(19)國家知識產(chǎn)權(quán)局(71)申請人北京中農(nóng)綠安有機(jī)農(nóng)業(yè)科技有限公司地址100193北京市海淀區(qū)天秀路10號中(72)發(fā)明人杜韻閆碩蔣沁宏張?jiān)戚x杜相革董民(74)專利代理機(jī)構(gòu)天津合正知識產(chǎn)權(quán)代理有限專利代理師邢月A01N47/34(2006.01)A01N63/60(2020.01)A01P7/04(2006.01)(54)發(fā)明名稱一種除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合殺蟲劑及其制備方法本發(fā)明提供了一種除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合殺蟲劑及其制備方法，該復(fù)合殺蟲劑包括除蟲脲/SPc復(fù)合體與dsCHS,所述的dsCHS與除蟲脲/SPc復(fù)合體中的SPc的質(zhì)量比為0.1-5:1;所述明所述的除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合殺蟲劑中CHS為幾丁質(zhì)合成酶基因，在除蟲脲處理后，昆蟲的CHS基因表達(dá)升高，以反饋幾丁質(zhì)的減少，在dsCHS通過46.67%,提升到82.22%。21.一種除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合殺蟲劑，其特征在于：該復(fù)合殺蟲劑包括除蟲脲/SPc復(fù)合體與dsCHS,所述的dsCHS與除蟲脲/SPc復(fù)合體中的SPc的質(zhì)量比為0.1-5:1;所述的2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合殺蟲劑，其特征在于：所述的除蟲脲/SPc復(fù)合體由納米載體SPc與除蟲脲孵育而成，納米載體SPc與除蟲脲的質(zhì)量比為0.5-3:3.權(quán)利要求1或2所述的除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合殺蟲劑的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：步驟1是將納米載體SPc與除蟲脲進(jìn)行孵育后，得到除蟲脲/SPc復(fù)合體；步驟2是將所述的除蟲脲/SPc復(fù)合體與dsCHS進(jìn)行孵育，得到所述的除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合殺蟲劑。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合殺蟲劑，其特征在于：所述的步驟1中的孵育步驟的溫度為20-35℃,時間為1-30分鐘。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合殺蟲劑，其特征在于：所述的步驟2中的孵育步驟的溫度為20-35℃,時間為1-30分鐘。6.一種幾丁質(zhì)合成抑制劑，其特征在于：所述的抑制劑包含質(zhì)量百分比為1-100%的權(quán)利要求1或2所述的除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合殺蟲劑。3技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于殺蟲劑領(lǐng)域，尤其是涉及一種除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合殺蟲劑及其制備方法。背景技術(shù)[0002]面對傳統(tǒng)合成農(nóng)藥因環(huán)境污染、害蟲抗性增強(qiáng)導(dǎo)致的局限性，現(xiàn)在亟需降低化學(xué)農(nóng)藥使用，延緩害蟲抗藥性發(fā)展的防控技術(shù)，RNAi技術(shù)憑借其高特異性和低殘留潛力成為綠色農(nóng)藥的革命性方向，但受限于dsRNA在昆蟲體內(nèi)易被降解、單靶點(diǎn)效率低，難以單獨(dú)起到較好的防控效果。但將化學(xué)農(nóng)藥與dsRNA結(jié)合，是否能在優(yōu)化防控效果的同時減少化學(xué)農(nóng)藥使用，降低對非靶標(biāo)昆蟲的影響。其中除蟲脲通過抑制昆蟲表皮幾丁質(zhì)的合成，導(dǎo)致幼蟲無法正常蛻皮，最終死亡。它依賴于昆蟲的蛻皮過程，因此相比于神經(jīng)毒性殺蟲劑，其殺蟲速度較慢，無法實(shí)現(xiàn)快速控制蚜蟲種群。雖然除蟲脲主要作用于幾丁質(zhì)合成，但高劑量應(yīng)用可能對天敵昆蟲(如寄生蜂和捕食性昆蟲)造成不利影響。dsCHS具有高度特異性，只針對目標(biāo)害蟲的關(guān)鍵基因，不影響非靶標(biāo)昆蟲，從而提高生物防治的兼容性。發(fā)明內(nèi)容[0003]有鑒于此，本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提出一種除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合殺蟲劑及其制備方法。[0004]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明提供了一種除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合殺蟲劑，該復(fù)合殺蟲劑包括除蟲脲/SPc復(fù)合體與dsCHS,所述的dsCHS與除蟲脲/SPc復(fù)合體中的SPc的質(zhì)量比為0.1-5:1;所[0005]進(jìn)一步，所述的除蟲脲/SPc復(fù)合體由納米載體SPc與除蟲脲孵育而成，納米載體SPc與除蟲脲的質(zhì)量比為0.5-3:1。[0006]本發(fā)明還提供了一種除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合殺蟲劑的制備方法，包括如下步步驟1是將納米載體SPc與除蟲脲進(jìn)行孵育后，得到除蟲脲/SPc復(fù)合體；步驟2是將所述的除蟲脲/SPc復(fù)合體與dsCHS進(jìn)行孵育，得到所述的除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合殺蟲劑。[0007]進(jìn)一步，所述的步驟1中的孵育步驟的溫度為20-35℃,時間為1-30分鐘。[0008]進(jìn)一步，所述的步驟2中的孵育步驟的溫度為20-35℃,時間為1-30分鐘。[0009]本發(fā)明提供了一種幾丁質(zhì)合成抑制劑，所述的抑制劑包含質(zhì)量百分比為1-100%的所述的除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合殺蟲劑。[0010]星形聚陽離子(SPc)兼具疏水核心與多官能團(tuán)親水殼層的結(jié)構(gòu)不僅提高了dsRNA提升了防控效能并降低了研發(fā)成本。該技術(shù)體系通過納米載體的多功能集成與多活性成分4的時空協(xié)同，為解決RNA農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)化難題提供了兼具高效性、可持續(xù)性與環(huán)境友好性的新范本發(fā)明所述的除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合殺蟲劑中CHS為幾丁質(zhì)合成酶基因，在質(zhì)合成酶基因之后將進(jìn)一步破壞蚜蟲的幾丁質(zhì)合成，將其致死率從46.67%,提升到82.22%。附圖說明[0012]圖1為本發(fā)明實(shí)施例所述的除蟲脲滴定SPc的等溫量熱圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例所述的除蟲脲和除蟲脲/SPc殺蟲劑處理后桃蚜的死亡率：其圖3為本發(fā)明實(shí)施例所述的除蟲脲和除蟲脲/SPc復(fù)合體處理后桃蚜轉(zhuǎn)錄組分析：圖4為本發(fā)明實(shí)施例所述的dsCHS滴定除蟲脲/SPc的等溫滴定量熱結(jié)果：其中，A圖圖5為本發(fā)明實(shí)施例所述的除蟲脲、除蟲脲/SPc和除蟲脲/SPc/dsCHS的透射電鏡圖6為本發(fā)明實(shí)施例1所述的除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合體對桃蚜的影響：其中，A具體實(shí)施方式[0013]除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述[0015]下面結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。[0016]實(shí)施例1納米載體(SPc)對除蟲脲的載藥能力及結(jié)合作用力先將SPc與過量除蟲脲混合孵育后，采用20000dp的透析袋透析該混合溶液，以除去未結(jié)合在納米載體上的除蟲脲，得到除蟲脲/SPc復(fù)合體，并計算SPc對除蟲脲的載藥率。接著，根據(jù)載藥率準(zhǔn)確加入除蟲脲和SPc,在室溫下孵育15min,即可獲得除蟲脲/SPc復(fù)合[0017]利用等溫滴定量熱儀(ITC)解析除蟲脲與SPc之間的相互作用。具體操作為：使用250μL的除蟲脲(0.1mM)滴定2mL的SPc(0.01mM)溶液中，設(shè)置等溫滴定微量熱儀(TA△S等熱力學(xué)參數(shù)。[0018]除蟲脲可在水溶液中自發(fā)與SPc結(jié)合形成除蟲脲/SPc復(fù)合體。通過凍干法測得載藥率為31.1%。等溫滴定量熱結(jié)果顯示(如圖1所示),除蟲脲與SPc有較高的結(jié)合系數(shù)Ka(M?1)5為6.85×10?,表明兩者之間有較強(qiáng)的相互作用。熵變△H為-9654kcal/mol,函變△S為-32.3kcal/mol/deg,根據(jù)吉布斯自由能：△G=△H-T△S,算得兩物質(zhì)相互作用反應(yīng)的吉布斯自由能△G為-23.76kcal/mol,表明除蟲脲與SPc能自發(fā)結(jié)合。根據(jù)反應(yīng)的△H和△S,可推測除蟲脲與SPc之間的結(jié)合作用主要是氫鍵作用。[0019]實(shí)施例2除蟲脲/SPc復(fù)合體的室內(nèi)生物活性測定采用背板點(diǎn)滴的方法檢測除蟲脲對桃蚜的毒力。用原藥分別制備濃度為5mg/L,25mg/L,50mg/L,100mg/L,200mg/L,500mg/L[0020]采用背板點(diǎn)滴法評價除蟲脲/SPc多元復(fù)合體對蚜蟲的毒力。設(shè)置以下處理：水(對3d內(nèi)的死亡率。[0021]采用根吸法進(jìn)一步評價除蟲脲/SPc多元復(fù)合體對蚜蟲的毒力。處理分組與濃度設(shè)[0022]用除蟲脲處理桃蚜3d后，對3齡桃蚜的死亡率進(jìn)行毒力測定，測的致死中濃度(LC?0)為92.107mg/L,亞致死濃度(LC?0)為21.866mg/L(如表1所示)。[0023]表1除蟲脲對桃蚜的毒力幼蟲齡期信區(qū)間)信區(qū)間)[0024]在除蟲脲/SPc復(fù)合體處理后3天統(tǒng)計桃蚜的死亡率，發(fā)現(xiàn)除蟲脲背板點(diǎn)滴導(dǎo)致桃蚜死亡率為20.56%,除蟲脲/SPc復(fù)合體對桃蚜的死亡率達(dá)到了46.11%,較除蟲脲單獨(dú)處理提升124.32%。根吸法導(dǎo)致桃蚜死亡率為23.89%,除蟲脲/SPc復(fù)合體對桃蚜的死亡率達(dá)到了41.67%,較除蟲脲單獨(dú)處理提升74.42%。如圖2所示。[0025]實(shí)施例3除蟲脲處理桃蚜致死機(jī)制的解析用清水與除蟲脲分別處理30頭桃蚜，每個處理設(shè)置三個重復(fù)，在處理24h后提取行比對注釋；以FPKM值表征各轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。采用DE(DEGs)進(jìn)行分析，篩選條件為倍數(shù)變化(Foldchange)≥2.0且FDR<0.01,以進(jìn)一步探究干擾對桃蚜致死作用的分子機(jī)制。[0026]通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)較除蟲脲處理而言，除蟲脲/SPc復(fù)合體處理后發(fā)現(xiàn)有625個基因的表達(dá)明顯改變。共有476個基因上調(diào)，149個基因下調(diào)(如圖3中的A圖所示)。通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)DEGs可分為多種基因途徑，如脂肪消化和吸收、激素合成和代謝和角質(zhì)層形成等通路(如圖3中的B圖和C圖所示)。同時我們挑選了幾個差異基因驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組的準(zhǔn)確性(如圖3中的D圖所示)。[0027]除蟲脲主要靶標(biāo)是昆蟲的幾丁質(zhì)合成通路，我們發(fā)現(xiàn)除蟲脲/SPc復(fù)合體較除蟲脲單獨(dú)處理桃蚜，發(fā)現(xiàn)桃蚜幾丁質(zhì)合成酶基因(chitinsynthetase,CHS)顯著上調(diào)(圖3)。幾丁質(zhì)合成酶作為昆蟲幾丁質(zhì)合成通路中關(guān)鍵酶，對昆蟲的表皮合成至關(guān)重要，影響著昆蟲6定RNA濃度及1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測。隨后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara,日化產(chǎn)物均勻涂布于含100mg/L氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，于37℃條件下倒置培養(yǎng)過[0031]按SPc與dsCHS質(zhì)量比1:1加入dsCHS與除蟲脲/SPc,于室溫下孵育15min,得到除利用等溫滴定量熱儀(ITC)解析除蟲脲/SPc與dsCHS之間的相互作用。具體操作[0033]等溫滴定量熱結(jié)果顯示(如圖4所示),dsCHS與除蟲脲/SPc有較低的解離系數(shù)K(M)為7.9×10??,表明兩者之間有較強(qiáng)的相互作用。熵變△H[0036]除蟲脲在水溶液中粒徑為1353.99nm,除蟲脲/SPc復(fù)合體粒徑減小到248.07nm,[0037]表2不同組分的粒徑大小7平均粒徑(nm)除蟲脲除蟲脲/SPc除蟲脲/SPc/dsCHS[0038]以上結(jié)果與透射電鏡結(jié)果一致，除蟲脲為晶體塊狀，除蟲脲/SPc為規(guī)則的大小均一的球體(如圖5所示)。[0039]實(shí)施例6除蟲脲/SPc/dsCHS多元?dú)⑾x劑的活性測試采用背板點(diǎn)滴法評價除蟲脲/SPc/dsCHS多元復(fù)合體與除蟲脲/SPc/dseGFP(dsGFP的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示)對蚜蟲的毒力。結(jié)果如圖6所示，除蟲脲/SPc/dsCHS造成CHS基因的表達(dá)水平顯著降低，在處理后6天除蟲脲/SPc/dseGFP的死亡率為46.67%,除蟲脲/SPc/dsCHS的死亡率提升到82.22%。[0040]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精1/4頁1/4頁時間(分)摩爾比時間(分)參數(shù)數(shù)值亡率(%)亡率(%)處理后時間(天)8A0CCB酪氨酸代謝淀粉和蔗糖代謝核黃素代謝腎素分泌過氧化物酶體壽命調(diào)控通路(線蟲)壽命調(diào)控通路(多物種)昆蟲激素生物合成造血細(xì)胞譜系谷胱甘肽代謝半乳糖代謝