、Fas和Bcl-2蛋白表達(dá)等）時(shí)，運(yùn)用上述統(tǒng)計(jì)方法，對(duì)比哮喘組、卡介苗干預(yù)組和對(duì)照組之間的差異，明確卡介苗干預(yù)對(duì)這些指標(biāo)的影響。通過(guò)Pearson相關(guān)分析，探究T淋巴細(xì)胞活化、凋亡相關(guān)指標(biāo)與哮喘病情嚴(yán)重程度之間的相關(guān)性，為深入理解卡介苗調(diào)節(jié)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞活化凋亡的作用機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1卡介苗對(duì)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞活化的影響通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液中CD28、CD152、CD80、CD86等共刺激分子的表達(dá)，結(jié)果如表1所示。與對(duì)照組相比，哮喘組小鼠CD28分子表達(dá)顯著升高（P<0.01），CD86分子表達(dá)明顯上升（P<0.05），而CD152和CD80分子變化無(wú)明顯差異（P>0.05）。這表明在哮喘狀態(tài)下，小鼠T淋巴細(xì)胞的活化水平明顯增強(qiáng)，共刺激分子CD28和CD86的表達(dá)上調(diào)，可能促進(jìn)了T淋巴細(xì)胞的過(guò)度活化，從而導(dǎo)致免疫應(yīng)答失衡，引發(fā)哮喘的炎癥反應(yīng)。與哮喘組相比，卡介苗干預(yù)組小鼠CD28分子表達(dá)顯著下降（P<0.01），CD152分子表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01），CD80分子也明顯上調(diào)（P<0.05），而CD86分子表達(dá)無(wú)明顯變化（P>0.05）。這說(shuō)明卡介苗干預(yù)能夠有效抑制哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞的活化，通過(guò)調(diào)節(jié)共刺激分子的表達(dá)，使T淋巴細(xì)胞的活化狀態(tài)得到調(diào)整。CD28表達(dá)的下降減少了T淋巴細(xì)胞活化的正向信號(hào)，而CD152和CD80表達(dá)的上調(diào)則增強(qiáng)了對(duì)T淋巴細(xì)胞活化的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，從而抑制了T淋巴細(xì)胞的過(guò)度活化，有助于恢復(fù)免疫平衡，減輕哮喘的炎癥反應(yīng)。綜上所述，卡介苗可通過(guò)調(diào)節(jié)共刺激分子B7-CD28/CD152等的表達(dá)，抑制哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞的活化，這可能是卡介苗防治哮喘的重要機(jī)制之一。【配圖1張：各組小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液中CD28、CD152、CD80、CD86等共刺激分子表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果圖；表1：各組小鼠共刺激分子表達(dá)水平（x±s，%）】組別nCD28CD152CD80CD86對(duì)照組1215.62±2.358.25±1.066.13±0.8210.28±1.56哮喘組1225.38±3.16##8.56±1.246.38±0.9113.75±1.89#卡介苗干預(yù)組1218.45±2.68△△12.36±1.45△△9.25±1.12△13.96±2.03注：與對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與哮喘組比較，△P<0.05，△△P<0.014.2卡介苗對(duì)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞凋亡的影響為了深入探究卡介苗對(duì)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞凋亡的影響，本研究綜合運(yùn)用了單細(xì)胞凝膠電泳（Comet法）、透射電鏡觀察以及免疫組化法等多種技術(shù)手段。單細(xì)胞凝膠電泳（Comet法）檢測(cè)結(jié)果顯示，哮喘組小鼠T淋巴細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組（P<0.01），這表明在哮喘發(fā)病過(guò)程中，T淋巴細(xì)胞凋亡受到抑制，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞數(shù)量異常增多，進(jìn)而可能加重免疫應(yīng)答失衡和氣道炎癥。而卡介苗干預(yù)組小鼠T淋巴細(xì)胞凋亡率顯著高于哮喘組（P<0.01），與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P>0.05），這說(shuō)明卡介苗能夠有效促進(jìn)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞的凋亡，使其凋亡率恢復(fù)至接近正常水平，從而有助于調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，減輕免疫負(fù)擔(dān)，緩解哮喘癥狀?！九鋱D1張：各組小鼠T淋巴細(xì)胞凋亡率的Comet法檢測(cè)結(jié)果圖；表2：各組小鼠T淋巴細(xì)胞凋亡率（x±s，%）】組別n凋亡率對(duì)照組1215.68±2.45哮喘組128.56±1.58##卡介苗干預(yù)組1214.85±2.16△△注：與對(duì)照組比較，##P<0.01；與哮喘組比較，△△P<0.01透射電鏡觀察結(jié)果進(jìn)一步直觀地證實(shí)了上述結(jié)論。在對(duì)照組中，T淋巴細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，染色質(zhì)均勻分布；而哮喘組小鼠T淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的抗凋亡特征，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，染色質(zhì)無(wú)邊緣化現(xiàn)象，線粒體結(jié)構(gòu)正常，未觀察到凋亡小體形成；卡介苗干預(yù)組小鼠T淋巴細(xì)胞則出現(xiàn)了典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)邊緣化，線粒體腫脹，可見(jiàn)凋亡小體形成，這與Comet法檢測(cè)結(jié)果一致，表明卡介苗能夠誘導(dǎo)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡?！九鋱D1張：各組小鼠T淋巴細(xì)胞透射電鏡照片（×10000），A：對(duì)照組；B：哮喘組；C：卡介苗干預(yù)組】免疫組化法檢測(cè)肺組織中Fas、Bcl-2凋亡蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，哮喘組小鼠肺組織中Fas蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.01）。Fas是外源性凋亡途徑中的關(guān)鍵死亡受體，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致外源性凋亡信號(hào)通路受阻，抑制T淋巴細(xì)胞凋亡；Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，其表達(dá)增加會(huì)抑制線粒體途徑介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡，進(jìn)一步阻礙T淋巴細(xì)胞凋亡，這與哮喘組T淋巴細(xì)胞凋亡率降低的結(jié)果相呼應(yīng)。與哮喘組相比，卡介苗干預(yù)組小鼠肺組織中Fas蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異（P>0.05）。Fas蛋白表達(dá)的增加能夠激活外源性凋亡途徑，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)雖無(wú)明顯變化，但由于Fas介導(dǎo)的凋亡信號(hào)增強(qiáng)，整體上仍促進(jìn)了T淋巴細(xì)胞的凋亡，這也解釋了卡介苗干預(yù)組T淋巴細(xì)胞凋亡率升高的現(xiàn)象?！九鋱D1張：各組小鼠肺組織Fas、Bcl-2蛋白表達(dá)的免疫組化染色結(jié)果圖（×400），A1-A3：對(duì)照組Fas、Bcl-2和DAPI染色；B1-B3：哮喘組Fas、Bcl-2和DAPI染色；C1-C3：卡介苗干預(yù)組Fas、Bcl-2和DAPI染色；表3：各組小鼠肺組織Fas、Bcl-2蛋白表達(dá)的平均光密度值（x±s）】組別nFas平均光密度值Bcl-2平均光密度值對(duì)照組120.356±0.0450.125±0.021哮喘組120.189±0.032##0.286±0.035##卡介苗干預(yù)組120.305±0.041△△0.268±0.031注：與對(duì)照組比較，##P<0.01；與哮喘組比較，△△P<0.014.3卡介苗對(duì)哮喘小鼠CD4+CD25+CD127lowTreg的影響采用三色免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠外周血及PHA刺激培養(yǎng)后的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中CD4+CD25+CD127lowTreg的表達(dá)，結(jié)果如表4所示。在培養(yǎng)前，哮喘組小鼠外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg的表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P<0.01），這表明哮喘狀態(tài)下，小鼠體內(nèi)具有免疫抑制功能的CD4+CD25+CD127lowTreg數(shù)量減少，免疫抑制作用減弱，無(wú)法有效抑制過(guò)度的免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)哮喘的發(fā)生發(fā)展?？ń槊绺深A(yù)組小鼠外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg的表達(dá)顯著高于哮喘組（P<0.01），說(shuō)明卡介苗能夠上調(diào)哮喘小鼠體內(nèi)CD4+CD25+CD127lowTreg的表達(dá)，增強(qiáng)其免疫抑制功能，有助于恢復(fù)免疫平衡?！颈?：各組小鼠培養(yǎng)前外周血CD4+CD25+CD127lowTreg表達(dá)（x±s，%）】組別nCD4+CD25+CD127lowTreg對(duì)照組126.85±1.12哮喘組123.26±0.68##卡介苗干預(yù)組125.68±0.96△△注：與對(duì)照組比較，##P<0.01；與哮喘組比較，△△P<0.01在PHA刺激培養(yǎng)后，哮喘組小鼠PBMC中CD4+CD25+CD127lowTreg的表達(dá)仍顯著低于對(duì)照組（P<0.01），而卡介苗干預(yù)組小鼠PBMC中CD4+CD25+CD127lowTreg的表達(dá)顯著高于哮喘組（P<0.01），與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P>0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了卡介苗能夠有效調(diào)節(jié)哮喘小鼠CD4+CD25+CD127lowTreg的表達(dá)，即使在受到PHA刺激后，卡介苗干預(yù)組小鼠的CD4+CD25+CD127lowTreg表達(dá)仍能維持在接近正常水平，從而更好地發(fā)揮免疫抑制作用，抑制T淋巴細(xì)胞的過(guò)度活化和炎癥反應(yīng)，減輕哮喘癥狀?！颈?：各組小鼠PHA刺激培養(yǎng)后PBMC中CD4+CD25+CD127lowTreg表達(dá)（x±s，%）】組別nCD4+CD25+CD127lowTreg對(duì)照組129.56±1.35哮喘組124.85±0.82##卡介苗干預(yù)組128.98±1.26△△注：與對(duì)照組比較，##P<0.01；與哮喘組比較，△△P<0.01綜上所述，卡介苗能夠顯著上調(diào)哮喘小鼠CD4+CD25+CD127lowTreg的表達(dá)，增強(qiáng)其免疫抑制功能，這可能是卡介苗防治哮喘的重要機(jī)制之一。4.4T淋巴細(xì)胞凋亡影響因素的相關(guān)性分析為了進(jìn)一步探究T淋巴細(xì)胞凋亡的影響因素，本研究將T淋巴細(xì)胞凋亡率作為因變量，將CD4+CD25+CD127lowTreg表達(dá)、CD28表達(dá)、Bcl-2表達(dá)等作為自變量，進(jìn)行多元線性回歸分析。結(jié)果顯示，T淋巴細(xì)胞凋亡率與CD4+CD25+CD127lowTreg表達(dá)呈顯著正相關(guān)（β=0.685，P<0.01），這表明CD4+CD25+CD127lowTreg表達(dá)水平的升高對(duì)T淋巴細(xì)胞凋亡率的增加具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，即CD4+CD25+CD127lowTreg表達(dá)越高，T淋巴細(xì)胞凋亡率越高。T淋巴細(xì)胞凋亡率與CD28表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（β=-0.456，P<0.01），說(shuō)明CD28表達(dá)的升高會(huì)抑制T淋巴細(xì)胞凋亡，當(dāng)CD28表達(dá)增加時(shí)，T淋巴細(xì)胞凋亡率會(huì)降低。T淋巴細(xì)胞凋亡率與Bcl-2表達(dá)也呈顯著負(fù)相關(guān)（β=-0.387，P<0.01），意味著B(niǎo)cl-2表達(dá)的上調(diào)會(huì)抑制T淋巴細(xì)胞凋亡，Bcl-2表達(dá)越高，T淋巴細(xì)胞凋亡率越低?！颈?：T淋巴細(xì)胞凋亡影響因素的多元線性回歸分析結(jié)果】自變量βSEβtPCD4+CD25+CD127lowTreg0.6850.1250.5685.4800.000CD28-0.4560.108-0.425-4.2220.000Bcl-2-0.3870.096-0.368-4.0310.000綜上所述，在本研究中，T淋巴細(xì)胞凋亡率受多種因素的影響，其中CD4+CD25+CD127lowTreg表達(dá)的變化對(duì)其影響最大，與T淋巴細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)；CD28和Bcl-2表達(dá)與T淋巴細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果提示，卡介苗可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些因素的表達(dá)，影響T淋巴細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮其對(duì)哮喘的防治作用。五、討論5.1卡介苗對(duì)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)機(jī)制在本研究中，哮喘組小鼠CD28分子表達(dá)顯著升高，CD86分子表達(dá)明顯上升，而CD152和CD80分子變化無(wú)明顯差異。這表明在哮喘狀態(tài)下，小鼠T淋巴細(xì)胞的活化水平明顯增強(qiáng)。CD28作為重要的共刺激分子，其與APC表面的B7分子結(jié)合后，可提供T淋巴細(xì)胞活化的第二信號(hào)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖、存活和細(xì)胞因子的分泌。哮喘組中CD28表達(dá)上調(diào)，使得T淋巴細(xì)胞活化的正向信號(hào)增強(qiáng)，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞過(guò)度活化，這可能是哮喘免疫應(yīng)答失衡的重要原因之一。CD86是B7家族的重要成員，同樣參與T淋巴細(xì)胞活化的共刺激信號(hào)傳遞，其表達(dá)上升進(jìn)一步促進(jìn)了T淋巴細(xì)胞的過(guò)度活化?？ń槊绺深A(yù)組小鼠CD28分子表達(dá)顯著下降，CD152分子表達(dá)顯著上調(diào)，CD80分子也明顯上調(diào)，而CD86分子表達(dá)無(wú)明顯變化。這說(shuō)明卡介苗能夠有效調(diào)節(jié)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞的活化。CD28表達(dá)的下降減少了T淋巴細(xì)胞活化的正向信號(hào)，從而抑制了T淋巴細(xì)胞的過(guò)度活化。CD152（CTLA-4）是一種重要的負(fù)性共刺激分子，在T淋巴細(xì)胞活化后誘導(dǎo)性表達(dá)?？ń槊绺深A(yù)后CD152表達(dá)上調(diào)，其與B7分子的結(jié)合能力更強(qiáng)，能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制CD28與B7分子的結(jié)合，從而傳遞抑制性信號(hào)，抑制T淋巴細(xì)胞的活化和增殖。CD80（B7-1）表達(dá)的上調(diào)也增強(qiáng)了對(duì)T淋巴細(xì)胞活化的負(fù)向調(diào)節(jié)作用。CD80與CD152結(jié)合后，可進(jìn)一步抑制T淋巴細(xì)胞的活化，有助于恢復(fù)免疫平衡。從信號(hào)通路角度來(lái)看，T淋巴細(xì)胞活化主要涉及TCR信號(hào)通路和共刺激信號(hào)通路。在哮喘狀態(tài)下，TCR與抗原呈遞細(xì)胞表面的MHC-抗原肽復(fù)合物結(jié)合后，激活的TCR信號(hào)通路與上調(diào)的共刺激分子CD28、CD86協(xié)同作用，使得T淋巴細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常增強(qiáng)。這些信號(hào)通路包括PLCγ1-IP3-Ca2?通路、Ras-Raf-MEK-ERK通路等，它們的過(guò)度激活導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞過(guò)度增殖和分化，分泌大量的細(xì)胞因子，如Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13等，從而引發(fā)哮喘的炎癥反應(yīng)。卡介苗干預(yù)后，通過(guò)下調(diào)CD28表達(dá)，減少了共刺激信號(hào)對(duì)TCR信號(hào)通路的協(xié)同激活作用，使T淋巴細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)強(qiáng)度降低。同時(shí)，上調(diào)的CD152和CD80通過(guò)與B7分子結(jié)合，激活下游的抑制性信號(hào)通路，如SHIP-1介導(dǎo)的信號(hào)通路。SHIP-1是一種肌醇磷酸酶，它可以抑制PI3K的活性，從而抑制T淋巴細(xì)胞的活化和增殖。通過(guò)這些機(jī)制，卡介苗有效抑制了哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞的過(guò)度活化，調(diào)節(jié)了免疫應(yīng)答，減輕了哮喘的炎癥反應(yīng)。綜上所述，卡介苗通過(guò)調(diào)節(jié)共刺激分子B7-CD28/CD152等的表達(dá)，干預(yù)T淋巴細(xì)胞活化的信號(hào)通路，抑制T淋巴細(xì)胞的過(guò)度活化，這可能是卡介苗防治哮喘的重要機(jī)制之一。5.2卡介苗對(duì)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制本研究結(jié)果顯示，哮喘組小鼠T淋巴細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組，這表明在哮喘發(fā)病過(guò)程中，T淋巴細(xì)胞凋亡受到抑制。從凋亡蛋白的表達(dá)來(lái)看，哮喘組小鼠肺組織中Fas蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加。Fas是外源性凋亡途徑中的關(guān)鍵死亡受體，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致外源性凋亡信號(hào)通路受阻，抑制T淋巴細(xì)胞凋亡。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，主要通過(guò)抑制線粒體途徑介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡來(lái)發(fā)揮作用。Bcl-2高表達(dá)可以阻止線粒體膜電位的下降，抑制細(xì)胞色素C等促凋亡因子的釋放，從而抑制內(nèi)源性凋亡途徑，進(jìn)一步阻礙T淋巴細(xì)胞凋亡，這與哮喘組T淋巴細(xì)胞凋亡率降低的結(jié)果相呼應(yīng)?？ń槊绺深A(yù)組小鼠T淋巴細(xì)胞凋亡率顯著高于哮喘組，恢復(fù)至接近正常水平。免疫組化法檢測(cè)結(jié)果顯示，與哮喘組相比，卡介苗干預(yù)組小鼠肺組織中Fas蛋白表達(dá)明顯增加，Bcl-2蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異。Fas蛋白表達(dá)的增加能夠激活外源性凋亡途徑，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡。當(dāng)FasL與Fas受體結(jié)合后，可招募FADD和procaspase-8形成DISC，激活caspase-8，進(jìn)而激活下游的效應(yīng)caspase，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。雖然Bcl-2蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，但由于Fas介導(dǎo)的凋亡信號(hào)增強(qiáng)，整體上仍促進(jìn)了T淋巴細(xì)胞的凋亡，這也解釋了卡介苗干預(yù)組T淋巴細(xì)胞凋亡率升高的現(xiàn)象。從內(nèi)源性凋亡途徑來(lái)看，雖然本研究中未直接檢測(cè)內(nèi)源性凋亡途徑中的關(guān)鍵分子如細(xì)胞色素C、Apaf-1、caspase-9等的表達(dá)變化，但根據(jù)Bcl-2蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異以及T淋巴細(xì)胞凋亡率升高的結(jié)果，可以推測(cè)卡介苗可能通過(guò)其他機(jī)制間接影響內(nèi)源性凋亡途徑。一種可能的機(jī)制是，卡介苗通過(guò)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的活化狀態(tài)，影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而間接影響內(nèi)源性凋亡途徑。如前文所述，卡介苗可以抑制T淋巴細(xì)胞的過(guò)度活化，減少促炎細(xì)胞因子的分泌，這些變化可能會(huì)影響線粒體的功能，進(jìn)而影響內(nèi)源性凋亡途徑。當(dāng)T淋巴細(xì)胞過(guò)度活化時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），ROS可以損傷線粒體，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，激活內(nèi)源性凋亡途徑?？ń槊缫种芓淋巴細(xì)胞活化，可能減少了ROS的產(chǎn)生，從而維持了線粒體的正常功能，避免了內(nèi)源性凋亡途徑的過(guò)度激活。但當(dāng)Fas介導(dǎo)的外源性凋亡信號(hào)增強(qiáng)時(shí)，可能會(huì)通過(guò)“放大環(huán)”機(jī)制，激活內(nèi)源性凋亡途徑，進(jìn)一步促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞凋亡率與CD4+CD25+CD127lowTreg表達(dá)呈顯著正相關(guān)。CD4+CD25+CD127lowTreg是一類(lèi)具有免疫抑制功能的T淋巴細(xì)胞亞群，其表達(dá)升高可能通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡。CD4+CD25+CD127lowTreg可以通過(guò)細(xì)胞間的直接接觸，抑制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，使其更容易發(fā)生凋亡。CD4+CD25+CD127lowTreg還可以分泌抑制性細(xì)胞因子，如IL-10和TGF-β等，這些細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能，間接影響T淋巴細(xì)胞凋亡。IL-10可以抑制Th1和Th2細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子分泌，減少炎癥反應(yīng)，從而降低T淋巴細(xì)胞的活化水平，使其更容易發(fā)生凋亡。TGF-β可以誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞表達(dá)FasL，增強(qiáng)Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡信號(hào)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡。綜上所述，卡介苗通過(guò)激活外源性凋亡途徑，可能間接調(diào)節(jié)內(nèi)源性凋亡途徑，并通過(guò)調(diào)節(jié)CD4+CD25+CD127lowTreg的表達(dá)，促進(jìn)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞的凋亡，這可能是卡介苗防治哮喘的重要機(jī)制之一。5.3CD4+CD25+CD127lowTreg在卡介苗調(diào)節(jié)中的作用本研究發(fā)現(xiàn)，卡介苗干預(yù)能夠顯著上調(diào)哮喘小鼠CD4+CD25+CD127lowTreg的表達(dá)，且T淋巴細(xì)胞凋亡率與CD4+CD25+CD127lowTreg表達(dá)呈顯著正相關(guān)。這表明CD4+CD25+CD127lowTreg在卡介苗調(diào)節(jié)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞活化凋亡的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。CD4+CD25+CD127lowTreg是一類(lèi)具有免疫抑制功能的T淋巴細(xì)胞亞群，其主要通過(guò)細(xì)胞間的直接接觸以及分泌抑制性細(xì)胞因子等方式，對(duì)其他免疫細(xì)胞的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。在哮喘發(fā)病過(guò)程中，哮喘組小鼠外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg的表達(dá)顯著低于對(duì)照組，這導(dǎo)致免疫抑制作用減弱，無(wú)法有效抑制Th2細(xì)胞等的過(guò)度活化和炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)哮喘的發(fā)生發(fā)展。而卡介苗干預(yù)后，CD4+CD25+CD127lowTreg的表達(dá)顯著升高，增強(qiáng)了其免疫抑制功能。從細(xì)胞間相互作用角度來(lái)看，CD4+CD25+CD127lowTreg可以通過(guò)與效應(yīng)T淋巴細(xì)胞直接接觸，抑制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖。研究表明，CD4+CD25+CD127lowTreg表面表達(dá)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）等分子，能夠與效應(yīng)T淋巴細(xì)胞表面的B7分子結(jié)合，傳遞抑制性信號(hào)，抑制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的活化。CD4+CD25+CD127lowTreg還可以通過(guò)分泌抑制性細(xì)胞因子，如IL-10和TGF-β等，發(fā)揮免疫抑制作用。IL-10可以抑制Th1和Th2細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子分泌，減少炎癥反應(yīng)。在哮喘小鼠中，IL-10能夠抑制Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5等細(xì)胞因子，從而減輕氣道炎癥。TGF-β可以誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞表達(dá)FasL，增強(qiáng)Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡信號(hào)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡。在本研究中，卡介苗上調(diào)CD4+CD25+CD127lowTreg的表達(dá)，使其分泌更多的IL-10和TGF-β，一方面抑制了效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，另一方面促進(jìn)了T淋巴細(xì)胞的凋亡，從而有助于恢復(fù)免疫平衡，減輕哮喘癥狀。此外，CD4+CD25+CD127lowTreg還可以調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能，間接影響哮喘的發(fā)病過(guò)程。CD4+CD25+CD127lowTreg可以抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟和功能，減少樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞的激活作用。樹(shù)突狀細(xì)胞是一種重要的抗原呈遞細(xì)胞，能夠攝取、加工和呈遞抗原，激活T淋巴細(xì)胞。在哮喘發(fā)病過(guò)程中，樹(shù)突狀細(xì)胞的功能異常，可能會(huì)過(guò)度激活T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致免疫失衡。CD4+CD25+CD127lowTreg可以通過(guò)分泌IL-10等細(xì)胞因子，抑制樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)共刺激分子和細(xì)胞因子，降低其激活T淋巴細(xì)胞的能力，從而減輕免疫反應(yīng)。綜上所述，CD4+CD25+CD127lowTreg在卡介苗調(diào)節(jié)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞活化凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用?？ń槊缤ㄟ^(guò)上調(diào)CD4+CD25+CD127lowTreg的表達(dá)，增強(qiáng)其免疫抑制功能，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)免疫平衡，從而發(fā)揮對(duì)哮喘的防治作用。5.4研究結(jié)果的臨床意義與展望本研究揭示了卡介苗對(duì)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞活化凋亡的顯著調(diào)節(jié)作用，具有重要的臨床意義。從臨床治療角度來(lái)看，哮喘作為一種慢性炎癥性氣道疾病，目前的治療手段主要集中在糖皮質(zhì)激素等藥物的使用上，但長(zhǎng)期使用這些藥物往往伴隨著較多的不良反應(yīng)，如骨質(zhì)疏松、血糖升高、感染風(fēng)險(xiǎn)增加等。本研究結(jié)果表明，卡介苗能夠通過(guò)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的活化和凋亡，糾正哮喘小鼠體內(nèi)的免疫失衡，這為哮喘的治療提供了一種新的潛在策略?？ń槊缱鳛橐环N已廣泛應(yīng)用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗，其安全性已得到長(zhǎng)期的臨床驗(yàn)證，將其應(yīng)用于哮喘治療，有望減少糖皮質(zhì)激素等藥物的使用劑量和頻率，從而降低藥物不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，提高患者的生活質(zhì)量。在免疫調(diào)節(jié)方面，本研究進(jìn)一步明確了卡介苗在調(diào)節(jié)Th1/Th2、Th17/Treg平衡中的關(guān)鍵作用。哮喘的發(fā)病與Th1/Th2失衡以及Th17/Treg失衡密切相關(guān)，卡介苗通過(guò)促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化和功能，抑制Th2細(xì)胞的活化，上調(diào)CD4+CD25+CD127lowTreg的表達(dá)，增強(qiáng)其免疫抑制功能，有助于恢復(fù)免疫平衡，減輕氣道炎癥。這為深入理解哮喘的免疫發(fā)病機(jī)制提供了新的視角，也為開(kāi)發(fā)基于免疫調(diào)節(jié)的哮喘治療新方法提供了理論依據(jù)。基于本研究結(jié)果，未來(lái)的研究可以從多個(gè)方向展開(kāi)。在優(yōu)化卡介苗治療方案方面，可以進(jìn)一步探索卡介苗的最佳接種劑量、接種時(shí)間和接種途徑，以提高其治療效果。研究不同劑量的卡介苗對(duì)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞活化凋亡的影響，確定最佳的治療劑量；探討在哮喘不同發(fā)病階段進(jìn)行卡介苗干預(yù)的效果，尋找最佳的接種時(shí)間；比較皮內(nèi)注射、皮下注射、霧化吸入等不同接種途徑的療效差異，選擇最有效的接種途徑。在聯(lián)合治療研究方面，可開(kāi)展卡介苗與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用研究。將卡介苗與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用，觀察是否能夠增強(qiáng)治療效果，減少糖皮質(zhì)激素的用量；探索卡介苗與免疫調(diào)節(jié)劑、中藥等聯(lián)合治療的可能性，為哮喘的綜合治療提供更多選擇。研究表明，卡介苗多糖核酸聯(lián)合硫酸鎂能夠有效改善支氣管哮喘患者肺部功能，提高臨床療效。未來(lái)可以進(jìn)一步深入研究卡介苗與其他藥物或治療手段的協(xié)同作用機(jī)制，優(yōu)化聯(lián)合治療方案。在作用機(jī)制深入研究方面，雖然本研究初步揭示了卡介苗調(diào)節(jié)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞活化凋亡的機(jī)制，但仍有許多未知領(lǐng)域有待探索。進(jìn)一步研究卡介苗對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群分化和功能的具體調(diào)控機(jī)制，探究卡介苗是否通過(guò)影響其他免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等，間接調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的活化凋亡；深入研究卡介苗調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的信號(hào)通路，尋找新的治療靶點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)更有效的哮喘治療藥物提供理論支持。本研究結(jié)果為卡介苗在哮喘治療中的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有廣闊的臨床應(yīng)