緒論代謝工程概述第1頁，共39頁。（優(yōu)選）緒論代謝工程概述第2頁，共39頁。本章內(nèi)容§1.1代謝工程的產(chǎn)生和概念的演變§1.2代謝工程的研究?jī)?nèi)容§1.3代謝工程的應(yīng)用領(lǐng)域和前景第3頁，共39頁。第一節(jié)代謝工程的產(chǎn)生和概念的演變現(xiàn)代生物技術(shù)手段主要包括基因工程(GeneEngineering)、細(xì)胞工程(CellEngineering)、發(fā)酵工程(FermentationEngineering)、酶工程(EnzymeEngineering)和生化工程(BiochemicalEngineering)，現(xiàn)代生物技術(shù)在化工、醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)林牧漁、輕工食品、能源和環(huán)境等領(lǐng)域都將發(fā)揮重要作用，可促進(jìn)傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的改造和新型產(chǎn)業(yè)的形成，對(duì)人類社會(huì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。其中發(fā)酵工程是生物技術(shù)的重要組成部分，是生物技術(shù)轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品的重要環(huán)節(jié)。20世紀(jì)90年代提出的代謝工程發(fā)展迅速，被視為繼傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)多肽單基因表達(dá)（第一代基因工程）、基因定向突變（第二代基因工程）之后的第三代基因工程。第4頁，共39頁。代謝研究的產(chǎn)生和發(fā)展歷史微生物發(fā)酵已經(jīng)有幾千年的歷史。早在2000年以前，人們就開始利用微生物進(jìn)行白酒、黃酒、清酒的發(fā)酵，此時(shí)的發(fā)酵為天然發(fā)酵時(shí)代。20世紀(jì)40年代，隨著抗生素青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)的大規(guī)模進(jìn)行，開始了現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)時(shí)代。通過自然選擇的方法，人們用10-6的突變幾率來篩選所謂的高產(chǎn)菌株。由于沒有代謝控制發(fā)酵理論作為指導(dǎo)，直到20世紀(jì)60年代現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)仍處于盲目階段。1957年，日本的木下等人開始了谷氨酸的發(fā)酵研究。隨著各國(guó)對(duì)代謝發(fā)酵理論的深入研究，許多國(guó)家轉(zhuǎn)向發(fā)酵菌株本身的研究，獲得了許多的氨基酸高產(chǎn)菌株。隨后，核酸類物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)菌也以代謝控制發(fā)酵理論為指導(dǎo)進(jìn)行選育，并奮起直追成為后起之秀。第5頁，共39頁。早期的代謝研究主要內(nèi)容*早期研究中側(cè)重應(yīng)用過程中采用的方法及所達(dá)到的目標(biāo)，通常是對(duì)細(xì)胞特定的代謝途徑進(jìn)行改造。**代謝控制發(fā)酵就是利用遺傳學(xué)的方法或生物化學(xué)方法，人為地在DNA分子水平上改變和控制微生物的代謝，使目的產(chǎn)物大量的生成、積累的發(fā)酵。代謝控制發(fā)酵的核心為：解除微生物代謝控制機(jī)制，打破微生物正常的代謝調(diào)節(jié)，人為地控制微生物的代謝。第6頁，共39頁。隨著代謝控制發(fā)酵理論的日臻完善，目前已發(fā)展出一個(gè)重要的研究分支——代謝工程。它是近年來分子生物學(xué)、生物化學(xué)、化學(xué)工程學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的發(fā)展與交差的產(chǎn)物，從而使生物技術(shù)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，使有關(guān)的研究進(jìn)入了細(xì)胞水平。從細(xì)胞的代謝途徑出發(fā)，運(yùn)用工程學(xué)原理進(jìn)行代謝調(diào)控，使之向產(chǎn)物積累的方向發(fā)展，由此創(chuàng)建了一個(gè)新興的領(lǐng)域，即“代謝工程”。第7頁，共39頁。途徑工程Pathwayengineering利用DNA重組技術(shù)修飾各種代謝途徑，提高特定代謝物的產(chǎn)量1988，Macquitty代謝工程Metabolicengineering利用DNA重組技術(shù)優(yōu)化細(xì)胞酶活、運(yùn)輸和調(diào)控功能，提高細(xì)胞活力1991，Bailey代謝途徑工程Metabolicpathwayengineering生化途徑的修飾、設(shè)計(jì)與構(gòu)建1991，Tongetal代謝工程Metabolicengineering利用DNA重組技術(shù)對(duì)代謝進(jìn)行目的性修飾1993，Cameron代謝工程/代謝設(shè)計(jì)Pathwayengineering/Metabolicdesign改造細(xì)胞代謝途徑，提高提高天然最終產(chǎn)物產(chǎn)量或合成新產(chǎn)物1994，pieperberg**代謝工程概念演變代謝工程Metabolicengineering對(duì)生化反應(yīng)的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行目的性修飾1994，Gregory代謝工程Metabolicengineering為達(dá)到所需目標(biāo)對(duì)活細(xì)胞的代謝途徑進(jìn)行修飾1996，william代謝工程Metabolicengineering利用分子生物學(xué)原理系統(tǒng)分析代謝途徑，設(shè)計(jì)合理的遺傳修飾戰(zhàn)略，從而優(yōu)化細(xì)胞生物學(xué)特性1999，koffasl第8頁，共39頁。**代謝工程的現(xiàn)代概念代謝工程也被人們成為“途徑工程”，它屬于基因工程的一個(gè)重要的分支。它應(yīng)用重組DNA技術(shù)和應(yīng)用分析生物學(xué)相關(guān)的遺傳手段，進(jìn)行有精確目標(biāo)的遺傳操作，改變酶的功能輸送體系的功能，以改進(jìn)細(xì)胞某些方面的代謝活性的整套操作（包括代謝分析、代謝設(shè)計(jì)、遺傳操作、目的代謝活性的實(shí)現(xiàn)）是一種生物化學(xué)反應(yīng)代謝網(wǎng)絡(luò)有目的的修飾。第9頁，共39頁。代謝工程的一些基本定義底物：培養(yǎng)基質(zhì)中的化合物，是能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝或直接利用構(gòu)成細(xì)胞組分。碳源、氮源、能源物質(zhì)以及滿足細(xì)胞功能必須的各種礦物質(zhì)元素均屬于細(xì)胞代謝的底物。代謝產(chǎn)物：由細(xì)胞合成的化合物，可以是初級(jí)代謝產(chǎn)物（二氧化碳、乙醇等），也可以是次級(jí)代謝產(chǎn)物或者蛋白質(zhì)。生物基質(zhì)要素：構(gòu)成生物質(zhì)大分子池的一類物質(zhì)，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)等第10頁，共39頁。代謝工程的一些基本定義代謝流和碳骨架物質(zhì)流：代謝物在代謝途徑中流動(dòng)形成代謝流。在代謝工程領(lǐng)域代謝流往往是指骨架物質(zhì)流。代謝主流：在一定的培養(yǎng)條件下，代謝物再代謝網(wǎng)絡(luò)中流動(dòng)，流量相對(duì)集中的代謝流叫做該條件下的代謝主流。代謝途徑的延伸和改變都會(huì)改變代謝主流，從而實(shí)現(xiàn)新基質(zhì)的利用和新產(chǎn)品的開發(fā)。代謝主流的測(cè)定是代謝工程的重要組成部分。第11頁，共39頁。代謝工程的一些基本定義載流途經(jīng)：代謝主流流經(jīng)的代謝途徑為主要載流途經(jīng)，簡(jiǎn)稱載流途經(jīng)。在代謝工程研究中載流途經(jīng)是指碳流在代謝網(wǎng)絡(luò)中通過的主要途徑。代謝主流的變動(dòng)性和選擇性：生物細(xì)胞的代謝主流處于不斷的變化之中，其方向、流量甚至代謝主流的載流途經(jīng)都可能發(fā)生變化。這就是代謝主流的變動(dòng)性和代謝主流對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)途徑的選擇性。這種變動(dòng)和選擇的根據(jù)在于生物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，選擇的原因在于細(xì)胞所處的環(huán)境條件的變化。第12頁，共39頁。代謝工程的一些基本定義代謝途徑定義為：一連串可以進(jìn)行的并可觀測(cè)的生物化學(xué)反應(yīng)步驟，這些反應(yīng)步驟是以指定的一組輸入和輸出代謝物所連結(jié)。第13頁，共39頁。代謝工程的一些基本定義代謝網(wǎng)絡(luò)：在代謝過程中,通過特定的生物化學(xué)反應(yīng),一些物質(zhì)被分解,從而為基本的生命過程提供能量,同時(shí)合成另一些生命所必需的物質(zhì)。發(fā)生在某物種的活細(xì)胞內(nèi)所有代謝反應(yīng)構(gòu)成了此物種的代謝網(wǎng)絡(luò)。對(duì)蛋白質(zhì)層次的代謝網(wǎng)絡(luò)來說，一個(gè)代謝物分子就是一個(gè)節(jié)點(diǎn)，而節(jié)點(diǎn)之間的連結(jié)則是生化反應(yīng)。大部分的分子只參加一種或兩種反應(yīng)，但少數(shù)分子參與許多反應(yīng)，它們實(shí)際上就是代謝流的集散中心或通用代謝物第14頁，共39頁。代謝工程的一些基本定義代謝通量定義為：輸入代謝物反應(yīng)生成輸出代謝物的速率。胞內(nèi)代謝通量的確定稱為代謝通量分析（metabolicfluxanalysis，MFA），其在代謝工程處于中心地位。第15頁，共39頁。代謝工程的一些基本定義代謝控制分析(MCA)

*ＭetabolicControlAnalysis，簡(jiǎn)稱ＭＣＡ

代謝工程的一個(gè)主要目標(biāo)就是對(duì)代謝通量控制的理解。其是通過途徑中酶的活性、代謝物、效應(yīng)物和其它參數(shù)所施加的通量控制程度進(jìn)行定量表述。

代謝控制的關(guān)鍵參數(shù)確定以后，人們需要實(shí)施這些變化從而最有效地達(dá)到預(yù)定目標(biāo)。在實(shí)施通量控制的策略中，無論采用哪種路線，為獲得最佳的結(jié)果，都應(yīng)將基因修飾和環(huán)境條件改變結(jié)合起來使用。

第16頁，共39頁。第二節(jié)代謝工程的研究?jī)?nèi)容代謝工程的實(shí)質(zhì)在于對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行定量分析，并且在此基礎(chǔ)上進(jìn)行代謝改造（代謝網(wǎng)絡(luò)重組），以最大限度地提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率。主要內(nèi)容：生物合成相關(guān)代謝調(diào)控和代謝網(wǎng)絡(luò)理論代謝流的定量分析代謝網(wǎng)絡(luò)的重新設(shè)計(jì)中心代謝作用機(jī)理及相關(guān)代謝分析基因操作第17頁，共39頁。代謝工程研究的目的通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建具有能合成目標(biāo)產(chǎn)物的代謝網(wǎng)絡(luò)或具有高產(chǎn)能力的工程菌(細(xì)胞株、生物個(gè)體)并用于生產(chǎn)是代謝工程研究的主要目的。第18頁，共39頁。代謝網(wǎng)絡(luò)理論代謝網(wǎng)絡(luò)理論是把細(xì)胞的生化反應(yīng)以網(wǎng)絡(luò)整體而不是孤立地考慮。細(xì)胞代謝的網(wǎng)絡(luò)由上萬種酶催化的系列反應(yīng)系統(tǒng)、膜傳遞系統(tǒng)、信號(hào)傳遞系統(tǒng)組成，并且既受精密調(diào)節(jié)，又彼此互相協(xié)調(diào)。代謝網(wǎng)絡(luò)理論是代謝工程研究的基礎(chǔ)第19頁，共39頁。代謝分析代謝分析是代謝工程的重要組成部分，它涉及代謝流的定量和定向、研究細(xì)胞內(nèi)代謝物濃度的反應(yīng)工程方法以及細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)流分析等第20頁，共39頁。代謝工程的實(shí)質(zhì)代謝工程最重要的貢獻(xiàn)在于其強(qiáng)調(diào)在胞內(nèi)條件下代謝通量及其調(diào)控。

代謝工程的實(shí)質(zhì)是：將通量及其控制進(jìn)行量化的方法與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，用以執(zhí)行所建議的基因修飾任務(wù)。當(dāng)反復(fù)利用代謝工程方法時(shí)，它就為在很廣范圍內(nèi)系統(tǒng)改進(jìn)細(xì)胞的性質(zhì)提供了一種強(qiáng)有力的方法。通量是細(xì)胞生理學(xué)的一個(gè)基本決定因素，也是代謝途徑中最重要的參數(shù)。

第21頁，共39頁。代謝工程與隨機(jī)誘變的區(qū)別盡管定向性從某種意義上來講是所有菌種改進(jìn)工作的固有特性，但是代謝工程與隨機(jī)誘變相比，其工作焦點(diǎn)致力于定向性，以致其在目標(biāo)酶的選擇、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及數(shù)據(jù)分析等方面都起著重要的作用。另一方面，細(xì)胞的定向改進(jìn)應(yīng)解釋為合理的途徑設(shè)計(jì)與修飾，因此在這個(gè)意義上說，代謝工程與隨機(jī)誘變是完全不同的。實(shí)際上,通過隨機(jī)誘變而得到的性能優(yōu)良的菌株能夠作為關(guān)于途徑結(jié)構(gòu)與控制方面重要信息的來源，這可經(jīng)由反向代謝工程獲取。第22頁，共39頁。代謝工程也包括兩個(gè)明確的步驟：即分析與合成。因?yàn)榇x工程是隨著DNA重組而出現(xiàn)的可行技術(shù)，所以最初代謝工程幾乎都集中于這個(gè)領(lǐng)域的合成方面:如在各種宿主細(xì)胞中新基因的表達(dá)、內(nèi)源酶的擴(kuò)增、基因的缺失或酶活性的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄的或酶的解除調(diào)控等。因此，代謝工程在很大程度上曾是應(yīng)用分子生物學(xué)的技術(shù)體現(xiàn)，而很少帶有工程方面的內(nèi)容。第23頁，共39頁。*代謝工程的主要特征代謝工程的主要特征就是利用DNA重組技術(shù)，重建代謝網(wǎng)絡(luò)，改變代謝流及分支代謝速度，以改進(jìn)代謝產(chǎn)物及蛋白類產(chǎn)品，由于外源DNA的引入擴(kuò)展了固有的代謝途徑，獲得了新的化學(xué)物質(zhì)。改變轉(zhuǎn)化蛋白的過程，減少不必要的廢物。第24頁，共39頁。**代謝工程研究的主要問題提高細(xì)胞已有的代謝途徑中天然產(chǎn)物的產(chǎn)量改變細(xì)胞已有代謝途徑，合成新產(chǎn)物對(duì)不同細(xì)胞的代謝途徑進(jìn)行整合，構(gòu)建全新的代謝途徑優(yōu)化細(xì)胞的生物學(xué)特性，如生長(zhǎng)速率、耐受性等。第25頁，共39頁。代謝工程的研究手段1.采用遺傳學(xué)手段的遺傳操作（1）基因工程技術(shù)的應(yīng)用（2）常規(guī)誘變技術(shù)的應(yīng)用2.生物合成途徑的代謝調(diào)控（1）生物合成中間產(chǎn)物的定量生物測(cè)定（2）共合成法在生物合成中的應(yīng)用（3）酶的誘導(dǎo)合成和分解代謝產(chǎn)物阻遏（4）無機(jī)磷對(duì)生物合成的調(diào)節(jié)3.研究生物合成機(jī)制的常用方法（1）刺激實(shí)驗(yàn)法（2）同位素示蹤法（3）洗滌菌絲懸浮法（4）無細(xì)胞抽提法（5）遺傳特性誘變法第26頁，共39頁。代謝工程的研究方法1分子生物學(xué)方法：構(gòu)建特殊的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，尤其對(duì)于具有較高生產(chǎn)價(jià)值的微生物，具有重要意義。例如Backman等利用切割載體獲得Tyr營(yíng)養(yǎng)突變型，為構(gòu)建苯丙氨酸的生產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)。2分析化學(xué)及檢測(cè)方法：代謝工程的研究對(duì)象是代謝途徑，因此必須對(duì)代謝通路中的一些酶及產(chǎn)物進(jìn)行研究和分析。傳統(tǒng)的分析通路阻斷的手段有：物質(zhì)平衡、同位素標(biāo)記、分析障礙突變體等，目前它們?nèi)匀皇潜夭豢缮俚氖侄?，而核磁共振、流氏?xì)胞術(shù)的應(yīng)用則為這一領(lǐng)域的發(fā)展增添了新的活力。3數(shù)學(xué)及計(jì)算機(jī)工具：研究代謝工程不僅需要遺傳學(xué)知識(shí)，而且需要對(duì)宿主菌的生化代謝途徑和生理學(xué)有深入的理解，所以將DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的信息應(yīng)用于代謝工程并開發(fā)出適合的軟件系統(tǒng)是十分必要的，Karp等構(gòu)建了981個(gè)生命體化合物數(shù)據(jù)庫(kù)，為未來的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。人們已在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合數(shù)學(xué)和化學(xué)的理論，發(fā)展了一些人工智能程序。第27頁，共39頁。代謝工程的基本過程 1、代謝分析與代謝設(shè)計(jì)：代謝工程的研究對(duì)象是代謝途徑，因此必須對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)中的一些酶及產(chǎn)物進(jìn)行研究和分析。根據(jù)代謝流的分析確定代謝設(shè)計(jì)的合理靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)合適的代謝工程操作手段，對(duì)于靶點(diǎn)進(jìn)行改造，達(dá)到改造代謝的目的。第28頁，共39頁。代謝工程的基本過程2、基因操作：代謝改造的核心是在分子水平上對(duì)于靶基因或基因簇進(jìn)的克隆、表達(dá)、修飾、敲除、調(diào)控、構(gòu)建特殊的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)以及重組基因在細(xì)胞染色體DNA上的穩(wěn)定整合。第29頁，共39頁。代謝工程的基本過程3、效果分析：通常一次性的代謝設(shè)計(jì)和基因操作往往不能達(dá)到實(shí)際生產(chǎn)所要求的產(chǎn)量、速率或濃度。因此對(duì)于一次代謝改造的效果分析，得到本次操作的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)數(shù)據(jù)，改進(jìn)缺陷，綜合優(yōu)勢(shì)，進(jìn)行下一次代謝改造，經(jīng)過不斷的改造和分析，可以得到好的結(jié)果。第30頁，共39頁。代謝工程的三個(gè)基本觀點(diǎn)隨著生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、應(yīng)用分子生物學(xué)、遺傳工程和代謝工程的發(fā)展，工業(yè)發(fā)酵正在經(jīng)歷一個(gè)從技藝到科學(xué)的重大變化，正在向微生物生物工程過渡。在生物工程受到廣泛重視的今天，有必要把微生物(菌種選育)、微生物學(xué)過程(發(fā)酵工藝)和微生物學(xué)體系(生物反應(yīng)器)作為一個(gè)整體，在科學(xué)的水平上對(duì)工業(yè)發(fā)酵進(jìn)行重新審視。第31頁，共39頁。

代謝工程的三個(gè)基本觀點(diǎn)從工業(yè)發(fā)酵的現(xiàn)狀出發(fā)，主要根據(jù)對(duì)碳元素代謝及其控制，菌種是化能異養(yǎng)型微生物，產(chǎn)物是微生物細(xì)胞排出細(xì)胞的代謝中間產(chǎn)物的工業(yè)發(fā)酵，提出了3個(gè)基本觀點(diǎn)。第32頁，共39頁。 **代謝工程的三個(gè)基本觀點(diǎn)1．1 生物能支撐觀點(diǎn)微生物細(xì)胞是工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)者，微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)和維持需要由其自身的能量轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)或從其他形式的能量轉(zhuǎn)化形成的生物能來支撐。因此，工業(yè)發(fā)酵具有生物學(xué)屬性。1．2 代謝網(wǎng)絡(luò)觀點(diǎn)由生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)和跨輸送步驟組成的代謝網(wǎng)絡(luò)既沒有絕對(duì)的起點(diǎn)，也沒有絕對(duì)的終點(diǎn)。代謝網(wǎng)絡(luò)中任何一種中間產(chǎn)物(或可借助生物學(xué)、化學(xué)方法與代謝網(wǎng)絡(luò)聯(lián)網(wǎng)的任何一種化合物)都可能被開發(fā)成為工業(yè)發(fā)酵的目的產(chǎn)物或原料。1．3 細(xì)胞經(jīng)濟(jì)觀點(diǎn)微生物細(xì)胞的經(jīng)濟(jì)性是在自然選擇的過程中逐漸形成的。野生的(未經(jīng)人工變異的)微生物細(xì)胞在自然選擇的過程中逐漸形成競(jìng)爭(zhēng)型的細(xì)胞經(jīng)濟(jì)。而工業(yè)發(fā)酵往往要以目的產(chǎn)物的生產(chǎn)為主導(dǎo)，調(diào)整代謝網(wǎng)絡(luò)中的代謝流，構(gòu)建一種導(dǎo)向型細(xì)胞經(jīng)濟(jì)。從競(jìng)爭(zhēng)型細(xì)胞經(jīng)濟(jì)的轉(zhuǎn)變?nèi)Q于遺傳和環(huán)境因素的信息導(dǎo)向，這種導(dǎo)向必須遵循細(xì)胞經(jīng)濟(jì)的基本運(yùn)行規(guī)律。第33頁，共39頁。代謝工程研究的設(shè)計(jì)思路在具體的設(shè)計(jì)和操作中,一般從以下方面著手:1)提高通向目標(biāo)產(chǎn)物的代謝流;2)擴(kuò)展代謝途徑;3)構(gòu)建新的代謝途徑。提高通向目標(biāo)產(chǎn)物的代謝流的手段通常有:a、增強(qiáng)催化限速反應(yīng)的酶的表達(dá)量或活性,從而提