(12)發(fā)明專利(10)授權(quán)公告號CN11939155(65)同一申請的已公布的文獻(xiàn)號CGMCCNo.307952024.05.27(73)專利權(quán)人中國農(nóng)業(yè)大學(xué)地址100094北京市海淀區(qū)圓明園西路2號高惟衍李若冰牛牧原彭思嘉徐嘉悅許津閣(74)專利代理機(jī)構(gòu)北京清亦華知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11201專利代理師張培培A23LA23LA23KA23KA23BKR1020240086789審查員黃磊和體外抑制病原菌生長的方法本發(fā)明公開了一種微生物、微生物菌劑、食品和食品的制備方法，涉及微生物領(lǐng)域。所述微生物為亞膜威克漢姆酵母，保藏編號為CGMCCNo.30795.本發(fā)明篩選得到的亞膜威克漢姆酵母新菌株生長速度快，耐酸和耐鹽能力強(qiáng)，尤其是抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長，代謝硝酸鹽能力強(qiáng)；利用該新菌株制得的發(fā)酵食品，含鹽21.一種微生物，其特征在于，所述微生物為亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus),于2024年05月27日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.30795。2.一種微生物菌劑，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的微生物。3.一種食品或飼料，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的微生物或權(quán)利要求2所述的微生物菌劑中的至少一種。4.權(quán)利要求1所述的微生物或權(quán)利要求2所述的微生物菌劑在制備食品或飼料中的用途。5.一種食品的制備方法，其特征在于，包括：將根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物和權(quán)利要求2所述的微生物菌劑中的一種或多種與待發(fā)酵的食品原料進(jìn)行發(fā)酵處理，得到所述食品。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述食品原料包括不限于辣椒、白菜、黃7.一種體外抑制病原菌生長的方法，其特征在于，包括：將權(quán)利要求1所述微生物和權(quán)利要求2所述微生物菌劑中的至少一種與含有病原菌的樣本共培養(yǎng)；所述病原菌選自金黃色葡萄球菌、大腸桿菌中的至少一種。3微生物、微生物菌劑、食品、食品的制備方法和體外抑制病原技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，尤其是涉及一種微生物、微生物菌劑、食品、食品的制備方法和體外抑制病原菌生長的方法。背景技術(shù)[0002]食鹽是發(fā)酵辣椒加工中必不可少的成分，能夠降低辣椒水分活度，抑制腐敗菌的生長，延長辣椒的保質(zhì)期，改善辣椒風(fēng)味。傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒通常添加15在食物原料表面的微生物進(jìn)行發(fā)酵。[0003]隨著全球倡導(dǎo)低鈉鹽飲食，減鹽發(fā)酵辣椒越來越受到人們的重視。減鹽發(fā)酵辣椒通常添加5～12%的食鹽，但是在發(fā)酵過程中，大多數(shù)酵母菌仍然無法避免由于鹽脅迫引起產(chǎn)規(guī)模減鹽發(fā)酵食物的制備。[0004]因此，仍需篩選具有良好耐鹽耐酸性能以及良好發(fā)酵性能的酵母菌，以滿足減鹽發(fā)酵食品及其發(fā)酵工藝的開發(fā)。發(fā)明內(nèi)容[0005]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題至少之一。為此，本發(fā)明提供了一種亞膜威克漢姆酵母FVPHBJ24144及其應(yīng)用，本發(fā)明還提供了微生物菌劑、食品或飼料、食品的制備方法、體外抑制病原菌的方法，本發(fā)明篩選得到的亞膜威克漢姆酵母新菌株具有生長速度快、耐酸和耐鹽能力強(qiáng)、可以抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長、代謝硝酸鹽能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，利用該新菌株制得的發(fā)酵食品含鹽量低、酵母菌含量豐富，營養(yǎng)[0006]因此，在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種微生物，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，所述微生物為亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus),于2024年05月27日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.30795。[0007]保藏信息：[0008]菌株名稱：亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)FVPHBJ24144[0009]分類命名：亞膜威克漢姆酵母Wickerhamomycessu[0011]保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心[0014]本發(fā)明篩選得到的亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)新菌株FVPHBJ24144生長速度快，耐酸和耐鹽能力強(qiáng)，尤其是在3mM亞硝酸鹽環(huán)境中仍可正常生4長，并且可以抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長，代謝硝酸鹽能力強(qiáng)；利用該新菌株制得[0015]在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種微生物菌劑。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，所述微生物菌劑包括前述微生物。[0016]在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種食品或飼料。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，所述食品或飼料包括前述微生物或前述微生物菌劑中的至少一種。本發(fā)明的食品或飼料含鹽量價值高。[0017]在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了前述的微生物或前述的微生物菌劑中在制備食品或飼料中的用途。[0018]在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種食品制備的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：將前述的微生物、前述的微生物菌劑中的一種或多種與待發(fā)酵的食品原料進(jìn)行發(fā)酵處理，得到所述食品。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法發(fā)酵效率高、生產(chǎn)周期短、應(yīng)用價[0019]在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種體外抑制病原菌生長的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，包括：將微前述生物和前述微生物菌劑中的至少一種與含有病原菌的樣本共培養(yǎng)；所述病原菌選自金黃色葡萄球菌、大腸桿菌中的至少一種。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法，亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)FVPHBJ24144能有效抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌生長，能用于體外抑制病原菌生長。[0020]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。附圖說明[0021]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對實(shí)施例的描述中將變得[0022]圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)[0023]圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)[0024]圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)[0025]圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)[0026]圖5為本發(fā)明實(shí)施例3中亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)FVPHBJ24144在含有不同鹽濃度的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)前后吸光度值(OD?0)考察結(jié)果圖；[0027]圖6為本發(fā)明實(shí)施例3中亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)FVPHBJ24144在含有不同鹽濃度的培養(yǎng)基中，活菌數(shù)量考察結(jié)果圖；5(Wickerhamomycessubpelliculosus)FVPHBJ24144的活菌數(shù)量考察結(jié)果圖；[0029]圖8為本發(fā)明實(shí)施例5中亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)FVPHBJ24144實(shí)驗(yàn)組與大腸桿菌對照組的抑制大腸桿菌生長的考察結(jié)果圖；[0030]圖9為本發(fā)明實(shí)施例5中亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)FVPHBJ24144實(shí)驗(yàn)組與金黃色葡萄球菌對照組的抑制金黃色葡萄球菌生長的考察結(jié)果圖；subpelliculosus)FVPHBJ24144代謝硝酸鹽能力的考察結(jié)果圖。具體實(shí)施方式[0032]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)[0033]在本文中所披露的范圍的端點(diǎn)和任何值都不限于該精確的范圍或值，這些范圍或值應(yīng)當(dāng)理解為包含接近這些范圍或值的值。對于數(shù)值范圍來說，各個范圍的端點(diǎn)值之間、各個范圍的端點(diǎn)值和單獨(dú)的點(diǎn)值之間，以及單獨(dú)的點(diǎn)值之間可以彼此組合而得到一個或多個新的數(shù)值范圍，這些數(shù)值范圍應(yīng)被視為在本文中具體公開。不排除其他方面的內(nèi)容。以但未必發(fā)生，并且該描述包括其中發(fā)生該事件或狀況的情況，以及其中未發(fā)生該事件或狀況的情況。[0036]在本文中，術(shù)語“YPD培養(yǎng)基”為酵母菌培養(yǎng)基，依據(jù)凝固劑(通常是瓊脂[0037]在本文中，術(shù)語“亞膜酵母菌綱(Saccharomycetes)擲孢酵母目(Sporobolomycetales)擲孢酵母科(Sporobolomycetaceae)魯氏接合[0038]本發(fā)明提出了微生物、微生物菌劑、食品或飼料、食品制備的方法、體外抑制病原菌的方法，下面將分別對其進(jìn)行詳細(xì)描述。[0039]微生物[0040]本發(fā)明提出了一種微生物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述微生物為亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus),命名為FVPHBJ24144,于2024年05月27日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院[0041]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述微生物的16srDNA測序結(jié)果如SEQIDNO:1所示。[0042]本發(fā)明篩選得到的亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)FVPHBJ24144新菌株生長速度快，耐酸和耐鹽能力強(qiáng)，尤其是在3mM亞硝酸鹽環(huán)境中仍可正常生長，并且可以抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長，代謝硝酸鹽能力強(qiáng)；利用該新菌株6[0043]在本文中，術(shù)語“亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)[0045]本發(fā)明提出了一種微生物菌劑。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，所述微生物菌劑包括前述微生物。本發(fā)明的微生物菌劑可用于制備發(fā)酵食品，并且其活化后產(chǎn)酸，可用于調(diào)節(jié)食品酸味。并且，該微生物菌劑還可以抑制諸如大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等病原菌生長。[0046]在一些具體的實(shí)施方式中，所述微生物菌劑為微生物液體菌劑，所述微生物的濃度為1×10?~1×1012CFU/mL。[0047]示例性地，前述微生物液體菌劑中微生物的濃度可以為：1×10?CFU/mL、5×[0048]需要說明的是，本發(fā)明的微生物菌劑可為微生物液體菌劑，包括但不限于發(fā)酵產(chǎn)[0049]需要說明的是，本發(fā)明的微生物菌劑中，亞膜威克漢姆酵母可以以活細(xì)胞和/或非活細(xì)胞的形式存在。[0053]在一些具體的實(shí)施方式中，所述亞膜威克漢姆酵母FVPHBJ24144是以活細(xì)胞、干菌體、固定化的細(xì)胞或者以其他任何形式存在的。[0054]在一些具體的實(shí)施方式中，所述干菌體是所述亞膜威克漢姆酵母FVPHBJ24144經(jīng)冷凍干燥處理獲得的。[0055]在一些具體的實(shí)施方式中，所述微生物菌劑還可以含有食品或飼料中的至少一種可接受的菌株。[0056]在一些具體的實(shí)施方式中，所述微生物菌劑進(jìn)一步包括食品中可接受的輔料或載體或者動物飼料中可接受的輔料或載體。[0057]在本文中，“食品中可接受的”是指可被人類食用的物質(zhì)或組合物，其可根據(jù)不同國家的食品要求進(jìn)行調(diào)整。[0058]在本文中，“動物飼料中可接受的輔料或載體”是指可被動物食用的物質(zhì)或組合物，其可根據(jù)不同國家的動物飼料要求進(jìn)行調(diào)整。[0059]需要說明的是，前面針對微生物所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，同樣適用于該微生物菌劑，在此不再贅述。[0060]食品或飼料[0061]本發(fā)明提出了一種食品或飼料。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述食品或飼料包括前述微生物或前述微生物菌劑中的至少一種。本發(fā)明的食品或飼料含鹽量低、酵母菌含量豐富、[0062]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括食品或飼料上可接受的輔料或載體。[0063]在一些具體地實(shí)施方式中，將前述微生物或前述微生物菌劑添加或接種到食品7食品或飼料。[0064]示例性地，所述食品包括不限于：益生菌片、發(fā)酵乳制品(比如益生菌酸奶)、益生[0066]需要說明的是，前面針對微生物所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，同樣適用于該食品或飼料，在此不再贅述。[0067]用途[0068]本發(fā)明還提出了前述微生物或前述微生物菌劑在制備食品或飼料中的用途。[0069]需要說明的是，前面針對微生物所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，同樣適用于該用途，在此不再贅述。[0071]本發(fā)明提出了一種食品的制備方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：將前述微生物、前述微生物菌劑中的一種或多種和待發(fā)酵的食品原料進(jìn)行發(fā)酵處理，得到所述食[0073]本發(fā)明還提出了一種體外抑制病原菌生長的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：將前述微生物和前述微生物菌劑中的至少一種與含有病原菌的樣本共培養(yǎng)。[0074]根據(jù)本發(fā)型的實(shí)施例，所述病原菌選自金黃色葡萄球菌、大腸桿菌中的至少一種。[0075]需要說明的是，前面針對微生物所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，同樣適用于該方法，在此不再贅述。[0076]下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。[0077]實(shí)施例1:亞膜威克漢姆酵母FVPHBJ24144的獲得[0078]本發(fā)明亞膜威克漢姆酵母FVPHBJ24144是從河北發(fā)酵辣椒醬中分離獲得的。[0079]菌種采集及分離過程：取自然發(fā)酵剁辣椒加入到滅菌的生理鹽水，混勻后稀釋涂布于YPD培養(yǎng)基(蛋白胨10.0g,酵母浸粉100g,葡萄糖200g),于pH6.0±0.2,30℃,靜置培養(yǎng)24-48h,分別挑取大小、形態(tài)不一的單菌落在新鮮的YPD培養(yǎng)基平板上劃線，在30℃靜置培養(yǎng)24-48h,重復(fù)進(jìn)行多次劃線純化培養(yǎng)，直至平皿中的菌落形態(tài)一致，經(jīng)鏡檢無雜菌后進(jìn)行鑒定。[0080]菌種保藏：將菌液與無菌的50%甘油于凍存管中1:1混合均勻后，保存在-80℃。[0081]實(shí)施例2:亞膜威克漢姆酵母FVPHBJ24144的鑒定[0082]將實(shí)施例1中分離純化后的培養(yǎng)物通過劃線、涂片鏡檢，進(jìn)一步確定其為純培養(yǎng)物后，進(jìn)行菌種形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定、16SrDNA基因的PCR擴(kuò)增與測序分析。[0083]1.形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定[0084]參考《常見真菌系統(tǒng)鑒定手冊》,對FVPHBJ24144進(jìn)行形態(tài)特征和生理生化特性等鑒定。CN119391553B說明書6/9頁8[0085]鑒定結(jié)果顯示：在YPD瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征為菌落中等大小，白色，圓形(圖1)。在YPD液體培養(yǎng)基中最終pH為3.5。變性10min,然后進(jìn)行30個循環(huán)：94℃變表1所示。體積(μL)引物27F(10μmol/L)2引物1492R(10μmol/L)22總體積[0090]送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行16SrDNA序列檢測。測得的序列在樹的構(gòu)建。理生化鑒定進(jìn)一步確認(rèn)FVPHBJ24144為亞膜威克漢姆酵母，序列登陸號為CGMCCNo.30795。物中心”,保藏編號為CGMCCNo.30795。[0094]TTGCCTGCGCTTATTGCGCGGCGATAAACCTTTACACACATTGTCTAGTTTTTTTTGAAACTTTGCTT[0095]實(shí)施例3:亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)FVPHBJ24144生長特性、產(chǎn)酸能力、耐酸特性、耐鹽特性考察[0096]在該實(shí)施例中，按如下方法準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)菌株：亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomyces9subpelliculosus)FVPHBJ24144在YPD瓊脂平板上劃線培養(yǎng)24～48h,挑取單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中生長16～20h活化，得到活化的菌株。[0097]1.菌株生長特性和產(chǎn)酸能力[0098]將活化的菌株按照1%的接種量接種至YPD液體培養(yǎng)基中，于30℃靜置培養(yǎng)，每1h測定600nm處吸光值直到穩(wěn)定期為止，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線(圖2)。(Wickerhamomycessubpelliculosus)FVPHBJ24144生長代謝緩慢；24h后進(jìn)入對數(shù)生長期。測定到達(dá)穩(wěn)定期時的菌液pH,基本維持在4.0以下。[0101]將活化好的菌株按照1%的接種量接種至不同pH值(pH考察值為3、4、5、6)的YPD液體培養(yǎng)基中，于30℃靜置培養(yǎng)24h,分別測定酵母菌在不同pH值培養(yǎng)基中，培養(yǎng)前后的吸光度值(OD600)(圖3),同時采用可培養(yǎng)菌測定方法測定培養(yǎng)前后酵母菌活菌的數(shù)量(圖4)。[0102]結(jié)果顯示：亞膜威克漢姆酵母FVPHBJ24144對酸具有較高的耐受性。當(dāng)YPD液體培養(yǎng)基pH值為4～6時，生長狀況良好(圖3、圖4);當(dāng)pH值下降至3.5時仍保持較高的菌數(shù)維持在10'CFU/mL以上(圖4)。[0104]將活化好的菌株按照1%的接種量接種至含不同NaCl濃度(0%、4%、8%、10%、15%、20%)的YPD液體培養(yǎng)基中，于3℃靜置培養(yǎng)24h,分別測定酵母菌在不同鹽濃度的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)前后的吸光度值(OD600)(圖5),同時采用可培養(yǎng)菌測定方法測定培養(yǎng)前后酵母菌活菌的數(shù)量(圖6)。[0105]結(jié)果顯示：亞膜威克漢姆酵母FVPHBJ24144對NaCl具有較高的耐受性。在鹽濃度為15%的液體培養(yǎng)基中，菌株仍能生長；在鹽濃度為20%的液體培養(yǎng)基中，活菌數(shù)量維持在[0106]實(shí)施例4:亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)FVPHBJ24144的應(yīng)用[0107]在該實(shí)施例中，利用亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)[0108]1.亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)FVPHBJ24144發(fā)酵劑的制備[0109]亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)FVPHBJ24144在YPD瓊脂平板上劃線培養(yǎng)24～48h,挑取單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中生長16～20h活化，活化后的亞膜威克漢姆酵母FVPHBJ24144按照1%的接種量接種至YPD液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)16～20h,菌液離心，用無菌蒸餾水洗滌至無培養(yǎng)基殘留，重懸至無菌蒸餾水中，菌體密度為1×101?~破碎處理，添加食鹽4.5～7.5kg攪拌均勻，食鹽添加量占總蔬菜質(zhì)量的8%～12%,接種占總蔬菜質(zhì)量1%的亞膜威克漢姆酵母FVPHBJ24144發(fā)酵劑，室溫密封發(fā)酵30天，即得用亞膜威克漢姆酵母FVPHBJ24144作為發(fā)酵劑制得的發(fā)酵蔬菜。[0112]考察酵母菌活菌數(shù)，結(jié)果顯示：在整個發(fā)酵過程中，酵母菌活菌數(shù)均保持在[0113]示例性地，適合利用亞膜威克漢姆酵母FVPHBJ24144制作發(fā)酵蔬菜的蔬菜包括不[0114]實(shí)施例5:亞膜威克漢姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)FVPHBJ24144抑菌特性考察[0115]1.抑制大腸桿菌生長[0116]在96孔板A1-F1中加入200μL蒸餾水、10μL發(fā)酵液上清液，混勻，無菌水制備菌液濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，經(jīng)LB培養(yǎng)基1:1000稀釋后，向每行行一次OD值的測量，直至菌密度基本穩(wěn)定并停止測量。[0117]結(jié)果顯示：亞膜威克漢姆酵母FVPHBJ24144能抑制大腸桿菌的生長。一定時間內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組大腸桿菌濃度明顯低于對照組(圖8)。[0118]2.抑制