2025年分子PCR試題及答案一、單項選擇題（每題2分，共30分）1.以下關于PCR基本原理的描述，錯誤的是：A.變性階段通過高溫（94-98℃）使雙鏈DNA解旋為單鏈B.退火階段引物與模板單鏈的互補序列特異性結合C.延伸階段TaqDNA聚合酶以dNTP為原料，從引物5'端向3'端延伸D.每個循環(huán)后目標DNA片段的拷貝數理論上呈指數增長2.常規(guī)PCR反應體系中，Mg2+的主要作用是：A.維持反應體系pH穩(wěn)定B.激活TaqDNA聚合酶活性C.防止引物與模板非特異性結合D.促進dNTP與模板的結合3.熒光定量PCR中，SYBRGreenI染料的檢測原理是：A.與雙鏈DNA小溝結合后熒光信號增強B.與單鏈DNA特異性結合后發(fā)射熒光C.通過水解探針釋放熒光基團D.利用FRET效應監(jiān)測擴增產物4.引物設計時，若目標序列GC含量為70%，則引物的Tm值計算公式（Wallace法）應為：A.Tm=4(G+C)+2(A+T)B.Tm=64.9+41×(G+C-16.4)/(A+T+G+C)C.Tm=2(A+T)+4(G+C)D.Tm=81.5+0.41×(G+C)-500/L（L為引物長度）5.以下哪種情況最可能導致PCR產物出現smearedband（拖尾條帶）？A.引物濃度過低B.dNTP濃度過高C.退火溫度過高D.模板DNA純度過高6.逆轉錄PCR（RT-PCR）中，若使用oligo(dT)引物進行反轉錄，適用于擴增以下哪種RNA？A.原核生物mRNA（無polyA尾）B.真核生物mRNA（含polyA尾）C.病毒單鏈RNA（無polyA尾）D.細胞內rRNA7.多重PCR技術的關鍵限制因素是：A.模板DNA的濃度B.引物之間的交叉退火C.Taq酶的熱穩(wěn)定性D.反應體系的體積8.數字PCR（dPCR）與實時熒光定量PCR（qPCR）的主要區(qū)別在于：A.dPCR通過終點熒光信號絕對定量，qPCR通過Ct值相對定量B.dPCR需要標準曲線，qPCR無需標準曲線C.dPCR靈敏度低于qPCRD.dPCR僅適用于定性檢測9.PCR擴增過程中，若延伸時間過長，可能導致的結果是：A.非特異性擴增產物增多B.目標片段擴增效率降低C.引物二聚體形成D.模板DNA降解10.以下關于TaqMan探針的描述，正確的是：A.探針5'端標記淬滅基團，3'端標記報告基團B.探針與模板結合后，Taq酶的5'→3'外切酶活性水解探針C.探針僅能與目標片段的正義鏈結合D.探針長度通常為50-70bp11.某實驗室進行HPV分型PCR檢測時，陰性對照出現明顯條帶，最可能的原因是：A.模板DNA污染（如氣溶膠污染）B.引物退火溫度過高C.dNTP濃度過低D.Taq酶失活12.為擴增一段長度為1500bp的DNA片段，常規(guī)PCR的延伸時間應設置為：A.15秒B.30秒C.1分鐘D.2分鐘13.以下哪種物質不會抑制PCR反應？A.血液中的血紅蛋白B.植物組織中的酚類化合物C.提取試劑中的EDTA（低濃度）D.擴增產物中的dNTP14.熒光定量PCR的Ct值是指：A.熒光信號達到設定閾值時的循環(huán)數B.熒光信號達到平臺期的循環(huán)數C.反應體系中dNTP耗盡的循環(huán)數D.引物完全退火的循環(huán)數15.降落PCR（TouchdownPCR）的主要目的是：A.提高擴增效率B.減少非特異性擴增C.延長反應時間D.降低引物二聚體二、多項選擇題（每題3分，共15分，錯選、漏選均不得分）1.以下屬于PCR反應體系必需成分的是：A.模板DNAB.引物C.TaqDNA聚合酶D.Mg2+2.引物設計時需避免的問題包括：A.引物內部形成發(fā)夾結構（ΔG≤-5kcal/mol）B.引物3'端為A或T（避免錯配延伸）C.引物間存在≥4bp的互補序列（導致引物二聚體）D.引物GC含量過高（>80%）3.熒光定量PCR中，絕對定量的實現方式包括：A.使用已知拷貝數的標準品繪制標準曲線B.通過ΔΔCt法計算相對表達量C.利用數字PCR直接計數陽性微滴D.通過熔解曲線分析確定產物特異性4.PCR產物出現引物二聚體的可能原因有：A.引物濃度過高B.退火溫度過低C.模板DNA濃度過低D.dNTP濃度過低5.以下關于RT-PCR的描述，正確的是：A.需先將RNA反轉錄為cDNAB.可用于檢測基因表達水平C.反轉錄酶的選擇不影響實驗結果D.若模板為總RNA，需去除基因組DNA污染（如用DNaseI處理）三、簡答題（每題8分，共40分）1.簡述PCR引物設計的基本原則（至少5條）。2.對比SYBRGreenI熒光定量PCR與TaqMan探針法的優(yōu)缺點。3.列舉3種PCR擴增失敗的常見原因及對應的解決措施。4.解釋數字PCR（dPCR）的技術原理，并說明其在低豐度靶標檢測中的優(yōu)勢。5.某實驗室進行新冠病毒N基因PCR檢測時，陽性樣本Ct值明顯高于預期（正常Ct值25-30，實際檢測為38-40），分析可能的原因及解決方法。四、案例分析題（共15分）某高校分子生物學實驗室開展轉基因作物檢測實驗，目標基因為CaMV35S啟動子（長度約200bp）。實驗步驟如下：①提取作物葉片基因組DNA（A260/A280=1.8，A260/A230=1.6）；②配置PCR反應體系（25μL）：10×Buffer2.5μL，Mg2+（25mM）2μL，dNTP（2.5mM）2μL，引物（10μM）各1μL，Taq酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA（50ng/μL）2μL，ddH2O補至25μL；③PCR程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s（35個循環(huán)）；72℃終延伸10min。④瓊脂糖凝膠電泳（1.5%）檢測，結果顯示：陽性對照（已知含35S啟動子）出現清晰條帶，陰性對照（野生型作物DNA）無條帶，但3份待測樣本均未出現目標條帶（引物二聚體也未觀察到）。請分析待測樣本無條帶的可能原因（至少4條），并提出對應的驗證或改進措施。答案一、單項選擇題1.C（延伸方向為引物3'端向5'端？不，Taq酶是從引物3'端向5'端延伸？不，DNA合成方向是5'→3'，所以引物的3'端是延伸起點，正確描述應為“從引物3'端向5'端延伸”錯誤，正確應為“從引物3'端開始，沿模板5'→3'方向延伸”，因此C錯誤）2.B（Mg2+是Taq酶的激活劑）3.A（SYBRGreenI與雙鏈DNA小溝結合后熒光增強）4.D（GC含量>50%時，使用更準確的公式Tm=81.5+0.41×(G+C)-500/L）5.B（dNTP濃度過高會導致錯誤摻入，形成拖尾）6.B（oligo(dT)結合polyA尾，適用于真核mRNA）7.B（多重PCR需引物間無交叉退火）8.A（dPCR通過終點計數絕對定量，qPCR通過Ct值相對定量）9.A（延伸時間過長可能導致非特異性擴增）10.B（TaqMan探針5'報告基團，3'淬滅基團，Taq酶水解探針）11.A（陰性對照陽性多因污染）12.D（常規(guī)延伸時間1min/kb，1500bp需1.5-2min）13.D（dNTP是反應原料，不會抑制）14.A（Ct值為熒光達到閾值的循環(huán)數）15.B（降落PCR通過逐步降低退火溫度減少非特異性擴增）二、多項選擇題1.ABCD（模板、引物、酶、Mg2+均為必需）2.ACD（引物3'端應避免A/T？不，3'端最好為G/C以增強結合，避免連續(xù)G/C或錯配，因此B錯誤；A、C、D均為需避免的問題）3.AC（絕對定量需標準品或dPCR計數）4.ABC（dNTP濃度過低會導致擴增效率低，但不會直接導致引物二聚體）5.ABD（反轉錄酶的選擇影響cDNA質量，如M-MLV或AMV）三、簡答題1.引物設計基本原則：①長度：18-25bp（過短特異性差，過長合成困難）；②GC含量：40-60%（避免過高導致非特異性結合或過低影響退火穩(wěn)定性）；③Tm值：引物間Tm差≤5℃（確保同時退火），通常55-65℃；④避免二級結構：引物內部ΔG≥-5kcal/mol（防止發(fā)夾結構影響與模板結合）；⑤3'端特異性：避免3'端連續(xù)3個G/C（易錯配），且3'端堿基最好與模板嚴格互補（防止非特異性延伸）；⑥避免引物二聚體：引物間互補序列≤3bp（防止引物相互退火形成二聚體）。2.SYBRGreenI與TaqMan法對比：SYBRGreenI：優(yōu)點：成本低（無需定制探針）、操作簡單（通用染料）、可通過熔解曲線分析產物特異性；缺點：非特異性擴增（如引物二聚體）會導致熒光信號假陽性；TaqMan探針法：優(yōu)點：特異性高（探針與目標序列互補結合）、避免非特異性干擾；缺點：成本高（需設計合成特異性探針）、靈活性低（不同目標需不同探針）。3.PCR擴增失敗常見原因及解決措施：①模板質量差（如降解或含抑制物）：解決措施為重新提取DNA（使用更高效的純化方法，如柱純化），或稀釋模板以降低抑制物濃度；②引物設計不當（如Tm值過低或與模板錯配）：解決措施為通過在線工具（如Primer3）重新設計引物，或調整退火溫度（如使用梯度PCR優(yōu)化）；③Taq酶失活（如反復凍融或保存不當）：解決措施為更換新酶，或增加酶量（需避免過量導致非特異性擴增）；④Mg2+濃度不合適（過低影響酶活性，過高增加非特異性）：解決措施為優(yōu)化Mg2+濃度（如設置1.5-3.0mM梯度）。4.數字PCR原理及優(yōu)勢：原理：將反應體系分割為數萬個微滴（或微腔），每個微滴含0或1個靶標分子；擴增后通過計數陽性微滴比例（符合泊松分布）計算原始拷貝數；優(yōu)勢：無需標準曲線即可絕對定量；對低豐度靶標（如稀有突變、循環(huán)腫瘤DNA）檢測靈敏度高（可檢測單拷貝）；抗干擾能力強（微滴分隔降低抑制物影響）。5.新冠N基因Ct值偏高的可能原因及解決方法：①模板濃度低（如采樣量不足或提取效率低）：解決方法為增加模板量（需注意抑制物濃度），或優(yōu)化RNA提取流程（如使用磁珠法提高得率）；②擴增效率低（如引物/探針降解）：解決方法為檢測引物/探針保存狀態(tài)（避免反復凍融），或更換新批次試劑；③反應體系抑制物殘留（如采樣管中的胍鹽未洗凈）：解決方法為稀釋模板（10倍梯度稀釋），或使用PCR增強劑（如BSA、DMSO）；④PCR儀溫度偏差（如退火溫度過高導致引物結合效率低）：解決方法為校準PCR儀（使用溫度驗證模塊），或通過梯度PCR優(yōu)化退火溫度（如55-65℃）。四、案例分析題可能原因及改進措施：1.模板DNA濃度過低：實驗中模板添加量為2μL（50ng/μL），即100ng，但作物基因組DNA量大（如植物基因組約1e9bp），200bp目標基因的拷貝數可能不足。驗證方法：通過Nanodrop或Qubit定量DNA濃度，確保模板量在50-200ng（針對植物基因組）；改進措施：增加模板量（如4μL）或濃縮DNA。2.引物失效（如降解或設計錯誤）：引物可能因保存不當（反復凍融）或設計時與目標序列不匹配（如35S啟動子存在突變）。驗證方法：使用陽性對照DNA（已知含35S）與待測引物進行PCR，若仍無條帶則引物問題；改進措施：重新合成引物（-20℃分裝保存），或通過BLAST驗證引物與目標序列的匹配性。3.Mg2+濃度過高：反應體系中Mg2+終濃度=（25mM×2μL）/25μL=2mM（常規(guī)1.5-2.5mM），但植物DNA含較多多糖/酚類，可能與Mg2+結合，導致實際有效濃度不足。驗證方法：設置Mg2+梯度（1.5-3.0mM）；改進措施：提高Mg2+濃度至2.5-3.0m