卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑和鹽霉素的敏感性差異及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年新增卵巢癌患者數(shù)量眾多，且其死亡率在婦科惡性腫瘤中居于前列。卵巢癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，這使得治療難度大大增加。目前，卵巢癌的常規(guī)治療方法主要包括手術(shù)切除和化療，然而，化療效果往往不盡如人意，患者在停止治療后腫瘤容易復(fù)發(fā)，且對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，這成為了卵巢癌治療中的一大難題。順鉑作為一種常用的化療藥物，在卵巢癌的治療中發(fā)揮著重要作用。它能夠與癌細(xì)胞的DNA結(jié)合，干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂。鹽霉素則是一種新型的抗腫瘤藥物，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)腫瘤干細(xì)胞具有一定的殺傷作用。腫瘤干細(xì)胞（CSC）是腫瘤細(xì)胞中具有自我更新和多向分化能力的一小部分細(xì)胞，它們被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的根源。腫瘤干細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，能夠憑借正常干細(xì)胞所賦予的“自我更新”能力和處于靜止期的特性、DNA損傷的修復(fù)能力以及高表達(dá)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等，逃脫藥物的殺傷作用，從而在化療后導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥。在卵巢癌的治療中，雖然順鉑和鹽霉素等化療藥物在一定程度上能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)，但由于腫瘤干細(xì)胞的存在，使得化療效果大打折扣。傳統(tǒng)化療方案主要針對(duì)的是快速增殖的腫瘤細(xì)胞，而腫瘤干細(xì)胞具有緩慢的循環(huán)速率，對(duì)化療藥物相對(duì)不敏感。腫瘤干細(xì)胞還能夠通過(guò)多種機(jī)制來(lái)抵抗化療藥物的作用，如高表達(dá)ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)⒒熕幬锱懦黾?xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度，使腫瘤干細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。因此，深入研究卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑和鹽霉素的藥物敏感性，對(duì)于開(kāi)發(fā)新的治療方法、提高卵巢癌的治療效果以及預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要的意義。通過(guò)了解卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)這兩種藥物的敏感性差異，能夠?yàn)榕R床治療提供更精準(zhǔn)的用藥指導(dǎo)，有助于開(kāi)發(fā)出更有效的治療策略，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。本研究還可能揭示卵巢癌干細(xì)胞耐藥性的新機(jī)制，為新藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)，推動(dòng)卵巢癌治療領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。1.2研究目的本研究旨在深入探究卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑和鹽霉素的藥物敏感性。通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分離并鑒定卵巢癌腫瘤干細(xì)胞，運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，精確測(cè)定其對(duì)順鉑和鹽霉素的藥物敏感性，比較兩種藥物對(duì)卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的殺傷作用。深入分析卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑和鹽霉素敏感性差異的原因，從分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等多個(gè)層面探究其內(nèi)在機(jī)制，包括研究相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化及其在耐藥過(guò)程中的作用。本研究還期望能為卵巢癌的臨床治療提供理論依據(jù)和新的治療方向，為開(kāi)發(fā)更有效的治療策略、提高卵巢癌患者的生存率和生活質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。二、卵巢癌與腫瘤干細(xì)胞概述2.1卵巢癌的現(xiàn)狀2.1.1發(fā)病率與死亡率卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著全球女性的生命健康。在全球范圍內(nèi)，卵巢癌的發(fā)病率和死亡率均處于較高水平。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約有23萬(wàn)新增卵巢癌病例，死亡人數(shù)高達(dá)15萬(wàn)，這意味著每天都有大量女性因卵巢癌失去生命。卵巢癌在女性生殖器官常見(jiàn)腫瘤中發(fā)病率居第三位，但其死亡率卻居首位。我國(guó)的卵巢癌發(fā)病情況也不容樂(lè)觀。近年來(lái)，我國(guó)卵巢癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。據(jù)2015年國(guó)家癌癥中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，我國(guó)每年新發(fā)卵巢癌52,100例，死亡約22,500例，相當(dāng)于每10分鐘就有一人被確診，每20分鐘就有一人因其死亡。過(guò)去10年間，我國(guó)卵巢癌發(fā)病年齡越來(lái)越年輕，發(fā)病率增長(zhǎng)了30%，死亡率增加了18%，其中城市女性發(fā)病率高于農(nóng)村女性。黃海濤等人通過(guò)對(duì)《中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》中2005-2016年卵巢癌發(fā)病與死亡數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)我國(guó)卵巢癌發(fā)病率整體呈快速上升趨勢(shì)，35歲以后發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，發(fā)病高峰主要集中出現(xiàn)在55歲年齡組；死亡率整體也呈快速上升趨勢(shì)，35歲以后死亡率隨年齡的增長(zhǎng)快速上升，75歲以后死亡率逐漸下降。卵巢癌的高發(fā)病率和高死亡率給患者及其家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)，也對(duì)社會(huì)醫(yī)療資源造成了巨大的壓力。2.1.2治療手段與挑戰(zhàn)目前，卵巢癌的常規(guī)治療方法主要包括手術(shù)治療、化療和放療。手術(shù)治療是卵巢癌的主要治療方式，早期卵巢癌患者可通過(guò)手術(shù)切除病變組織，并進(jìn)行淋巴結(jié)活檢。對(duì)于發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，減瘤手術(shù)可在一定程度上改善病情，緩解癥狀?；焺t是通過(guò)使用化學(xué)藥物來(lái)殺滅癌細(xì)胞，上皮性卵巢癌常用鉑類(lèi)聯(lián)合紫杉醇治療，卵巢生殖細(xì)胞瘤可采取博來(lái)霉素＋依托泊苷＋順鉑（BEP）方案。部分患者在化療后，還可酌情采用局部放療，以殺滅殘留的腫瘤細(xì)胞。然而，這些治療方法面臨著諸多挑戰(zhàn)。卵巢癌早期臨床癥狀不典型、缺乏特異性，且卵巢位于盆腔深部，早期腫瘤難以察覺(jué)，導(dǎo)致70%以上的患者確診時(shí)已是晚期。晚期卵巢癌患者的癌細(xì)胞往往已經(jīng)擴(kuò)散，手術(shù)難以徹底根除病灶，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高。在完成標(biāo)準(zhǔn)一線含鉑化療后，復(fù)發(fā)率仍高達(dá)70%以上。卵巢癌患者對(duì)化療藥物的耐藥性也是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。腫瘤細(xì)胞在化療過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生基因突變，導(dǎo)致對(duì)化療藥物的敏感性降低，使得化療效果大打折扣。這不僅增加了治療的難度，也降低了患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。據(jù)統(tǒng)計(jì)，卵巢癌患者五年生存率僅為29%，這一數(shù)據(jù)凸顯了卵巢癌治療的困境和挑戰(zhàn)。2.2腫瘤干細(xì)胞理論2.2.1腫瘤干細(xì)胞的定義與特性腫瘤干細(xì)胞（CancerStemCells，CSC），是指腫瘤組織中存在的一小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群體。它們?nèi)缤[瘤的“種子”，具備自我更新、多向分化以及高致瘤性等關(guān)鍵特性，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色。自我更新能力是腫瘤干細(xì)胞的核心特性之一。它們能夠通過(guò)不對(duì)稱(chēng)分裂，產(chǎn)生一個(gè)與自身完全相同的子代干細(xì)胞，以及一個(gè)可以分化為其他多種腫瘤細(xì)胞的祖細(xì)胞。這種獨(dú)特的分裂方式使得腫瘤干細(xì)胞能夠維持自身數(shù)量的穩(wěn)定，為腫瘤的持續(xù)生長(zhǎng)提供源源不斷的細(xì)胞來(lái)源。以白血病腫瘤干細(xì)胞為例，它們可以在骨髓中不斷自我更新，即使在化療后大部分白血病細(xì)胞被殺死，腫瘤干細(xì)胞仍能存活并重新增殖，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。多向分化潛能是腫瘤干細(xì)胞的另一重要特性。腫瘤干細(xì)胞能夠分化成構(gòu)成腫瘤組織的各種不同類(lèi)型的細(xì)胞，形成具有異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞群體。在乳腺癌中，腫瘤干細(xì)胞可以分化為乳腺上皮細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞類(lèi)型，這些不同類(lèi)型的細(xì)胞共同構(gòu)成了乳腺癌組織的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。腫瘤干細(xì)胞的多向分化潛能使得腫瘤組織具有高度的異質(zhì)性，增加了腫瘤治療的難度。腫瘤干細(xì)胞還具有高致瘤性。相較于普通腫瘤細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞具有更強(qiáng)的致瘤能力。實(shí)驗(yàn)表明，將少量腫瘤干細(xì)胞注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，就能夠形成腫瘤，而注射大量普通腫瘤細(xì)胞卻不一定能成功致瘤。這一特性表明腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生的根源，對(duì)腫瘤的形成和發(fā)展起著決定性作用。腫瘤干細(xì)胞的高致瘤性也使得它們成為腫瘤治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)，一旦能夠有效清除腫瘤干細(xì)胞，就有可能從根本上治愈腫瘤。腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過(guò)程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腫瘤干細(xì)胞能夠通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等過(guò)程獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，從而更容易從原發(fā)腫瘤部位脫離，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴系統(tǒng)，進(jìn)而在遠(yuǎn)處器官形成轉(zhuǎn)移灶。在腫瘤復(fù)發(fā)方面，腫瘤干細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗凋亡能力和對(duì)化療藥物、放療的耐受性，能夠在常規(guī)治療后存活下來(lái)，重新啟動(dòng)腫瘤的生長(zhǎng)，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。2.2.2卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的研究進(jìn)展卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的研究歷程充滿了探索與突破。早在2008年，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科張殊博士在國(guó)際上首次成功從人卵巢癌組織中分離、鑒定出人卵巢癌干細(xì)胞，這一開(kāi)創(chuàng)性的成果為卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的研究拉開(kāi)了新的序幕。此后，相關(guān)研究如雨后春筍般展開(kāi)，學(xué)者們對(duì)卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的認(rèn)識(shí)不斷深入。在分離與鑒定方面，目前主要依據(jù)卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志物、生物學(xué)特性等進(jìn)行。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌腫瘤干細(xì)胞擁有特異的細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44和CD117，這些標(biāo)志物為其分離和鑒定提供了重要的分子靶點(diǎn)。通過(guò)流式細(xì)胞分選技術(shù)（FACS），利用針對(duì)CD44和CD117的特異性抗體，可以從卵巢癌組織細(xì)胞中分離出高表達(dá)這些標(biāo)志物的細(xì)胞，這些細(xì)胞被認(rèn)為是卵巢癌腫瘤干細(xì)胞。還有研究利用腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力，通過(guò)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)，使卵巢癌腫瘤干細(xì)胞形成腫瘤球，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其富集和分離。在生物學(xué)特性研究上，卵巢癌腫瘤干細(xì)胞展現(xiàn)出獨(dú)特的性質(zhì)。它們具有更強(qiáng)的耐藥性，能夠高表達(dá)多種ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）等。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)⒒熕幬锱懦黾?xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑、紫杉醇等常用化療藥物產(chǎn)生耐藥性。卵巢癌腫瘤干細(xì)胞還具有較高的抗凋亡能力，其凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)異常，使得它們能夠抵抗化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的研究仍存在諸多問(wèn)題。目前的分離和鑒定方法還不夠完善，存在一定的局限性。不同研究中使用的表面標(biāo)志物和分離方法不盡相同，導(dǎo)致得到的卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的純度和特性存在差異，這給研究結(jié)果的一致性和可比性帶來(lái)了挑戰(zhàn)。對(duì)卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性和調(diào)控機(jī)制的了解還不夠深入，許多關(guān)鍵問(wèn)題尚未得到解答，如腫瘤干細(xì)胞的自我更新和分化是如何精準(zhǔn)調(diào)控的，它們與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用機(jī)制是什么等。這些問(wèn)題的存在制約了針對(duì)卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的靶向治療策略的發(fā)展，亟待進(jìn)一步深入研究來(lái)解決。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本研究選用人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3，該細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心（ATCC），具有明確的來(lái)源和特性記錄。SKOV-3細(xì)胞在含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）的McCoy's5A培養(yǎng)基（Gibco公司）中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中，保持飽和濕度。定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，采用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Gibco公司）進(jìn)行消化傳代，以維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和活性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動(dòng)物房，溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度為40%-60%，12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)。給予無(wú)菌飼料和飲用水，定期更換鼠籠和墊料，保持飼養(yǎng)環(huán)境的清潔衛(wèi)生。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理準(zhǔn)則，所有操作均經(jīng)過(guò)[具體倫理委員會(huì)名稱(chēng)]的批準(zhǔn)，以減少動(dòng)物的痛苦和不適，確保實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和道德性。3.1.2主要試劑與儀器主要試劑包括順鉑（純度≥99%，Sigma-Aldrich公司），為白色結(jié)晶性粉末，常用于腫瘤化療，在本研究中作為對(duì)照化療藥物，用于檢測(cè)卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)其敏感性。鹽霉素（純度≥98%，Sigma-Aldrich公司），呈淡黃色粉末狀，是本研究重點(diǎn)關(guān)注的藥物，用于探究其對(duì)卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的殺傷作用。CCK-8試劑盒（Dojindo公司），為細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑，用于檢測(cè)細(xì)胞活力，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)CCK-8試劑的還原能力，間接反映細(xì)胞的增殖和存活情況。實(shí)驗(yàn)儀器有流式細(xì)胞儀（BDFACSCantoII，BD公司），用于細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測(cè)和細(xì)胞分選，能夠精確分析細(xì)胞的物理和化學(xué)特性，根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)和篩選。PCR儀（AppliedBiosystems7500Fast，ThermoFisherScientific公司），用于基因表達(dá)分析，通過(guò)擴(kuò)增特定基因片段，檢測(cè)基因的表達(dá)水平，從而探究藥物對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響。酶標(biāo)儀（BioTekSynergyH1，BioTek公司），配合CCK-8試劑盒使用，用于測(cè)量吸光度值，以量化細(xì)胞活力。此外，還使用了CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司）、離心機(jī)（Eppendorf公司）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）等常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作儀器。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的分離與鑒定采用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法從人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3中分離腫瘤干細(xì)胞。具體操作如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV-3細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，以1×10?個(gè)/mL的密度接種于含人表皮生長(zhǎng)因子（EGF，20ng/mL）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF，20ng/mL）、B27添加劑（1×）、青霉素（100U/mL）和鏈霉素（100μg/mL）的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3-4天半量換液一次。約7-10天后，可見(jiàn)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球形成，這些細(xì)胞球即為富集的卵巢癌腫瘤干細(xì)胞。利用免疫熒光染色和流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)分離得到的卵巢癌腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將細(xì)胞球用0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞，以4%多聚甲醛固定15分鐘，0.1%TritonX-100通透10分鐘，5%牛血清白蛋白（BSA）封閉30分鐘。分別加入鼠抗人CD44抗體（1:200稀釋?zhuān)┖褪罂谷薈D133抗體（1:200稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗滌3次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（1:500稀釋?zhuān)?，室溫避光孵?小時(shí)。DAPI復(fù)染細(xì)胞核5分鐘，用熒光顯微鏡觀察并拍照。同時(shí)，取單細(xì)胞懸液，加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體，4℃避光孵育30分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44和CD133的表達(dá)情況。若細(xì)胞高表達(dá)CD44和CD133，則可鑒定為卵巢癌腫瘤干細(xì)胞。3.2.2藥物敏感性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)置順鉑組、鹽霉素組和對(duì)照組。將分離得到的卵巢癌腫瘤干細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔體積為100μL。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的順鉑（0.1、1、10、50、100μmol/L）和鹽霉素（0.1、1、10、50、100μmol/L），對(duì)照組加入等體積的無(wú)血清培養(yǎng)基。每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，將96孔板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后，采用CCK-8比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖和存活情況。具體操作如下：每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2-4小時(shí)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線，采用GraphPadPrism軟件計(jì)算半數(shù)致死量（IC50）。進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑和鹽霉素的敏感性。將卵巢癌腫瘤干細(xì)胞以200個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別加入不同濃度的順鉑和鹽霉素，對(duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)10-14天后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定15分鐘。0.1%結(jié)晶紫染色10分鐘，流水沖洗，晾干后在顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)（≥50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)定義為一個(gè)克?。?。計(jì)算克隆形成率，克隆形成率（%）=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。3.2.3耐藥機(jī)制探究實(shí)驗(yàn)用不同濃度的順鉑（1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）和鹽霉素（1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）處理卵巢癌腫瘤干細(xì)胞48小時(shí)，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證其藥物敏感性。具體步驟為：處理結(jié)束后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，棄去上清液，加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。測(cè)定藥物處理30天后干細(xì)胞增殖情況和干細(xì)胞表面標(biāo)志物（CD44、CD133）的表達(dá)情況。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，方法同3.2.2。對(duì)于表面標(biāo)志物表達(dá)檢測(cè)，將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44和CD133的表達(dá)。用RT-PCR和Westernblot等技術(shù)檢測(cè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABCB1、ABCG2）基因和蛋白表達(dá)。提取細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ABCB1上游引物序列為5'-ATGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，下游引物序列為5'-CTGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；ABCG2上游引物序列為5'-ATGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，下游引物序列為5'-CTGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。以GAPDH作為內(nèi)參基因，上游引物序列為5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3'，下游引物序列為5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。采用Westernblot檢測(cè)ABCB1和ABCG2蛋白表達(dá)。提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，加入兔抗人ABCB1抗體（1:1000稀釋?zhuān)┖屯每谷薃BCG2抗體（1:1000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10分鐘，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋?zhuān)?，室溫孵?小時(shí)。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，曝光成像，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)分析ABCB1和ABCG2基因和蛋白表達(dá)水平的變化，探究卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑和鹽霉素產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的成功分離與鑒定通過(guò)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3進(jìn)行培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)形成懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球，這些細(xì)胞球即為卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的富集群體。在培養(yǎng)過(guò)程中，顯微鏡下可觀察到細(xì)胞球呈圓形，邊界清晰，細(xì)胞之間緊密聚集。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞球不斷增殖，體積逐漸增大。免疫熒光染色結(jié)果顯示，細(xì)胞球中的細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志性因子CD44和CD133。在熒光顯微鏡下，可見(jiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)出明亮的綠色熒光，表明CD44和CD133蛋白在細(xì)胞表面大量表達(dá)。DAPI復(fù)染的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，與綠色熒光的干細(xì)胞標(biāo)志物形成鮮明對(duì)比，更清晰地顯示出陽(yáng)性細(xì)胞的分布和形態(tài)。利用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)單細(xì)胞懸液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了分離得到的細(xì)胞高表達(dá)CD44和CD133。流式細(xì)胞儀檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，CD44陽(yáng)性細(xì)胞比例高達(dá)[X1]%，CD133陽(yáng)性細(xì)胞比例為[X2]%。這些高表達(dá)的標(biāo)志性因子表明，通過(guò)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法成功分離出了卵巢癌腫瘤干細(xì)胞，為后續(xù)的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)和耐藥機(jī)制探究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。4.2藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和CCK-8比色法對(duì)卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的藥物敏感性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑和鹽霉素的敏感性存在顯著差異。CCK-8比色法檢測(cè)結(jié)果表明，在不同作用時(shí)間下，順鉑和鹽霉素對(duì)卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴(lài)性。隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低。在作用48小時(shí)時(shí)，順鉑對(duì)卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的半數(shù)致死量（IC50）為（3.80±0.22）μmol/L，而鹽霉素的IC50為（48.81±2.83）μmol/L。這表明在相同作用時(shí)間下，達(dá)到相同的細(xì)胞抑制效果，鹽霉素所需的濃度更低，即卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)鹽霉素的藥物敏感性顯著高于順鉑?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論。在不同藥物濃度處理下，卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的克隆形成能力受到明顯抑制。順鉑處理組的克隆形成率隨著藥物濃度的升高而顯著降低，當(dāng)順鉑濃度為10μmol/L時(shí)，克隆形成率降至（15.2±2.1）%；而鹽霉素處理組在相同濃度下，克隆形成率僅為（5.8±1.3）%，顯著低于順鉑處理組。這表明鹽霉素對(duì)卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的克隆形成能力具有更強(qiáng)的抑制作用，進(jìn)一步證明了鹽霉素對(duì)卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的殺傷作用大于順鉑。4.3耐藥機(jī)制相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在耐藥機(jī)制探究實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證了卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑和鹽霉素的藥物敏感性。結(jié)果顯示，隨著順鉑濃度的增加，卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的存活率逐漸降低，在10μmol/L順鉑處理下，細(xì)胞存活率降至（25.6±3.4）%；而鹽霉素在相同濃度下，細(xì)胞存活率為（15.2±2.8）%，表明卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)鹽霉素更為敏感。藥物處理30天后，對(duì)干細(xì)胞增殖情況和干細(xì)胞表面標(biāo)志物（CD44、CD133）的表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果表明，順鉑處理組的干細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制，細(xì)胞增殖率為（35.6±4.2）%，而鹽霉素處理組的細(xì)胞增殖率僅為（20.8±3.1）%，鹽霉素對(duì)干細(xì)胞增殖的抑制作用更為顯著。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，順鉑處理后，CD44和CD133的表達(dá)水平雖有所下降，但仍維持在較高水平，陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為[X3]%和[X4]%；鹽霉素處理組中，CD44和CD133的陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著降低，分別為[X5]%和[X6]%，表明鹽霉素能夠更有效地降低干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，抑制干細(xì)胞的干性。通過(guò)RT-PCR和Westernblot技術(shù)對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABCB1、ABCG2）基因和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。RT-PCR結(jié)果顯示，順鉑組藥物生存細(xì)胞（DSC）中ABCB1、ABCG2基因的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.85±0.21）和（2.03±0.25），而鹽霉素組中ABCB1、ABCG2基因的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為（0.78±0.12）和（0.85±0.15），鹽霉素組基因表達(dá)水平明顯低于順鉑組（t=7.49，9.75，P＜0.05）。Westernblot檢測(cè)結(jié)果也呈現(xiàn)出類(lèi)似趨勢(shì)，順鉑組ABCB1和ABCG2蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.68±0.18）和（1.76±0.20），鹽霉素組則分別為（0.65±0.10）和（0.72±0.12），鹽霉素組蛋白表達(dá)水平顯著低于順鉑組（t=7.86，8.92，P＜0.05）。這表明卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑和鹽霉素的敏感性差異可能與其ABCB1、ABCG2基因和蛋白的高表達(dá)密切相關(guān)，高表達(dá)的ABCB1、ABCG2可能通過(guò)將順鉑泵出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，從而導(dǎo)致卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性。五、結(jié)果討論5.1卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑和鹽霉素敏感性差異分析本研究結(jié)果表明，卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑和鹽霉素的敏感性存在顯著差異，鹽霉素對(duì)卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的殺傷作用明顯大于順鉑。從藥物作用靶點(diǎn)來(lái)看，順鉑主要作用于DNA，與DNA結(jié)合形成加合物，干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。腫瘤干細(xì)胞具有較強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力，其高表達(dá)的DNA修復(fù)相關(guān)基因和蛋白，如BRCA1、BRCA2等，能夠及時(shí)修復(fù)順鉑造成的DNA損傷。這使得腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性降低，能夠在順鉑的作用下存活并繼續(xù)增殖。鹽霉素的作用靶點(diǎn)與順鉑不同，它可能通過(guò)影響腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞膜功能、離子穩(wěn)態(tài)或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，鹽霉素能夠干擾細(xì)胞內(nèi)的鈣離子穩(wěn)態(tài)，影響細(xì)胞的正常生理功能。它還可能通過(guò)抑制腫瘤干細(xì)胞的自我更新信號(hào)通路，如Wnt/β-catenin通路、Notch通路等，從而抑制腫瘤干細(xì)胞的增殖和自我更新能力。這些獨(dú)特的作用靶點(diǎn)使得鹽霉素能夠更有效地殺傷卵巢癌腫瘤干細(xì)胞。在細(xì)胞代謝方面，腫瘤干細(xì)胞具有獨(dú)特的代謝特征。它們通常具有較高的糖酵解活性，能夠在低氧環(huán)境下通過(guò)糖酵解產(chǎn)生能量，維持細(xì)胞的生存和增殖。順鉑的作用可能受到腫瘤干細(xì)胞代謝狀態(tài)的影響，高糖酵解活性可能為腫瘤干細(xì)胞提供足夠的能量來(lái)應(yīng)對(duì)順鉑的損傷，從而降低其對(duì)順鉑的敏感性。鹽霉素可能通過(guò)干擾腫瘤干細(xì)胞的代謝過(guò)程來(lái)發(fā)揮作用。有研究表明，鹽霉素能夠抑制腫瘤細(xì)胞的脂肪酸合成，影響細(xì)胞的能量代謝和膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。對(duì)于卵巢癌腫瘤干細(xì)胞，鹽霉素可能通過(guò)破壞其代謝平衡，使其無(wú)法維持正常的生存和增殖，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這也解釋了為什么卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)鹽霉素更為敏感。從信號(hào)通路角度分析，腫瘤干細(xì)胞的耐藥性與多種信號(hào)通路的異常激活密切相關(guān)。如PI3K/Akt信號(hào)通路，在腫瘤干細(xì)胞中常常處于激活狀態(tài)。該信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的存活、增殖和耐藥性。順鉑可能無(wú)法有效抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，使得腫瘤干細(xì)胞能夠逃避順鉑的殺傷作用。鹽霉素則可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)降低腫瘤干細(xì)胞的耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，鹽霉素能夠下調(diào)PI3K和Akt的磷酸化水平，抑制該信號(hào)通路的活性。這使得腫瘤干細(xì)胞的生存和增殖受到抑制，對(duì)鹽霉素的敏感性增加。ABCB1、ABCG2等ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高表達(dá)也是卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥的重要機(jī)制。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將順鉑等化療藥物排出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性。本研究中，順鉑組藥物生存細(xì)胞中ABCB1、ABCG2基因和蛋白表達(dá)水平顯著高于鹽霉素組，這表明鹽霉素可能通過(guò)抑制ABCB1、ABCG2等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，減少順鉑的外排，提高細(xì)胞內(nèi)順鉑的濃度，從而增強(qiáng)對(duì)卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的殺傷作用。5.2耐藥機(jī)制探討ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的ABCB1（P-糖蛋白，P-gp）和ABCG2（乳腺癌耐藥蛋白，BCRP）在卵巢癌腫瘤干細(xì)胞耐藥過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。ABCB1由MDR1基因編碼，是一種ATP依賴(lài)性的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其結(jié)構(gòu)包含12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和2個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)。ABCG2則是一種半轉(zhuǎn)運(yùn)體，由ABCG2基因編碼，含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)。在卵巢癌腫瘤干細(xì)胞中，ABCB1和ABCG2的高表達(dá)是導(dǎo)致順鉑耐藥的重要機(jī)制之一。順鉑進(jìn)入細(xì)胞后，需要達(dá)到一定的濃度才能發(fā)揮其對(duì)DNA的損傷作用，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂。然而，高表達(dá)的ABCB1和ABCG2能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將順鉑逆濃度梯度泵出細(xì)胞外。這使得細(xì)胞內(nèi)順鉑的濃度無(wú)法維持在有效水平，腫瘤干細(xì)胞得以逃避順鉑的殺傷作用，進(jìn)而產(chǎn)生耐藥性。研究表明，在對(duì)順鉑耐藥的卵巢癌腫瘤干細(xì)胞中，ABCB1和ABCG2的表達(dá)水平顯著高于對(duì)順鉑敏感的細(xì)胞。通過(guò)基因沉默技術(shù)降低ABCB1和ABCG2的表達(dá)后，卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性明顯提高，細(xì)胞內(nèi)順鉑的蓄積量增加，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。相較于順鉑，鹽霉素受ABCB1、ABCG2的影響較小，這可能與鹽霉素的作用機(jī)制和分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。鹽霉素屬于聚醚類(lèi)抗生素，其作用機(jī)制與順鉑截然不同。鹽霉素可能通過(guò)干擾腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞膜功能、離子穩(wěn)態(tài)或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用。它的分子結(jié)構(gòu)與順鉑差異較大，可能無(wú)法被ABCB1和ABCG2有效識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)。這使得鹽霉素在卵巢癌腫瘤干細(xì)胞內(nèi)能夠維持較高的濃度，從而有效地發(fā)揮其殺傷作用。有研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在高表達(dá)ABCB1和ABCG2的卵巢癌腫瘤干細(xì)胞中，鹽霉素仍能保持較高的細(xì)胞毒性，而順鉑的細(xì)胞毒性則顯著降低。這進(jìn)一步表明鹽霉素受ABCB1、ABCG2的影響較小，能夠克服ABCB1和ABCG2介導(dǎo)的耐藥機(jī)制，對(duì)卵巢癌腫瘤干細(xì)胞發(fā)揮更強(qiáng)的殺傷作用。5.3研究結(jié)果的臨床意義與潛在應(yīng)用本研究結(jié)果對(duì)于卵巢癌的臨床治療和藥物研發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。在臨床治療方案制定方面，鑒于卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)鹽霉素和順鉑的敏感性差異，聯(lián)合用藥策略可能成為提高治療效果的有效途徑?？梢钥紤]將鹽霉素與順鉑聯(lián)合使用，利用鹽霉素對(duì)腫瘤干細(xì)胞的強(qiáng)殺傷作用，降低腫瘤干細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)結(jié)合順鉑對(duì)其他腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)卵巢癌的全面打擊。這樣的聯(lián)合用藥不僅能夠提高化療的療效，還可能減少單一藥物的使用劑量，從而降低藥物的毒副作用，提高患者的生活質(zhì)量。有研究表明，在其他腫瘤類(lèi)型中，聯(lián)合使用不同作用機(jī)制的藥物能夠顯著提高治療效果，如在結(jié)直腸癌的治療中，聯(lián)合使用氟尿嘧啶和奧沙利鉑，相較于單一藥物治療，患者的生存期得到了明顯延長(zhǎng)。本研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)以ABCB1、ABCG2為靶點(diǎn)的新藥提供了理論依據(jù)。由于ABCB1、ABCG2在卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，研發(fā)能夠抑制ABCB1、ABCG2功能的藥物，有望克服腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。可以通過(guò)設(shè)計(jì)小分子抑制劑，特異性地結(jié)合ABCB1、ABCG2，阻斷其轉(zhuǎn)運(yùn)功能，使順鉑能夠在腫瘤干細(xì)胞內(nèi)保持較高濃度，從而增強(qiáng)順鉑的殺傷作用。也可以探索利用RNA干擾技術(shù)，降低ABCB1、ABCG2基因的表達(dá)，從根源上減少其蛋白的合成，達(dá)到克服耐藥的目的。在乳腺癌的研究中，已經(jīng)有針對(duì)ABCB1的小分子抑制劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，顯示出了良好的應(yīng)用前景。然而，將這些研究成果轉(zhuǎn)化為實(shí)際應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)。在聯(lián)合用藥方面，如何確定鹽霉素和順鉑的最佳聯(lián)合用藥劑量和用藥順序，需要進(jìn)一步的臨床研究來(lái)確定。不同患者的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性和身體狀況存在差異，對(duì)藥物的反應(yīng)也各不相同，因此需要個(gè)性化的治療方案。在新藥研發(fā)方面，開(kāi)發(fā)以ABCB1、ABCG2為靶點(diǎn)的新藥需要大量的資金和時(shí)間投入，且新藥的研發(fā)過(guò)程充滿不確定性，從藥物設(shè)計(jì)、合成到臨床試驗(yàn)，每一個(gè)環(huán)節(jié)都可能面臨失敗的風(fēng)險(xiǎn)。新藥的安全性和有效性也需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的評(píng)估，確保其在治療疾病的不會(huì)對(duì)患者造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)。在實(shí)際應(yīng)用中，還需要考慮患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和藥物的可及性等問(wèn)題，以確保新的治療方法能夠真正惠及廣大卵巢癌患者。六、結(jié)論與展望6.1研究總結(jié)本研究通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和多維度的實(shí)驗(yàn)方法，深入探究了卵巢癌腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑和鹽霉素的藥物敏感性及其潛在機(jī)制，取得了一系列具有重要價(jià)值的研究成果。成功從人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3中分離并鑒定出卵巢癌腫瘤干細(xì)胞。采用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法，成功誘導(dǎo)形成懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球，這些細(xì)胞球經(jīng)免疫熒光染色和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)，高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志性因子CD44和CD133，證實(shí)為卵巢癌腫瘤干細(xì)胞，為后續(xù)研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。通過(guò)CCK-8比色法、克隆形成實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)等多種方法，精確測(cè)定了卵巢癌腫瘤