ICS65.150B50備案號(hào)：41659-2014DB46ThedetectiontechnicalregulationsforStreptococcosisi海南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB46/T280—2014本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由海南省海洋與漁業(yè)廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王德強(qiáng)、可小麗、劉志剛、佟延南、李芳遠(yuǎn)、盧邁新、高風(fēng)英、朱華平。DB46/T280—20141羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了羅非魚(yú)鏈球菌病病原體與流行情況、檢測(cè)鏈球菌所用試劑、染色液和培養(yǎng)基、儀器設(shè)備、采樣、臨床診斷、實(shí)驗(yàn)室診斷、細(xì)菌致病性實(shí)驗(yàn)和結(jié)果判定等方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于羅非魚(yú)鏈球菌病的檢測(cè)與診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T4789.28食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑SC/T7014水生動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)規(guī)范SC/T7201.1魚(yú)類(lèi)細(xì)菌病檢疫技術(shù)規(guī)程第1部分：通用技術(shù)3病原體與流行情況3.1主要病原體無(wú)乳鏈球菌（Streptococcusagalactiae）、海豚鏈球菌（Streptococcusiniae）。3.2流行情況在我國(guó)南方羅非魚(yú)養(yǎng)殖區(qū)，一年四季均有發(fā)生，水溫30℃以上為爆發(fā)高峰期，對(duì)各種規(guī)格羅非魚(yú)均可造成危害。4試劑、染色液和培養(yǎng)基除非另有說(shuō)明，檢測(cè)中所用試劑均為分析純，水為蒸餾水或去離子水。實(shí)驗(yàn)中所需常規(guī)試劑、染色液和培養(yǎng)基均按SC/T7201.1和附錄A的規(guī)定執(zhí)行，其他分子生物學(xué)試驗(yàn)試劑按附錄B的規(guī)定執(zhí)行。5儀器設(shè)備除下列儀器設(shè)備外，其余儀器設(shè)備按SC/T7201.1的規(guī)定執(zhí)行。a)PCR擴(kuò)增儀。b)核酸電泳儀和水平電泳槽。c)凝膠成像儀。d)微量移液器。6采樣DB46/T280—20142病魚(yú)樣品采集按SC/T7014的規(guī)定執(zhí)行。7臨床診斷7.1活動(dòng)情況患病魚(yú)活動(dòng)緩慢，反應(yīng)遲鈍，食欲減退，離群獨(dú)游；病情嚴(yán)重時(shí)，常在水面翻滾或打轉(zhuǎn)。7.2外部檢查體色發(fā)黑，眼球腫大突出，眼角膜發(fā)白渾濁，虹膜充血，嚴(yán)重者眼球脫落；下頜、鰓蓋邊緣、鰭條基部不同程度的充血、出血，伴有肛門(mén)紅腫、外突的現(xiàn)象；部分急性患病個(gè)體有時(shí)無(wú)上述癥狀。7.3解剖檢查肝臟充血、腫大，顏色不均，呈花肝狀，質(zhì)地脆弱；脾充血腫大；膽囊充盈、充滿(mǎn)藍(lán)黑色的膽汁；部分患病魚(yú)體出現(xiàn)腹水，腸道有輕度炎癥，腸腔內(nèi)有少量黃色的粘液。8實(shí)驗(yàn)室診斷8.1病原菌分離8.1.1平板劃線(xiàn)分離以無(wú)菌操作分別從病魚(yú)眼、肝臟、脾臟、腎臟和腦組織中取少量組織劃線(xiàn)接種于血瓊脂平板，28℃倒置培養(yǎng)24~48h。8.1.2純培養(yǎng)用無(wú)菌接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，接種于新的血瓊脂平板上，28℃倒置培養(yǎng)24h。8.2菌落形態(tài)在血平板上培養(yǎng)24h后，無(wú)乳鏈球菌菌落圓形，直徑1mm~2mm，呈乳白色、不透明，菌落表面濕潤(rùn)光滑、微隆起、邊緣整齊；海豚鏈球菌菌落圓形，直徑1.5mm~3mm,呈灰白色、不透明，表面光滑、濕潤(rùn)。8.3革蘭氏染色按GB/T4789.28執(zhí)行。無(wú)乳鏈球菌革蘭氏染色呈陽(yáng)性，菌體為球形或卵形，無(wú)鞭毛，無(wú)芽孢，菌體呈單個(gè)、成對(duì)或長(zhǎng)鏈狀排列。海豚鏈球菌革蘭氏染色呈陽(yáng)性，球形，單個(gè)或成對(duì)排列，少數(shù)3~4個(gè)排成短鏈狀，無(wú)鞭毛，無(wú)芽孢。8.4生理生化檢驗(yàn)8.4.1常規(guī)檢測(cè)方法運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)DB46/T280—20143用滅菌牙簽或接種針將純培養(yǎng)的細(xì)菌穿刺垂直接種于半固體BHI培養(yǎng)基中央，28℃培養(yǎng)24h。通過(guò)細(xì)菌由中央向周邊遷移形成游動(dòng)圈大小來(lái)檢測(cè)其運(yùn)動(dòng)性強(qiáng)弱。再用0.85%生理鹽水將細(xì)菌制成輕度混濁的菌懸液（約1×106CFU/mL)，滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀(guān)察其運(yùn)動(dòng)情況。生長(zhǎng)試驗(yàn)將細(xì)菌接種于血平板，于10℃和45℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀(guān)察其是否生長(zhǎng)；再將細(xì)菌分別接種于6.5%NaCl、pH9.6的BHI液體培養(yǎng)基和添加0.1%美藍(lán)牛奶BHI液體培養(yǎng)基中，37℃孵育48h，觀(guān)察其生長(zhǎng)情況。溶血試驗(yàn)用無(wú)菌接種環(huán)將細(xì)菌接種于新鮮的的血瓊脂平板上，28℃倒置培養(yǎng)24h。在血平板上形成明顯的透明環(huán)為β溶血，形成狹窄的灰綠色溶血環(huán)為α溶血，不形成溶血環(huán)為γ溶血。馬尿酸鈉水解試驗(yàn)用無(wú)菌接種環(huán)將待檢菌接種于1mL含1%馬尿酸鈉的BHI液體培養(yǎng)基中，37℃孵育48h，1500g離心3min，取上清液0.8mL，加入三氯化鐵試劑0.2mL，立即混勻，10min~15min后觀(guān)察結(jié)果；出現(xiàn)恒定沉淀物為陽(yáng)性。接觸酶試驗(yàn)按SC/T7014規(guī)定執(zhí)行。淀粉水解試驗(yàn)按SC/T7014規(guī)定執(zhí)行。吲哚試驗(yàn)按SC/T7014規(guī)定執(zhí)行。V-P試驗(yàn)按SC/T7014規(guī)定執(zhí)行。糖類(lèi)分解試驗(yàn)按SC/T7014規(guī)定執(zhí)行。0試劑盒檢測(cè)方法0.1API20STREP檢測(cè)0.1.1革蘭氏染色按GB/T4789.28執(zhí)行。0.1.2接觸酶試驗(yàn)按的規(guī)定執(zhí)行。DB46/T280—20140.1.3溶血試驗(yàn)按的規(guī)定執(zhí)行。0.1.4生化指標(biāo)檢測(cè)按API20STREP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。0.1.5結(jié)果判讀根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)的判讀表判讀。0.2RapidID32STREP檢測(cè)0.2.1革蘭氏染色按GB/T4789.28執(zhí)行。0.2.2接觸酶試驗(yàn)按的規(guī)定執(zhí)行。0.2.3溶血試驗(yàn)按的規(guī)定執(zhí)行。0.2.4生化指標(biāo)檢測(cè)按RapidID32STREP試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。0.2.5結(jié)果判讀用ATBTMExpression儀或miniAPI或人工判讀。8.5聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)8.5.1細(xì)菌16SrRNA基因序列檢測(cè)樣品處理取細(xì)菌純培養(yǎng)液2mL置于離心管中，12000rpm離心10min，收集菌體，用1mLTE緩沖液(pH8.0)重懸菌體；加入50mg/mL溶菌酶溶液6μL，37℃水浴2h；再加入2mol/LNaCl50μL，10%SDS110μL，20mg/mL蛋白酶K3μL，37℃水浴過(guò)夜。細(xì)菌基因組DNA提取細(xì)菌DNA抽提按照SC/T7014中的規(guī)定進(jìn)行。PCR擴(kuò)增16SrRNA基因片段.1PCR反應(yīng)體系10×PCRbuffer(含Mg2+)5μL，10mmol/LdNTP1μL，5U/μLTaq酶0.5μL，引物PLS和PLA(20μmol/L)各1μL，DNA模板2μL，用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)至50μL。.2PCR反應(yīng)程序DB46/T280—2014594℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min，循環(huán)30次；72℃再延伸10min。電泳檢測(cè)及膠回收PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1471bp。切膠回收并純化目的條帶?？寺y(cè)序參照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟將純化的目的片段連接于pMD18-T克隆載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑篩選挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，并進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果分析采用序列拼接軟件ContigExpress對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，采用VectorNTIsuite8.0軟件和BLAST程序(/blast)進(jìn)行序列同源性分析。分離菌株與GeneBank中已登錄的無(wú)乳鏈球菌或海豚鏈球菌16SrRNA基因序列同源性為99%以上。8.5.2雙重PCR快速鑒別無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌雙重PCR反應(yīng)體系10μL2×GC-richbufferⅠ(含Mg2+)，dNTP0.4μL(10mmol)，兩對(duì)引物(P1和P2；P3和P4)各0.5μL(20μmol/L)，DNA模板2μL，5U/μLExTaq酶0.2μL，加無(wú)菌雙蒸水至20μL。雙重PCR反應(yīng)程序96℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，51℃退火30s，72℃延伸35s，循環(huán)32次；72℃再延伸10min。電泳檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照(模板為無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌DNA混合物)的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果應(yīng)同時(shí)顯474bp和296bp兩條帶，陰性對(duì)照(無(wú)DNA模板)的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果不顯示任何條帶，則認(rèn)定檢測(cè)結(jié)果成立，否則檢測(cè)結(jié)果不成立。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立條件下，若擴(kuò)增產(chǎn)物為474bp的唯一條帶，菌株為無(wú)乳鏈球菌；若擴(kuò)增產(chǎn)物為296bp的唯一條帶，菌株為海豚鏈球菌。9細(xì)菌致病性實(shí)驗(yàn)9.1感染對(duì)象和條件應(yīng)選擇與被檢樣品同齡、同規(guī)格、同品種（系）無(wú)患病史的健康羅非魚(yú)；感染水溫與原始發(fā)病水溫一致。9.2感染方式用無(wú)菌生理鹽水或蒸餾水稀釋菌落，制成菌懸液，通過(guò)注射（肌肉或腹腔注射）或浸泡方式對(duì)魚(yú)體進(jìn)行人工感染，連續(xù)7d觀(guān)察實(shí)驗(yàn)魚(yú)的反應(yīng)。9.3感染結(jié)果根據(jù)科赫法則，人工感染患病的羅非魚(yú)出現(xiàn)與自然患病羅非魚(yú)相同的癥狀，且從人工感染患病的羅非魚(yú)中分離出與人工感染細(xì)菌菌落形態(tài)相同的細(xì)菌，可確定為病原菌。DB46/T280—2014610結(jié)果判定符合以下所有特征性者可判定為鏈球菌?。篴)臨床檢驗(yàn)結(jié)果符合7中規(guī)定。b)菌落形態(tài)符合8.2的規(guī)定，革蘭氏染色結(jié)果符合8.3規(guī)定。c)生理生化檢測(cè)結(jié)果符合附錄C中規(guī)定。d)或API20STREP或RapidID32STREP試劑盒的檢測(cè)結(jié)果為無(wú)乳鏈球菌。e)或細(xì)菌16SrRNA基因序列同源性分析結(jié)果符合規(guī)定。f)或雙重PCR結(jié)果符合規(guī)定。g)致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合9.3規(guī)定。DB46/T280—20147（規(guī)范性附錄）試劑的配制方法A.11×TAEBuffer(pH8.5)Tris堿242g，Na2EDTA.H2O37.2g，加約800mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙猓尤氡宜?7.1mL，充分?jǐn)嚢韬蠹尤ルx子水定容至1000mL，使用時(shí)50倍稀釋。A.2TEBuffer(Ph8.0)：1mol/LTirs-HCl(pH8.0)100mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL，混合后加去離子水定容至1L，高溫高壓滅菌，室溫保存。A.310×PCRBuffer(Mg2+Plus)：100mmol/LKCl，160mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/LMgS04，200mmol/LTris-HCl(pH8.8)，1%TritonX-100，lmg/mLBSA。A.4BHI（腦心浸出液BrainHeartInfusion，BHI）液體培養(yǎng)基A.4.1配方幼牛腦（提取浸出粉）牛心（提取浸出粉）葡萄糖氯化鈉蛋白胨磷酸氫二鈉蒸餾水A.4.2配制稱(chēng)取以上樣品加熱攪拌溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH為7.0后分裝于三角瓶中，121℃高壓滅菌15min，備用。A.5半固體BHI（腦心浸出液BrainHeartInfusion，BHI）培養(yǎng)基在BHI液體培養(yǎng)基配方中添加入0.5%的瓊脂粉，將樣品按說(shuō)明書(shū)加水溶解后，調(diào)節(jié)pH至7.0，分裝于試管中（不超過(guò)試管總體積的1/3），121℃高壓滅菌15min，垂直冷卻后，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩.6三氧化鐵試劑配制稱(chēng)取三氧化鐵（FeCl3·6H2O)12g溶于2%鹽酸溶液100mL中即可。DB46/T280—20148（規(guī)范性附錄）分子試劑表B.1分子試劑編號(hào)試劑濃度1TaqDNA聚合酶5U/μL2ExtaqDNA聚合酶5U/μL32×GC-richbufferⅠ（Mg2+Plus）5mM4dNTPMixture2.5mmol/L5細(xì)菌16SrRNA基因通用引物對(duì)PLS（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）20μmol/L6細(xì)菌16SrRNA基因通用引物對(duì)PLA（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）20μmol/L7無(wú)乳鏈球菌的cfb特異基因引物對(duì)P1（5’-CTAGAGTACACATGTACTTAAG-3’）20μmol/L8無(wú)乳鏈球菌的cfb特異基因引物對(duì)P2（5’-CAGTAATCAAGCCCAGCAA-3’）20μmol/L9海豚鏈球菌16SrRNA基因的特異引物對(duì)P3（5’-CTAGAGTACACATGTACTTAAG-3’）20μmol/L海豚鏈球菌16SrRNA基因的特異引物對(duì)P4（5’-GGATTTTCCACTCCCATTAC-3’）20μmol/L瓊脂糖/溴化乙錠替代染料/2000bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（marker）/PMD18-T載體/DH5α感受態(tài)細(xì)胞/溶菌酶50mg/mL蛋白