第五章蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定

1.蛋白質(zhì)概況蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五種元素組成。某些蛋白質(zhì)中還含有微量的P、Cu、Fe、I等；是生物體的重要的結(jié)構(gòu)和功能性物質(zhì)，也是食品的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分；蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，人體11%~13%總熱量來(lái)自蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)食品是人體對(duì)8種必需氨基酸的來(lái)源；蛋白質(zhì)是食品的最重要質(zhì)量指標(biāo)，其含量與分解產(chǎn)物直接影響食品的色、香、味；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，主要（也是最常用的）用凱氏定氮法測(cè)定總氮量，然后乘一個(gè)蛋白質(zhì)換算系數(shù)。在食品和生物材料中包括蛋白質(zhì)，還包括有非蛋白質(zhì)含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物堿、含氮類脂、卟啉和含氮的色素），蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)需要盡可能加以鑒別；由于氨基酸組成不同，不同蛋白質(zhì)含氮量也不同，一般樣品中由于蛋白質(zhì)種類繁多，使總蛋白含氮量穩(wěn)定在16％左右，即一份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，6.25為常用的蛋白質(zhì)系數(shù)；一些特定種類的樣品蛋白質(zhì)系數(shù)為花生5.46，大米5.95，大豆5.71，小麥5.70，牛乳6.38蛋白質(zhì)的測(cè)定原理分兩大類：利用蛋白質(zhì)的共性即含氮量、肽鍵和折射率等測(cè)定蛋白質(zhì)含量；利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基、酸性、堿性基團(tuán)及芳香基團(tuán)等測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

凱氏定氮法凱氏定氮法是準(zhǔn)確性較高的測(cè)定方法，常作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法；微量凱氏定氮法樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套微量凱氏定氮器凱氏法改良的主要問(wèn)題是，氮化合物中氮的完全氨化問(wèn)題及簡(jiǎn)化操作的問(wèn)題經(jīng)過(guò)不斷改進(jìn)，使應(yīng)用范圍、分析準(zhǔn)確度、操作速度方面不斷優(yōu)化蛋白質(zhì)快速測(cè)定法：雙縮脲法、水楊酸法、考馬斯亮蘭結(jié)合法等顯色比色法，紫外分光光度法，折光法、旋光法等物理分析法常用于生產(chǎn)中。

氨基酸及測(cè)定概況氨基酸是蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物，天然分離的氨基酸達(dá)175種以上，但基本氨基酸只有20種，其中Leu,Ile,Lys,Phe,Met,Thr,Ser,Val八種為必需氨基酸，是食品分析中的重要項(xiàng)目氨基酸總量——酸堿滴定法，比色法各種氨基酸的分離與定量——色譜法凱氏定氮法測(cè)定蛋白總量新鮮食品中的含氮化合物以蛋白質(zhì)為主要成分，樣品中還有核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉及含氮色素，測(cè)出的總氮稱為粗蛋白含量凱氏定氮法由Kieldahl于1833年提出，經(jīng)過(guò)不斷改進(jìn)，演變?yōu)槌Ａ糠?、微量法、自?dòng)定氮儀法、半微量法和改良凱氏法等

一、常量凱氏定氮法

1.原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。通過(guò)加堿蒸餾，使氨蒸出，依下法滴定①用H3BO3吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。②也可以用過(guò)量的標(biāo)準(zhǔn)H2SO4或標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定過(guò)量的酸。凱氏定氮法整個(gè)過(guò)程分三步：消化蒸餾吸收與滴定1）消化過(guò)程及其總反應(yīng)式：2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4=(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O其中，濃硫酸（98%）具有的脫水性和氧化性，使：有機(jī)物脫水后炭化為碳、氫、氮。碳被氧化為CO2，硫酸被還原為SO2SO2使N還原為氨，本身被氧化為SO3消化過(guò)程的促進(jìn)劑——硫酸鉀作為增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)，純硫酸沸點(diǎn)340℃，加入硫酸鉀之后可以提高至400℃以上。原因在于隨著體系體積減?。蛩岱纸?、水和CO也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。消化過(guò)程的催化劑——硫酸銅加硫酸銅作為催化劑C+2CuSO4→Cu2SO4↓+SO2↑+CO2↑Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+SO2↑+2H2O當(dāng)C被氧化完，Cu2SO4沉淀不再生成，溶液呈現(xiàn)透明的藍(lán)綠色，指示消化終點(diǎn)還可以做蒸餾時(shí)堿性指示劑其它催化和氧化劑也可以氧化汞、汞（均有毒，價(jià)格貴）、硒粉、二氧化鈦為催化劑。加入氧化劑如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機(jī)物氧化速度。2）蒸餾過(guò)程在完全消化的樣品溶液中加入過(guò)量的濃氫氧化鈉，加熱蒸餾，使氨全部蒸出，用過(guò)量硼酸或標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)酸溶液吸收3）吸收與滴定用4%硼酸吸收，用0.1M鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，指示劑用混合指示劑（甲基紅—溴甲基酚綠混合指示劑）硼酸的Ka1＝5.8×10－10，酸性很弱，滴定時(shí)不影響指示劑的變色范圍滴定反應(yīng)的實(shí)質(zhì)是NH3與HCl的強(qiáng)酸弱堿反應(yīng)，其滴定終點(diǎn)在酸性范圍：pH4.3-6.25用酸滴定甲基紅變色范圍pH4.4～6.2紅-黃pKa＝5.2溴甲酚綠變色范圍pH3.8～5.4黃-藍(lán)pKa＝4.9混合指示劑變色時(shí)酸（紅-灰-綠）堿變色點(diǎn)pH5.1（1份：5份，0.2％乙醇溶液）用堿滴定用定量過(guò)量的H2SO4或HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過(guò)剩的酸液，滴定終點(diǎn)pH為4.3～9.7以甲基澄（紅3.1-4.4黃)、酚酞(無(wú)色8.0-9.6紅色)或甲基紅作指示劑。2、操作方法：1)消化準(zhǔn)確稱取固體樣品0.2～2g，小心移入干燥潔凈的500ml凱氏燒瓶，加入研細(xì)的硫酸銅0.5g、硫酸鉀10g和濃硫酸20ml，搖勻，安裝消化裝置，于凱氏瓶口放一個(gè)漏斗，將燒瓶斜置于石棉網(wǎng)上；（問(wèn)題1、樣品中加入濃硫酸后，溶液的顏色立即發(fā)生什么變化？）常量凱氏定氮消化、蒸餾裝置改進(jìn)后的消化裝置2）用小火加熱，使內(nèi)容物炭化，泡沫停止產(chǎn)生后，加大火力，保持液體微沸狀態(tài)，至液體變?yōu)樗{(lán)綠色澄清，再微沸30分鐘；3）（準(zhǔn)備蒸餾）冷卻后小心加入200ml蒸餾水，再放冷，加入數(shù)個(gè)玻璃珠（防止爆沸）。問(wèn)題2、消化過(guò)程中是否有大量的泡沖到瓶頸，原因是什么？問(wèn)題3、瓶頸有什么顏色的有毒煙產(chǎn)生？問(wèn)題4、如何判斷消化的終點(diǎn)？4）蒸餾：凱氏瓶安裝到蒸餾裝置中，接受瓶?jī)?nèi)裝入50ml4％硼酸溶液及混合指示劑2－3滴；從漏斗加入70－80ml40％氫氧化鈉溶液，搖動(dòng)，至溶液變深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀，再加入100ml蒸餾水，關(guān)閉加樣口，加熱蒸餾，至氨全部蒸出，餾液約250ml。問(wèn)題5、加入過(guò)量40％氫氧化鈉溶液時(shí)溶液顏色有什么變化？（檢查蒸餾終點(diǎn)）將冷凝管下端提起，用洗瓶沖洗冷凝管口，取1分鐘后的蒸餾液幾滴，用奈氏試劑檢查，如無(wú)紅棕色出現(xiàn)，表明氨蒸餾完畢，即可停止加熱和蒸餾（滴定）將接受瓶中的液體直接用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至綠色變微紅色為終點(diǎn)，記錄鹽酸用量空白實(shí)驗(yàn)的操作：從消化開(kāi)始。。。問(wèn)題6、如何檢驗(yàn)蒸餾終點(diǎn)？檢查氨是否全部蒸完以奈氏試劑——〔Nessler試劑，K2（HgI4）〕檢驗(yàn)NH4+離子，遇銨離子析出黃色或紅棕色沉淀。奈氏試劑配制3.5gKI+1.3gHgCl2溶于70毫升水。加30毫升4mol/L氫氧化鈉（或氫氧化鉀）溶液，必要時(shí)過(guò)濾，并存于玻璃瓶中蓋緊口。3、結(jié)果計(jì)算：F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般為6.254、方法說(shuō)明：1）所用試劑溶液應(yīng)用無(wú)氨蒸餾水配制。2）消化時(shí)不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶?jī)?nèi)壁上的含氮化合物在無(wú)硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。3）消化時(shí)應(yīng)注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪?，并促進(jìn)其消化完全。4）樣品中若含脂肪較多時(shí)，消化過(guò)程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開(kāi)始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱，并時(shí)時(shí)搖動(dòng)；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度。5）當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30％過(guò)氧化氫2—3m1后再繼續(xù)加熱消化。6）若取樣量較大，如干試樣超過(guò)5g可按每克試樣5m1的比例增加硫酸用量。7）—般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對(duì)于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品．如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。8）蒸餾裝置不能漏氣。9）蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。

氫氧化銅在70～90℃時(shí)發(fā)黑。

10）蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸111）硼酸吸收液溫度不超過(guò)40度，過(guò)高使氨容易散失二、微量凱氏定氮法1、原理及適用范圍2、與常量法不同點(diǎn)：采用水蒸汽蒸餾加入接受瓶的硼酸量由50ml→10ml,滴定用鹽酸濃度由0.1mol/L→0.01mol/L可用微量滴定管。凱氏燒瓶較小100ml微量凱氏定氮裝置3、微量凱氏定氮法操作過(guò)程：消化：消化方法同常量法；消化完全的消化液完全轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶定容。蒸餾：用水蒸汽蒸餾方法提取氨：準(zhǔn)確取10ml消化稀釋液于微量反應(yīng)管中，經(jīng)漏斗再加入10ml40％氫氧化鈉使呈強(qiáng)堿性，用少量蒸餾水洗漏斗數(shù)次，關(guān)漏斗，進(jìn)行水蒸汽蒸餾，冷凝管下端插入10ml4％硼酸溶液中蒸餾及滴定：蒸餾至吸收液中所加的混合指示劑變?yōu)榫G色時(shí)再繼續(xù)蒸餾10分鐘后，將冷凝管口提起離開(kāi)液面再蒸餾1min，用蒸餾水洗管口后停止蒸餾，用0.01M鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定并同時(shí)作空白對(duì)照4、微量凱氏定氮法說(shuō)明水蒸氣發(fā)生器的水中加入甲基澄及硫酸數(shù)滴使保持酸性，避免水中的氨帶入樣品中蒸餾過(guò)程中保持加熱，防止溶液倒流消化液中堿要加足，使呈強(qiáng)堿性；漏斗采用水密封，以免氨散失三、自動(dòng)凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前2、特點(diǎn)：（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：催化劑以片劑形式加入，一次可同時(shí)消化8個(gè)樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個(gè)樣。自動(dòng)凱氏消化儀同時(shí)能消化20個(gè)樣品。新的加熱元件是一個(gè)無(wú)需維修的鋁塊加熱器。消化管受熱均勻，消化過(guò)程中蒸發(fā)出的蒸汽全被收集。消化溫度和消化時(shí)間均可輸入程序，并能顯示。玻璃器件均為硼酸鹽玻璃，無(wú)金屬離子污染樣品以確保樣品的純凈。儀器價(jià)格低，準(zhǔn)確度高：在滴定時(shí)，采用PH電極確定滴定終點(diǎn)，其靈敏度要高。操作人員可用隨機(jī)所帶的PH4及PH7兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)PH電極的校正就可得知該電極是否還能正常工作。全自動(dòng)計(jì)算機(jī)程序操作：由于按計(jì)算機(jī)設(shè)置的程序進(jìn)行操作，并將各項(xiàng)操作的內(nèi)容通過(guò)打印機(jī)直接打印記錄。滴定結(jié)束后，所有廢液立即自動(dòng)排出，接著就可進(jìn)行第二個(gè)樣品的滴定操作。多功能性應(yīng)用范圍較廣：能夠適用于各種不同食品的蛋白質(zhì)含量測(cè)定，對(duì)于粘稠易發(fā)泡的樣品：如蛋白質(zhì)溶液、牛奶、啤酒等液體樣品，可通過(guò)特殊的加液漏斗滴加過(guò)氧化氫作為催化劑，進(jìn)行消化。因?yàn)楦邷叵?，?duì)天然有機(jī)物的消化比較徹底，可用于土壤、肥料等含氮量的測(cè)定，亦有用于元素分析儀測(cè)定樣品的前處理。耐用性好，儀器壽命長(zhǎng)：采用優(yōu)質(zhì)材料確保對(duì)樣品不會(huì)造成接觸污染。接觸高溫的部位一般都采用聚四氟乙烯等耐高溫材料，以保證經(jīng)久耐用。第二講一、目的和要求目的：學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)快速測(cè)定法和氨基酸測(cè)定的常用方法。掌握：蛋白質(zhì)雙縮脲法、氨基酸甲醛滴定法。了解：蛋白質(zhì)其它快速測(cè)定法、氨基酸電位滴定法。二、教學(xué)安排2學(xué)時(shí)三、重點(diǎn)和難點(diǎn)重點(diǎn)：蛋白質(zhì)雙縮脲法。難點(diǎn)：氨基酸甲醛滴定法。四、授課方法及內(nèi)容安排教學(xué)內(nèi)容表達(dá)方式時(shí)間分配1蛋白質(zhì)快速測(cè)定法在現(xiàn)代生物工程研究中的意義講述10分鐘2四種蛋白質(zhì)快速測(cè)定法、三種氨基酸測(cè)定法PPT課件65分鐘3蛋白質(zhì)測(cè)定方法比較板書15分鐘五、參考資料教材：《食品分析》大連輕工業(yè)學(xué)院等編，中國(guó)輕工業(yè)出版社2007年1版參考教材：《工業(yè)發(fā)酵分析》天津輕工業(yè)學(xué)院等四校合編中國(guó)輕工業(yè)出版社六、板書內(nèi)容第第二節(jié)蛋白質(zhì)的快速測(cè)定法一、雙縮脲法1、原理：2、方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍3.主要儀器：4.試劑：5．操作方法：6、方法說(shuō)明及注意事項(xiàng)：二、染料結(jié)合法三、水楊酸比色法四、考馬斯（Comessie)亮蘭結(jié)合法（Bradford法）第四節(jié)氨基酸定量測(cè)定

（一）甲醛滴定法二、電位滴定法三、茚三酮的比色法五、作業(yè)雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理是什么？如何處理樣品以減小脂肪、色素雜質(zhì)及不溶性成分對(duì)比色測(cè)定的影響？紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理是什么？成分對(duì)其測(cè)定的準(zhǔn)確性有何影響？雙指示劑甲醛滴定法測(cè)定氨基酸的原理是什么？六、授課內(nèi)容：

蛋白質(zhì)的快速測(cè)定法傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，采用自動(dòng)定氮系統(tǒng)后，提高了測(cè)定速度和效率，但仍然操作復(fù)雜，有環(huán)境污染。新開(kāi)發(fā)的一些快速分析方法克服了這些缺點(diǎn)，在準(zhǔn)確度達(dá)到要求的條件下得到廣泛應(yīng)用：雙縮脲法、紫外分光光度法、染料結(jié)合法、水楊酸比色法等。一、雙縮脲法雙縮脲反應(yīng)：雙縮脲在強(qiáng)堿性條件下與硫酸銅作用生成紫紅色配合物實(shí)際上，凡是具有兩個(gè)－CO－NH－，－CO－NH2及以上基團(tuán)的分子，在較強(qiáng)堿性條件下，都可以與銅顯色。1、原理：蛋白質(zhì)分子具有與雙縮脲相似的結(jié)構(gòu)，與堿性硫酸銅溶液可生成紫紅色配合物，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，最大吸收波長(zhǎng)為560nm紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，測(cè)定范圍為1~10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液等。

2、方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍本法主要的缺點(diǎn)是靈敏度較低（1mg/ml以上,最小樣品含蛋白40mg以上），但操作簡(jiǎn)單快速，不需要對(duì)樣品進(jìn)行消化；不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，干擾物質(zhì)少。因此雙縮脲法常用于需要快速、但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。在生物化學(xué)領(lǐng)域中測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測(cè)定。3.主要儀器：分光光度計(jì)，離心機(jī)（4000rpm）4.試劑：堿性硫酸銅溶液：含0.1M氫氧化鉀需要加入穩(wěn)定劑，防止產(chǎn)生氫氧化銅沉淀。兩個(gè)措施:加入穩(wěn)定劑甘油或酒石酸鉀鈉（即以絡(luò)合物存在）配制時(shí)要緩慢加入硫酸銅溶液和劇烈攪拌，必須澄清，無(wú)氫氧化銅生成此試劑可長(zhǎng)期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。5．操作方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線：采用凱氏法測(cè)出的蛋白質(zhì)樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照蛋白含量40－110mg稱取標(biāo)準(zhǔn)樣品于8支50ml納氏比色管中，各管加入1ml四氯化碳，再用堿式硫酸銅溶液稀釋各管至50ml，搖動(dòng)10分鐘，再靜置1小時(shí)，取上層清液離心5分鐘，取上清于560nm處比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取含蛋白量在40－110mg的樣品于同樣的納氏比色管，加1ml四氯化碳，同樣顯色、測(cè)定吸光度A，用A值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白mg數(shù)，計(jì)算得樣品含蛋白量6、方法說(shuō)明及注意事項(xiàng)：測(cè)定范圍包括可溶性的多肽和蛋白質(zhì)含脂肪高的樣品先用醚除去脂肪樣品中含不溶性成分時(shí)，會(huì)給比色帶來(lái)困難，可預(yù)先將蛋白抽出后測(cè)定類脂和色素對(duì)此反應(yīng)有干擾。可用四氯化碳消除干擾。蛋白質(zhì)種類不同，對(duì)發(fā)色程度影響不大；但含脯氨酸時(shí)，若有多量糖類共存，會(huì)顯色不好，使測(cè)定值偏低BCAProteinAssay試劑盒（貨號(hào)：71285-3）基于雙縮脲反應(yīng)的蛋白檢測(cè)試劑盒，可用于定量濃度在20-2000ug/ml的蛋白樣本，可在數(shù)分鐘內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果即使在某些化合物及去污劑存在的情況下也可以獲得準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，但螯合劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、還原劑有可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果試劑盒中提供500ml的BCA溶液，15ml的硫酸銅溶液及3*1ml的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(2mg/ml)。每個(gè)試劑盒足夠用于500個(gè)蛋白濃度測(cè)定。二、染料結(jié)合法原理：在特定條件下，蛋白質(zhì)可與某些染料定量結(jié)合而生成沉淀，過(guò)濾去除沉淀，殘余染料用分光光度計(jì)測(cè)定，即可計(jì)算出反應(yīng)消耗的染料量，進(jìn)而計(jì)算出蛋白質(zhì)含量常用染料：胺黑10B，酸性澄12，溴酚藍(lán)，橙黃G樣品性質(zhì)：谷物、油料籽粒、乳類食品優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單、快速、重現(xiàn)性好，無(wú)危險(xiǎn)化學(xué)試劑，與凱氏定氮相關(guān)性好注意：樣品脂肪含量，比色波長(zhǎng)的選用，標(biāo)準(zhǔn)曲線三、水楊酸比色法1、原理：樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)硫酸消化轉(zhuǎn)變?yōu)殇@鹽，在亞硝基鐵氰化鈉存在下，一定酸度和溫度條件下（37度）可與水楊酸鈉、次氯酸鈉生成藍(lán)色化合物，在波長(zhǎng)660nm處比色測(cè)定，計(jì)算出含氮量，進(jìn)而可計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。顯色原理：消化液中的氨與次氯酸鈉反應(yīng)生成氯化銨，氯化銨與水楊酸鈉反應(yīng)，形成5-氨基水楊酸鈉，再經(jīng)氧化和絡(luò)合后形成綠色絡(luò)合物，該物質(zhì)最大吸光波長(zhǎng)是660nm。2、試劑氮標(biāo)準(zhǔn)溶液：硫酸銨先配成1mg/ml的母液，使用時(shí)稀釋為2.5ug/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液空白酸溶液：含蔗糖、硫酸、硫酸銅、硫酸鈉溶液按樣品消化方法消化后使用磷酸緩沖液：磷酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉水楊酸鈉溶液：水楊酸鈉、亞硝基鐵氰化鈉（催化劑）次氯酸鈉:氧化劑3、操作方法1）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取6個(gè)25ml容量瓶編號(hào)012345，分別加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加空白酸液2ml，分別加磷酸鹽緩沖液5ml，加水稀釋至總體積至15ml；分別加水楊酸鈉5ml，37度水浴15分鐘加入次氯酸鈉2.5ml，37度水浴15分鐘取出試液定容至25ml，于660nm下進(jìn)行比色，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。2）樣品處理：取0.20-1.00g樣品消化，定容至25ml3）樣品測(cè)定：準(zhǔn)確吸取10ml，于100ml容量瓶，用水定容；再吸取2ml于25ml容量瓶，加5ml磷酸鹽緩沖液，后續(xù)操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作空白對(duì)照：以2ml空白酸溶液代替樣液4、結(jié)果計(jì)算5、說(shuō)明消化的樣品放置時(shí)間長(zhǎng)后對(duì)比色有影響應(yīng)盡快測(cè)定，溫度對(duì)顯色反應(yīng)影響大，應(yīng)嚴(yán)格控制37度顯色溫度四、考馬斯（Comessie)亮蘭結(jié)合法（Bradford法）【原理】考馬斯亮蘭能與蛋白質(zhì)的疏水部分特異結(jié)合，考馬斯亮蘭G-250的最大光吸收峰在465nm（紅色），當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)，其最大吸收峰改變?yōu)?95nm（藍(lán)色），且吸收強(qiáng)度增大。在一定濃度范圍（0～100μg/ml），光密度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系。故可以用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。考馬斯亮蘭化學(xué)結(jié)構(gòu)考馬斯亮蘭結(jié)合法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的蛋白質(zhì)定量測(cè)定法。具有操作方便、快速、干擾因素少的特點(diǎn)。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該反應(yīng)非常靈敏，可測(cè)微克級(jí)蛋白質(zhì)含量【試劑】（1）牛血清白蛋白配成100μg/ml；（2）考馬斯亮藍(lán)G-250：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml90%乙醇中，加入85%磷酸100ml，最后用蒸餾水定容至1000ml。此溶液在常溫下可放置一個(gè)月；【方法】1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制0～100μg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支試管，配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml。準(zhǔn)確吸取所配各管溶液0.1ml，分別放入10ml具塞試管中，加入5ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，蓋塞，反轉(zhuǎn)混合數(shù)次；放置2min后，在595nm下比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。CB-ProteinAssayTM試劑盒（貨號(hào)：219468）

改進(jìn)的考馬斯亮藍(lán)染色法，快速簡(jiǎn)便地估測(cè)蛋白濃度

CB-ProteinAssayTM試劑盒用于簡(jiǎn)單快捷的測(cè)定蛋白濃度，采用改進(jìn)的Bradford考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合檢測(cè)。5分鐘可獲得結(jié)果。與還原劑兼容，但不適用于含去污劑的蛋白溶液。每個(gè)試劑盒包含CB-Protein染料和白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。每個(gè)試劑盒足夠用于500個(gè)蛋白濃度測(cè)定?！緝?yōu)點(diǎn)】操作簡(jiǎn)便、快速，只需加一種試劑，重復(fù)性好，屬于染料結(jié)合法。顯色迅速。約于2分鐘內(nèi)完成染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合。所現(xiàn)顏色至少在1小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的。干擾物質(zhì)較少，如干擾雙縮脲法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。檢測(cè)靈敏度高，微量法測(cè)定蛋白含量范圍為1-10μg；常量法測(cè)以檢測(cè)范圍10-100μg。此法的缺點(diǎn)是：（1）經(jīng)研究認(rèn)為,染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用—球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。五、紫外分光光度法原理：蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物的芳香環(huán)殘基在紫外光區(qū)對(duì)=280nm波長(zhǎng)的紫外光具有選擇性吸收作用。在此波長(zhǎng)下，樣液對(duì)紫外光的吸收程度與其蛋白質(zhì)濃度(3~8mg/ml)成線性關(guān)系。主要試劑0.1M檸檬酸水溶液8M尿素的2M氫氧化鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制準(zhǔn)確稱取樣品2.00g（用定氮法確定蛋白質(zhì)含量）至50ml燒杯，加入0.1M檸檬酸溶液30ml，攪拌10分鐘使充分溶解，用四層紗布過(guò)濾于玻璃離心管中，以3000－5000r/min離心5－10分鐘，取出上清；分別吸取0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0ml于10ml容量瓶中各加入8M脲的氫氧化鈉溶液定容，充分振搖2分鐘，離心；取上清比色；以各溶液的蛋白含量為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定：準(zhǔn)確稱取試樣1.00g，加檸檬酸溶液同樣處理；取含3－8mg蛋白質(zhì)的上清加入8M脲氫氧化鈉溶液定容，離心，取上清比色；方法說(shuō)明：牛乳樣品測(cè)定的過(guò)程為：準(zhǔn)確吸取混合均勻的樣品0.2ml，置于25ml比色管，用95－97％的醋酸稀釋至標(biāo)線，搖勻，以此醋酸為參比液測(cè)定吸光度，并用牛乳標(biāo)樣制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；化學(xué)作用如稀酸、稀堿、尿素、表面活性劑、重金屬以及酶的作用，都能引起分子立體結(jié)構(gòu)部分破壞，使蛋白質(zhì)分子展開(kāi)。只測(cè)可溶性蛋白、肽及氨基酸。蛋白的酸解過(guò)程受溫度影響，溫度應(yīng)控制在20－30度在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測(cè)定樣品時(shí)的pH要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。第三節(jié)氨基酸定量測(cè)定氨基酸的定量測(cè)定包括總量測(cè)定及不同氨基酸的分離測(cè)定總量測(cè)定方法包括甲醛滴定法、電位滴定法、茚三酮比色法（一）甲醛滴定法1.原理：氨基酸本身有堿性NH2基，又有酸性COOH基，成中性內(nèi)鹽，加入甲醛溶液后，與NH2基結(jié)合，堿性消失，可用強(qiáng)堿滴定COOH基。即不加入甲醛時(shí)，滴定的酸是氨基酸以外的酸；而加入甲醛后，滴定的是包含氨基酸羧基在內(nèi)的所有酸；由兩次滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)堿計(jì)算氨基酸的摩爾數(shù)，轉(zhuǎn)換為氨基酸態(tài)氮的百分含量。2．特點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單、快速，適用于發(fā)酵工業(yè)測(cè)定發(fā)酵液氨基酸，了解發(fā)酵過(guò)程；也適于食品中游離氨基酸的測(cè)定，是GB18186-2000?e?ì?′óí1ú?ò±ê×?方法3、試劑①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將40%甲醛中和至淡藍(lán)色；②0.1%百里酚酞90％乙醇溶液9.4-10.6無(wú)色－藍(lán)色；③0.1%中性紅50%乙醇溶液，6.8-8.0，紅－黃澄，用于滴定背景酸；④0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。4．操作：移取含氨基酸約20－30mg的樣品兩份，分別置于250ml錐形瓶中，各加入50ml蒸餾水，兩份用不同指示劑，用相同的標(biāo)準(zhǔn)堿液滴定。①加入3滴中性紅指示劑，用氫氧化鈉直接滴定至由紅變?yōu)殓晟珵榻K點(diǎn)，滴定了樣液中其它酸性物質(zhì)。②加入3滴百里酚酞+20ml中性甲醛，搖勻靜置1分鐘，用標(biāo)準(zhǔn)堿液滴定至淡藍(lán)色，中和了樣液中氨基酸的羧基與其它酸性物質(zhì)的總和。由二次標(biāo)準(zhǔn)堿液體積之差可計(jì)算氨基酸含量。5、方法說(shuō)明此法適用于可溶性的游離氨基酸含量測(cè)定；對(duì)固體樣品，需準(zhǔn)確稱樣后，用水在50度萃取30分鐘，液體樣品可直接測(cè)