(19)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局(30)優(yōu)先權(quán)數(shù)據(jù)(62)分案原申請(qǐng)數(shù)據(jù)(71)申請(qǐng)人伊澤阿恩埃免疫療法股份有限公司地址比利時(shí)申請(qǐng)人布魯塞爾自由大學(xué)(74)專利代理機(jī)構(gòu)中國(guó)貿(mào)促會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司11038專利代理師張小勇A61K9/51(2006.01)A61K47/24(2006.01)A61K38/19(2006.01)A61K31/7105(2006.01)A61P31/00(2006.01)(54)發(fā)明名稱脂質(zhì)納米顆粒本發(fā)明涉及脂質(zhì)納米顆粒(LNP)領(lǐng)域；更具質(zhì)和一種或多種核酸。本發(fā)明的LNP的特征在于具有約140nm的最小平均直徑，從而誘導(dǎo)更強(qiáng)力的免疫應(yīng)答。本發(fā)明提供了LNP在核酸分子特別非常適合用于疫苗，例如用于治療癌癥或傳染性23.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的LNP4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的LNP,其中所述PEG脂質(zhì)選自包含以下的列表：PEG5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的LNP,其中所述LNP占所述可離子化的脂質(zhì)的約6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的LNP,其中所述一種或多種核酸分子選自包含以下7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的LNP,其中所述一種或多種mRNA分子選自包含以下的列表：免8.根據(jù)權(quán)利要求6至7中任一項(xiàng)所述的LNP,其中所述免疫調(diào)節(jié)性編碼mRNA選自包含以9.一種藥物組合物或疫苗，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的一種或多種LNP10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的LNP或根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物311.一種用于制備具有約140nm的最小平均直徑的包含核酸的LNP的方法，所述方法包括以下步驟：-制備包含一種或多種核酸和補(bǔ)充有適當(dāng)緩沖劑的水性溶劑的第二水性組合物；-使用以下設(shè)置在微流體混合裝置中混合所述第一和第二組合物：-總流速(FR)為約0.5至約8ml/min,優(yōu)選為約1至4ml/min。-流速比(FRR)為約1/1至5/1,優(yōu)選為約2/1至約3/1。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述醇溶劑為乙醇和/或所述水性溶劑為水。13.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的LNP或根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物的用途，其用于在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)核酸編碼的抗原的免疫應(yīng)答。14.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的LNP或根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物或疫4脂質(zhì)納米顆粒[0001]本申請(qǐng)是CN201980015578.5的分案申請(qǐng)。發(fā)明領(lǐng)域[0002]本發(fā)明涉及脂質(zhì)納米顆粒(LNP)領(lǐng)域；更具體地，其包含可離子醇、PEG脂質(zhì)和一種或多種核酸。本發(fā)明的LNP的特征在于具有約140n而誘導(dǎo)更強(qiáng)力的免疫應(yīng)答。本發(fā)明提供了LNP在核酸分子特別是mRNA的免疫原性遞送中的用途；從而使得它們非常適合用于疫苗，例如用于治療癌癥或傳染性疾病。最后，提供了用發(fā)明背景[0004]生物活性物質(zhì)的靶向遞送領(lǐng)域中的主要挑戰(zhàn)之一通常是它們的不穩(wěn)定性和低的細(xì)胞穿透潛力。對(duì)于核酸分子特別是(m)RNA分子的遞送尤其如此。因此，適當(dāng)分的保護(hù)和遞送至關(guān)重要。因此，持續(xù)需要用于包裝生物活性物質(zhì)例如核酸的方法和組合物。[0005]在這方面，基于脂質(zhì)的納米顆粒組合物例如脂質(zhì)復(fù)合物和脂質(zhì)體已被用作生物活性物質(zhì)的包裝載體，以允許轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中和/或細(xì)胞內(nèi)隔室中。這些基于脂質(zhì)的納米顆粒組合物通常包含不同脂質(zhì)例如陽(yáng)離子脂質(zhì)、可離子化的脂質(zhì)、磷脂、結(jié)構(gòu)脂質(zhì)(例如甾醇或膽甾醇)、PEG(聚乙二醇)脂質(zhì)等的混合物(如Reichmuth等人，2016的綜述)。盡管許多這類脂質(zhì)組合物是本領(lǐng)域已知的，但它們通常具有小的直徑，即小于200nm,最經(jīng)常甚至小于[0006]基于脂質(zhì)的納米顆粒包含四種脂質(zhì)(陽(yáng)離子或可離子化的脂質(zhì)、磷脂、甾醇和聚乙二醇化脂質(zhì))的混合物，其已被開(kāi)發(fā)用于在全身施用后向肝臟非免疫原性遞送siRNA和mRNA。為了引起最佳的肝細(xì)胞攝取和表達(dá)，這些LNP通常顯示70-100nm的小尺寸(Li等人，[0007]除肝臟靶向外，LNP還已被用于將編碼抗原的mRNA免疫原性遞送至肌肉或真皮(80-120nm)的LNP,因?yàn)檫@種小尺寸已顯示對(duì)免疫原性至關(guān)重要，并且小尺寸的LNP有效地[0008]我們現(xiàn)在已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，與通常認(rèn)為的小尺寸的顆粒對(duì)于LNP介導(dǎo)的mRNA遞送是有益的觀點(diǎn)相反，直徑大于140nm,優(yōu)選甚至大于200nm的納米顆粒非常適合于在LNP發(fā)明概述[0010]在第一方面，本發(fā)明提供了脂質(zhì)納米顆粒(LNP),其包含可離子化的脂質(zhì)、磷脂、甾最小平均直徑。5[0011]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述可離子化的脂質(zhì)是式(I)的化合物：(I)[0014]RCO0選自包含以下的列表：肉豆蔻酰基、α-D-生育酚琥珀?；?、亞油酰基和油酰[0015]X選自包含以下的列表：[0017]更具體地，所述可離子化的脂質(zhì)是式(I)的脂質(zhì)，其中RCCO是a-D-生育酚琥珀酰[0019]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述甾醇選自包含以下的列表：膽甾醇、麥角甾[0020]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述磷脂選自包含以下的列表：1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE),1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC),1,2-二亞油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DLPC),1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油-磷酸膽堿(DMPC),1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC),1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC),1,2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC),1,2-二十一烷?；?sn-甘油-磷酸膽堿(DUPC),1-棕櫚?；?2-油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(POPC),1,2-二-0-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(18:0二醚PC),1-油?；?2-膽甾醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(OChemsPC),1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(C16LysoPC),1,2-二亞麻?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿，1,2-二花生四烯?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿，1,2-二十二碳己?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿，1,2-二植烷?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME16.0PE),1,2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-二亞油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-二亞麻?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-二花生四烯?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-二十二碳己?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)鈉鹽(DOPG),鞘磷脂及其混合物。[0021]在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述磷脂選自包含以下的列表：1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE),1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)及其混合物。[0022]在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述PEG脂質(zhì)選自包含以下的列表：PEG修飾的磷脂酰乙醇胺，PEG修飾的磷脂酸，PEG修飾的神經(jīng)酰胺，PEG修飾的二烷基胺，PEG修飾的二?；视停琍EG修飾的二烷基甘油及其混合物。[0023]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，應(yīng)用以下一者或多者：[0025]-所述LNP占所述甾醇的約15mol%至50mol%;[0026]-所述LNP占所述PEG脂質(zhì)的約0.5mol%至10mol%;和/或6以下的列表：編碼免疫調(diào)節(jié)性多肽的mRNA分子，例如(加上所有潛在分子的列表)和/或編碼抗原和/或疾病特異性mRNA的mRNA分子。在一個(gè)非常具體的實(shí)施方案中，所述一種或多種mRNA分子選自包含以下的列表：編碼CD40L、CD70和caTLR4的mRNA分子；和/或編碼抗原和/[0029]本發(fā)明還提供了包含本文所定義的一種或多種LNP的藥物組合物或疫苗。[0030]此外，本發(fā)明提供了用于人類或獸醫(yī)醫(yī)學(xué)的如本文所定義的LNP或包含一種或多[0031]在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于制備根據(jù)本發(fā)明的LNP的方法，包括：[0032]-制備包含所述可離子化的脂質(zhì)、所述磷脂、所述甾醇、所述PEG脂質(zhì)和合適的醇溶劑的第一醇組合物；[0033]制備包含所述一種或多種核酸和水性溶劑的第二水性組合物；[0034]-使用以下設(shè)置在微流體混合裝置中混合所述第一和第二組合物：[0035]-總流速(FR)為約0.5至約8ml/min,優(yōu)選為約1至4ml/min。[0036]-流速比(FRR)為約1/1至5/1,優(yōu)選為約2/1至約3/1。[0037]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述醇溶劑是乙醇和/或所述水性溶劑是水。[0038];本發(fā)明進(jìn)一步提供了根據(jù)本發(fā)明的LNP、藥物組合物或疫苗在所述一種或多種核酸分子的免疫原性遞送中的用途。[0039]最后，本發(fā)明提供了用于預(yù)防和/或治療癌癥或傳染性疾病的如本文所述的LNP、藥物組合物或疫苗。[0040]附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明[0041]現(xiàn)在具體參考附圖，要強(qiáng)調(diào)的是，所示的細(xì)節(jié)僅是示例性的，并且僅是為了舉例說(shuō)明性地討論本發(fā)明的不同實(shí)施方案。提出它們是為了提供被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的原理和概念最有用和最容易描述本發(fā)明的原理和概念的內(nèi)容。在這方面，沒(méi)有試圖以比本發(fā)明的基本理解所必需的更多的細(xì)節(jié)示出本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。附圖說(shuō)明使本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地知曉如何在實(shí)踐中體現(xiàn)本發(fā)明的幾種形式。[0043]圖2:靜脈內(nèi)施用后不同尺寸的OVAmRNALNP的免疫原性。[0045]圖4:靜脈內(nèi)施用含有OVAmRNA(10μg)和TriMixmRNA(15μg)的大尺寸的LNP后，[0046]圖5:在一次和兩次靜脈內(nèi)施用mRNALNP后140nm和230nm尺寸的原性的比較。[0048]圖7:靜脈內(nèi)LNPmRNA相對(duì)結(jié)內(nèi)施用的比較[0049]圖8:T細(xì)胞對(duì)LNPmRNA制劑的應(yīng)答是持久且可加強(qiáng)的。7答方面具有更高的免疫原性。發(fā)明詳述[0052]如上文已經(jīng)詳細(xì)描述的，本發(fā)明提供了具有比本領(lǐng)域中通常使用的直徑更大的直徑的LNP,對(duì)此我們已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)它們非常適合于核酸特別是mRNA的免疫原性遞送；對(duì)此我們發(fā)現(xiàn)與向脾臟的增強(qiáng)的遞送的相關(guān)性。“核酸分子的免疫原性遞送”是指將核酸分子遞送至細(xì)胞由此與細(xì)胞接觸，所述核酸分子的內(nèi)在化和/或在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)導(dǎo)致誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。[0053]因此，在第一方面，本發(fā)明提供了脂質(zhì)納米顆粒(LNP),其包含可離子化的脂質(zhì)、磷優(yōu)選約200nm。[0054]脂質(zhì)納米顆粒(LNP)通常已知為包含不同脂質(zhì)的組合的納米級(jí)顆粒。盡管這種LNP中可以包括許多不同類型的脂質(zhì)，但是本發(fā)明的LNP通常包含可離子化的脂質(zhì)、磷脂、甾醇[0055]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“納米顆?！笔侵妇哂惺顾鲱w粒適合于全身、尤其是靜脈內(nèi)施用特別是核酸的直徑的任何顆粒，其通常具有小于1000納米(nm)的直徑。[0056]在一些實(shí)施方案中，納米顆粒的平均直徑小于600nm。在一些實(shí)施方案中，納米顆粒的平均直徑小于400nm,但是在任何情況下，本發(fā)明的納米顆粒的平均直徑均大于約140nm,更優(yōu)選地大于約200nm。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的LNP具有約140nm、約使用多個(gè)LNP的混合物的情況下，最小平均直徑是指所述多個(gè)LNP的最小平均直徑。在所述情況下，例如，混合物可以含有具有小于140nm的平均直徑的一些LNP,只要其余的LNP的平均直徑大于140nm以導(dǎo)致全部LNP一起的平均最小直徑為140nm。每當(dāng)在本申請(qǐng)中使用時(shí)，即[0057]在本發(fā)明的上下文中，在化合物或脂質(zhì)的上下文中的術(shù)語(yǔ)“可離子化的”(或可替代地為陽(yáng)離子的)意指所述化合物或脂質(zhì)中存在任何不帶電荷的基團(tuán)，其能夠通過(guò)產(chǎn)生離子(通常為H離子)而解離并因此本身帶正電?；蛘?，所述化合物或脂質(zhì)中的任何不帶電荷的基團(tuán)可產(chǎn)生電子并因此帶負(fù)電。[0058]在本發(fā)明的上下文中，可以適當(dāng)?shù)厥褂萌魏晤愋偷目呻x子化的脂質(zhì)。具體地，合適的可離子化的脂質(zhì)是可離子化的氨基脂質(zhì)，其包含通過(guò)S-S鍵連接的兩個(gè)相同或不同的尾部，所述尾部各自包含可離子化的胺，例如由以下所示的：在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述可離子化的脂質(zhì)是式(I)的化合物：(I)其中：RCO0選自包含以下的列表：肉豆蔻?；?、α-D-生育酚琥珀酰基、亞油酰基和油酰8[0064]X選自包含以下的列表：[0066]這樣的可離子化的脂質(zhì)具體由以下式中的任何一個(gè)表示：[0068]更具體地，所述可離子化的脂質(zhì)是式(I)的脂質(zhì)，其中RCCO是a-D-生育酚琥珀酰[0072]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“甾醇”(也稱為類甾醇)是類甾醇的一個(gè)亞類，其天然存在于植物、動(dòng)物和真菌中，或者可以由一些細(xì)菌產(chǎn)生。在本發(fā)明的上下文中，可以使用任何合適的甾醇，例如選自包含以下的列表：膽甾醇、麥角甾醇、菜油甾醇、氧甾醇、本發(fā)明的磷脂中，優(yōu)選是甘油-磷脂。此外，磷酸基團(tuán)經(jīng)常被簡(jiǎn)單的有機(jī)分子例如膽堿(即產(chǎn)生磷酸膽堿)或乙醇胺(即產(chǎn)生磷酸乙醇胺)修飾。9[0074]在本發(fā)明的上下文中，合適的磷脂可以選自包含以下的列表：1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE),1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC),1,2-二亞油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DLPC),1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油-磷酸膽堿(DMPC),1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC),1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC),1,2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC),1,2-二十一烷?；?sn-甘油-磷酸膽堿(DUPC),1-棕櫚?；?2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(POPC),1,2-二-0-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(18:0二醚PC),1-油?；?2-膽甾醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(OChemsPC),1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(C16LysoPC),1,2-二亞麻酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿，1,2-二花生四烯?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿，1,2-二十二碳己?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿，1,2-二植烷?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME16.0PE),1,2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-二亞油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-二亞麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-二十二碳己?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)鈉鹽(DOPG),鞘磷脂及其混合物。[0075]在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述磷脂選自包含以下的列表：1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE),1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)及其混合物。醇)基團(tuán)修飾的任何合適的脂質(zhì)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述PEG脂質(zhì)選自包含以下的包括C14-PEG2000(1,2-二肉豆蔻?；?rac-甘油、甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000))和C18-PEG5000(1,2-二硬脂?；?rac-甘油、甲氧基聚乙二醇-5000(DSG-PEG5000))。[0077]在本發(fā)明的具體的實(shí)施方案中，應(yīng)用以下一者或多者：[0078]-所述LNP占所述可離子化的脂質(zhì)的約35mol%至65mol%;[0079]-所述LNP占所述甾醇的約15mol%至60mol%;[0080]-所述LNP占所述PEG脂質(zhì)的約0.5mol%至2mol%;和/或[0081]-所述LNP占所述磷脂的約5mol%至15mol%。[0082]在本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，應(yīng)用以下一者或多者：[0083]-所述LNP占所述可離子化的脂質(zhì)的約10mol%至60mol%;[0084]-所述LNP占所述甾醇的約15mol%至50mol%;[0086]-所述LNP占所述磷脂的約5mol%至40mol%。[0087]在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，應(yīng)用以下一者或多者：[0088]-所述LNP占所述可離子化的脂質(zhì)的約40mol%至60mol%;[0089]-所述LNP占所述甾醇的約20mol%至40mol%;[0090]-所述LNP占所述PEG脂質(zhì)的約0.5mol%至5m[0091]-所述LNP占所述磷脂的約5mol%至15mol%。[0092]因此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述LNP占所述可離子化的脂質(zhì)的約10mol%至60mol%;優(yōu)選約40mol%至60mol%。[0093]在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述LNP占所述甾醇的約15mol%至50mol%;優(yōu)選約20mol%至40mol%。[0095]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述LNP占所述磷脂的約5mol%至40mol%;優(yōu)選約5mol%至15mol%?？呻x子化的脂質(zhì)；和/或約15mol%至50mol%的甾醇；和/或約0.5mol%至10mol%的所述[0097]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的LNP包含約40mol%至60mol%的所述可離可離子化的脂質(zhì)磷脂(mol%)膽甾醇PEG脂質(zhì)磷脂的類型型1222354525167185951115225252111根據(jù)本發(fā)明的核酸可以是單鏈或雙鏈且線性或共價(jià)封閉以形成環(huán)的分子形式。核酸可以用可以在應(yīng)用之前通過(guò)穩(wěn)定序列、加帽和聚腺苷酸化來(lái)修飾RNA。[0104]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“RNA”涉及包含核糖核苷酸殘基并且優(yōu)選完全或基本合成的RNA,重組產(chǎn)生的RNA,以及修飾的RNA,其與天然存在的RNA的區(qū)別在于一個(gè)或多個(gè)核如非天然存在的核苷酸或化學(xué)合成的核苷酸或脫氧核苷酸。這些改變的RNA可以稱為類似工染色體載體例如細(xì)菌人工染色體(BAC),酵母人工染色體或天然存在的RNA的類似物。以使用DNA作為模板產(chǎn)生并編碼肽或蛋白質(zhì)的“轉(zhuǎn)錄物”。mRNA通常包含5'非翻譯區(qū)(5-UTR)、蛋白質(zhì)或肽編碼區(qū)和3'非翻譯區(qū)錄或化學(xué)合成獲得RNA。體外轉(zhuǎn)錄方法是技術(shù)人員已知的。例如，有許多可商購(gòu)獲得的體外轉(zhuǎn)錄試劑盒。遞細(xì)胞更特別地樹(shù)突狀細(xì)胞的功能性的蛋白的mRNA分子。這樣的分子可以選自包含以下的21;尤其是CD40L、CD70和caTLR4中的一種或多種。本發(fā)明的方法中使用的免疫刺激因子的caTLR4免疫刺激分子的組合，其在本文中也稱為“TriMix”。[0108]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述mRNA分子是編碼抗原和/或疾病特異性蛋白的和/或免疫應(yīng)答所針對(duì)的至少一個(gè)表位。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中，抗原是任選地在加工后誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的分子，該免疫應(yīng)答優(yōu)選對(duì)抗原或表達(dá)該抗原的細(xì)胞是特異性的。特別性反應(yīng)。[0110]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，抗原是靶特異性抗原，其可以是腫瘤抗原，或細(xì)菌、病毒或真菌抗原。所述靶特異性抗原可源自以下任一種：從(一種或多種)靶細(xì)胞分離的總mRNA,一種或多種特異性的靶mRNA分子，(一種或多種)靶細(xì)胞的蛋白裂解物，來(lái)自(一多種)靶細(xì)胞的特異性蛋白，或合成的靶特異性肽或蛋白質(zhì)以及編碼靶特異性抗原或其衍[0111]為了避免任何誤解，本發(fā)明的LNP可以包含單個(gè)mRNA分子，或者它們可以包含多種蛋白質(zhì)的一種或多種mRNA分子的組合。[0112]在非常具體的實(shí)施方案中，所述編碼免疫調(diào)節(jié)分子的mRNA分子可以與編碼抗原特異性蛋白和/或疾病特異性蛋白的一種或多種mRNA分子組合。例如，本發(fā)明的LNP可以包含特異性蛋白和/或疾病特異性蛋白的一種或多種mRNA分子組合。因此，在非常具體的實(shí)施方[0113]在另一方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種如本文定義的LNP的藥物組合物。這樣的藥物組合物特別適合作為疫苗。因此，本發(fā)明還提供了包含一種或多種根據(jù)本發(fā)明的LNP的疫苗。[0114]在本發(fā)明的上下文中，本文所用的術(shù)語(yǔ)“疫苗”是指旨在提供針對(duì)疾病的適應(yīng)性免疫(抗體和/或T細(xì)胞應(yīng)答)的任何制劑。為此，本文所指的疫苗包含編碼抗原的至少一種mRNA分子，其中所述抗原引發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。該抗原可以以微生物、蛋白質(zhì)或肽或編碼核酸的抗原的弱化或經(jīng)殺死的形式的格式存在。在本發(fā)明的上下文中，抗原是指被宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別為異源的蛋白質(zhì)或肽，從而刺激針對(duì)其的抗體的產(chǎn)生，目的是對(duì)抗此類抗原。疫苗可以是預(yù)防性的(例如：預(yù)防或減輕任何天然或“野生”病原體的未來(lái)感染的影響)或治療性的(例如，積極治療或減輕正在進(jìn)行的疾病的癥狀)。疫苗的施用稱為疫苗接種。[0115]本發(fā)明的疫苗可用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，特別是針對(duì)疾病相關(guān)抗原或表達(dá)疾病相關(guān)抗原的細(xì)胞的免疫應(yīng)答，例如針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答。因此，疫苗可以用于涉及疾病相關(guān)抗原或表達(dá)疾病相關(guān)抗原的細(xì)胞的疾病例如癌癥的預(yù)防性和/或治療性治療。優(yōu)選地，所述免疫應(yīng)答是T細(xì)胞應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，疾病相關(guān)抗原是腫瘤抗原。由本文所述的納米顆粒中包含的RNA編碼的抗原優(yōu)選為疾病相關(guān)抗原或引發(fā)針對(duì)疾病相關(guān)抗原或表達(dá)疾病相關(guān)抗原的細(xì)胞的免疫應(yīng)答。[0116]本發(fā)明的LNP和疫苗特別考慮用于靜脈內(nèi)施用，即將液體物質(zhì)直接輸注到靜脈中。靜脈內(nèi)途徑是在整個(gè)體內(nèi)(即全身性)遞送液體和藥物的最快方法。因此，本發(fā)明提供了靜靜脈內(nèi)施用。本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的疫苗和LNP的用途；其中疫苗是靜脈內(nèi)施用的。[0117]本發(fā)明還提供了用于人類或獸類醫(yī)學(xué)的根據(jù)本發(fā)明的LNP、藥物組合物和疫苗。還考慮了將本發(fā)明的LNP、藥物組合物和疫苗用于人類或獸類醫(yī)學(xué)。最后，本發(fā)明提供了一種用于通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明的LNP、藥物組合物和疫苗施用至有需要的受試者來(lái)預(yù)防和治療人類和獸類疾病的方法。[0118]本發(fā)明進(jìn)一步提供了根據(jù)本發(fā)明的LNP、藥物組合物或疫苗用于免疫原性遞送所述一種或多種核酸分子的用途。此效果特別地使用本發(fā)明的較大的LNP來(lái)實(shí)現(xiàn)，因?yàn)橛捎谒鼈儍?yōu)先靶向脾臟。發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)的小尺寸的LNP優(yōu)先靶向肝臟，因此幾乎沒(méi)有或沒(méi)有免疫原此，本發(fā)明提供了用于治療癌癥或傳染性疾病的本發(fā)明的LNP、藥物組合物和疫苗。[0120]-制備包含所述可離子化的脂質(zhì)、所述磷脂、所述甾醇、所述PEG脂質(zhì)和合適的醇溶劑的第一醇組合物；[0121]-制備包含所述一種或多種核酸和水性溶劑的第二水性組合物；[0122]-使用以下設(shè)置在微流體混合裝置中混合所述第一和第二組合物：[0123]-總流速(FR)為約0.5至約8ml/min,優(yōu)選為約1至4ml/min。[0124]-流速比(FRR)為約1/1至5/1,優(yōu)選為約2/1至約3/1。[0125]更詳細(xì)地，將脂質(zhì)組分以合適的濃度組合在醇媒介物例如乙醇中。另外，添加包含核酸的水性組合物，然后將其裝載在微流體混合裝置中。[0126]微流體混合的目的是在微型裝置中實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品(即脂質(zhì)相和核酸相)的徹底和快速混合。通常通過(guò)增強(qiáng)不同物質(zhì)流之間的擴(kuò)散效果來(lái)實(shí)現(xiàn)這種樣品混合。另外，可以使用幾種微流體混合裝置，例如在Lee等人，2011中綜述的。根據(jù)本發(fā)明的特別合適的微流體混合裝置是來(lái)自PrecisionNanosystems的NanoAssemblr。[0127]這種微流體混合裝置的混合參數(shù)對(duì)獲得的LNP的特性，特別是對(duì)其尺寸的影響很大。因此，為了獲得大的LNP(即平均直徑至少為140nm,優(yōu)選至少為200nm),FR和FRR參數(shù)是高度相關(guān)的。[0128]總FR(FlowRate,流速)是微流體混合的速度的量度，并且在現(xiàn)有技術(shù)中通常設(shè)置[0129]FRR(流速比)是醇相中的脂質(zhì)與水相中的核酸之間的比率，并且在本發(fā)明中通常設(shè)置為約2/1至約3/1。實(shí)施例[0130]實(shí)施例1.[0131]在此第一個(gè)實(shí)施例中，評(píng)估了粒徑對(duì)mRNALNP的免疫原性的影響。為此，制備了相D-生育酚半琥珀酰(可離子化的脂質(zhì))、10mol%的DOPE、38.5mol%的膽甾醇和1.5mol%的DSG-PEG5000(聚乙二醇化的脂質(zhì))。LNP在Nano-Assemblr上使用不同的流速(FR;ml/min)和水/乙醇體積比(FRR)生產(chǎn)。以FR4ml/min產(chǎn)生140nm尺寸的LNP,而以FR1ml/min產(chǎn)生230nm尺寸的LNP。[0132]圖1顯示了在小鼠中使用OVA/TriMixmRNALNP(OVA:10μg;TriMixmRNA:15μg)進(jìn)[0133]實(shí)施例2.[0134]在此實(shí)施例中，確定了小鼠中不同尺寸和組成的OVAmRNALNP在靜脈內(nèi)施用后的免疫原性。如圖2所定義，所有LNP均以指定的脂質(zhì)比率(mol%)包含α-D-生育酚半琥珀酰使用不同的流速(FR;ml/min)和水/乙醇體積比(FRR)生產(chǎn)。免疫后6天，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)定11/12頁(yè)11/12頁(yè)后的免疫原性。曲線圖描繪了用OVAMHCI表位SIINFEKL(5μg/ml)對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行再刺激后，分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞/10?個(gè)脾細(xì)胞的數(shù)量。如圖3所定義，所有LNP以指定的脂質(zhì)比率3所定義，LNP在Nano-Assemblr上使用不同的流速(FR;ml/min)和水/乙醇體積比(FRR)生產(chǎn)。免疫后6天，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)定量OVA特異性CD8+T細(xì)胞的百分比。[0137]實(shí)施例4.制備了兩種不同的組合物。測(cè)定了在靜脈內(nèi)注射含有OVAmRNA(10μg)和TriMixmRNA(15μg)的大尺寸的LNP后OVA特異性T細(xì)胞的百分比，并顯示在圖4中。在第0天和第20天免疫小鼠。對(duì)第15天和第39天的血液樣品評(píng)估OVA特異性T細(xì)胞百分比。從圖4可以清楚地看出，聚乙二醇化脂質(zhì)的類型對(duì)LNP的免疫原性沒(méi)有影響。[0139]實(shí)施例5.復(fù)免疫后的免疫原性(圖5)。LNP以指定的脂質(zhì)比率(mol%)包含50mol%的α-D-生育酚半琥珀酰(可離子化的脂質(zhì))、10mol%的DOPE(磷脂)、38mol%的膽甾醇和1.5mol%的DSG-caTLR4)。免疫后五天測(cè)量OVA特異性CD8T細(xì)胞應(yīng)答的百分比。[0141]實(shí)施例6.[0142]在此實(shí)施例中，我們比較了用不同尺寸的FlucmRNALNP靜脈內(nèi)注射小鼠后脾臟酰(可離子化的脂質(zhì))、D0PC、膽甾醇和DSG-PEG5000。通過(guò)使用不同流速的微流體混合(FR1相對(duì)FR4)產(chǎn)生不同尺寸的LNP。該圖描述了通過(guò)ph/s/cm2/sr的體內(nèi)生物發(fā)光測(cè)量的Fluc[0143]實(shí)施例7.[0144]在此實(shí)施例中，我們證明了配制的靜脈內(nèi)mRNALNP與結(jié)內(nèi)方法相比引起更好的免疫原性和抗腫瘤功效。[0145]使用的API的特征如下：[0148]此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖7中，其清楚地顯示，在免疫原性和抗腫瘤功效這兩者上，使用的使用mRNALNP的靜脈內(nèi)方法優(yōu)之間似乎存在相關(guān)性。[0149]實(shí)施例8.[0151]為此，在免疫方案中使用了3種不同的制劑，其結(jié)果如圖8所示。根據(jù)這些結(jié)果，可以得出以下觀察結(jié)果/結(jié)論：[0152]-在免疫3后40天具有高百分比的E7特異性T細(xì)胞的延長(zhǎng)的收縮期[0153]-記憶轉(zhuǎn)換[0154]-極好的召回應(yīng)答：靜脈內(nèi)制劑疫苗能夠得到加強(qiáng)。[0155]實(shí)施例9.[0156]在此實(shí)施例中，進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，其證明了LNP的尺寸的影響。[0157]為此，使用了以下實(shí)驗(yàn)設(shè)置：[0158]-可離子化的脂質(zhì)/膽甾醇/DOPE/DMG-PEG2000的比率-50/38.