發(fā)酵工藝學(xué)（培訓(xùn)講座課件）

發(fā)酵工藝學(xué)

發(fā)酵工藝概論

發(fā)酵已經(jīng)從過去簡單的生產(chǎn)酒精類飲料，生產(chǎn)醋酸和發(fā)酵面包發(fā)展到今天成為生物工程的

一個極其重要的分支，成為一個包括了微生物學(xué)，化學(xué)工程，基因工程，細(xì)胞工程，機(jī)械工

程和計(jì)算機(jī)軟硬件工程的一個多學(xué)科工程。

現(xiàn)代發(fā)酵工程不但生產(chǎn)酒精類飲料，醋酸和面包，而且生產(chǎn)各種食品添加劑：谷氨酸，檸

檬酸，蘋果酸，核甘酸，多糖等：醫(yī)療保健藥物如胰島素，干擾素，生長激素，抗生素和疫

苗；農(nóng)用生產(chǎn)資料：天然殺蟲劑，細(xì)菌肥料，微生物除草劑；在化學(xué)工業(yè)上生產(chǎn)AA,酶，

維生素和單細(xì)胞蛋白等。

Useofmicroorganisms：適應(yīng)性強(qiáng)

消化能力強(qiáng)

繁殖能力強(qiáng)

1857年，法國化學(xué)家，微生物學(xué)家巴斯德提出了著名的發(fā)酵理論，一切發(fā)酵工程都是微生

物作用的結(jié)果巴斯德認(rèn)為：釀酒是發(fā)酵，是微生物在起作用。酒變質(zhì)也是發(fā)酵，是另一

類微生物在作祟?？捎眉訜岬姆椒▉須⑺烙泻ξ⑸铮部蓪⒓兎N微生物分離出，獲得所需

發(fā)酵產(chǎn)品。

一、發(fā)酵工程（fermentationengineering）

1.直接利用微生物的機(jī)能將物料加工以提供產(chǎn)品的過程，又稱微生物工程。在

最適發(fā)酵條件下，大量培養(yǎng)細(xì)胞和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的工藝技術(shù)。

2.發(fā)酵工業(yè)簡介FermentationIndustry

發(fā)酵食品FermentedFoods

有機(jī)酸OrganicAcids

氨基酸AminoAcids

核酸類物質(zhì)Nucleotides

酶制劑Enzymes

醫(yī)藥工業(yè)（抗生素…）Pharmaceutical(Antibiotics...)

飼料工業(yè)（單細(xì)胞蛋白）Feedstuff(eg.SCP)

環(huán)境工程（廢物處理）EnvironmentalApplication(WasteTreatment)其它(冶

金工業(yè)…）Others(eg.Metallurgicalindustry)

二、微生物

（-）為什么要利用微生物？

微生物繁殖非常迅速

微生物培養(yǎng)易于控制

微生物本身也容易改造

（二）抗生素、氨基酸、酶制劑等產(chǎn)品為什么能通過微生物發(fā)酵來生產(chǎn)？這與微生物的生

長和代謝特點(diǎn)有什么關(guān)系？

1、某些微生物因爭奪生存環(huán)境或營養(yǎng)物，會產(chǎn)生抗生素將其他種類的微生物殺死。

2、微生物會產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶，將營養(yǎng)物質(zhì)水解成可吸收的小分子的多肽

或氨基酸、葡萄糖。

3、微生物細(xì)胞會通過合成或分解代謝生產(chǎn)它必需的一些物質(zhì)，包括氨基酸、核甘酸等。

三、Fermentationengineering

1.發(fā)酵工程組成

從廣義上講，由三部分組成：上游工程、發(fā)酵工程、下游工程

上游工程-FERMENTATIONProcessControl一下游工程

UPSTREAMPROCESSESDOWNSTREAMPROCESSES

-genetics,cell...-productextraction,purification&

assay

-inoculumdevelopment-wastetreatment

-mediaformulation-byproductrecovery-sterilization

-inoculation

2.獲得發(fā)酵產(chǎn)品的條件

適宜的微生物

保證或控制微生物進(jìn)行代謝的各種條件

進(jìn)行微生物發(fā)酵的設(shè)備

精制成產(chǎn)品的方法和設(shè)備

UseofMicroorganisms：

Positive（益處）

-Biomass

-Production

-Conversion

Negative（危害）

-Pathogens

-Spoilage

3.發(fā)酵的定義

傳統(tǒng)發(fā)酵：最初發(fā)酵是用來描述酵母菌作用于果汁或麥芽汁產(chǎn)生氣泡的現(xiàn)象，或者是指酒

的生產(chǎn)過程。

Fermentation最初來自拉丁語,發(fā)泡，（fervere）

生化和生理學(xué)意義的發(fā)酵：

指微生物在無氧條件下，分解各種有機(jī)物質(zhì)產(chǎn)生能量的一種方式。

如葡萄糖在無氧條件下被微生物利用產(chǎn)生酒精并放出C02。

或更嚴(yán)格地說：發(fā)酵是以有機(jī)物作為電子受體的氧化還原產(chǎn)能反應(yīng)。

工業(yè)上的發(fā)酵：

泛指利用微生物生產(chǎn)某些產(chǎn)品的過程。產(chǎn)品有細(xì)胞代謝產(chǎn)物，菌體細(xì)胞，酶等。

包括：

1.厭氧培養(yǎng)的生產(chǎn)過程，如酒精，乳酸等。

2.通氣（有氧）培養(yǎng)的生產(chǎn)過程，如抗生素、氨基酸、酶制劑等。

四、發(fā)酵工業(yè)簡史

1.天然發(fā)酵階段：sauce,pickledvegetables,cheese,doughfermentation

2.純培養(yǎng)技術(shù)的建立：巴斯德，科赫等。人為地控制微生物的發(fā)酵進(jìn)程。

3.通氣攪拌技術(shù)的建立：青霉素的生產(chǎn)——深層培養(yǎng)。

4.代謝控制發(fā)酵：Glu和Lys生產(chǎn)。

5.開拓原料時期：石油發(fā)酵，醋酸生產(chǎn)谷氨酸

6.基因工程階段：將不同來源的DNA進(jìn)行體外重組，轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞進(jìn)行繁殖和遺傳，達(dá)

到定向改變生物性狀的目的。

時間發(fā)酵階段主要產(chǎn)品主要技術(shù)

-1900天然發(fā)酵酒醋干酪酵母天然分批

1905-純培養(yǎng)酒精丙酮丁醇密閉純培養(yǎng)

1940-通氣攪拌抗生素有機(jī)酸通氣攪拌

酶維生素分批或連續(xù)

1957-代謝控制氨基酸核甘酸選育缺陷菌株

1960-開拓原料單細(xì)胞蛋白連續(xù)發(fā)酵

1979-基因工程菌胰島素干擾素DNA重組

純培養(yǎng):第一個轉(zhuǎn)折點(diǎn)通氣攪拌:第二個轉(zhuǎn)折點(diǎn)代謝控制：第三個轉(zhuǎn)折點(diǎn)

基因工程菌：第四個轉(zhuǎn)折點(diǎn)

Historyofappliedmicrobiology

Ancienttimes

-flavour（bread,soysauce）

-brewing（beer,wine）

1861LouisPasteur

-firstphaseindustrialbiotechnology

1940penicillin（Fleming）

-antibioticindustry

-productionoffinechemicals

原始發(fā)展階段（發(fā)酵技術(shù)開始于家庭小制作，技術(shù)進(jìn)步緩慢，完全是經(jīng)驗(yàn)式的，并不知道

其中的原理。）

傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)階段（人們開始了解發(fā)酵現(xiàn)象的本質(zhì)，采用開放式的發(fā)酵方式，生產(chǎn)過程及

設(shè)備較為簡單，規(guī)模一般不大。）

現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)階段（技術(shù)要求高、發(fā)展速度快；生產(chǎn)規(guī)模大；菌種生產(chǎn)能力大幅度提高，

新產(chǎn)品、新技術(shù)、新設(shè)備的應(yīng)用達(dá)到前所未有的程度。）

生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)階段（利用構(gòu)建的基因工程菌生產(chǎn)。）

五、生物反應(yīng)的過程：實(shí)質(zhì)是利用生物催化劑從事生物技術(shù)產(chǎn)品的生產(chǎn)過程。

Cellenzyme

biocatalystmonitorsterlizedair

、一/product

bioreactorextract—byproductf

residue

sterilizing

T

medium

空氣保藏菌種碳源、氮源、無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)T

—>

空氣凈化處理斜面活化

—>

擴(kuò)大培養(yǎng)

種子罐

滅菌

主發(fā)酵

―>

產(chǎn)物分離純化

—>

成品

菌種篩選T選搖瓶試驗(yàn)一發(fā)酵罐試驗(yàn)

發(fā)酵工程的概念和內(nèi)容

菌種選育：自然界篩選、誘變育種、基因工程、細(xì)胞工程

—>

培養(yǎng)基配制：根據(jù)培養(yǎng)基的配制原則制備，實(shí)踐中需多次試驗(yàn)配方

—>

滅菌：殺滅雜菌

擴(kuò)大培養(yǎng)和接種

―>

發(fā)酵過程（中心階段）：檢測進(jìn)程，滿足營養(yǎng)需要；嚴(yán)格控制溫度、pH、溶氧、轉(zhuǎn)速等T

分離純化：菌體：過濾、沉淀代謝產(chǎn)物：蒸儲、萃取、離子交換

四部分組成

1.菌種選育及擴(kuò)大培養(yǎng)：生物催化劑的制備，篩選到高產(chǎn)，穩(wěn)產(chǎn)，培養(yǎng)基要求不太苛刻

的菌種。

2,原料預(yù)處理及培養(yǎng)基的制備：淀粉制糖，糖蜜原料

3.發(fā)酵設(shè)備及反應(yīng)條件的選擇：

生物催化劑是酶：酶反應(yīng)過程

生物催化劑是生物細(xì)胞：發(fā)酵過程

兩種發(fā)酵方式（根據(jù)對氧的需要分）：

厭氧----alcohol,beer,acetone,butanol,lacticacid,aminoacid

好氧——需大量的氧，通入無菌空氣。氨基酸，抗生素（antibiotic）

根據(jù)培養(yǎng)基物理性狀分：固體和液體

根據(jù)微生物生長特性分：分批和連續(xù)

4.產(chǎn)品的分離與純化：是從發(fā)酵液中提取符合質(zhì)量指標(biāo)的制品。即根據(jù)產(chǎn)品類型，特點(diǎn)

選擇合適的下游技術(shù)（downstreamprocessing）的組合。

六、微生物工業(yè)產(chǎn)品的類型

1.微生物菌體的發(fā)酵

以獲得具有某種用途的菌體為目的的發(fā)酵工業(yè)。

傳統(tǒng)的菌體發(fā)酵工業(yè)：①面包酵母發(fā)酵②微生物菌體蛋白（單細(xì)胞蛋白）

現(xiàn)代的菌體發(fā)酵工業(yè)：藥用真菌（如冬蟲夏草，靈芝與天麻共生的密環(huán)菌）

農(nóng)業(yè)上——生防治劑：蘇云金桿菌（Bt）,蠟狀芽抱桿菌，細(xì)胞中的伴抱晶體可以殺滅鱗

翅目和雙翅目害蟲；絲狀真菌的白僵菌，綠僵菌可以防治松毛蟲；木霉菌可以防治生物病

害。

另外，活性乳酸菌制劑，用以改善人體腸道微環(huán)境，也是一種菌體的直接利用。還有人畜

防治疾病用的疫苗等。

2.微生物酶發(fā)酵

酶普遍存在于動物，植物和微生物中。酶的最初來源是從動植物組織中提取。但目前應(yīng)用

的酶大多來自微生物發(fā)酵。如在食品工業(yè)中，用微生物生產(chǎn)的淀粉醐和糖化酶用于生產(chǎn)葡萄

糖，氨基酰化酶用于拆分DL氨基酸。

目前應(yīng)用的醐大多來自微生物發(fā)酵。

3.微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵：以微生物代謝產(chǎn)物作為產(chǎn)品是發(fā)酵工業(yè)中種類最多，也是最重要

的部分。這類產(chǎn)品可分為兩類：

(1)初級代謝產(chǎn)物(primarymetabolite)

菌體生長繁殖所必需的，在對數(shù)生長期產(chǎn)生的物質(zhì)，如氨基酸、核甘酸、蛋白質(zhì)等。許多

初級代謝產(chǎn)物在經(jīng)濟(jì)上.具有相當(dāng)?shù)闹匾浴?/p>

(2)次級代謝產(chǎn)物(secondarymetabolite)

與菌體生長繁殖無明顯關(guān)系，是在菌體生長的穩(wěn)定期(靜止期)合成的具有特定功能的產(chǎn)

物。如抗生素、生物堿、細(xì)菌毒素、植物生長因子、色素等。

也把初級代謝物的非生物量的積累看成是次級代謝物。如微生物發(fā)酵產(chǎn)生的維生素，檸檬

酸，谷氨酸。

初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物的異同：

4.微生物的生物轉(zhuǎn)化

利用微生物細(xì)胞的一種或多種酶，把一種化合物轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)相關(guān)的更有價值的產(chǎn)物。最

古老的生物轉(zhuǎn)化：利用菌體將乙醇轉(zhuǎn)化成乙酸的醋酸發(fā)酵。另外還有：

異丙醇T丙醇葡萄糖-葡萄糖酸山梨醇TL-山梨糖

最顯著的特點(diǎn)是特異性強(qiáng)，包括反應(yīng)特異性，結(jié)構(gòu)位谿特異性和立體特異性。山微生物細(xì)

胞的酶或醐系對底物某一特定部位進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)。

5.微生物特殊機(jī)能的利用

①利用微生物消除環(huán)境污染

②保持生態(tài)平衡等

③濕法冶金(金屬的浸瀝回收)

④利用基因工程菌株開拓發(fā)醉工業(yè)新領(lǐng)域

第一章菌種選育

第一節(jié)工業(yè)常用微生物及要求

一、常見微生物

(一)細(xì)菌(bacteria)

發(fā)酵工業(yè)中常用的細(xì)菌主要是桿菌，主要有：

醋桿菌屬(Acetobacter)

乳桿菌屬(Lactobacillus)

芽抱桿菌屬(Bacillus):a-淀粉酶，蛋白酶，肌甘、鳥昔等核甘。其中最為重要的是枯草

芽泡桿菌(Bacillussubtilis)

短桿菌屬(Brevibacterium)：谷氨酸

棒桿菌屬(Corynebacterium)：谷氨酸

(二)放線菌(actinomyces)

屬原核微生物(有菌絲體，無橫隔，不具完整的核。)最大的經(jīng)濟(jì)價值在于產(chǎn)生多種抗生

素(antibiotic)o

鏈霉菌(Streptomyces)：紅，金，土，氯，鏈霉素

小單胞菌屬(Micromonospora)：慶大霉素

(三)霉菌(mould)

亦稱絲狀真菌(不是分類學(xué)上的名詞，凡在營養(yǎng)基質(zhì)上形成絨毛狀，網(wǎng)狀或絮狀菌絲的真

菌統(tǒng)稱霉菌。)

1.曲霉屬(Aspergillus)

黑曲霉(A.niger)產(chǎn)蛋白酶，淀粉酶，果酸酶，變異菌株產(chǎn)檸檬酸

米曲霉(A.oryzae)產(chǎn)淀粉酶，蛋白酶，釀酒的糖化曲和醬油曲

黃曲霉(A.flavus)產(chǎn)黃曲霉毒素

米曲霉和黃曲霉均為半知菌;

2.青霉屬(Penicillum)：例如桔子上的綠色斑點(diǎn)

桔青霉(P.citrinum)：產(chǎn)生5'一磷酸二酯酶，降解核糖核酸為四個單核甘酸。

3.根霉屬(Rhizopus)接合菌

米根霉(R.oryzae)

華根霉(R.chinensis)

酒藥和酒曲中含有米根霉或華根霉。

4.紅曲霉屬（Monascus）

淀粉酶，麥芽糖酶，蛋白酶，檸檬酸等。可生產(chǎn)食用紅色素。

（四）酵母（yeast）

單細(xì)胞真核微生物，低等真菌。

①酵母屬（Saccharomyces）

啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）

②假絲酵母屬（Candida）

產(chǎn)骯假絲酵母（Candidautilis）生產(chǎn)飼料酵母，其蛋白質(zhì)和維生素含量都比啤酒酵母高。

可利用糖蜜，土豆淀粉廢液生產(chǎn)人畜可食用蛋白質(zhì)。

③畢赤酵母屬（Pichia）

產(chǎn)膜酵母，在液面形成白膜，是釀造物和酒類飲料的污染菌。

（五）其它微生物

1.擔(dān)子菌（basidiomycetes）

即菇類（mushroom）擔(dān)子菌資源的利用已經(jīng)引起人們的重視?？捎糜诙嗵羌翱拱┧幬镩_

發(fā)。

2,藻類（alga）是分布極廣的一類自養(yǎng)微生物資源，許多國家把它用作人類保健食品和飼

料。從蛋白質(zhì)產(chǎn)率看，螺旋藻是大豆的28倍，每公頃珊列藻所得蛋白質(zhì)是小麥的20?35

倍。

（六）噬菌體（phage）凡用細(xì)菌和放線菌為生長菌株的發(fā)酵工業(yè)，均存在噬菌體的危害

問題。噬菌體在自然界分布極為廣泛.其三大特點(diǎn)是：

①體積比細(xì)菌小的多，可以通過細(xì)菌濾器。

②沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由核酸的蛋白質(zhì)構(gòu)成。

③營專性活物寄生，即只能在特異性寄主細(xì)胞中增殖。

烈性噬菌體——引起寄主細(xì)胞迅速裂解。受感染的細(xì)菌稱敏感性細(xì)菌。

溫和噬菌體——隨寄主細(xì)胞的繁殖而繁殖。含溫利噬菌體的細(xì)菌稱溶原性細(xì)菌。

噬菌體危害以細(xì)菌和放線菌為生產(chǎn)菌株的發(fā)酵工業(yè)。

二、微生物工業(yè)對菌種的要求

1.原料廉價，生長迅速，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高。

2.易控制培養(yǎng)條件，發(fā)酵周期較短。

3.抗雜菌和噬菌體的能力強(qiáng)。

4.菌種遺傳性能穩(wěn)定，不易變異和退化，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素，保證安

全生產(chǎn)。

第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育

在正常生理?xiàng)l件F,微生物依靠其代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，趨向于快速生長和繁殖。但發(fā)酵工業(yè)需

要培養(yǎng)微生物使其積累大量的代謝產(chǎn)物。所以要采取種種措施打破菌的正常代謝，積累所需

要的代謝產(chǎn)物。如青霉素的原始菌種產(chǎn)黃色素，經(jīng)菌種選育，可使產(chǎn)生菌不再分泌黃色素。

土霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)生大量泡沫，經(jīng)誘變處理改變遺傳特性可使泡沫減少，節(jié)省大量消泡劑。菌

種經(jīng)誘變獲得抗phage的特性。

菌種選育的目的是改良菌種的特性，使其符合工業(yè)生產(chǎn)的要求。

一、自然選育：從自然界分離獲得菌種，根據(jù)菌種的自發(fā)突變進(jìn)行篩選而獲得菌種

㈠從自然界分離獲得菌種

1.采樣：取地面5?15cm的土壤。

2.增殖培養(yǎng)：（富集培養(yǎng)enrichment）提供有利于所需菌株生長而不利于其它菌型生長

的條件，使所需菌株大量繁殖，從而有利于分離它們。

方法：

（1）控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分：如淀粉瓊脂培養(yǎng)基用于絲狀真菌增殖。

（2）控制培養(yǎng)條件：

細(xì)菌，放線菌：pH7.0?7.535?37℃

霉菌，酵母菌:pH4.5?6.020?28℃

（3）抑制不需要的菌類

分離細(xì)菌：加入丙酸鈉以抑制霉菌，酵母

分離厭氧菌：焦性沒食子酸與氫氧化鈉反應(yīng)除氧

3.純種分離

（1）劃線法：簡單、快速。

（2）稀釋法：在培養(yǎng)基上分離的菌落單一均勻，獲得純種的幾率大，適合分離具有嶷延

性的微生物。

固體培養(yǎng)基四區(qū)劃法接種法

步驟-

接種針先以火焰滅菌法滅菌

步驟二

輕觸營養(yǎng)平板上無菌的瓊脂處冷卻

步驟三

以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細(xì)菌。

步驟四

更換一個新的無菌營養(yǎng)平板

步驟五

將接種針上的細(xì)菌劃于?個新的營養(yǎng)平板上。此為第一菌區(qū)。

步驟六

重復(fù)第一步驟，將接種針以火焰滅菌法滅菌，然后輕觸瓊脂無菌處冷卻。

步驟七

由第五步驟的第?區(qū)中劃出第二區(qū)，如右上圖。

步驟八

重復(fù)第六以及第七步驟，由第七步驟的第二區(qū)中劃出第三區(qū)，如右上圖。

步驟九

重復(fù)第六以及第七步驟，由第八步驟的第三區(qū)中劃出第四區(qū)，劃滿剩下的空間。完成后的

營養(yǎng)平板，如右上圖。

步驟十

在營養(yǎng)平板上貼好標(biāo)簽，標(biāo)示好接種日期、操作者姓名、菌種學(xué)名以及培養(yǎng)基名稱。

固體培養(yǎng)基的稀釋涂抹接種法

【目的】用來分離單一菌落或用來估計(jì)樣本中微生物的數(shù)目。

需要使用的儀器——震蕩機(jī)

吸取準(zhǔn)備好欲稀釋的菌液

吸取充分均勻后的菌液

取含有9mL無菌水之試管，將試管口過火滅菌。將菌液路入，此時試管須做記號為第一

次稀釋。

將試管于震蕩機(jī)上，使菌液混合均勻

取出試管中的第一次十倍稀釋菌液1mL,加入另一個新的含9mL無菌水的試管中。重復(fù)

此步驟直至所需要的稀釋濃度。

從最后稀釋菌液中吸取0.1mL菌液，谿入準(zhǔn)備好的無菌瓊脂內(nèi)。

將三角玻璃棒浸于酒精中

將三角玻璃棒在火焰上燃燒（須注意勿使燃燒中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃燒）

使用玻璃棒將菌液均勻涂布開來，將培養(yǎng)皿路于恒溫培養(yǎng)箱中隔天觀察菌落數(shù)目，再依照

稀釋倍數(shù)推算出菌液濃度。

4.生產(chǎn)性能的測定：純種分離后得到菌株數(shù)量大，不可能一一進(jìn)行性能測試。一般采用兩

步法：初篩，復(fù)篩。從而獲得較好菌株（野生型菌株）（區(qū)別于變異菌株）。

初篩：以量為主

復(fù)篩：以質(zhì)為主

㈡從自發(fā)突變體中獲得菌株

微生物可遺傳的特性發(fā)生變化稱變異，又稱突變，是微生物產(chǎn)生變種的根源，也是育種的

基礎(chǔ)。自然突變是指在自然條件下出現(xiàn)的基因變化。但自發(fā)突變的頻率較低，往往不能符合

工業(yè)生產(chǎn)的要求。因此要利用誘變劑提高菌種的突變頻率。

二、誘變育種

用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變。是當(dāng)前菌種選育的一種主要方法。因?yàn)槿斯?/p>

誘變能提高突變頻率和擴(kuò)大變異譜，速度快，方法簡便。但誘發(fā)突變隨機(jī)性大，必須與大規(guī)

模的篩選工作相配合。所以誘變育種的主要環(huán)節(jié)是：

（1）以合適的誘變劑處理細(xì)胞懸浮液——誘變

（2）用合適的方法淘汰負(fù)效應(yīng)變異株，選出性能優(yōu)良的正變異株——篩選

誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)。

誘變劑：

物理：紫外線，快中子

化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胭

1,誘變育種的程序

選擇出發(fā)菌株（parentstrain）一制備菌懸液―前培養(yǎng)（添加喋吟，暗嚏或酵母膏提高變異

率）一誘變（物理誘變，化學(xué)誘變）一變異菌株的分離和篩選

2.突變株的篩選：

搖瓶篩選法：挑單菌落接斜面一接搖瓶-測生產(chǎn)能力

瓊脂塊篩選法：打孔器取出培養(yǎng)，珞鑒定平板測發(fā)酵產(chǎn)量。

①隨機(jī)篩選：傳統(tǒng)方法，但要耗費(fèi)大量的人力物力。近年來，隨著遺傳學(xué)，生物化學(xué)知識

的積累，人們對于代謝途徑，代謝調(diào)控機(jī)制了解得更多，所以篩選方法逐漸轉(zhuǎn)向理化性篩選。

②理化性篩選：介紹初級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選。根據(jù)代謝調(diào)控機(jī)理，氨基酸、核甘酸

合成途徑中普遍存在反饋?zhàn)瓒艉头答佉种?。這對于生產(chǎn)菌本身是有意義的，可以避免合成過

多的代謝物而造成的浪費(fèi)。但在工業(yè)中，需要生產(chǎn)菌產(chǎn)生大量的氨基酸，核甘酸等產(chǎn)物。

所以要打破微生物原有的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)。

方法㈠降低終產(chǎn)物濃度

a.篩選終產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型

獲得缺少第三個酶的突變株，需供給E才生長。限量供給E,可打破反饋調(diào)節(jié)，產(chǎn)生大量

C?

b.篩選細(xì)胞膜透性改變的突變株

使終產(chǎn)物排出細(xì)胞，以降低細(xì)胞內(nèi)終產(chǎn)物濃度，避免終產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)。

如：用谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)的生物素營養(yǎng)缺陷型(biotindeficiency)

進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵。

生物素：是B族維生素的一種。又稱維生素H或輔酶R。生物素是合成脂肪酸所必需的。

因?yàn)橹舅岬纳锖铣墒牵?/p>

利用糖代謝中間產(chǎn)物乙酰CoA(直接原料是丙二酸單酰CoA)在乙酰CoA竣化前(多酶

復(fù)合體，輔基為生物素)催化下合成。

脂肪酸+甘油磷酸

磷脂+蛋白質(zhì)

生物膜

因此，脂肪酸是組成細(xì)胞膜類脂的必要成分。

該缺陷型在生物素處于限量的情況下，不利于脂肪酸的合成，因而使細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生

變化，有利于谷氨酸透過細(xì)胞膜分泌至體外的發(fā)酵液中。

如果使用油酸缺陷型菌株或甘油缺陷型菌株，即使在生物素過量的條件下，也可使谷氨酸

在體外大量積累。

㈡篩選抗反饋突變菌株

a.篩選結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株

用代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類似物處理微生物細(xì)胞，可抑制或阻遏自身的合成醐類。因此細(xì)胞由于

缺少這種氨基酸不能生長或者死亡.而那些對該結(jié)構(gòu)類似物不敏感的突變株，仍可生長，從

而可以篩選出該代謝物的抗反饋突變株。

b.利用回復(fù)突變篩選抗反饋突變菌株

出發(fā)菌株經(jīng)誘變處理，獲得對產(chǎn)物敏感的營養(yǎng)缺陷型。再將營養(yǎng)缺陷型進(jìn)行第二次誘變處

理得到恢復(fù)突變株。篩選的目的不是要獲得完全恢復(fù)原有狀態(tài)的回復(fù)突變株，而是希望經(jīng)過

兩次誘發(fā)突變所得的回復(fù)突變株不受產(chǎn)物的反饋抑制。

如：谷氨酸棒桿菌的肌甘酸脫氫酶的回復(fù)突變株對其終產(chǎn)物鳥甘酸的反饋調(diào)節(jié)不敏感，從

而提高了鳥甘酸的產(chǎn)量。

第三節(jié)生產(chǎn)菌種的改良

上述誘變育種可以獲得高產(chǎn)菌株，缺點(diǎn)是工作量大，且?guī)в邢喈?dāng)?shù)拿つ啃?，不能達(dá)到定向

育種的目的。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，原生質(zhì)體融合，DNA重組可以達(dá)到改良菌種的目的。

一、原生質(zhì)體融合（protoplastfusion）

原生質(zhì)體：脫去細(xì)胞壁，只有細(xì)胞膜包裹的球狀體。

1.標(biāo)記菌株的篩選：要求兩個親株性能穩(wěn)定，并帶有遺傳標(biāo)記（營養(yǎng)缺陷型和抗藥性）

2.原生質(zhì)體的制備：用適當(dāng)?shù)娜鼙诿赋ゼ?xì)胞壁，得到兩種不同的原生質(zhì)體

3.原生質(zhì)體的融合與再生：兩個親株的原生質(zhì)體在高滲條件混合，在助融劑（融合劑）作

用下融合，這是原生質(zhì)體融合的先決條件。然后是細(xì)胞壁再生，即恢復(fù)完整細(xì)胞并能生

長分裂（必要條件）。

聚乙二醇（PEG）一脫水劑

助融劑

Ca2+-提高融合頻率

4.融合子的選擇：

融合后產(chǎn)生兩種情況：

真正的融合——產(chǎn)生雜合二倍體或單倍重組體

暫時的融合——形成異核體

所以要獲得真正融合子，必須在融合子再生后，進(jìn)行幾代自然分離選擇，才能確定。

該方法仍屬于一種半理化性篩選，因?yàn)楸M管采用的兩親株的特性是己知的，但它們基因組

的交換和重組是非定向的。

二、DNA重組技術(shù)（DNArecombinationtechnology）

又稱基因工程，遺傳工程。是以分子遺傳學(xué)的理論為基礎(chǔ)，綜合分子生物學(xué)和微生物遺傳

學(xué)的最新技術(shù)而發(fā)展起來的一門技術(shù)。是按人的意志，將某一生物（供體）的遺傳信息在體

外經(jīng)人工與載體相接（重組），構(gòu)成重組DNA分子，然后轉(zhuǎn)入另一生物體（受體）細(xì)胞中，使

被引入的外源DNA片段在后者內(nèi)部得以表達(dá)和遺傳。

1.目標(biāo)DNA片斷的獲得

2.與載體DNA分子的連接

3.重組DNA分子引入宿主細(xì)胞

4.從中選出所需重組DNA分子的宿主細(xì)胞

作為發(fā)酵工業(yè)的工程菌在此四步之后還需加上外源基因的表達(dá)及穩(wěn)定性的考慮。

第四節(jié)菌種的衰退、復(fù)壯與保藏

一、菌種的衰退

衰退的原因：

1.菌種保藏不當(dāng)

2.菌種生長條件沒有得到滿足

二、菌種的復(fù)壯

1.純種分離

2.通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯

3.淘汰已衰退的個體

三、菌種保臧

1.原理人工創(chuàng)造條件使菌體的代謝活動處于休眠狀態(tài)。

低溫、干燥、缺氧、缺營養(yǎng)物質(zhì)

2.方法

（1）斜面保藏法：用螺旋口試管防失水，盡量減少碳源含量

（2）干燥保藏法：沙土管，固體曲

（3）懸液保藏法：將微生物懸浮在不含養(yǎng)分的溶液中（水、生理鹽水、buffer）

（4）冷凍干燥保藏法：冷凍，減壓蒸發(fā)除去水分，使生命活動停止

（5）低溫保藏法：大多數(shù)微生物可在-20℃以下的低溫中保藏，比冷凍干燥更為常用。

（6）液氮保藏法

第五節(jié)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)

一、微生物的培養(yǎng)方法

1.表面培養(yǎng)：是一種好氧靜貉培養(yǎng)法。如固體斜面，固體平板，液體培養(yǎng)表面形成的膜狀

物。

2.固體培養(yǎng)：工業(yè)上常用大米，款皮，米糠，谷殼等，再加??些其它營養(yǎng)成分滅菌后制成。

特點(diǎn)：疏松，培養(yǎng)基一種子罐

固體培養(yǎng)基

（一級種子）（二級種子）

一搖瓶->種子培養(yǎng)一發(fā)酵培養(yǎng)

（二）斜面菌種的培養(yǎng)P247

1.不宜多次移種。?般只移接三次，防自然變異。

2.活化斜面中加0.1%葡萄糖。

培養(yǎng)基特點(diǎn)：原料較精細(xì)。

（三）一級種子培養(yǎng)（搖瓶）

用三角瓶進(jìn)行，液體恒溫振蕩，即搖瓶。

有些發(fā)酵產(chǎn)品（如谷氨酸），一級種子培養(yǎng)不用搖瓶，而是用大型斜面（茄瓶），優(yōu)點(diǎn)是可一

次制備一批大型斜面，珞于冰箱中，比液體斜血培養(yǎng)物易于保存，不必每天制備液體一級種

子。

培養(yǎng)基特點(diǎn)：使用的原料基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。

（四）二級種子培養(yǎng)（種子罐）

種子罐大小根據(jù)發(fā)酵罐大小和接種量確定。培養(yǎng)基組成與發(fā)酵罐培養(yǎng)基基本-致，但所含

的配比量可有差異。

培養(yǎng)基的特點(diǎn)：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。

大量地接入培養(yǎng)成熟菌種的優(yōu)點(diǎn)：

1.可以縮短生長過程的延緩期，因而縮短了發(fā)酵周期，提高了設(shè)備利用率。

2.節(jié)約了發(fā)酵培養(yǎng)的動力消耗。

3.并有利于減少染菌機(jī)會。

（五）種子罐級數(shù)：制備種子需逐級擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)。

①對于生長快的細(xì)菌（如谷氨酸），種子罐一發(fā)酵罐——二級培養(yǎng)

（一級種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)）

②對于生長較慢的菌種（如青霉素生產(chǎn)菌），利用：

種子罐一種子罐T發(fā)酵罐——三級培養(yǎng)

（二級種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)）

（六）接種齡與接種量P253

①種齡：種子培養(yǎng)時間稱種齡。

生產(chǎn)中，一般選在生命力極為旺盛的對數(shù)生長期。

種齡過于年輕：前期生長緩慢，發(fā)酵周期延長

種齡過于年老：導(dǎo)致生產(chǎn)能力衰退

最適種齡通過實(shí)驗(yàn)確定。

②接種量

接種量是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。

發(fā)酵罐的接種量大小與菌種特性，種子質(zhì)量和發(fā)酵條件等有關(guān)。

一般細(xì)菌接種量在1%左右，霉菌接種量在10%左右(7%-15%)

接種量過大：菌種生長快，培養(yǎng)基過稠，溶氧不足。

接種量過?。喊l(fā)酵前期菌體生長緩慢，發(fā)酵周期延長。

近年來，谷氨酸生產(chǎn)中，以大接種量和豐富培養(yǎng)基作為高產(chǎn)措施。如：高生物素，大接種

量，添加青霉素的工藝。

為了加大接種量，有些品種的生產(chǎn)利用雙種法，即兩個種子罐的種子接入一個發(fā)酵罐。

第二章培養(yǎng)基及其制備

從微生物營養(yǎng)要求看，所有微生物都需要碳源，氮源，無機(jī)元素，水及生長物質(zhì)。如果是

好氧微生物還需要氧氣。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上配制含有純化合物的培養(yǎng)基非常簡單，但在大規(guī)模

生產(chǎn)上是不合適的。

第一節(jié)工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基的作用：

-滿足菌體的生長

-促進(jìn)產(chǎn)物的形成

一、工業(yè)上常用的碳源(carbonsource)

1.應(yīng)用最廣的是谷物淀粉(玉米、馬鈴薯、木薯淀粉)，淀粉水解后得葡萄糖。

使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類。

缺點(diǎn)：

a.難利用、發(fā)酵液比較稠、一般>2.0%時加入一定的a-淀粉酶。

b.成分較復(fù)雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等。

優(yōu)點(diǎn):

來源廣泛、價格低，可解除葡萄糖效應(yīng)。

2.葡萄糖

-所有的微生物都能利用葡萄糖，但會引起葡萄糖效應(yīng)。

-工業(yè)上常用淀粉水解糖，但是糖液必須達(dá)到一定的質(zhì)量指標(biāo)。

3.糖蜜

制糖工業(yè)上的廢糖蜜wastemolasses或結(jié)晶母液

包括：甘蔗糖蜜(canemolasses)------糖高，氮少

甜菜糖蜜(beetmolasses)

兩者成分見P226

糖蜜使用的注意點(diǎn)：除糖份外，含有較多的雜質(zhì)，對發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響，需要進(jìn)行預(yù)處

理。

二、工業(yè)上常用的氮源(nitrogensource)

1.無機(jī)氮(迅速利用的氮源)

種類：氨水、鍍鹽或硝酸鹽、尿素

特點(diǎn)：吸收快，但會引起pH值的變化

選擇合適的無機(jī)氮源有兩層意義：

-滿足菌體生長

-穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH

無機(jī)氮源的影響：硫酸鏤>硝酸錢>硝酸鈉>尿素

2.有機(jī)氮：

來源：一些廉價的原料，如玉米漿、豆餅粉、花生餅粉、魚粉、酵母浸出膏等。其中玉米

漿(玉米提取淀粉后的副產(chǎn)品)和豆餅粉既能做氮源又能做碳源。

成分復(fù)雜：除提供氮源外，還提供大量的無機(jī)鹽及生長因子。

微生物早期容易利用無機(jī)氮，中期菌體的代謝酶系已形成——有機(jī)氮源。有機(jī)氮源來源不

穩(wěn)定，成份復(fù)雜，所以利用有機(jī)氮源時要考慮到原料波動對發(fā)酵的影響。

三、無機(jī)鹽(inorganicmineral)

硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物及一些微量元素。無機(jī)鹽含量對菌體生長和產(chǎn)物的生成影響很大。

四、生長因子(growthfactor)

微生物生長不可缺少的微量有機(jī)物質(zhì)。如氨基酸、喋吟、喀唯、維生素。

生長因子不是所有微生物都必需的。只是對于某些自己不能合成這些成分的微生物才是必

不可少的營養(yǎng)物。如以糖質(zhì)原料為碳源的谷氨酸生產(chǎn)菌均為生物素缺陷型(biotinauxotroph),

以生物素為生長因子。

1.生物素

作用:(1)主要影響細(xì)胞膜通透性。P263

(2)影響菌體的代謝途徑。

生物素濃度對菌體生長和谷氨酸積累均有影響。大量合成谷氨酸所需要的生物素濃度比菌

體生長的需要量低，即為菌體生長需要的，亞適量原因：P263,P260(0D值)

生物素過量：菌體大量繁殖，不產(chǎn)或少產(chǎn)谷氨酸。

生物素不足：菌體生長不好，谷氨酸產(chǎn)量也低。

-谷氨酸產(chǎn)生菌為生物素缺陷型。

-要達(dá)到菌體生長需要的,亞適量

生物素存在于動植物組織中，多與蛋白質(zhì)呈結(jié)合狀態(tài)存在。用酸水解可以分開。那么，生

產(chǎn)上有哪些原料可以作為生物素來源呢？

2.提供生長因子的農(nóng)副產(chǎn)品原料

(1)玉米漿：(comsteepliquor,CSL)

最具代表性。雖然主要用作氮源，但含有乳酸，少量還原糖和多糖，含有豐富的氨基酸，

核酸，維生素，無機(jī)鹽等。常作為提供生長因子的物質(zhì)。所以，從某種意義上說，玉米漿液

用于配制發(fā)酵培養(yǎng)基是發(fā)酵工業(yè)中的一個重大發(fā)現(xiàn)。

(2)款皮水解液：可代替玉米漿，但蛋白質(zhì)，氨基酸等營養(yǎng)成分比玉米漿少。

(3)糖蜜：兩種糖蜜(canemolasses,beetmolasses)均可代替玉米漿。但氨基酸等有機(jī)

氮含量較低。

(4)酵母：可用酵母膏，酵母浸出液或直接用酵母粉。

第二節(jié)淀粉水解糖的制備

在工業(yè)生產(chǎn)中，將淀粉水解為葡萄糖(glucose)的過程稱淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉

水解糖。其主要糖分是葡萄糖。根據(jù)水解條件不同，尚有數(shù)量不等的少量麥芽糖及其它一些

二糖，低聚糖等復(fù)合糖。

一、淀粉水解制糖的意義

1.大多數(shù)微生物不能直接利用淀粉(所有的氨基酸生產(chǎn)菌不能直接利用)

2.有些微生物能夠直接利用淀粉作原料.，但必須在微生物產(chǎn)生淀粉酶后才能進(jìn)行，過程緩

慢，發(fā)酵周期延長。

3.若直接利用淀粉作原料，滅菌過程的高溫會導(dǎo)致淀粉結(jié)塊，發(fā)酵液粘度劇增。

二、淀粉水解糖的制備方法及原理

(一)酸解法(acidhydrolysismethod)

以酸為催化劑，在高溫高壓下使淀粉水解生成葡萄糖的方法。

1.水解過程：

總反應(yīng)式：(C6H10O5)n+nH2O-nC6H12O6

過程：(C6H10O5)nT(C6H10O5)XTC12H22O11-?C6H12O6

淀粉糊精麥芽糖葡萄糖

H+對作用點(diǎn)無選擇性，A-1,4-糖背鍵和A-1,6-糖昔鍵均被切斷。

2.葡萄糖的復(fù)合反應(yīng)和分解反應(yīng)

在水解過程中，山于受到酸和熱的作用，一部分葡萄糖會發(fā)生復(fù)合反應(yīng)和分解反應(yīng)。

淀粉

一鹽酸

復(fù)合反應(yīng)葡萄糖分解反應(yīng)

//\

復(fù)合二糖5'一羥甲基糠醛

TfT

復(fù)合低聚糖有機(jī)酸、有色物質(zhì)

損失葡萄糖量7%<l%

不利影響：

(1)降低了葡萄糖的收率。

(2)給產(chǎn)物的提取和糖化液的精制帶來困難。

復(fù)合反應(yīng)：葡萄糖分子間經(jīng)1,6糖背鍵結(jié)合成龍膽二糖(有苦味)，異麥芽糖和其它低

聚糖(復(fù)合低聚糖)。生成的多數(shù)復(fù)合糖不能被微生物利用，使發(fā)酵結(jié)束時殘?zhí)歉摺?/p>

分解反應(yīng)：生成的5'一羥甲基糠醛是產(chǎn)生色素的根源，增加了糖化液精制脫色的困難。

如何控制分解反應(yīng)和復(fù)合反應(yīng)的發(fā)生？

(1)淀粉乳濃度

(2)酸濃度都不能過高原因P229-230

(3)溫度

3.評價

優(yōu)點(diǎn)：工藝簡單，水解時間短，生產(chǎn)效率高，設(shè)備周轉(zhuǎn)快。

缺點(diǎn)：

(1)副產(chǎn)物多，影響糖液純度，一般DE值(葡萄糖值)只有90%左右。

(2)對淀粉原料要求嚴(yán)格，不能用粗淀粉，只能用純度較高的精制淀粉。

DE值：dextroseequivalentvalue

(葡萄糖當(dāng)量值)

表示淀粉糖的含糖量。

還原糖含量（％）

口￡值=------x100%

干物質(zhì)含量（％）

P231（中間）圖最高點(diǎn)下降的原因？

（二）酶解法（enzymehydrolysismethod）

用專一性很強(qiáng)的淀粉酶及糖化酶將淀粉水解為葡萄糖的工藝。

分兩步：

（1）液化：用A-淀粉酶將淀粉轉(zhuǎn)化為糊精和低聚糖

（2）糖化：用糖化酶（又稱葡萄糖淀粉酶）將糊精和低聚糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖。

所以，淀粉的液化和糖化均在酶作用下進(jìn)行，又稱雙酶法（doubleenzymehydrolysis

method）o

液化（liquification）

a—淀粉酶水解底物內(nèi)部的a—1,4糖昔鍵，不能水解a-1,6糖昔鍵，一般采用耐高溫淀粉

酶，使液化速度加快。85-90℃o

淀粉的糊化與老化：山于淀粉顆粒的結(jié)晶性結(jié)構(gòu)對酶作用的抵抗力非常強(qiáng)，需要先加熱淀

粉乳，使淀粉顆粒吸水膨脹，糊化，破壞結(jié)晶性結(jié)構(gòu)。

糊化：淀粉受熱后，淀粉顆粒膨脹，晶體結(jié)構(gòu)消失，互相接觸變成糊狀液體，即使停止攪

拌，淀粉也不會再沉淀的現(xiàn)象。

老化：指分子間氫鍵已斷裂的糊化淀粉又重新排列形成新的氫鍵的過程，也就是復(fù)結(jié)晶的

過程。

▲淀粉酶很難進(jìn)入老化淀粉的結(jié)晶區(qū)起作用，必須采取相應(yīng)的措施控制糊化淀粉的老化。

液化程度的控制（液化后需糖化的原因）：如果讓液化持續(xù)下去，雖然最終產(chǎn)物也是葡萄

糖和麥芽糖，但：

a.糖液的DE值低（a-淀粉酶不能水解a-1,6糖昔鍵）

b.液化在較高溫度下進(jìn)行，液化時間加長，一部分已液化的淀粉又會重新結(jié)合成硬束狀態(tài),

老化，使糖化酶難以作用。

c.液化的目的是為了給糖化酶的作用創(chuàng)造條件，而糖化酶水解糊精及低聚糖等分子時，需

先與底物分子生成絡(luò)合結(jié)構(gòu)，然后發(fā)生水解作用，這就要求被作用的底物分子有一定的大

小范圍才有利于糖化酶生成這種結(jié)構(gòu)，底物分子過大或過小都會妨礙酶的結(jié)合和水解速度。

根據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，DE值在20-30之間為好，液化終點(diǎn)可通過碘液判斷，此時呈棕色。P25

液化到終點(diǎn)后，為了避免液化酶對糖化酶的影響，需對液化液進(jìn)行滅酶處理，升溫到100℃,

保持10分鐘，降溫，供糖化用。

2.糖化(saccharification)

糖化酶從非還原性末端水解a-1,4糖甘鍵和a-1,6糖甘鍵。

終點(diǎn)確定：DE值達(dá)最高時(DE值不再上升時)，停止酶反應(yīng)(加熱至80℃,20min滅前)。

否則DE值將由于葡萄糖經(jīng)a-1,6糖背鍵起復(fù)合反應(yīng)而降低。糖化的溫度(50-60℃)和pH

值(4.0-5.0)決定于所用糖化劑的性質(zhì)。

3.評價

優(yōu)點(diǎn)：

(1)反應(yīng)條件溫和，不需高溫、高壓設(shè)備。

(2)副反應(yīng)少，水解糖液純度高。

(3)對原料要求粗放，可用粗原料并在較高淀粉乳濃度下水解。

(4)糖液顏色淺，質(zhì)量高。

缺點(diǎn)：

(1)生產(chǎn)周期長，一般需要48小時。

(2)需要更多的設(shè)備，且操作嚴(yán)格。

(三)酸酶結(jié)合法(acid-enzymehydrolysismethod)

集酸解法和酶解法的優(yōu)點(diǎn)而采取的生產(chǎn)工藝。根據(jù)原料淀粉性質(zhì)分:

1.酸酶法：先將淀粉酸水解成糊精和低聚糖，再用糖化酶將其水解為葡萄糖。

適用：淀粉顆粒堅(jiān)硬（如玉米、小麥）的原料，若用-淀粉酶液化，短時間液化，反應(yīng)

往往不徹底。

2.酶酸法：先用-淀粉酶液化，再用酸水解。

適用：顆粒大小不一（如碎米淀粉）的淀粉原料，若用酸法，則水解不均勻。或者小的水

解，大的未水解：或者大的水解，時間長，小的則發(fā)生復(fù)合反應(yīng)。

（四）不同糖化工藝的比較

項(xiàng)目

酸解法

酸酶結(jié)合法

酶解法

DE值

91

95

98

羥甲基糠醛（％）

0.3

0.008

0.003

色度100.30.2

淀粉轉(zhuǎn)化率909598

工藝條件高溫加壓高溫加壓常溫

過程耗能多多少

副產(chǎn)物多中少

生產(chǎn)周期短中長

設(shè)備規(guī)模小中大

防腐要求高

較高

低

適合發(fā)酵工藝情況

差

中

有利

第三節(jié)糖蜜原料

糖蜜是很好的發(fā)酵原料，用其生產(chǎn)，可降低成本，節(jié)約能源，便于實(shí)現(xiàn)高糖發(fā)酵工藝，但

有些成分不適合發(fā)酵，必須進(jìn)行預(yù)處理。

-、糖蜜的分類及組成

含糖量含氮量

1.分類：canemolasses高低

beetmolasses低高

rawsugarmolasses精制粗糖時分離出的糖蜜

hightestmolasses（高級糖蜜）

glucosemolasses葡萄糖工業(yè)不能再結(jié)晶葡萄糖的母液

2.組成：粘稠、黑褐色、半流動狀液體。組成各不相同。除含有發(fā)酵性糖分外，還含有膠

體物質(zhì)，灰分，維生素，氨基酸。甘蔗糖蜜中生物素含量較甜菜糖蜜中高。（國外大多以糖

蜜為原料生產(chǎn)谷氨酸。

二、糖蜜的預(yù)處理：

膠體（產(chǎn)生大量泡沫）和灰分影響菌體生長及產(chǎn)品純度。

1.澄清：加酸，加絮凝劑（石灰）

2.脫鈣：力口Na2c03

3.降低生物素含量（谷氨酸發(fā)酵中）

（1）去除生物素：活性炭及樹脂吸附

（2）拮抗生物素：加表面活性劑（Tween60）,阻止油酸合成一磷脂合成不足。

（3）加青霉素：使新增殖的子細(xì)胞不具有完整的細(xì)胞壁，改善了細(xì)胞膜的滲透性。

另外，從菌種方面：使用油酸或甘油缺陷型，不受培養(yǎng)基中高生物素的影響。

第三章培養(yǎng)基滅菌與空氣凈化

第一節(jié)培養(yǎng)基滅菌

一、滅菌的原理和方法

消毒（disinfection）與滅菌（sterilization）的區(qū)別？

消毒是指用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病原微生物。?般只能殺死營養(yǎng)

細(xì)胞而不能殺死細(xì)菌芽泡或非病源微生物。例如，巴氏消毒法，是將物料加熱至60℃維持

30min,以殺死不耐高溫的微生物營養(yǎng)細(xì)胞。

滅菌是用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽抱和抱子。

包括全部病源和非病源微生物。

消毒不一定能達(dá)到滅菌要求，而滅菌則可達(dá)到消毒的目的。

抑菌（bacteriostasis）：抑制體內(nèi)或體外細(xì)菌的生長繁殖。

無菌：不存在活的細(xì)菌。

為防止雜菌的污染，哪些需要滅菌？培養(yǎng)基，發(fā)酵設(shè)備，空氣，菌種制作

關(guān)于滅菌和消毒的不正確的理解是（）

A.滅菌是指殺滅環(huán)境中的一切微生物的細(xì)胞、芽抱和抱子

B.消毒和滅菌實(shí)質(zhì)上是相同的

C.接種環(huán)用灼燒法滅菌

D.常用滅菌的方法有加熱法、過濾法、紫外線法、化學(xué)藥品法

防腐（antisepsis）

防腐就是利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，從而達(dá)到防止食品等發(fā)生霉

腐的措施。

（1）低溫（4）高滲

（2）缺氧（5）高酸度

（3）干燥（6）防腐劑

除菌的方法

-培養(yǎng)基的加熱滅菌

-空氣的過濾除菌

-紫外線或電離輻射

-化學(xué)藥物滅菌

1.化學(xué)試劑滅菌法

方式：浸泡，添加，擦拭，噴灑，氣態(tài)熏蒸

甲醛、乙醇、過氧乙酸、酚類（苯酚）或新潔爾滅、高鎰酸鉀等

①高鎰酸鉀：氧化0.1%-0.25%

②漂白粉：氧化，對細(xì)菌利phage均有效，是發(fā)酵工業(yè)中最常用的化學(xué)殺菌劑。

③75%酒精：殺菌作用在于使細(xì)胞脫水，引起蛋白質(zhì)凝固變性。

適用范圍：環(huán)境、皮膚及器械的表面消毒

2.電磁波、射線滅菌法

電磁波、紫外線或放射性物質(zhì)。以紫外線最常用。紫外線對芽抱和營養(yǎng)細(xì)胞都能起作用，

但細(xì)菌芽抱和霉菌抱了對紫外線的抵抗力強(qiáng)。紫外線的穿透力低，僅適用于表面滅菌和無菌

室,培養(yǎng)間等空間的滅菌。波長在260nm左右滅菌效率最高。

適用范圍：無菌室、接種箱

3.干熱滅菌法

細(xì)胞的氧化作用是導(dǎo)致死亡的主要依據(jù)。由于微生物對干熱的耐受力比對濕熱強(qiáng)的多，故

干熱所需溫度高，時間長，一般160-170℃,（對要求保持干燥的物品可用）

常用烘箱，滅菌條件：160℃下保溫lh

適用范圍：金屬或玻璃器皿

4.濕熱滅菌法

利用飽和蒸汽滅菌，條件：121℃,30min

熱能使蛋白質(zhì)變性。由于蒸汽有很強(qiáng)的穿透能力，來源方便，滅菌可靠，是常用的方法。

適用范圍：生產(chǎn)設(shè)備及培養(yǎng)基滅菌

5.過濾除菌法

利用過濾方法阻留微生物。適用于澄清液體和氣體的除菌。

適用范圍：制備無菌空氣

6.火焰火菌法

方法簡單，滅菌徹底，但適用范圍有限。

適用范圍：接種針、玻璃棒、三角瓶口

谷氨酸棒狀桿菌的培養(yǎng)液常采用的滅菌方法是（）

A.高壓蒸汽滅菌

B.高溫滅菌

C.加入抗生素滅菌

D.酒精滅菌

二、培養(yǎng)基的濕熱滅菌

濕熱滅菌原理

蒸汽具有很強(qiáng)的穿透能力，而且在冷凝時會放出大量的冷凝熱，很容易使蛋白質(zhì)凝固而殺

死各種微生物。

滅菌條件：121℃,30min,

滅菌不利方面：同時會破壞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，甚至產(chǎn)生不利于菌體生長的物質(zhì)。

（一）間歇滅菌（常用）

又稱分批滅菌，是將配制好的培養(yǎng)基同時放在發(fā)酵罐或其他裝絡(luò)中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和

所用設(shè)備一起進(jìn)行加熱滅菌的過程，也稱實(shí)罐滅菌或?qū)嵪?/p>

過程包括：升溫、保溫和冷卻三階段。

各階段對滅菌的貢獻(xiàn)：20%>75%>5%0

培養(yǎng)基間歇滅菌過程中的溫度變化情況：圖

(-)連續(xù)滅菌(又稱連消)

將培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外通過連續(xù)滅菌裝珞進(jìn)行加熱、保溫和冷卻而進(jìn)行滅菌。

連續(xù)滅菌的基本設(shè)備有哪些？

配料罐一泵一加熱塔T維持罐一冷卻管一發(fā)酵罐

連續(xù)滅菌的流程與設(shè)備

(1)配料預(yù)熱罐，將配制好的料液預(yù)熱到60-70笛，以免連續(xù)滅菌時山于料液與蒸汽溫

度相差過大而產(chǎn)生水汽撞擊聲；

(2)連消塔，用高溫蒸汽使料液溫度很快升高到滅菌溫度(126-132℃)；

(3)維持罐，使料液在滅菌溫度下保持5-7min。因?yàn)椋哼B消塔加熱的時間很短，光靠這

段時間的滅菌是不夠的；

(4)冷卻管，使料液冷卻到40-5(TC后(冷水噴淋)，輸送到預(yù)先滅菌過的罐點(diǎn)

缺點(diǎn)

連

續(xù)

滅

菌

1.高溫短時滅菌，培養(yǎng)基

營養(yǎng)成分損失少。

2.發(fā)酵罐占用時間縮短，

利用率高。

3.滅菌質(zhì)量穩(wěn)定，提高了熱利用率。

1.設(shè)備復(fù)雜，操作麻煩，

染菌機(jī)會多。

2.不適合含大量固體物

料的滅菌。

間

歇

滅

菌

1.設(shè)備要求低，不需另外

加熱、冷卻裝谿。

2.操作要求低，適合小批

量生產(chǎn)規(guī)模

3.適合含大量固體物料的

滅菌

1.培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)損

失大，滅菌后培養(yǎng)基

質(zhì)量下降

2.發(fā)酵罐的利用率較低

3.不適合大規(guī)模生產(chǎn)的

滅菌

4.需反復(fù)加熱冷卻，能耗較高。

罐頭食品在很長時間）。

A.罐頭密封很嚴(yán)，細(xì)菌無法侵入

B.罐頭密封很嚴(yán)，細(xì)菌無法呼吸

C.罐頭在封罐前經(jīng)過高溫高壓滅菌，封罐后罐內(nèi)沒有細(xì)菌

D.罐頭在封罐前經(jīng)過高溫高壓滅菌，封罐后罐內(nèi)細(xì)菌無法生存

第二節(jié)空氣凈化（除菌）

發(fā)酵對空氣無菌程度的要求：

一般要求1000次使用周期中只允許有一個菌通過,即經(jīng)過濾后空氣的無菌程度為N=10-3o

-空氣中微生物（包括細(xì)菌、酵母、霉菌和病毒）含量一般為103?104個/米3。?般附著

在空氣中的灰塵上或霧滴上。

-灰塵粒子的平均大小約0.6pm左右，空氣除菌主要去除空氣中的微粒（0.6-lpm）。

一、空氣除菌的方法

（-）輻射殺菌：紫外線，八P射線，使DNA分子產(chǎn)生胸腺喀咤二聚體，導(dǎo)致細(xì)胞死

亡，一般可用于無菌室，手術(shù)室殺菌。

（-）熱殺菌：將空氣加熱到一定溫度后保溫一定時間，使微生物蛋白質(zhì)（酶）氧化而

致死。（培養(yǎng)基滅菌利用的是蛋白質(zhì)的凝固）。熱殺菌是有效的，可靠的殺菌方法，但是如果

采用蒸汽或電熱來加熱大量的空氣，以達(dá)到殺菌目的是十分不經(jīng)濟(jì)的。工業(yè)上是利用空氣壓

縮時放出的熱量進(jìn)行殺菌。

（三）靜電除菌：利用靜電引力來吸附帶點(diǎn)粒子而達(dá)到除菌除塵的目的。懸浮于空氣中

的微生物，微生物抱子大多帶有不同的電荷，沒有帶電荷的微粒在進(jìn)入高壓靜電場時都會被

電離成帶電微粒。對于一些直徑很小的微粒，所帶電荷很小，所以靜電除菌對很小的微粒效

率很低，迄今為止這種方法在無菌空氣制備中并不多見。

（四）過濾除菌：是目前工業(yè)上最常用的獲得大量無菌空氣的方法。

二、空氣過濾除菌的原理與介質(zhì)：

原理：使空氣通過高溫滅菌的介質(zhì)過濾層，將空氣中的微生物等顆粒攔截在介質(zhì)層中達(dá)到

除菌的目的。

1.過濾除菌的種類

絕對過濾：過濾介質(zhì)的濾孔小于細(xì)胞和胞子。孔徑＜0.3菌體大小一般為0.5-5Mm。

如聚乙烯醇縮甲醛樹脂（PVF）制成的0.3m的微孔濾膜。纖維素，聚四氟乙烯，聚乙烯

醇縮甲醛樹脂經(jīng)熱處理后均可作為過濾介質(zhì)。一般用于醫(yī)療及特種發(fā)酵。

深層介質(zhì)過濾：介質(zhì)的孔隙一般大于微生物細(xì)胞。

如用棉花、玻璃纖維和顆?；钚蕴刻畛涞倪^濾器。

2.深層介質(zhì)過濾的原理

微粒隨氣流通過濾層時，由于濾層纖維的層層阻礙，使氣流出現(xiàn)無數(shù)次改變運(yùn)動速度和方

向的繞流運(yùn)動，引起微粒與濾層纖維間產(chǎn)生慣性沖擊、攔截、布朗擴(kuò)散、重力沉降、靜電引

力等作用把微粒滯留在纖維表面上，實(shí)現(xiàn)過濾的目的。目前工廠和實(shí)驗(yàn)室大多采用該方法。

3.空氣過濾除菌介質(zhì)

(1)纖維狀或顆粒狀過濾介質(zhì)

-棉花：常用(脫脂棉)，有彈性，纖維長度適中，填充密度13(M50kg/cm3。

-玻璃纖維：直徑小，不易折斷，過濾效果好，填充密度130-280kg/cm3o

-活性炭：要求質(zhì)地堅(jiān)硬，顆粒均勻。常用小圓柱體的顆?；钚蕴肌?.3pm以卜一顆粒的

過濾效率僅為99%,需多次過濾。

缺點(diǎn)：體積大，裝填費(fèi)時費(fèi)力，松緊度不易掌握，空氣壓降大。介質(zhì)滅菌和吹干耗用大量

蒸汽和空氣。

(2)紙類過濾介質(zhì)——玻璃纖維紙屬于深層過濾技術(shù)。

纖維間空隙約為將3-6張疊在一起使用，過濾效率高，壓降小。對0.3同1以上

顆粒的過濾效率為99.99%,而且阻力小，壓力降較小。

缺點(diǎn)：強(qiáng)度不大(特別是受潮后)?？稍诩垵{中加7-50%的木漿或其他化學(xué)處理。

(3)微孔濾膜類過濾介質(zhì)

空隙V0.5pim

發(fā)酵生產(chǎn)中制備無菌空氣的大致過程：

空氣T空壓機(jī)T貯氣罐T冷卻T除油水T加熱T總過濾器T分過濾器一無菌空

氣

空氣預(yù)處理空氣過濾

除菌流程分析：

要有一系列冷卻，分離和加熱設(shè)備保證空氣的相對濕度在50%-60%的條件下過濾。

三、空氣的預(yù)處理

目的:

-提高壓縮前空氣的潔凈度

-去除壓縮后空氣中的油和水

1.提高壓縮前空氣的潔凈度

措施：

（1）提高空氣吸氣口的位路（高度每上升10m,空氣中微生物量下降一個數(shù)量級）

（2）在空氣入口處設(shè)谿粗過濾器（或前貉高效過濾器）——捕集較大的灰塵顆粒，并

保護(hù)空壓機(jī)。

高空取氣管

-為遠(yuǎn)離地面幾十米的管子。

-每升高10米，空氣中雜菌降低一個數(shù)量級。因此從高空取氣要比從低空取氣有利得多。

高效前貉過濾除菌流程

1——高效前輅過濾器2——壓縮機(jī)3——貯罐4——冷卻器5——絲網(wǎng)分離器

6——加熱器7——過濾器

2.空氣壓縮和壓縮空氣的冷卻

（1）空氣壓縮：克服輸送過程中過濾介質(zhì)的阻力并維持一定的氣流速度。用空壓機(jī)：渦

輪式，往復(fù)式。

（2）壓縮后空氣溫度顯著上升，需冷卻。

因?yàn)槿糁苯油ㄈ脒^濾器會：

-壓縮后的高溫空氣能引起過濾介質(zhì)的炭化或燃燒

-增大發(fā)酵罐的降溫負(fù)荷

-增加培養(yǎng)液水分的蒸發(fā)

一般用列管式冷卻器進(jìn)行冷卻。還有翅板式換熱器。

空氣貯罐（結(jié)構(gòu)圖）

-消除壓縮機(jī)排出空氣量的脈沖，維持穩(wěn)定的空氣壓力。

-利用重力沉降作用除去部分油霧。

-緊接空壓機(jī)安裝。

-有些裝有冷卻管。

3.壓縮空氣的除油除水

冷卻降溫后的空氣濕度增大，會使過濾介質(zhì)受潮失效。

兩類設(shè)備：

旋風(fēng)分離器——利用離心力進(jìn)行沉降，對于10m以上的微粒分離效率較高。

絲網(wǎng)分離器——利用慣性進(jìn)行攔截，分離效率較高，能除去2?5m的細(xì)小顆粒。P251

采用慣性攔截等機(jī)理，有效去除空氣中的水、油霧、塵埃，不銹鋼絲網(wǎng)可清洗，使用壽命

長。

4.空氣的加熱

壓縮空氣冷卻除去油和水后，空氣的相對濕度仍為100%。若不加熱，只要溫度稍有降低,

可再度析出水分，使過濾介質(zhì)受潮。所以將除油水的空氣加熱（溫差在10~15℃左右），

降低相對濕度（達(dá)50%?60%）后，輸入過濾器。

用列管換熱器。

空氣過濾除菌設(shè)備流程

粗過濾空壓機(jī)儲罐二級冷卻加熱器空氣過濾

四、空氣過濾器

過濾除菌的關(guān)鍵設(shè)備（結(jié)構(gòu)圖：介質(zhì)層過濾器和超細(xì)玻璃纖維紙過濾器）

180M3發(fā)酵罐車間

大型空氣壓縮機(jī)

發(fā)酵車間的空氣過濾器

空氣凈化的流程

-吸氣口吸入的空氣先經(jīng)過壓縮前的過濾

-進(jìn)入空氣壓縮機(jī)(120-150℃)

-冷卻(20-25℃),除去油、水,再加熱至30-35。5

-最后通過總過濾器和分過濾器，獲得潔凈度、壓力、溫度和流量都符合要求的無菌空氣。

第四章發(fā)酵工藝過程控制

第一節(jié)發(fā)酵的操作方式

一、分批培養(yǎng)(batchcultureorfermentation)又稱分批發(fā)酵，常用的培養(yǎng)方法。

1.概念：在一個密閉系統(tǒng)對數(shù)生長期穩(wěn)定期死亡期

2.特點(diǎn)：

(1)整個培養(yǎng)系統(tǒng)與外界沒有其它物質(zhì)交換(02、C02、消泡劑、酸堿除外)

(2)整個過程中菌的濃度、營養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度不斷變化,是?種非穩(wěn)態(tài)的培養(yǎng)方法。

即：在發(fā)酵罐中完成微生物生長的四個階段：lagphase,logphase,stationaryphase,decline

phase或deathphase

3.分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，周期短，染菌機(jī)會少，生產(chǎn)過程