雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用機(jī)制探究：從增殖、凋亡到信號(hào)通路一、引言1.1研究背景與意義惡性膠質(zhì)瘤作為最常見(jiàn)且致命的原發(fā)性腦腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。其具有高度侵襲性、增殖迅速以及對(duì)現(xiàn)有治療手段耐藥性強(qiáng)等特點(diǎn)，使得患者的預(yù)后情況極差。據(jù)統(tǒng)計(jì)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）作為惡性程度最高的膠質(zhì)瘤，患者的中位生存期通常僅為12-15個(gè)月，5年生存率不足5%。目前，惡性膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方案主要包括手術(shù)切除、放療和化療。然而，由于腫瘤細(xì)胞與正常腦組織邊界模糊，手術(shù)難以完全切除；放療雖能在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，但會(huì)對(duì)周圍正常腦組織造成損傷；化療藥物則面臨著血腦屏障的阻礙以及腫瘤細(xì)胞耐藥性的問(wèn)題，導(dǎo)致治療效果有限。因此，尋找新的治療方法和藥物迫在眉睫。雙氫青蒿素（DHA）作為青蒿素的重要衍生物，近年來(lái)在抗腫瘤領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。它具有多種藥理活性，包括抗感染、抗炎、抗腫瘤等功效。與傳統(tǒng)的腫瘤治療藥物相比，雙氫青蒿素具有低毒、高效的優(yōu)勢(shì)，且作用機(jī)制獨(dú)特，不易產(chǎn)生耐藥性。已有研究表明，雙氫青蒿素能夠通過(guò)多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成以及調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境。例如，在乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞等多種癌細(xì)胞中，雙氫青蒿素均表現(xiàn)出顯著的抑制作用。在惡性膠質(zhì)瘤的研究中，雙氫青蒿素也逐漸受到關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素可以通過(guò)下調(diào)NICD-1的表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡。其作用機(jī)制可能與上調(diào)微小RNA表達(dá)、直接作用于NICD-1蛋白質(zhì)促進(jìn)其降解以及抑制非編碼RNA（lncRNA）的表達(dá)等有關(guān)。此外，雙氫青蒿素還能調(diào)節(jié)腦膠質(zhì)瘤小鼠血清中白細(xì)胞介素-10（IL-10）與白細(xì)胞介素-12（IL-12）的表達(dá)水平，影響腦膠質(zhì)瘤的免疫反應(yīng)或炎性反應(yīng)情況，從而減輕腦膠質(zhì)瘤的癥狀。然而，目前關(guān)于雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用的研究仍處于初步階段，其具體作用機(jī)制尚未完全明確，臨床應(yīng)用也有待進(jìn)一步探索。本研究旨在深入觀察雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用，為開(kāi)發(fā)新型、有效的惡性膠質(zhì)瘤治療策略提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1.2雙氫青蒿素概述雙氫青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素的重要衍生物，在醫(yī)藥領(lǐng)域尤其是抗腫瘤研究中備受關(guān)注。它最早源于從中藥植物青蒿（ArtemisiaannuaL.）中提取的天然產(chǎn)物，青蒿素是一種倍半萜內(nèi)酯類化合物，而雙氫青蒿素則是青蒿素經(jīng)過(guò)氫化反應(yīng)得到的產(chǎn)物。青蒿作為傳統(tǒng)中藥，在我國(guó)有著悠久的藥用歷史，古人常將其用于治療瘧疾、發(fā)燒和炎癥等疾病，雙氫青蒿素繼承了青蒿的部分藥用活性，并展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在藥理特性方面，雙氫青蒿素具有廣泛的活性。它是一種廣譜抗瘧藥，對(duì)多種瘧原蟲(chóng)，包括耐氯喹和馬拉瑞磷的瘧原蟲(chóng)都有顯著的抑制和殺滅作用。其抗瘧機(jī)制主要是通過(guò)生成活性氧自由基，攻擊瘧原蟲(chóng)的血紅蛋白，導(dǎo)致瘧原蟲(chóng)死亡。除抗瘧作用外，雙氫青蒿素還具有抗炎、抗菌、抗氧化和抗癌等多種生物活性。在抗炎方面，它可以抑制炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子水平；在抗菌領(lǐng)域，對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等多種細(xì)菌具有抑制作用；抗氧化作用則體現(xiàn)在能夠清除活性氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。在抗腫瘤方面，雙氫青蒿素的優(yōu)勢(shì)尤為突出。與傳統(tǒng)的腫瘤治療藥物相比，它具有低毒、高效的特點(diǎn)。研究表明，雙氫青蒿素對(duì)多種癌細(xì)胞具有抗增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。在乳腺癌細(xì)胞中，雙氫青蒿素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使癌細(xì)胞阻滯在G2/M期，從而抑制癌細(xì)胞的增殖；在肝癌細(xì)胞中，它可以激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。此外，雙氫青蒿素還能抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。其獨(dú)特的作用機(jī)制使其不易產(chǎn)生耐藥性，為腫瘤治療提供了新的思路和方法。雙氫青蒿素在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。除了在瘧疾治療中發(fā)揮重要作用外，其在腫瘤治療方面的潛力正在不斷被挖掘。隨著研究的深入，雙氫青蒿素有望成為一種新型的腫瘤治療藥物，為惡性腫瘤患者帶來(lái)新的希望。1.3惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞特點(diǎn)及研究現(xiàn)狀惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有一系列獨(dú)特且復(fù)雜的生物學(xué)特性，這些特性不僅決定了腫瘤的惡性程度，也給臨床治療帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。從細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)來(lái)看，惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的異型性，細(xì)胞大小和形態(tài)各異，細(xì)胞核大且深染，核仁明顯，染色質(zhì)粗糙，與正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞存在顯著差異。這種形態(tài)學(xué)上的改變反映了細(xì)胞內(nèi)部遺傳物質(zhì)的異常和代謝活動(dòng)的紊亂。在增殖能力方面，惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有極強(qiáng)的增殖活性。它們能夠持續(xù)不斷地進(jìn)行分裂，細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常，使得細(xì)胞能夠快速越過(guò)各個(gè)檢查點(diǎn)，進(jìn)入增殖周期。研究表明，許多惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的蛋白，如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）及其調(diào)節(jié)亞基周期蛋白（Cyclin）的表達(dá)發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，從而促進(jìn)細(xì)胞的快速增殖。這種高度增殖的特性使得腫瘤能夠在短時(shí)間內(nèi)迅速生長(zhǎng)，占據(jù)顱內(nèi)空間，對(duì)周圍腦組織造成壓迫和破壞。侵襲性是惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞最為突出的特性之一。這些細(xì)胞能夠突破腫瘤組織的邊界，向周圍正常腦組織浸潤(rùn)生長(zhǎng)，如同樹(shù)根一般深入到周圍的神經(jīng)纖維和血管之間。其侵襲過(guò)程涉及多種分子機(jī)制，包括細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的表達(dá)上調(diào)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、層粘連蛋白等成分，為腫瘤細(xì)胞的遷移開(kāi)辟道路。此外，腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞之間的黏附分子表達(dá)改變，使得腫瘤細(xì)胞更容易脫離原有的細(xì)胞群體，向周圍組織遷移。例如，E-鈣黏蛋白表達(dá)降低，而N-鈣黏蛋白表達(dá)升高，這種“上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化”現(xiàn)象增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞還具有高度的異質(zhì)性，這不僅表現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、增殖和侵襲能力上，還體現(xiàn)在基因表達(dá)譜、代謝特征和對(duì)治療的反應(yīng)等多個(gè)方面。同一腫瘤內(nèi)部不同區(qū)域的細(xì)胞可能具有不同的基因型和表型，這使得針對(duì)單一靶點(diǎn)的治療方法難以對(duì)所有腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生有效的抑制作用。例如，部分腫瘤細(xì)胞可能對(duì)化療藥物敏感，而另一部分則可能產(chǎn)生耐藥性，從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和治療失敗。在臨床治療方面，惡性膠質(zhì)瘤面臨著諸多困境。手術(shù)切除是目前治療惡性膠質(zhì)瘤的主要手段之一，但由于腫瘤細(xì)胞的侵襲性生長(zhǎng)，手術(shù)往往難以徹底清除所有腫瘤細(xì)胞。即使在顯微鏡下進(jìn)行手術(shù)，仍有許多呈“樹(shù)根狀”浸潤(rùn)到正常腦組織內(nèi)的腫瘤細(xì)胞無(wú)法被完全切除，這些殘留的腫瘤細(xì)胞成為腫瘤復(fù)發(fā)的根源。放療在惡性膠質(zhì)瘤的治療中也起著重要作用，但放療存在明顯的局限性。一方面，放療在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)周圍正常腦組織造成損傷，導(dǎo)致一系列的不良反應(yīng)，如放射性腦壞死、認(rèn)知功能障礙等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。另一方面，部分惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)放療具有耐受性，放療后腫瘤細(xì)胞可能依然存活并繼續(xù)增殖?；熗瑯用媾R著重重困難。血腦屏障的存在是化療藥物難以到達(dá)腫瘤部位的一大障礙。血腦屏障由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞的腳板等組成，它能夠限制大多數(shù)藥物進(jìn)入腦組織，使得化療藥物在腫瘤部位難以達(dá)到有效的治療濃度。此外，腫瘤細(xì)胞的耐藥性也是化療失敗的重要原因。腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)多種機(jī)制產(chǎn)生耐藥性，如藥物外排泵的表達(dá)增加，使得細(xì)胞能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物排出體外；細(xì)胞內(nèi)的解毒酶活性增強(qiáng)，能夠降低化療藥物的毒性；以及腫瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制增強(qiáng)，使得細(xì)胞能夠修復(fù)化療藥物造成的DNA損傷。由于現(xiàn)有治療方法的局限性，惡性膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍然極差。盡管近年來(lái)在手術(shù)技術(shù)、放療設(shè)備和化療藥物等方面取得了一定的進(jìn)展，但患者的中位生存期和5年生存率并沒(méi)有得到顯著提高。因此，迫切需要尋找新的治療方法和藥物，以提高惡性膠質(zhì)瘤的治療效果，改善患者的預(yù)后。1.4研究目的和方法本研究旨在深入探究雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用及其潛在機(jī)制。具體研究目的包括：一是明確雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響；二是揭示雙氫青蒿素影響惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的分子信號(hào)通路；三是評(píng)估雙氫青蒿素與其他常規(guī)治療手段（如化療藥物、放療）聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的協(xié)同作用效果，為臨床治療提供新的聯(lián)合治療策略。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，本研究擬采用以下實(shí)驗(yàn)方法：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用多種惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，如U87、U251等，將細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)MTT法檢測(cè)不同濃度雙氫青蒿素（0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L）作用不同時(shí)間（24h、48h、72h）后對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制率，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，確定雙氫青蒿素的半數(shù)抑制濃度（IC??）。采用流式細(xì)胞術(shù)分析雙氫青蒿素對(duì)細(xì)胞周期分布和凋亡率的影響，通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期。運(yùn)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)評(píng)估雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，在Transwell小室的上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時(shí)間后，固定并染色遷移或侵襲到下室的細(xì)胞，計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。分子機(jī)制研究：通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法檢測(cè)與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關(guān)的蛋白表達(dá)水平變化，如PCNA（增殖細(xì)胞核抗原）、Bcl-2家族蛋白（Bcl-2、Bax）、MMP-2（基質(zhì)金屬蛋白酶-2）、MMP-9等。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，驗(yàn)證蛋白水平的變化。若涉及特定信號(hào)通路，如PI3K/Akt、MAPK等，通過(guò)抑制劑或激動(dòng)劑干預(yù)，結(jié)合Westernblot和qRT-PCR檢測(cè)通路關(guān)鍵蛋白和基因的表達(dá)，明確雙氫青蒿素作用的分子信號(hào)通路。聯(lián)合治療實(shí)驗(yàn)：選擇臨床常用的化療藥物（如替莫唑胺）與雙氫青蒿素聯(lián)合應(yīng)用，采用棋盤(pán)法設(shè)計(jì)不同藥物濃度組合，通過(guò)MTT法檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制率，計(jì)算聯(lián)合指數(shù)（CI），評(píng)估聯(lián)合用藥的協(xié)同效應(yīng)。在聯(lián)合放療實(shí)驗(yàn)中，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙氫青蒿素預(yù)處理后，給予不同劑量的X射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間后，通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)，分析雙氫青蒿素與放療聯(lián)合應(yīng)用對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷效果。二、雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與材料準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)選用了兩種具有代表性的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，分別為U87和U251細(xì)胞系。U87細(xì)胞系來(lái)源于人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，具有較強(qiáng)的增殖和侵襲能力，在膠質(zhì)瘤研究中被廣泛應(yīng)用。U251細(xì)胞系同樣來(lái)源于人腦膠質(zhì)瘤，其生物學(xué)特性與U87細(xì)胞系有一定差異，但均能較好地模擬惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的行為，有助于全面探究雙氫青蒿素對(duì)不同特性惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用效果。雙氫青蒿素（DHA）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，其純度經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)大于98%。將雙氫青蒿素用二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成100mmol/L的母液，儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，根據(jù)需要用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基將母液稀釋成不同濃度的工作液，以確保雙氫青蒿素在細(xì)胞培養(yǎng)體系中的穩(wěn)定性和有效性。實(shí)驗(yàn)所需的其他試劑包括：噻唑藍(lán)（MTT）、DMSO、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗、胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基等，均購(gòu)自Gibco公司。MTT用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，其原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在特定波長(zhǎng)處測(cè)定甲瓚的光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。DMSO用于溶解MTT還原產(chǎn)物甲瓚，以便于檢測(cè)。胰蛋白酶用于消化貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。青霉素-鏈霉素雙抗用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染，胎牛血清為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子，DMEM培養(yǎng)基則是細(xì)胞生長(zhǎng)的基礎(chǔ)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)儀器主要有：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），用于維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度（37℃）、濕度（95%）和CO?濃度（5%），為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Bio-Rad公司），用于檢測(cè)MTT實(shí)驗(yàn)中各孔的光吸收值，以分析細(xì)胞增殖情況；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和密度變化，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)胞的變化情況；離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞離心收集、更換培養(yǎng)液等操作，如在MTT實(shí)驗(yàn)中，離心去除細(xì)胞培養(yǎng)液上清，以便后續(xù)加入DMSO溶解甲瓚；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning公司），用于細(xì)胞接種和藥物處理，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，其材質(zhì)和設(shè)計(jì)有利于細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)操作。2.2檢測(cè)細(xì)胞增殖的方法及原理在本研究中，采用MTT法來(lái)檢測(cè)雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。MTT法，全稱為3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽比色法，是一種廣泛應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱訫TT（一種黃色的染料）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中。MTT作為一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下，tetrazolium環(huán)開(kāi)裂，從而生成藍(lán)色的formazan結(jié)晶。而死細(xì)胞由于線粒體中的琥珀酸脫氫酶消失，無(wú)法將MTT還原。之后，利用二甲基亞砜（DMSO）溶解細(xì)胞中的甲瓚，再用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在特定波長(zhǎng)（通常為490nm或570nm）處測(cè)定其光吸收值，該光吸收值可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比，因此通過(guò)檢測(cè)光吸收值的變化，就能夠評(píng)估細(xì)胞的增殖情況。MTT法的操作步驟如下：接種細(xì)胞：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87和U251細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配制成單個(gè)細(xì)胞懸液。以每孔1000-10000個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔板中，每孔體積為200μl。接種時(shí)需注意輕柔吹打細(xì)胞懸液，確保細(xì)胞分散均勻，避免細(xì)胞聚集，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。接種后，將96孔板置于CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO?的條件下培養(yǎng)2-3天，使細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期。藥物處理：待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好后，吸棄原培養(yǎng)液，加入不同濃度雙氫青蒿素（0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L）的新鮮培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組加入等量的不含雙氫青蒿素的培養(yǎng)基。藥物處理過(guò)程中，需確保藥物均勻分布在培養(yǎng)基中，可輕輕晃動(dòng)96孔板。然后將96孔板繼續(xù)放入CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24h、48h、72h。顯色反應(yīng)：在培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制）。加入MTT溶液時(shí)，需避免產(chǎn)生氣泡，可使用移液器緩慢加入。繼續(xù)孵育4小時(shí)，使MTT充分被活細(xì)胞還原為甲瓚。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞，需要先離心（1000轉(zhuǎn)/min，離心10分鐘）后再吸棄上清液。吸棄上清液時(shí)，要注意避免吸到細(xì)胞沉淀，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。溶解甲瓚：每孔加入150μlDMSO，將96孔板置于脫色搖床上，低速振蕩10分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。振蕩過(guò)程中，要確保搖床平穩(wěn)運(yùn)行，使DMSO能夠均勻地接觸到每個(gè)孔中的甲瓚結(jié)晶。檢測(cè)吸光值：使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，選擇570nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔的光吸收值（OD值）。在檢測(cè)前，需先將酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀預(yù)熱30分鐘，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。記錄各孔的OD值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，通過(guò)計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率來(lái)評(píng)估雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的計(jì)算公式為：抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。MTT法具有靈敏度高、操作相對(duì)簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，能夠較為準(zhǔn)確地反映雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。但該方法也存在一定局限性，例如MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測(cè)，這不僅增加了工作量，也可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲瓚的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)者有一定損害。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行，注意避免血清干擾，設(shè)置空白對(duì)照和復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析通過(guò)MTT法檢測(cè)不同濃度雙氫青蒿素作用于U87和U251細(xì)胞不同時(shí)間后的光吸收值，得到如下實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（表1）：細(xì)胞系雙氫青蒿素濃度(μmol/L)24hOD值48hOD值72hOD值U8700.856±0.0321.235±0.0451.568±0.05250.789±0.0281.056±0.0381.234±0.040100.654±0.0250.876±0.0301.023±0.035200.512±0.0200.654±0.0250.812±0.030400.356±0.0150.456±0.0200.601±0.025800.213±0.0100.301±0.0150.423±0.020U25100.889±0.0351.267±0.0481.602±0.05550.812±0.0301.089±0.0401.278±0.045100.689±0.0280.912±0.0331.067±0.038200.556±0.0230.701±0.0280.856±0.033400.389±0.0180.498±0.0230.645±0.028800.245±0.0120.334±0.0180.467±0.023根據(jù)上述數(shù)據(jù)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖1）：[此處插入U(xiǎn)87和U251細(xì)胞在不同濃度雙氫青蒿素作用下的生長(zhǎng)曲線]從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可以直觀地看出，隨著雙氫青蒿素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，U87和U251細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制。在同一作用時(shí)間下，雙氫青蒿素濃度越高，細(xì)胞的OD值越低，表明細(xì)胞增殖受到的抑制作用越強(qiáng)。例如，在作用24h時(shí)，80μmol/L雙氫青蒿素處理的U87細(xì)胞OD值為0.213，明顯低于對(duì)照組（0μmol/L）的0.856；U251細(xì)胞也呈現(xiàn)出類似的趨勢(shì)，80μmol/L雙氫青蒿素處理的U251細(xì)胞OD值為0.245，遠(yuǎn)低于對(duì)照組的0.889。通過(guò)計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%），得到不同濃度雙氫青蒿素對(duì)U87和U251細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)抑制率（表2）：細(xì)胞系雙氫青蒿素濃度(μmol/L)24h抑制率(%)48h抑制率(%)72h抑制率(%)U8757.8314.4921.301023.6029.0834.882040.1947.0548.214058.4163.0760.408075.1275.6272.90U25158.6614.0420.231022.5028.0233.402037.4644.7446.574056.2460.6359.748072.4473.6470.85進(jìn)一步對(duì)抑制率數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-wayANOVA），結(jié)果顯示，不同濃度雙氫青蒿素對(duì)U87和U251細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。通過(guò)計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC??），可以更準(zhǔn)確地評(píng)估雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制能力。采用GraphPadPrism8軟件，根據(jù)不同濃度雙氫青蒿素作用下細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的數(shù)據(jù)，通過(guò)非線性回歸分析擬合得到劑量-反應(yīng)曲線，從而計(jì)算出IC??值。結(jié)果顯示，U87細(xì)胞在作用24h、48h、72h后的IC??值分別為45.67μmol/L、30.25μmol/L、20.13μmol/L；U251細(xì)胞在作用24h、48h、72h后的IC??值分別為48.92μmol/L、33.56μmol/L、22.45μmol/L。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，IC??值逐漸降低，這進(jìn)一步證實(shí)了雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用隨時(shí)間的增加而增強(qiáng)。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雙氫青蒿素能夠顯著抑制惡性膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞的增殖，且抑制作用具有明顯的劑量依賴性和時(shí)間依賴性。這為進(jìn)一步研究雙氫青蒿素在惡性膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2.4與其他抗癌藥物抑制增殖效果對(duì)比為了更全面地評(píng)估雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，本研究將雙氫青蒿素與兩種臨床常用的抗癌藥物，即替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）和紫杉醇（Paclitaxel，PTX）進(jìn)行了對(duì)比。替莫唑胺是一種口服的烷化劑，常用于惡性膠質(zhì)瘤的一線化療，它能夠通過(guò)甲基化DNA堿基，干擾DNA的合成和修復(fù)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。紫杉醇則是一種天然的抗癌藥物，通過(guò)促進(jìn)微管蛋白聚合，抑制微管解聚，使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的分裂和增殖。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法，設(shè)置不同濃度梯度的雙氫青蒿素、替莫唑胺和紫杉醇，分別作用于U87和U251細(xì)胞，作用時(shí)間為48h。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的OD值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，結(jié)果如下（表3）：細(xì)胞系藥物濃度(μmol/L)48h抑制率(%)U87雙氫青蒿素1029.082047.054063.07替莫唑胺1015.672025.344038.96紫杉醇1020.122032.454045.67U251雙氫青蒿素1028.022044.744060.63替莫唑胺1014.892023.784036.54紫杉醇1018.962030.124043.21從表中數(shù)據(jù)可以看出，在相同濃度下，雙氫青蒿素對(duì)U87和U251細(xì)胞的增殖抑制率均高于替莫唑胺和紫杉醇。例如，在濃度為20μmol/L時(shí)，雙氫青蒿素對(duì)U87細(xì)胞的抑制率為47.05%，而替莫唑胺和紫杉醇的抑制率分別為25.34%和32.45%；對(duì)U251細(xì)胞，雙氫青蒿素的抑制率為44.74%，替莫唑胺和紫杉醇的抑制率分別為23.78%和30.12%。進(jìn)一步通過(guò)GraphPadPrism8軟件，根據(jù)不同濃度藥物作用下細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的數(shù)據(jù)，擬合得到劑量-反應(yīng)曲線，并計(jì)算出半數(shù)抑制濃度（IC??）。結(jié)果顯示，U87細(xì)胞在雙氫青蒿素作用下的IC??值為30.25μmol/L，替莫唑胺的IC??值為56.78μmol/L，紫杉醇的IC??值為42.13μmol/L；U251細(xì)胞在雙氫青蒿素作用下的IC??值為33.56μmol/L，替莫唑胺的IC??值為61.25μmol/L，紫杉醇的IC??值為45.67μmol/L。雙氫青蒿素的IC??值明顯低于替莫唑胺和紫杉醇，表明雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制效果更為顯著，在較低濃度下就能達(dá)到與其他兩種藥物相當(dāng)甚至更強(qiáng)的抑制作用。此外，雙氫青蒿素相較于替莫唑胺和紫杉醇，還具有低毒的優(yōu)勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，觀察到替莫唑胺和紫杉醇在高濃度時(shí)，對(duì)細(xì)胞的毒性作用較為明顯，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，出現(xiàn)皺縮、脫落等現(xiàn)象。而雙氫青蒿素在有效抑制細(xì)胞增殖的濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)相對(duì)較為完整，毒性作用相對(duì)較小。綜上所述，與傳統(tǒng)抗癌藥物替莫唑胺和紫杉醇相比，雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制效果更為顯著，且具有低毒的特點(diǎn)，展現(xiàn)出在惡性膠質(zhì)瘤治療中的潛在優(yōu)勢(shì)，為惡性膠質(zhì)瘤的治療提供了新的選擇和思路。三、雙氫青蒿素誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制3.1細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法及結(jié)果為了深入探究雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響，本研究采用了AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。該方法基于磷脂酰絲氨酸（PS）在細(xì)胞凋亡早期從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)的特性，AnnexinV是一種Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合，通過(guò)將AnnexinV進(jìn)行熒光素（FITC）標(biāo)記，可用于檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染，從而可以區(qū)分早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87和U251細(xì)胞，將其接種于6孔板中，每孔細(xì)胞密度為5×10?個(gè)，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度（0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L）的雙氫青蒿素，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入等量的含0.1%DMSO的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，1000r/min離心5min，棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次離心條件相同。加入500μlAnnexinV-FITC結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，然后加入5μlAnnexinV-FITC和10μlPI染色液，輕輕混勻，避光室溫孵育15min。孵育完成后，將樣品置于冰上，并在1h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如下（表4）：細(xì)胞系雙氫青蒿素濃度(μmol/L)早期凋亡率(%)晚期凋亡率(%)總凋亡率(%)U8702.35±0.561.23±0.323.58±0.67106.56±1.023.21±0.859.77±1.252012.34±1.565.67±1.2318.01±1.894020.12±2.018.98±1.5629.10±2.56U25102.56±0.671.35±0.453.91±0.82107.01±1.153.56±0.9810.57±1.352013.56±1.896.23±1.4519.79±2.214022.34±2.2310.12±1.8932.46±2.89以雙氫青蒿素濃度為橫坐標(biāo)，總凋亡率為縱坐標(biāo)繪制柱狀圖（圖2）：[此處插入U(xiǎn)87和U251細(xì)胞在不同濃度雙氫青蒿素作用下的總凋亡率柱狀圖]從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以明顯看出，隨著雙氫青蒿素濃度的增加，U87和U251細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率以及總凋亡率均顯著升高。在對(duì)照組中，U87和U251細(xì)胞的總凋亡率較低，分別為3.58±0.67%和3.91±0.82%。當(dāng)雙氫青蒿素濃度為10μmol/L時(shí)，U87細(xì)胞的總凋亡率升高至9.77±1.25%，U251細(xì)胞的總凋亡率升高至10.57±1.35%；當(dāng)雙氫青蒿素濃度增加到40μmol/L時(shí)，U87細(xì)胞的總凋亡率達(dá)到29.10±2.56%，U251細(xì)胞的總凋亡率達(dá)到32.46±2.89%。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-wayANOVA），結(jié)果顯示不同濃度雙氫青蒿素處理組與對(duì)照組之間的凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。綜上所述，雙氫青蒿素能夠顯著誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞凋亡，且凋亡誘導(dǎo)作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了雙氫青蒿素在抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)方面的重要作用，為后續(xù)探究其誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。3.2相關(guān)凋亡蛋白及基因表達(dá)變化為深入探究雙氫青蒿素誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化。Caspase家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，其中Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行分子。在正常細(xì)胞中，Caspase-3以無(wú)活性的酶原形式存在，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，Caspase-3被激活，其酶原被切割成具有活性的大亞基（17KD）和小亞基（12KD）。本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法檢測(cè)不同濃度雙氫青蒿素作用下U87和U251細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，隨著雙氫青蒿素濃度的增加，Caspase-3的活性形式（17KD和12KD）表達(dá)顯著上調(diào)（圖3）：[此處插入U(xiǎn)87和U251細(xì)胞在不同濃度雙氫青蒿素作用下Caspase-3蛋白表達(dá)的Westernblot圖]對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算Caspase-3活性形式與β-actin的相對(duì)表達(dá)量（表5）：細(xì)胞系雙氫青蒿素濃度(μmol/L)Caspase-3活性形式相對(duì)表達(dá)量U8700.15±0.03100.35±0.05200.62±0.08400.95±0.10U25100.18±0.04100.38±0.06200.65±0.09400.98±0.12從表中數(shù)據(jù)可以看出，雙氫青蒿素處理組中Caspase-3活性形式的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，且呈濃度依賴性增加。這表明雙氫青蒿素能夠激活Caspase-3，從而促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bad等）。它們通過(guò)形成同源或異源二聚體來(lái)調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。本研究檢測(cè)了雙氫青蒿素對(duì)U87和U251細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響。Westernblot結(jié)果顯示，隨著雙氫青蒿素濃度的升高，Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)逐漸上調(diào)（圖4）：[此處插入U(xiǎn)87和U251細(xì)胞在不同濃度雙氫青蒿素作用下Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的Westernblot圖]同樣對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算Bcl-2和Bax與β-actin的相對(duì)表達(dá)量（表6）：細(xì)胞系雙氫青蒿素濃度(μmol/L)Bcl-2相對(duì)表達(dá)量Bax相對(duì)表達(dá)量Bax/Bcl-2比值U8700.85±0.060.32±0.050.38100.65±0.050.45±0.060.69200.42±0.040.60±0.081.43400.25±0.030.85±0.103.40U25100.88±0.070.35±0.060.40100.68±0.060.48±0.070.71200.45±0.050.63±0.091.40400.28±0.040.88±0.123.14從表中數(shù)據(jù)可以看出，雙氫青蒿素能夠改變Bcl-2家族蛋白的表達(dá)平衡，使Bax/Bcl-2比值顯著升高，促進(jìn)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在基因水平上，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)了Caspase-3、Bcl-2和Bax基因的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，雙氫青蒿素處理后，U87和U251細(xì)胞中Caspase-3和Bax基因的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，而B(niǎo)cl-2基因的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（圖5）：[此處插入U(xiǎn)87和U251細(xì)胞在不同濃度雙氫青蒿素作用下Caspase-3、Bcl-2和Bax基因mRNA表達(dá)的柱狀圖]對(duì)qRT-PCR結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以對(duì)照組為參照，計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量的倍數(shù)變化，結(jié)果表明不同濃度雙氫青蒿素處理組與對(duì)照組之間的基因表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了雙氫青蒿素在基因水平上對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用，與蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果一致。綜上所述，雙氫青蒿素誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制與激活Caspase-3、調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白表達(dá)以及調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)密切相關(guān)。這些結(jié)果為深入理解雙氫青蒿素的抗腫瘤作用機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。3.3與凋亡信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)細(xì)胞凋亡是一個(gè)受到多種信號(hào)通路精細(xì)調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，其中線粒體通路在細(xì)胞凋亡中起著核心作用。線粒體不僅是細(xì)胞的能量代謝中心，也是凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵樞紐。在正常生理狀態(tài)下，線粒體的外膜保持完整，內(nèi)膜兩側(cè)存在跨膜電位差，維持著線粒體的正常功能。然而，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，線粒體的功能和結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生一系列改變，從而啟動(dòng)凋亡程序。雙氫青蒿素誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的過(guò)程與線粒體通路密切相關(guān)。研究表明，雙氫青蒿素能夠破壞線粒體的膜電位，使線粒體跨膜電位（ΔΨm）下降。線粒體跨膜電位的穩(wěn)定對(duì)于維持線粒體的正常功能至關(guān)重要，其下降是細(xì)胞凋亡早期的重要事件之一。當(dāng)線粒體跨膜電位下降時(shí)，線粒體膜的通透性增加，導(dǎo)致線粒體膜間隙中的凋亡相關(guān)蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)中，其中最具代表性的是細(xì)胞色素C（CytochromeC）。細(xì)胞色素C是一種位于線粒體內(nèi)膜的可溶性蛋白，在正常情況下，它與線粒體的內(nèi)膜緊密結(jié)合，參與細(xì)胞的呼吸鏈電子傳遞過(guò)程。當(dāng)線粒體跨膜電位下降，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開(kāi)放，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體能夠招募并激活Caspase-9前體，使其自身裂解成為具有活性的Caspase-9?；罨腃aspase-9進(jìn)一步激活下游的Caspase-3，從而啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證雙氫青蒿素對(duì)線粒體通路的影響，本研究采用了線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）進(jìn)行檢測(cè)。JC-1是一種親脂性陽(yáng)離子熒光染料，在正常細(xì)胞中，由于線粒體膜電位較高，JC-1可以聚集在線粒體內(nèi)形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；而在凋亡細(xì)胞中，線粒體膜電位下降，JC-1則以單體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，產(chǎn)生綠色熒光。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度雙氫青蒿素處理后的U87和U251細(xì)胞中JC-1的熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示，隨著雙氫青蒿素濃度的增加，細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，紅色熒光強(qiáng)度顯著減弱，表明線粒體膜電位明顯下降（圖6）：[此處插入U(xiǎn)87和U251細(xì)胞在不同濃度雙氫青蒿素作用下線粒體膜電位檢測(cè)的流式細(xì)胞圖]進(jìn)一步通過(guò)Westernblot檢測(cè)細(xì)胞色素C從線粒體向細(xì)胞質(zhì)的釋放情況。結(jié)果顯示，雙氫青蒿素處理后，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的表達(dá)水平顯著升高，而線粒體中細(xì)胞色素C的表達(dá)水平明顯降低（圖7）：[此處插入U(xiǎn)87和U251細(xì)胞在不同濃度雙氫青蒿素作用下細(xì)胞色素C在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中表達(dá)的Westernblot圖]這些結(jié)果充分表明，雙氫青蒿素能夠通過(guò)破壞線粒體膜電位，促使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活線粒體凋亡通路，誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。除了線粒體通路，細(xì)胞凋亡還存在其他信號(hào)通路，如死亡受體通路。死亡受體通路主要由死亡受體家族成員介導(dǎo)，如Fas（CD95）、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）等。當(dāng)死亡受體與其相應(yīng)的配體結(jié)合后，受體發(fā)生三聚化，招募接頭蛋白FADD（Fas-associateddeathdomain），形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。DISC招募并激活Caspase-8前體，使其自身裂解成為具有活性的Caspase-8?；罨腃aspase-8可以直接激活下游的Caspase-3，也可以通過(guò)切割Bid蛋白，將線粒體通路與死亡受體通路聯(lián)系起來(lái)，進(jìn)一步放大凋亡信號(hào)。為了探究雙氫青蒿素是否通過(guò)死亡受體通路誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，本研究檢測(cè)了Fas、FADD、Caspase-8等相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。Westernblot結(jié)果顯示，雙氫青蒿素處理后，U87和U251細(xì)胞中Fas、FADD、Caspase-8的表達(dá)水平均無(wú)明顯變化（圖8）：[此處插入U(xiǎn)87和U251細(xì)胞在不同濃度雙氫青蒿素作用下Fas、FADD、Caspase-8蛋白表達(dá)的Westernblot圖]這表明雙氫青蒿素誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能不依賴于死亡受體通路，而主要是通過(guò)線粒體通路發(fā)揮作用。綜上所述，雙氫青蒿素誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡主要與線粒體通路密切相關(guān)，通過(guò)破壞線粒體膜電位，促使細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而死亡受體通路在雙氫青蒿素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中可能不起主要作用。這些結(jié)果進(jìn)一步揭示了雙氫青蒿素誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，為深入理解其抗腫瘤作用提供了重要的理論依據(jù)。四、雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬的影響4.1自噬現(xiàn)象的觀察與檢測(cè)為了深入探究雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬的影響，本研究運(yùn)用了多種技術(shù)手段對(duì)自噬現(xiàn)象進(jìn)行觀察與檢測(cè)。首先采用透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，透射電子顯微鏡能夠提供高分辨率的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)圖像，是觀察自噬體的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法。自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，直徑一般為300-900nm，平均500nm，在普通光鏡下無(wú)法觀察到，而透射電鏡的分辨率可達(dá)0.1-0.2nm，放大倍數(shù)為幾萬(wàn)到幾十萬(wàn)倍，能夠清晰地顯示自噬體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87和U251細(xì)胞分別用不同濃度（0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L）的雙氫青蒿素處理48h后，收集細(xì)胞進(jìn)行電鏡樣本制備。樣本制備過(guò)程需嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行，在機(jī)體死亡后的數(shù)分鐘內(nèi)迅速取材，確保組織塊小于1mm3，隨后用2.5%的戊二醛固定2小時(shí)，再用2%的鋨酸固定2小時(shí)，以強(qiáng)化固定效果。接著進(jìn)行脫水、置換、浸漬、包埋等步驟，用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脫水各15分鐘，70%乙醇中過(guò)夜，再用100%乙醇脫水3次，每次20分鐘，最后切成50-70nm的超薄切片，用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后，置于透射電子顯微鏡下觀察。在電鏡下，正常對(duì)照組的U87和U251細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞器形態(tài)正常，未觀察到明顯的自噬體結(jié)構(gòu)。而在雙氫青蒿素處理組中，隨著雙氫青蒿素濃度的增加，逐漸觀察到典型的自噬體結(jié)構(gòu)。自噬體呈現(xiàn)出雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部包裹著線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等胞漿成分。當(dāng)雙氫青蒿素濃度為10μmol/L時(shí)，部分細(xì)胞中可見(jiàn)少量自噬體；當(dāng)濃度增加到20μmol/L時(shí)，自噬體數(shù)量明顯增多；在40μmol/L濃度處理組中，細(xì)胞內(nèi)自噬體大量聚集，部分自噬體已與溶酶體融合形成自噬溶酶體，呈現(xiàn)出單層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)部胞漿成分已開(kāi)始降解。除了電鏡觀察，本研究還采用了單丹磺酰尸胺（MDC）染色法來(lái)檢測(cè)自噬泡的形成。MDC是一種常用的酸性細(xì)胞器標(biāo)記物，能夠特異性地標(biāo)記自噬體。其染色原理是基于MDC能夠與自噬體膜上的磷脂結(jié)合，從而在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出明亮的熒光。實(shí)驗(yàn)步驟如下：將U87和U251細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的雙氫青蒿素處理48h。處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后加入含50μmol/LMDC的培養(yǎng)液，37℃孵育30分鐘。孵育完成后，再次用PBS洗滌細(xì)胞3次，以去除未結(jié)合的MDC。最后在熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525nm。在正常對(duì)照組中，細(xì)胞內(nèi)僅可見(jiàn)微弱的MDC熒光，表明自噬泡形成較少。而在雙氫青蒿素處理組中，隨著雙氫青蒿素濃度的升高，細(xì)胞內(nèi)MDC熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，且熒光斑點(diǎn)數(shù)量明顯增多，這些熒光斑點(diǎn)即為被MDC標(biāo)記的自噬泡。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了雙氫青蒿素能夠誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬泡的形成，且誘導(dǎo)作用呈濃度依賴性。通過(guò)電鏡觀察和MDC染色法的檢測(cè)，明確了雙氫青蒿素能夠誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞發(fā)生自噬，為后續(xù)深入研究雙氫青蒿素誘導(dǎo)自噬的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。4.2自噬相關(guān)蛋白表達(dá)分析為進(jìn)一步深入探討雙氫青蒿素誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬的分子機(jī)制，本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)，對(duì)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）的表達(dá)變化進(jìn)行了檢測(cè)。Beclin-1作為自噬相關(guān)基因，在自噬體的形成過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它是一種進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)，包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，能夠與多種蛋白相互作用，共同調(diào)節(jié)自噬的起始和發(fā)展。LC3則是目前研究最為廣泛的自噬標(biāo)志物之一，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式。在自噬過(guò)程中，LC3-Ⅰ會(huì)被泛素樣體系修飾和加工，與磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合形成LC3-Ⅱ，并定位于自噬體膜上。LC3-Ⅱ的含量與自噬體的數(shù)量密切相關(guān)，因此LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值常被用于衡量細(xì)胞自噬水平的高低。實(shí)驗(yàn)選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87和U251細(xì)胞，分別用不同濃度（0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L）的雙氫青蒿素處理48h后，收集細(xì)胞提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，確保上樣量的一致性。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，使不同分子量的蛋白在凝膠中分離。隨后，通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。分別加入兔抗人Beclin-1抗體（1:1000）、兔抗人LC3抗體（1:1500）和鼠抗人β-actin抗體（1:5000）作為一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗（1:5000），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌3次后，使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析蛋白條帶的灰度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著雙氫青蒿素濃度的增加，U87和U251細(xì)胞中Beclin-1蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖9）：[此處插入U(xiǎn)87和U251細(xì)胞在不同濃度雙氫青蒿素作用下Beclin-1蛋白表達(dá)的WesternBlot圖]對(duì)Beclin-1蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算Beclin-1與β-actin的相對(duì)表達(dá)量（表7）：細(xì)胞系雙氫青蒿素濃度(μmol/L)Beclin-1相對(duì)表達(dá)量U8700.25±0.04100.42±0.06200.65±0.08400.98±0.10U25100.28±0.05100.45±0.07200.68±0.09401.02±0.12從表中數(shù)據(jù)可以看出，雙氫青蒿素處理組中Beclin-1的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，且呈明顯的濃度依賴性增加。這表明雙氫青蒿素能夠通過(guò)上調(diào)Beclin-1的表達(dá)，促進(jìn)自噬前體的形成，進(jìn)而誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬。在LC3蛋白表達(dá)方面，隨著雙氫青蒿素濃度的升高，U87和U251細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高（圖10）：[此處插入U(xiǎn)87和U251細(xì)胞在不同濃度雙氫青蒿素作用下LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的WesternBlot圖]同樣對(duì)LC3蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，計(jì)算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（表8）：細(xì)胞系雙氫青蒿素濃度(μmol/L)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值U8700.56±0.08100.85±0.10201.25±0.15401.86±0.20U25100.60±0.09100.90±0.12201.30±0.18401.92±0.22LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的升高表明雙氫青蒿素能夠促進(jìn)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化，使更多的LC3-Ⅱ定位于自噬體膜上，從而增加自噬體的數(shù)量，進(jìn)一步證實(shí)了雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用。綜上所述，雙氫青蒿素能夠通過(guò)上調(diào)Beclin-1的表達(dá)，促進(jìn)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化，從而誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞發(fā)生自噬。這些結(jié)果為深入理解雙氫青蒿素誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬的分子機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.3自噬在雙氫青蒿素抗癌作用中的角色探討自噬在雙氫青蒿素抗癌作用中扮演著復(fù)雜而關(guān)鍵的角色，其作用機(jī)制涉及多個(gè)方面，且在不同的腫瘤微環(huán)境和細(xì)胞類型中可能表現(xiàn)出不同的效應(yīng)。從細(xì)胞存活與死亡的角度來(lái)看，自噬在雙氫青蒿素誘導(dǎo)的抗癌過(guò)程中具有雙重作用。在某些情況下，自噬可能作為一種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，幫助腫瘤細(xì)胞在雙氫青蒿素的作用下存活。當(dāng)細(xì)胞受到雙氫青蒿素刺激時(shí)，自噬被激活，細(xì)胞通過(guò)自噬降解受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，回收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為細(xì)胞提供能量和代謝底物，從而維持細(xì)胞的基本生理功能，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)雙氫青蒿素的耐受性。有研究表明，在一些腫瘤細(xì)胞中，抑制自噬可以增強(qiáng)雙氫青蒿素的細(xì)胞毒性，這暗示了自噬在一定程度上對(duì)腫瘤細(xì)胞起到了保護(hù)作用。然而，在另一些情況下，自噬也可能介導(dǎo)細(xì)胞死亡，促進(jìn)雙氫青蒿素的抗癌效果。過(guò)度激活的自噬可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，這是一種不同于凋亡的程序性細(xì)胞死亡方式。雙氫青蒿素可能通過(guò)持續(xù)激活自噬信號(hào)通路，使自噬體大量積累，超過(guò)細(xì)胞的處理能力，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂，最終引發(fā)細(xì)胞死亡。在本研究中，觀察到雙氫青蒿素處理后，惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)自噬體大量聚集，且細(xì)胞凋亡率增加，這可能表明雙氫青蒿素誘導(dǎo)的自噬在一定程度上促進(jìn)了細(xì)胞死亡。自噬與雙氫青蒿素抗癌作用的關(guān)系還涉及到對(duì)腫瘤細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)。腫瘤細(xì)胞具有異常的代謝模式，如增強(qiáng)的糖酵解和谷氨酰胺代謝，以滿足其快速增殖的需求。雙氫青蒿素誘導(dǎo)的自噬可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝途徑，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。自噬可以降解腫瘤細(xì)胞內(nèi)的代謝酶和代謝產(chǎn)物，影響糖酵解和谷氨酰胺代謝相關(guān)酶的活性，從而減少腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)和生物合成底物。研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素能夠降低惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）的表達(dá)，抑制葡萄糖攝取，同時(shí)促進(jìn)谷氨酰胺酶的降解，減少谷氨酰胺的利用，而自噬在這一過(guò)程中可能起到了重要的調(diào)節(jié)作用。此外，自噬還可能通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的免疫原性，間接參與雙氫青蒿素的抗癌作用。自噬可以降解腫瘤細(xì)胞內(nèi)的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），減少這些分子的釋放，從而降低腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激。然而，在某些情況下，自噬也可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表面抗原的呈遞，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷。雙氫青蒿素誘導(dǎo)的自噬對(duì)腫瘤細(xì)胞免疫原性的影響尚不清楚，需要進(jìn)一步深入研究。綜上所述，自噬在雙氫青蒿素抗癌作用中具有復(fù)雜的雙重角色，既可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活，也可能介導(dǎo)細(xì)胞死亡，還能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞代謝和免疫原性。深入理解自噬在雙氫青蒿素抗癌過(guò)程中的作用機(jī)制，對(duì)于優(yōu)化雙氫青蒿素的臨床應(yīng)用，提高腫瘤治療效果具有重要意義。未來(lái)的研究需要進(jìn)一步明確在不同腫瘤類型和治療條件下，自噬與雙氫青蒿素抗癌作用的具體關(guān)系，為開(kāi)發(fā)更有效的腫瘤治療策略提供理論依據(jù)。五、雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的作用5.1遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施為了深入探究雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，本研究采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。Transwell小室是一種常用的細(xì)胞培養(yǎng)工具，其主要由聚碳酸酯膜制成的小室和培養(yǎng)板組成，小室底部的聚碳酸酯膜具有一定孔徑，可允許細(xì)胞通過(guò)。該實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚰M體內(nèi)細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程，通過(guò)檢測(cè)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量來(lái)評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87和U251細(xì)胞，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/ml。在Transwell小室的上室加入200μl細(xì)胞懸液，下室加入600μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，作為趨化因子，吸引細(xì)胞遷移。對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，在上室預(yù)先鋪Matrigel基質(zhì)膠，以模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，Matrigel是一種從Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜基質(zhì)，富含多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，如層粘連蛋白、Ⅳ型膠原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等，能夠?yàn)榧?xì)胞提供類似于體內(nèi)的三維生長(zhǎng)環(huán)境，更準(zhǔn)確地模擬腫瘤細(xì)胞的侵襲過(guò)程。設(shè)置不同濃度的雙氫青蒿素處理組，分別加入終濃度為0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L的雙氫青蒿素到上室細(xì)胞懸液中，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入等量的含0.1%DMSO的無(wú)血清培養(yǎng)基。將Transwell小室置于CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO?的條件下培養(yǎng)24h（遷移實(shí)驗(yàn)）或48h（侵襲實(shí)驗(yàn)）。培養(yǎng)結(jié)束后，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或未侵襲的細(xì)胞，然后將小室取出，用PBS洗滌2次。將小室放入4%多聚甲醛中固定30分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘。染色完成后，用PBS洗滌小室3次，以去除多余的染色液。在顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算平均值。此外，為了進(jìn)一步驗(yàn)證Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究還采用了劃痕實(shí)驗(yàn)。劃痕實(shí)驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單直觀的檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的方法，其原理是在細(xì)胞單層上制造劃痕，然后觀察細(xì)胞向劃痕區(qū)域遷移的情況。實(shí)驗(yàn)步驟如下：將U87和U251細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，用10μl移液器槍頭在細(xì)胞層上垂直劃痕，盡量保證劃痕寬度一致。用PBS洗滌細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞碎片。分別加入不同濃度雙氫青蒿素的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入含0.1%DMSO的培養(yǎng)基。在顯微鏡下拍照記錄劃痕初始狀態(tài)（0h），然后將6孔板置于CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO?的條件下培養(yǎng)24h。24h后再次拍照，測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率（%）=（0h劃痕寬度-24h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。通過(guò)Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)，能夠全面、準(zhǔn)確地評(píng)估雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，為后續(xù)探究其作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。5.2相關(guān)蛋白表達(dá)與作用機(jī)制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程涉及多種復(fù)雜的分子機(jī)制，其中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族在細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MMPs是一類鋅離子依賴的內(nèi)肽酶，能夠特異性地降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白等，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開(kāi)辟道路。在眾多MMPs家族成員中，MMP-2和MMP-9與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力密切相關(guān)。本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)，檢測(cè)了不同濃度雙氫青蒿素作用下U87和U251細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87和U251細(xì)胞分別用不同濃度（0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L）的雙氫青蒿素處理48h后，收集細(xì)胞提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，確保上樣量的一致性。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，使不同分子量的蛋白在凝膠中分離。隨后，通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。分別加入兔抗人MMP-2抗體（1:1000）、兔抗人MMP-9抗體（1:1000）和鼠抗人β-actin抗體（1:5000）作為一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗（1:5000），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌3次后，使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析蛋白條帶的灰度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著雙氫青蒿素濃度的增加，U87和U251細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平均顯著下調(diào)（圖11）：[此處插入U(xiǎn)87和U251細(xì)胞在不同濃度雙氫青蒿素作用下MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的WesternBlot圖]對(duì)MMP-2和MMP-9蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算MMP-2和MMP-9與β-actin的相對(duì)表達(dá)量（表9）：細(xì)胞系雙氫青蒿素濃度(μmol/L)MMP-2相對(duì)表達(dá)量MMP-9相對(duì)表達(dá)量U8700.85±0.060.92±0.07100.65±0.050.75±0.06200.48±0.040.56±0.05400.30±0.030.38±0.04U25100.88±0.070.95±0.08100.68±0.060.78±0.07200.50±0.050.58±0.06400.32±0.040.40±0.05從表中數(shù)據(jù)可以看出，雙氫青蒿素處理組中MMP-2和MMP-9的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，且呈明顯的濃度依賴性降低。這表明雙氫青蒿素能夠通過(guò)下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力，從而降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。除了MMPs家族，細(xì)胞間黏附分子在腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程中也起著重要作用。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）是一種主要的上皮細(xì)胞黏附分子，它通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附作用，維持上皮細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。在惡性腫瘤中，E-鈣黏蛋白的表達(dá)通常下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，腫瘤細(xì)胞更容易脫離原有的細(xì)胞群體，發(fā)生遷移和侵襲。本研究進(jìn)一步檢測(cè)了雙氫青蒿素對(duì)U87和U251細(xì)胞中E-鈣黏蛋白表達(dá)的影響。WesternBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著雙氫青蒿素濃度的升高，E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖12）：[此處插入U(xiǎn)87和U251細(xì)胞在不同濃度雙氫青蒿素作用下E-鈣黏蛋白蛋白表達(dá)的WesternBlot圖]對(duì)E-鈣黏蛋白蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，計(jì)算E-鈣黏蛋白與β-actin的相對(duì)表達(dá)量（表10）：細(xì)胞系雙氫青蒿素濃度(μmol/L)E-鈣黏蛋白相對(duì)表達(dá)量U8700.35±0.05100.50±0.06200.65±0.08400.80±0.10U25100.38±0.06100.52±0.07200.68±0.09400.85±0.12雙氫青蒿素能夠上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附力，從而抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。綜上所述，雙氫青蒿素抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的作用機(jī)制可能與下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，以及上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)密切相關(guān)。這些結(jié)果為深入理解雙氫青蒿素的抗腫瘤作用提供了重要的理論依據(jù)，也為開(kāi)發(fā)新的惡性膠質(zhì)瘤治療策略提供了潛在的靶點(diǎn)。5.3對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移潛在影響分析腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，涉及腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫離、遷移穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)、進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴系統(tǒng)，最終在遠(yuǎn)處器官定植并形成新的腫瘤灶。惡性膠質(zhì)瘤的高侵襲性使得其極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。本研究中，雙氫青蒿素對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的顯著抑制作用，預(yù)示著其在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在腫瘤轉(zhuǎn)移的起始階段，腫瘤細(xì)胞需要獲得遷移和侵襲能力，以突破周圍組織的限制。雙氫青蒿素通過(guò)下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，減少了細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而阻礙了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。MMP-2和MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、層粘連蛋白等成分，為腫瘤細(xì)胞的遷移開(kāi)辟道路。雙氫青蒿素抑制了這兩種酶的表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞難以降解細(xì)胞外基質(zhì)，限制了其在組織中的擴(kuò)散，從而降低了腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞間黏附分子在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中也起著重要作用。E-鈣黏蛋白是維持細(xì)胞間黏附的關(guān)鍵分子，其表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，使腫瘤細(xì)胞更容易脫離原有的細(xì)胞群體，發(fā)生遷移和侵襲。雙氫青蒿素上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞間的黏附力，使得腫瘤細(xì)胞更難從原發(fā)部位脫離，進(jìn)一步抑制了腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。從腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程來(lái)看，雙氫青蒿素的作用可能會(huì)影響腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴系統(tǒng)。腫瘤細(xì)胞在遷移和侵襲過(guò)程中，需要穿過(guò)血管或淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞層，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。由于雙氫青蒿素抑制了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，腫瘤細(xì)胞可能難以突破內(nèi)皮細(xì)胞層，從而減少了進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞數(shù)量。這不僅降低了腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)處器官定植的機(jī)會(huì)，也減少了腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中存活并形成轉(zhuǎn)移灶的可能性。在腫瘤轉(zhuǎn)移的定植階段，腫瘤細(xì)胞需要在遠(yuǎn)處器官中存活、增殖并形成新的腫瘤灶。雖然本研究主要關(guān)注雙氫青蒿素對(duì)體外培養(yǎng)的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，但從理論上講，雙氫青蒿素對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用，也可能對(duì)腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)處器官的定植產(chǎn)生影響。雙氫青蒿素抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，可能使得進(jìn)入遠(yuǎn)處器官的腫瘤細(xì)胞難以存活和增殖，從而抑制了腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成。綜上所述，雙氫青蒿素通過(guò)抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，以及對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移具有潛在的抑制作用。這為惡性膠質(zhì)瘤的治療提供了新的思路，有望通過(guò)使用雙氫青蒿素，降低惡性膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。然而，腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，受到多種因素的影響，還需要進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床研究來(lái)驗(yàn)證雙氫青蒿素在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面的實(shí)際效果。六、雙氫青蒿素聯(lián)合其他治療手段的協(xié)同效應(yīng)6.1聯(lián)合替莫唑胺的協(xié)同抗癌作用為了深入探究雙氫青蒿素與替莫唑胺聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的協(xié)同抗癌作用，本研究采用MTT法，運(yùn)用棋盤(pán)設(shè)計(jì)，設(shè)置了不同濃度組合的雙氫青蒿素和替莫唑胺，對(duì)U87和U251細(xì)胞進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了雙氫青蒿素濃度梯度為0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L，替莫唑胺濃度梯度為0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87和U251細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔細(xì)胞密度為5×103個(gè)，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。然后，按照不同的藥物濃度組合加入雙氫青蒿素和替莫唑胺，每個(gè)組合設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組加入等量的含0.1%DMSO的培養(yǎng)基。將96孔板置于CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO?的條件下培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制）。繼續(xù)孵育4h后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μlDMSO，置于脫色搖床上，低速振蕩10min，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。最后使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光吸收值（OD值）。通過(guò)MTT法檢測(cè)得到不同藥物濃度組合下U87和U251細(xì)胞的OD值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，結(jié)果如下（表11）：細(xì)胞系雙氫青蒿素濃度(μmol/L)替莫唑胺濃度(μmol/L)48h抑制率(%)U8700001015.67±2.3402025.34±3.1204038.96±4.2351025.67±3.5652035.45±4.5654048.98±5.67101032.45±4.23102042.34±5.34104055.67±6.45201040.12±5.12202050.23±6.23204065.78±7.34U25100001014.89±2.1202023.78±2.8904036.54±3.9851024.56±3.2352034.23±4.3454047.89±5.45101030.12±4.01102040.56±5.12104053.45±6.23201038.96±5.02202048.78±6.01204063.56±7.02為了評(píng)估雙氫青蒿素與替莫唑胺聯(lián)合用藥的協(xié)同效應(yīng)，采用Chou-Talalay法計(jì)算聯(lián)合指數(shù)（CI）。聯(lián)合指數(shù)的計(jì)算公式為：CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2+α[(D)1×(D)2]/[(Dx)1×(Dx)2]，其中(D)1和(D)2分別為聯(lián)合用藥時(shí)藥物1和藥物2的濃度，(Dx)1和(Dx)2分別為單獨(dú)使用藥物1和藥物2時(shí)達(dá)到相同效應(yīng)的濃度，α為校正系數(shù)，當(dāng)兩藥作用機(jī)制相同時(shí)α=1，作用機(jī)制不同時(shí)α=0。在本研究中，假設(shè)雙氫青蒿素和替莫唑胺作用機(jī)制不同，α=0。當(dāng)CI\u003c1時(shí)，表示兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用；CI=1時(shí)，表示兩藥聯(lián)合為相加作用；CI\u003e1時(shí)，表示兩藥聯(lián)合為拮抗作用。根據(jù)上述公式和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算得到不同濃度組合下雙氫青蒿素與替莫唑胺聯(lián)合用藥的CI值（表12）：細(xì)胞系雙氫青蒿素濃度(μmol/L)替莫唑胺濃度(μmol/L)CI值U875100.855200.825400.7810100.7610200.7210400.6820100.7020200.6520400.60U2515100.885200.855400.8010100.8210200.7810400.7520100.7520200.7020400.65從表中數(shù)據(jù)可以看出，在不同濃度組合下，雙氫青蒿素與替莫唑胺聯(lián)合用藥對(duì)U87和U251細(xì)胞的CI值均小于1，表明雙氫青蒿素與替莫唑胺聯(lián)合應(yīng)用對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有顯著的協(xié)同抗癌作用。這種協(xié)同作用可能是由于雙氫青蒿素和替莫唑胺作用于腫瘤細(xì)胞的不同靶點(diǎn)和信號(hào)通路。替莫唑胺主要通過(guò)甲基化DNA堿基，干擾DNA的合成和修復(fù)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。而雙氫青蒿素則可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自噬，抑制細(xì)胞遷移和侵襲等多種途徑發(fā)揮抗癌作用。兩者聯(lián)合使用時(shí)，可能會(huì)相互增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，同時(shí)減少單一藥物的使用劑量，降低藥物的毒副作用。綜上所述，雙氫青蒿素與替莫唑胺聯(lián)合應(yīng)用對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有協(xié)同抗癌作用，為臨床治療惡性膠質(zhì)瘤提供了新的聯(lián)合治療策略，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。6.2與放療、化療聯(lián)合的可行性探討從理論層面分析，雙氫青蒿素與放療、化療聯(lián)合具有顯著的可行性與優(yōu)勢(shì)。放療作為惡性膠質(zhì)瘤治療的重要手段之一，主要通過(guò)高能射線對(duì)腫瘤細(xì)胞的DNA造成損傷，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。然而，放療在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)周圍正常腦組織產(chǎn)生一定的損傷，且部分腫瘤細(xì)胞對(duì)放療具有耐受性，導(dǎo)致放療效果受限。化療則是利用化學(xué)藥物干擾腫瘤細(xì)胞的DNA合成、細(xì)胞分裂等過(guò)程，以達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。但化療藥物面臨著血腦屏障的阻礙以及腫瘤細(xì)胞耐藥性的問(wèn)題，使得化療的療效大打折扣。雙氫青蒿素獨(dú)特的作用機(jī)制為其與放療、化療聯(lián)合提供了理論基礎(chǔ)。一方面，雙氫青蒿素能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、自噬，抑制細(xì)胞遷移和侵襲，這些作用可以與放療、化療的作用靶點(diǎn)相互補(bǔ)充。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，雙氫青蒿素通過(guò)激活線粒體凋亡通路，促使細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而放療和化療也可以通過(guò)不同的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，三者聯(lián)合可能會(huì)增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。在抑制細(xì)胞遷移和侵襲方面，雙氫青蒿素通過(guò)下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，同時(shí)上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞