2025年生物儀器操作試題及答案一、單項選擇題（每題2分，共30分）1.關(guān)于實時熒光定量PCR儀的操作，以下說法錯誤的是：A.加樣時需避免移液器槍頭接觸反應(yīng)管內(nèi)壁B.擴增程序中退火溫度需根據(jù)引物Tm值設(shè)置（通常比Tm值低5℃）C.反應(yīng)結(jié)束后直接打開儀器取出反應(yīng)管，無需等待降溫D.實驗前需用75%乙醇擦拭樣品槽避免交叉污染2.高速冷凍離心機使用時，若出現(xiàn)異常震動，最可能的原因是：A.離心管未對稱放置B.轉(zhuǎn)子未安裝到位C.設(shè)定轉(zhuǎn)速超過轉(zhuǎn)子最大允許轉(zhuǎn)速D.以上均可能3.酶標(biāo)儀進行雙波長檢測時，參考波長的主要作用是：A.提高檢測靈敏度B.消除孔板本身或雜質(zhì)的背景干擾C.增加吸光度線性范圍D.延長光源使用壽命4.倒置顯微鏡觀察活細(xì)胞時，若視野中細(xì)胞模糊且邊緣發(fā)虛，優(yōu)先調(diào)整的參數(shù)是：A.物鏡倍數(shù)B.聚光器高度C.粗準(zhǔn)焦螺旋D.細(xì)準(zhǔn)焦螺旋5.流式細(xì)胞儀進行樣本檢測前，需用標(biāo)準(zhǔn)微球進行校準(zhǔn)，校準(zhǔn)的核心目的是：A.驗證激光器功率是否穩(wěn)定B.確保各檢測器電壓設(shè)置合理C.保證不同實驗間結(jié)果的可比性D.清除液路中的氣泡6.梯度PCR儀與普通PCR儀的核心區(qū)別在于：A.支持更高的擴增效率B.可同時運行多個不同退火溫度的反應(yīng)C.具備更精準(zhǔn)的溫度控制精度（±0.1℃）D.內(nèi)置熒光檢測模塊7.超凈工作臺使用時，正確的操作是：A.開機后立即進行實驗操作B.實驗物品在臺內(nèi)按“污染區(qū)-半污染區(qū)-清潔區(qū)”從左到右擺放C.操作時手臂頻繁進出工作臺D.實驗結(jié)束后用紫外線照射30分鐘，無需關(guān)閉風(fēng)機8.冷凍干燥機（凍干機）運行過程中，若真空度無法達到設(shè)定值（<10Pa），最可能的故障是：A.冷凝器溫度未降至-50℃以下B.樣品量超過設(shè)備最大負(fù)載C.系統(tǒng)存在漏氣點（如密封膠圈老化）D.真空泵油未及時更換9.核酸蛋白測定儀（紫外分光光度計）檢測DNA濃度時，若A260/A280比值為1.3，提示樣品可能污染了：A.蛋白質(zhì)B.苯酚C.RNAD.鹽離子10.高壓蒸汽滅菌器滅菌完成后，若直接開啟門蓋，可能導(dǎo)致的后果是：A.滅菌物品潮濕無法使用B.蒸汽噴出造成人員燙傷C.滅菌腔內(nèi)壓力驟降破壞物品D.以上均可能11.二氧化碳培養(yǎng)箱維護時，以下操作錯誤的是：A.每月用無菌水更換水盤內(nèi)的蒸餾水B.長期不用時，保持箱內(nèi)溫度為37℃防止霉菌滋生C.定期用75%乙醇擦拭內(nèi)壁及擱板D.使用前需校準(zhǔn)CO?濃度傳感器12.超速離心機使用時，若轉(zhuǎn)子未完全平衡（單管與對側(cè)管重量差>0.1g），可能導(dǎo)致：A.離心時間延長B.轉(zhuǎn)子變形甚至斷裂C.樣品分離效果下降D.制冷系統(tǒng)過載13.激光共聚焦顯微鏡觀察熒光樣品時，若圖像出現(xiàn)嚴(yán)重的背景熒光，最可能的原因是：A.激發(fā)光波長選擇錯誤B.樣品固定不充分導(dǎo)致熒光分子擴散C.檢測器增益設(shè)置過高D.物鏡數(shù)值孔徑（NA）過小14.基因擴增儀（普通PCR儀）溫度校準(zhǔn)的常用方法是：A.使用水銀溫度計直接測量反應(yīng)孔溫度B.利用設(shè)備內(nèi)置的溫度傳感器自動校準(zhǔn)C.采用外控式溫度驗證系統(tǒng)（如TaqMan探針法）D.通過擴增陽性對照驗證溫度準(zhǔn)確性15.自動酶免分析儀加樣針堵塞時，儀器可能出現(xiàn)的報警是：A.液路壓力異常B.吸光度讀數(shù)超范圍C.孵育溫度偏離設(shè)定值D.機械臂移動卡頓二、填空題（每空1分，共20分）1.普通離心機離心管對稱放置時，需保證單管與對側(cè)管的重量差≤______g；高速離心機需≤______g。2.實時熒光定量PCR儀的Ct值指______，其與模板初始濃度呈______（正/負(fù)）相關(guān)。3.酶標(biāo)儀檢測吸光度時，常用的比色杯光徑為______cm；若使用96孔板（圓底），實際光徑約為______cm（需考慮液體體積）。4.流式細(xì)胞儀中，前向散射光（FSC）主要反映細(xì)胞的______，側(cè)向散射光（SSC）主要反映細(xì)胞的______。5.倒置顯微鏡的物鏡位于載物臺______（上/下）方，適用于觀察______（貼壁/懸?。┘?xì)胞。6.高壓蒸汽滅菌的標(biāo)準(zhǔn)條件是______℃、______kPa，持續(xù)______分鐘（用于培養(yǎng)基滅菌）。7.冷凍干燥機的核心組件包括______、______和真空泵。8.核酸蛋白測定儀檢測RNA時，A260/A230比值應(yīng)≥______，若比值過低提示______污染。9.二氧化碳培養(yǎng)箱的CO?濃度通常設(shè)置為______%，與______（生理指標(biāo)）保持一致以維持培養(yǎng)基pH穩(wěn)定。10.激光共聚焦顯微鏡的分辨率主要由______和______決定（寫出兩個關(guān)鍵參數(shù)）。三、簡答題（每題8分，共40分）1.簡述實時熒光定量PCR儀的操作流程（從開機到結(jié)果分析）。2.列舉流式細(xì)胞儀樣本制備的5項關(guān)鍵注意事項，并說明原因。3.高壓蒸汽滅菌器滅菌失敗的常見原因有哪些？如何驗證滅菌效果？4.酶標(biāo)儀檢測時，若某孔吸光度值顯著高于同組其他孔（排除加樣錯誤），可能的原因有哪些？如何排查？5.超速離心機使用前需進行哪些安全檢查？使用后應(yīng)如何維護？四、綜合分析題（共10分）某實驗室使用熒光定量PCR檢測新冠病毒核酸，實驗中出現(xiàn)以下問題：（1）陰性對照（NTC）Ct值為28（正常應(yīng)無擴增）；（2）陽性樣本Ct值均>35（正常應(yīng)為20-30）；（3）熔解曲線出現(xiàn)雙峰（正常應(yīng)為單峰）。請分析可能的原因，并提出對應(yīng)的解決措施。答案一、單項選擇題1.C（需等待儀器降溫至40℃以下再取管，避免反應(yīng)管變形或蒸發(fā)）2.D（三者均可能導(dǎo)致震動，需逐一排查）3.B（參考波長用于扣除非特異性吸光）4.D（細(xì)準(zhǔn)焦螺旋用于微調(diào)清晰度）5.C（校準(zhǔn)確保不同時間、不同儀器間數(shù)據(jù)可比性）6.B（梯度PCR儀可設(shè)置多個退火溫度）7.B（物品按污染程度分區(qū)擺放）8.C（漏氣是真空度不足的常見原因）9.A（A260/A280<1.8提示蛋白質(zhì)污染）10.D（直接開門可能導(dǎo)致潮濕、燙傷、物品損壞）11.B（長期不用時應(yīng)清空水盤并保持干燥）12.B（不平衡會導(dǎo)致轉(zhuǎn)子應(yīng)力集中，引發(fā)斷裂）13.C（增益過高會放大背景噪聲）14.C（外控系統(tǒng)更準(zhǔn)確）15.A（加樣針堵塞會導(dǎo)致液路壓力異常）二、填空題1.2；0.52.熒光信號達到閾值時的擴增循環(huán)數(shù)；負(fù)3.1；0.5（96孔板每孔體積約200μL時，光徑約0.5cm）4.大??；內(nèi)部結(jié)構(gòu)（顆粒度）5.下；貼壁6.121；103.4；15-207.冷凝器（冷阱）；樣品室8.2.0；鹽類或有機溶劑（如苯酚）9.5；血液中CO?分壓（維持培養(yǎng)基HCO??緩沖體系）10.激光波長；物鏡數(shù)值孔徑（NA）三、簡答題1.操作流程：（1）開機預(yù)熱（30分鐘以上，確保溫控系統(tǒng)穩(wěn)定）；（2）配制反應(yīng)體系（冰上操作，避免引物/酶失活）；（3）加樣（使用帶濾芯槍頭，避免交叉污染；蓋緊管蓋防止蒸發(fā)）；（4）設(shè)置程序（根據(jù)引物Tm值設(shè)定退火溫度，延伸時間根據(jù)擴增片段長度調(diào)整；選擇熒光通道）；（5）運行（觀察儀器狀態(tài)，記錄開始時間）；（6）結(jié)果分析（查看擴增曲線是否呈S型，Ct值是否在有效范圍；熔解曲線是否為單峰）；（7）關(guān)機（退出程序，清潔樣品槽，登記使用記錄）。2.流式樣本制備注意事項：（1）細(xì)胞濃度控制在1×10?-5×10?/mL：濃度過低導(dǎo)致信號弱，過高易堵塞液路。（2）避免細(xì)胞團塊：需用30-40μm篩網(wǎng)過濾，否則會影響FSC/SSC信號及計數(shù)準(zhǔn)確性。（3）染色后避光保存：熒光染料（如PE、FITC）易受光降解，導(dǎo)致信號衰減。（4）使用緩沖液含0.1%BSA或2%FBS：減少細(xì)胞非特異性吸附，降低背景噪聲。（5）固定/破膜后及時檢測：長時間保存會破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響SSC信號和抗原表位。3.滅菌失敗原因：（1）裝載量過大（超過腔室容積80%），導(dǎo)致蒸汽無法穿透；（2）冷空氣未排盡（如排氣閥故障），形成“冷點”；（3）溫度/壓力未達設(shè)定值（傳感器故障）；（4）滅菌時間不足（程序設(shè)置錯誤或中途斷電）；（5）物品包裝過厚（如未使用透氣包裝）。驗證方法：（1）化學(xué)指示卡（滅菌后由黃色變黑色）；（2）生物指示劑（嗜熱脂肪芽孢桿菌，培養(yǎng)48小時無生長）；（3）溫度記錄儀（監(jiān)測滅菌過程中各點溫度是否達標(biāo)）。4.吸光度異常的可能原因及排查：（1）孔板污染：孔底有氣泡（光線散射）或殘留液體（如洗滌不徹底）；排查方法：顯微鏡下觀察孔底，重新洗滌孔板。（2）試劑污染：某孔試劑（如酶標(biāo)抗體）濃度過高或漏加終止液；排查方法：更換新試劑重新檢測。（3）儀器故障：該孔位置的光電檢測器損壞；排查方法：使用標(biāo)準(zhǔn)品在不同孔位檢測，確認(rèn)是否為固定孔位異常。（4）樣本本身問題：樣本中存在顆粒物（如細(xì)胞碎片）；排查方法：離心后取上清重新檢測。5.超速離心機安全檢查及維護：安全檢查：（1）轉(zhuǎn)子型號與離心機匹配（查看轉(zhuǎn)子標(biāo)識）；（2）轉(zhuǎn)子無劃痕、腐蝕（避免高速旋轉(zhuǎn)時破裂）；（3）離心管與轉(zhuǎn)子匹配（體積、材質(zhì)符合要求）；（4）離心管平衡（重量差≤0.1g）；（5）轉(zhuǎn)子蓋密封良好（防止漏氣導(dǎo)致溫度異常）。維護：（1）使用后清潔轉(zhuǎn)子（去離子水擦拭，避免殘留鹽溶液腐蝕）；（2）定期更換真空系統(tǒng)油（每運行500小時或6個月）；（3）檢查驅(qū)動軸潤滑情況（每年專業(yè)維護）；（4）長期不用時，轉(zhuǎn)子干燥后涂保護油存放；（5）記錄使用次數(shù)及轉(zhuǎn)子累計運行時間（超過壽命需更換）。四、綜合分析題問題（1）陰性對照Ct=28：可能原因是擴增產(chǎn)物污染（氣溶膠污染）或試劑交叉污染。解決措施：實驗區(qū)嚴(yán)格分區(qū)（試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴增區(qū)）；使用帶濾芯槍頭；擴增后不再進入試劑準(zhǔn)備區(qū)；定期用DNA酶清潔操作臺和儀器。問題（2）陽性樣本Ct>35：可能原因是模板濃度過低（采樣量不足或提取效率低）、引物/探針降解（保存不當(dāng)