亞致死濃度殺蟲劑對褐飛虱生理基因調(diào)控的深度剖析一、引言1.1研究背景褐飛虱（NilaparvatalugensSt?l）隸屬半翅目飛虱科，是亞洲諸多國家水稻生產(chǎn)中臭名昭著的害蟲。這種害蟲具有典型的遷飛特性，主要借助氣流完成遠(yuǎn)距離遷飛，每年發(fā)生代數(shù)呈現(xiàn)出自北向南逐漸遞增的規(guī)律。褐飛虱的繁殖速率極快，且食性專一，僅能依靠取食水稻和野生稻完成自身發(fā)育。其偏好溫暖高濕的氣候環(huán)境，在適宜條件下，極易在水稻穗期大規(guī)模暴發(fā)成災(zāi)。褐飛虱完整的生命周期涵蓋卵、若蟲和成蟲三種蟲態(tài)，完成一個世代大約需要30天。其中，卵形似香蕉，多產(chǎn)于葉鞘和葉片組織內(nèi)，排列成卵條；若蟲歷經(jīng)5齡，體型呈橢圓形，約15天便可發(fā)育為成蟲；成蟲體色主要有深棕色和淺棕色兩種，并且存在明顯的翅兩型現(xiàn)象，即長翅型和短翅型。長翅型成蟲飛行能力強(qiáng)，但產(chǎn)卵量少、發(fā)育進(jìn)程慢；短翅型成蟲飛行能力弱，然而產(chǎn)卵量多、發(fā)育速度快，所以短翅型成蟲的大量出現(xiàn)往往預(yù)示著蟲害即將大規(guī)模爆發(fā)。褐飛虱對水稻的危害是多方面的，其成、若蟲常常群集于稻叢底部，通過刺吸莖葉組織的汁液來獲取養(yǎng)分，這會導(dǎo)致水稻植株的含水量迅速下降。同時，其唾液腺分泌的有毒物質(zhì)會破壞水稻植株組織，在受損莖部形成大量褐色斑點(diǎn)，嚴(yán)重時會致使稻株基部變黑，水稻發(fā)生癱瘓倒伏現(xiàn)象，也就是俗稱的“冒穿”“虱燒”“透天”，最終導(dǎo)致水稻嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收。此外，雌蟲在產(chǎn)卵時，會用鋒利的產(chǎn)卵管穿透葉鞘和莖組織，在其中產(chǎn)卵，這一行為不僅會形成大量傷口，加速水分散失，促使稻株倒伏，還為水稻小球菌核病的入侵提供了途徑。更為嚴(yán)重的是，褐飛虱還能傳播鋸齡葉矮縮病、水稻草叢狀矮縮病等病害，其取食時排泄的蜜露富含糖類和氨基酸類物質(zhì)，覆蓋在稻株上后，極易引發(fā)煤煙病菌滋生，從而影響水稻的光合作用。為了有效防治褐飛虱，目前主要采取化學(xué)防治、物理防治、生物防治以及選用抗性植物等方法。其中，化學(xué)防治因其高效性成為使用較為廣泛的手段，常用的殺蟲劑包括有機(jī)磷、氨基甲酸酯、噻嗪酮和新煙堿類等，并且選擇內(nèi)吸性強(qiáng)的藥劑往往能取得顯著的防治效果。然而，長期大量使用殺蟲劑也帶來了一系列問題，如環(huán)境污染和害蟲抗藥性不斷增強(qiáng)等。殺蟲劑在殺滅害蟲的同時，也可能對非靶標(biāo)生物造成傷害，破壞生態(tài)平衡；而害蟲抗藥性的產(chǎn)生則使得防治難度不斷加大，防治成本持續(xù)上升。在殺蟲劑的研究中，亞致死濃度是一個重要概念。亞致死濃度指的是在實(shí)驗(yàn)種群中不會導(dǎo)致明顯死亡率，但會對個體昆蟲或種群的生物、生理或行為產(chǎn)生影響的殺蟲劑濃度。殺蟲劑在田間使用后，其殘留的活性成分會受到天然水（如雨滴、露水等）的稀釋，并且自身也會逐漸降解為低劑量或亞致死劑量。研究殺蟲劑亞致死濃度對害蟲的影響，對于深入理解殺蟲劑的作用機(jī)制、評估其環(huán)境風(fēng)險以及制定科學(xué)合理的害蟲防治策略具有重要意義。亞致死濃度的殺蟲劑可能會對害蟲的生長發(fā)育、繁殖、行為以及生理生化等方面產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響害蟲種群的動態(tài)變化。例如，一些研究表明，亞致死濃度的殺蟲劑可能會延長害蟲的發(fā)育時間、降低其繁殖力、改變其行為習(xí)性，甚至可能導(dǎo)致害蟲對殺蟲劑產(chǎn)生抗性。鑒于褐飛虱對水稻生產(chǎn)的嚴(yán)重危害以及殺蟲劑使用過程中出現(xiàn)的問題，深入研究殺蟲劑亞致死濃度對褐飛虱的影響顯得尤為必要。特別是在保幼激素水解酶及類胰島素基因?qū)用娴难芯?，有望從分子生物學(xué)角度揭示褐飛虱對殺蟲劑亞致死濃度的響應(yīng)機(jī)制，為開發(fā)更加高效、環(huán)保的褐飛虱防治策略提供理論依據(jù)。保幼激素在昆蟲的生長發(fā)育和生殖過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，保幼激素水解酶能夠調(diào)節(jié)保幼激素的水平，進(jìn)而影響昆蟲的發(fā)育和繁殖。而類胰島素基因參與昆蟲的生長、發(fā)育、代謝以及繁殖等多個生理過程，研究殺蟲劑亞致死濃度對這些基因的影響，有助于全面了解殺蟲劑對褐飛虱的作用機(jī)制，為實(shí)現(xiàn)褐飛虱的可持續(xù)治理提供新的思路和方法。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入剖析殺蟲劑亞致死濃度對褐飛虱保幼激素水解酶及類胰島素基因的影響，從分子生物學(xué)角度揭示褐飛虱對殺蟲劑亞致死濃度的響應(yīng)機(jī)制，為研發(fā)更加科學(xué)、高效、環(huán)保的褐飛虱防治策略提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下：褐飛虱保幼激素二醇激酶的特性與功能研究：通過RT-PCR技術(shù)克隆褐飛虱保幼激素二醇激酶基因（Nljhdk），對其進(jìn)行序列測定與分析，明確其基因結(jié)構(gòu)和序列特征。運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，檢測Nljhdk在褐飛虱短翅種群不同發(fā)育時期的表達(dá)水平，探究其表達(dá)模式與褐飛虱生長發(fā)育的關(guān)系。利用RNA干擾技術(shù)，沉默褐飛虱體內(nèi)的Nljhdk基因，檢測干擾后Nljhdk、保幼激素酯酶基因（Nljhe）、保幼激素環(huán)氧水解酶基因（Nljheh）的表達(dá)量變化，以及對褐飛虱生長發(fā)育和繁殖的影響，從而深入解析Nljhdk的功能及其在保幼激素代謝途徑中的作用機(jī)制。兩種藥劑亞致死濃度對褐飛虱胰島素基因及保幼激素水解酶基因的影響：選取茚蟲威和氯蟲苯甲酰胺這兩種具有不同作用機(jī)制的殺蟲劑，設(shè)置不同的亞致死濃度梯度。采用浸葉法或點(diǎn)滴法處理褐飛虱雌蟲，在處理后的不同時間點(diǎn)，采集褐飛虱雌蟲卵巢組織。運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，檢測不同亞致死濃度的茚蟲威和氯蟲苯甲酰胺處理后，褐飛虱雌蟲卵巢中類胰島素基因（NlIlps）、Nljhe、Nljheh和Nljhdk基因的表達(dá)水平變化。分析基因表達(dá)變化與殺蟲劑亞致死濃度、處理時間之間的關(guān)系，探討這兩種殺蟲劑亞致死濃度對褐飛虱胰島素信號通路和保幼激素代謝途徑的影響機(jī)制，以及這些影響與褐飛虱繁殖能力變化之間的內(nèi)在聯(lián)系。1.3研究方法與技術(shù)路線研究方法生物測定法：運(yùn)用浸葉法或點(diǎn)滴法，對褐飛虱雌蟲進(jìn)行殺蟲劑處理。具體操作如下，將水稻葉片在不同亞致死濃度的茚蟲威和氯蟲苯甲酰胺溶液中浸泡一定時間，取出晾干后，放入飼養(yǎng)有褐飛虱雌蟲的容器中，讓其取食；點(diǎn)滴法則是使用微量注射器將一定量的藥劑點(diǎn)滴在褐飛虱雌蟲的特定部位。設(shè)置多個處理組和對照組，每個處理組設(shè)置不同的亞致死濃度梯度，對照組則使用清水或不含殺蟲劑的溶劑處理。每個處理組和對照組均設(shè)置多個重復(fù)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。通過觀察褐飛虱雌蟲的存活情況、行為變化等，確定殺蟲劑的亞致死濃度范圍?；蚩寺∨c序列分析：采用RT-PCR技術(shù)克隆褐飛虱保幼激素二醇激酶基因（Nljhdk）。首先提取褐飛虱的總RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到Nljhdk基因的片段。將擴(kuò)增得到的基因片段連接到克隆載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增。提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行測序分析，確定Nljhdk基因的核苷酸序列。通過生物信息學(xué)軟件對Nljhdk基因的序列進(jìn)行分析，包括開放閱讀框預(yù)測、氨基酸序列推導(dǎo)、同源性分析等，了解其基因結(jié)構(gòu)和序列特征。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)：提取不同處理組褐飛虱雌蟲卵巢組織的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)目的基因（NlIlps、Nljhe、Nljheh和Nljhdk）和內(nèi)參基因的序列，設(shè)計(jì)特異性引物。利用實(shí)時熒光定量PCR儀，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系中包含SYBRGreen熒光染料，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，熒光信號會逐漸增強(qiáng)，通過檢測熒光信號的強(qiáng)度，實(shí)時監(jiān)測PCR反應(yīng)的進(jìn)程。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值，計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，分析不同亞致死濃度的殺蟲劑處理后，目的基因表達(dá)水平的變化情況。RNA干擾技術(shù)：設(shè)計(jì)針對Nljhdk基因的dsRNA，通過注射或喂食的方式導(dǎo)入褐飛虱體內(nèi)，使其發(fā)生RNA干擾現(xiàn)象。具體來說，合成Nljhdk基因的dsRNA后，使用微量注射器將其注射到褐飛虱的體腔內(nèi)，或者將dsRNA與褐飛虱的食物混合，讓其通過取食攝入dsRNA。設(shè)置干擾組和對照組，干擾組導(dǎo)入Nljhdk基因的dsRNA，對照組導(dǎo)入無關(guān)序列的dsRNA或不做處理。在處理后的不同時間點(diǎn)，采集褐飛虱樣本，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測Nljhdk、Nljhe、Nljheh基因的表達(dá)量變化。同時，觀察褐飛虱的生長發(fā)育和繁殖情況，如發(fā)育歷期、羽化率、產(chǎn)卵量等，分析RNA干擾對褐飛虱生長發(fā)育和繁殖的影響。技術(shù)路線：本研究的技術(shù)路線如圖1所示，首先進(jìn)行褐飛虱的飼養(yǎng)與殺蟲劑的準(zhǔn)備，確保實(shí)驗(yàn)材料的充足和質(zhì)量。然后通過生物測定法確定殺蟲劑的亞致死濃度，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供濃度依據(jù)。接著對褐飛虱保幼激素二醇激酶基因（Nljhdk）進(jìn)行克隆與序列分析，了解其基因特征。在此基礎(chǔ)上，利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測Nljhdk在褐飛虱短翅種群不同發(fā)育時期的表達(dá)水平，以及不同亞致死濃度的殺蟲劑處理后，褐飛虱雌蟲卵巢中類胰島素基因（NlIlps）、Nljhe、Nljheh和Nljhdk基因的表達(dá)變化。最后運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，沉默褐飛虱體內(nèi)的Nljhdk基因，檢測相關(guān)基因表達(dá)量的變化以及對褐飛虱生長發(fā)育和繁殖的影響，從而深入探究殺蟲劑亞致死濃度對褐飛虱保幼激素水解酶及類胰島素基因的影響機(jī)制。graphTD;A[褐飛虱飼養(yǎng)與殺蟲劑準(zhǔn)備]-->B[生物測定確定亞致死濃度];B-->C[克隆Nljhdk基因并分析序列];C-->D[檢測Nljhdk在不同發(fā)育時期表達(dá)水平];B-->E[殺蟲劑處理褐飛虱雌蟲];E-->F[提取卵巢組織RNA并反轉(zhuǎn)錄];F-->G[實(shí)時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)變化];C-->H[設(shè)計(jì)針對Nljhdk的dsRNA];H-->I[RNA干擾處理褐飛虱];I-->J[檢測相關(guān)基因表達(dá)量及生長發(fā)育繁殖指標(biāo)];A[褐飛虱飼養(yǎng)與殺蟲劑準(zhǔn)備]-->B[生物測定確定亞致死濃度];B-->C[克隆Nljhdk基因并分析序列];C-->D[檢測Nljhdk在不同發(fā)育時期表達(dá)水平];B-->E[殺蟲劑處理褐飛虱雌蟲];E-->F[提取卵巢組織RNA并反轉(zhuǎn)錄];F-->G[實(shí)時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)變化];C-->H[設(shè)計(jì)針對Nljhdk的dsRNA];H-->I[RNA干擾處理褐飛虱];I-->J[檢測相關(guān)基因表達(dá)量及生長發(fā)育繁殖指標(biāo)];B-->C[克隆Nljhdk基因并分析序列];C-->D[檢測Nljhdk在不同發(fā)育時期表達(dá)水平];B-->E[殺蟲劑處理褐飛虱雌蟲];E-->F[提取卵巢組織RNA并反轉(zhuǎn)錄];F-->G[實(shí)時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)變化];C-->H[設(shè)計(jì)針對Nljhdk的dsRNA];H-->I[RNA干擾處理褐飛虱];I-->J[檢測相關(guān)基因表達(dá)量及生長發(fā)育繁殖指標(biāo)];C-->D[檢測Nljhdk在不同發(fā)育時期表達(dá)水平];B-->E[殺蟲劑處理褐飛虱雌蟲];E-->F[提取卵巢組織RNA并反轉(zhuǎn)錄];F-->G[實(shí)時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)變化];C-->H[設(shè)計(jì)針對Nljhdk的dsRNA];H-->I[RNA干擾處理褐飛虱];I-->J[檢測相關(guān)基因表達(dá)量及生長發(fā)育繁殖指標(biāo)];B-->E[殺蟲劑處理褐飛虱雌蟲];E-->F[提取卵巢組織RNA并反轉(zhuǎn)錄];F-->G[實(shí)時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)變化];C-->H[設(shè)計(jì)針對Nljhdk的dsRNA];H-->I[RNA干擾處理褐飛虱];I-->J[檢測相關(guān)基因表達(dá)量及生長發(fā)育繁殖指標(biāo)];E-->F[提取卵巢組織RNA并反轉(zhuǎn)錄];F-->G[實(shí)時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)變化];C-->H[設(shè)計(jì)針對Nljhdk的dsRNA];H-->I[RNA干擾處理褐飛虱];I-->J[檢測相關(guān)基因表達(dá)量及生長發(fā)育繁殖指標(biāo)];F-->G[實(shí)時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)變化];C-->H[設(shè)計(jì)針對Nljhdk的dsRNA];H-->I[RNA干擾處理褐飛虱];I-->J[檢測相關(guān)基因表達(dá)量及生長發(fā)育繁殖指標(biāo)];C-->H[設(shè)計(jì)針對Nljhdk的dsRNA];H-->I[RNA干擾處理褐飛虱];I-->J[檢測相關(guān)基因表達(dá)量及生長發(fā)育繁殖指標(biāo)];H-->I[RNA干擾處理褐飛虱];I-->J[檢測相關(guān)基因表達(dá)量及生長發(fā)育繁殖指標(biāo)];I-->J[檢測相關(guān)基因表達(dá)量及生長發(fā)育繁殖指標(biāo)];圖1技術(shù)路線圖二、褐飛虱與殺蟲劑研究現(xiàn)狀2.1褐飛虱的生物學(xué)特性褐飛虱（NilaparvatalugensSt?l）隸屬半翅目（Hemiptera）飛虱科（Delphacidae），在亞洲眾多國家的水稻產(chǎn)區(qū)均有分布。其分布區(qū)域大致可劃分為終年繁殖區(qū)、少量越冬區(qū)和不能越冬區(qū)。終年繁殖區(qū)位于北緯19°以南的海南省南部，該區(qū)域氣候終年溫暖濕潤，為褐飛虱的生存和繁衍提供了極為適宜的環(huán)境，使其能夠全年不間斷地繁殖。少量越冬區(qū)處于北緯19°-25°之間，其中北緯12°左右以南為常年穩(wěn)定越冬區(qū)，在這些地區(qū)，冬季的氣候條件相對較為溫和，褐飛虱能夠以一定的方式存活并越冬。而北緯25°以北的廣大稻區(qū)則屬于不能越冬區(qū)，這些地區(qū)冬季氣溫較低，不適宜褐飛虱生存，每年的蟲源主要依靠從南方地區(qū)隨季風(fēng)遷飛而來。褐飛虱具有獨(dú)特的形態(tài)特征，其個體雖小，但各個蟲態(tài)都有著鮮明的特點(diǎn)。成蟲分為長翅型和短翅型兩種。長翅型體長3.6-4.8毫米，短翅型體長2.5-4.0毫米。成蟲體色主要為黃褐、黑褐色，體表具有油狀光澤，在陽光下顯得格外醒目。其頭頂近似方形，額呈近長方形，中部略微寬闊，觸角稍伸出額唇基縫，這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其在感知外界環(huán)境變化時更加敏銳。后足基跗節(jié)外側(cè)長有2-4根小刺，這些小刺在其行動和防御中發(fā)揮著重要作用。前翅呈現(xiàn)黃褐色，質(zhì)地透明，翅斑為黑褐色，短翅型前翅僅能伸達(dá)腹部第5-6節(jié)，后翅均已退化。從性別特征來看，雄蟲陽基側(cè)突形狀如同蟹鉗狀，頂部呈尖角狀向內(nèi)前方突出，這一獨(dú)特的結(jié)構(gòu)在其求偶和交配過程中具有重要意義；雌蟲產(chǎn)卵器基部兩側(cè)，第1載瓣片的內(nèi)緣基部突起呈半圓形，這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與雌蟲的產(chǎn)卵行為密切相關(guān)。褐飛虱的卵呈香蕉型，長約1mm，寬0.22mm。卵粒通常產(chǎn)在葉鞘和葉片組織內(nèi)，整齊地排成一條，被稱為“卵條”。卵帽高大于寬底，頂端呈圓弧狀，稍露出產(chǎn)卵痕，露出部分近似短橢圓形，粗看猶如小方格，清晰可數(shù)。卵在剛產(chǎn)出時呈現(xiàn)乳白色，隨著時間的推移，逐漸變?yōu)榈S至銹褐色，并會出現(xiàn)紅色眼點(diǎn)，這一顏色和形態(tài)的變化過程反映了卵的發(fā)育進(jìn)程。若蟲共分為5齡，各齡若蟲在形態(tài)和特征上存在明顯差異。1齡若蟲體長1.1mm，體色黃白色，腹部背面有一倒凸形淺色斑紋，這一斑紋是其在該齡期的顯著特征。此時后胸顯著較前、中胸長，中、后胸后緣平直，尚未出現(xiàn)翅芽。2齡若蟲體長1.5mm，初期體色與1齡相似，隨著生長發(fā)育，倒凸形斑內(nèi)逐漸出現(xiàn)褐色，后期體轉(zhuǎn)變?yōu)辄S褐至暗褐色，倒凸形斑逐漸模糊，翅芽依然不明顯，后胸稍長，中胸后緣略向前凹。3齡若蟲體長2.0mm，體色變?yōu)辄S褐色至暗褐色，腹部第3、4節(jié)出現(xiàn)一對較大的淺色斑紋，第7-9節(jié)的淺色斑呈山字形，這些斑紋的出現(xiàn)和變化是3齡若蟲的重要識別特征。此時翅芽已明顯可見，中、后胸后緣向前凹成角狀，前翅芽尖端尚未到達(dá)后胸后緣。4齡若蟲體長2.4mm，體色斑紋與3齡相似，但斑紋更加清晰，前翅芽尖端伸達(dá)后胸后緣。5齡若蟲體長3.2mm，體色斑紋與3、4齡相同，前翅芽尖端伸達(dá)腹部第3-4節(jié)，前后翅芽尖端相接近，或前翅芽稍超過后翅芽，這一特征表明5齡若蟲已接近成蟲形態(tài)，即將完成發(fā)育。在生活史方面，褐飛虱為遠(yuǎn)距離遷飛性害蟲，其遷飛行為與季節(jié)、氣候和水稻生長周期密切相關(guān)。在我國，每年3月下旬至5月份，隨著西南氣流的到來，褐飛虱從中南半島遷入兩廣南部發(fā)生區(qū)（北緯19°到北回歸線）。在這一區(qū)域，它們迅速繁殖2-3代，隨著6月份早稻逐漸黃熟，大量長翅型成蟲隨季風(fēng)繼續(xù)北遷，主降于南嶺發(fā)生區(qū)（北回歸線至北緯26-28°）。7月中下旬，南嶺區(qū)早稻黃熟收割，褐飛虱再次北遷至長江流域及其以北地區(qū)。到了9月中下旬至10月上旬，長江流域及其以北地區(qū)水稻黃熟，褐飛虱又產(chǎn)生大量長翅型個體，隨東北氣流向西南回遷。在不同地區(qū)，褐飛虱每年發(fā)生的代數(shù)有所不同，例如在海南，由于氣候溫暖，褐飛虱一年可發(fā)生12代；廣東、廣西地區(qū)一年發(fā)生8-9代；而江淮地區(qū)則一年發(fā)生3-4代；北緯35°以北地區(qū)，一年僅發(fā)生1-2代。褐飛虱的生長發(fā)育對溫度和濕度條件有著嚴(yán)格的要求。在自然變溫條件下，褐飛虱卵期胚胎發(fā)育的起點(diǎn)溫度為10.6℃。卵在25℃左右時孵化率最高，可達(dá)91.5%，完成胚胎發(fā)育所需的時間與氣溫高低密切相關(guān)，在15℃、20℃、25℃、28℃及29℃恒溫下，卵期分別為26.7、15.2、8.2、7.9及8.5天，在28℃左右時卵期最短。在12-13℃條件下，褐飛虱4齡和5齡若蟲均能正常生活與活動。褐飛虱長翅型雄成蟲正常活動的溫度范圍為9-30℃，長翅型雌成蟲為10-32℃。在20-33℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，成蟲壽命縮短。褐飛虱雌成蟲壽命在25℃下為22天，在17-20℃時壽命長達(dá)30天。氣溫較高時，褐飛虱雌成蟲的產(chǎn)卵率較高，其產(chǎn)卵盛期歷時10-15天，產(chǎn)卵高峰期通常持續(xù)6-10天。如果氣溫低于17℃，褐飛虱卵巢管不能發(fā)育，但將這些成蟲每天只放在較低溫度下幾小時，幾天后，它們在低于17℃的溫度下也能產(chǎn)卵，這顯示出褐飛虱在一定程度上對低溫環(huán)境具有適應(yīng)能力。2.2殺蟲劑的使用現(xiàn)狀與問題在褐飛虱的防治手段中，化學(xué)防治憑借其高效性和及時性，成為應(yīng)用最為廣泛的方法?；瘜W(xué)防治主要依賴各類殺蟲劑，常見的殺蟲劑類型包括有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、新煙堿類以及生物源殺蟲劑等。不同類型的殺蟲劑具有各自獨(dú)特的作用機(jī)制，有機(jī)磷類殺蟲劑如毒死蜱，主要通過抑制昆蟲體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶活性，導(dǎo)致乙酰膽堿在神經(jīng)突觸處大量積累，從而使昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，最終麻痹死亡。氨基甲酸酯類殺蟲劑以異丙威為代表，其作用機(jī)制與有機(jī)磷類相似，也是抑制乙酰膽堿酯酶，但在作用方式和毒性表現(xiàn)上存在差異。擬除蟲菊酯類殺蟲劑如高效氯氰菊酯，能夠作用于昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，改變神經(jīng)細(xì)胞膜的離子通透性，使昆蟲過度興奮而死亡。新煙堿類殺蟲劑如吡蟲啉，作用于昆蟲的煙堿型乙酰膽堿受體，干擾昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)的正常傳導(dǎo)。生物源殺蟲劑則具有環(huán)保、低毒等特點(diǎn)，例如蘇云金芽孢桿菌，其產(chǎn)生的晶體蛋白能夠特異性地作用于昆蟲腸道上皮細(xì)胞，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致昆蟲死亡。在實(shí)際應(yīng)用中，這些殺蟲劑在不同地區(qū)和環(huán)境下的防治效果存在差異。在一些地區(qū)，新煙堿類殺蟲劑因其良好的內(nèi)吸性和持效性，對褐飛虱表現(xiàn)出較高的防治效果。在長江流域的部分稻區(qū)，使用吡蟲啉進(jìn)行褐飛虱防治，能夠在施藥后的一段時間內(nèi)有效控制蟲口密度，使防治效果達(dá)到80%以上。然而，在一些長期大量使用吡蟲啉的地區(qū)，褐飛虱對其產(chǎn)生了不同程度的抗性，導(dǎo)致防治效果下降。在華南地區(qū)的某些稻田，由于連續(xù)多年使用吡蟲啉，褐飛虱對其抗性倍數(shù)逐漸升高，防治效果已降至60%以下。不同殺蟲劑的混合使用或交替使用也會對防治效果產(chǎn)生影響。將吡蟲啉與毒死蜱混合使用，能夠在一定程度上延緩褐飛虱抗性的產(chǎn)生，提高防治效果，但同時也可能增加對非靶標(biāo)生物的影響。長期大量使用殺蟲劑也帶來了一系列嚴(yán)重的問題。害蟲抗藥性的產(chǎn)生是最為突出的問題之一。隨著殺蟲劑的廣泛使用，褐飛虱通過基因突變、代謝酶活性改變以及靶標(biāo)位點(diǎn)改變等機(jī)制，逐漸對多種殺蟲劑產(chǎn)生抗性。研究表明，褐飛虱對新煙堿類殺蟲劑的抗性主要是由于煙堿型乙酰膽堿受體基因的突變，導(dǎo)致殺蟲劑與靶標(biāo)位點(diǎn)的親和力下降。對有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類殺蟲劑的抗性則與昆蟲體內(nèi)的解毒酶活性增強(qiáng)有關(guān)，如細(xì)胞色素P450酶系、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等，這些酶能夠加速殺蟲劑的代謝和降解，從而降低殺蟲劑的毒性。褐飛虱對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性與鈉離子通道基因的突變密切相關(guān)，突變后的鈉離子通道對殺蟲劑的敏感性降低，使得褐飛虱能夠抵御殺蟲劑的作用。據(jù)調(diào)查，在一些褐飛虱常年發(fā)生嚴(yán)重的地區(qū)，對多種殺蟲劑的抗性倍數(shù)已達(dá)到幾十倍甚至上百倍，這使得傳統(tǒng)殺蟲劑的防治效果大打折扣，防治成本不斷增加。殺蟲劑的使用還會導(dǎo)致害蟲再猖獗現(xiàn)象。一方面，殺蟲劑在殺死褐飛虱的同時，也會大量殺傷其天敵，如黑肩綠盲蝽、蜘蛛等。這些天敵在生態(tài)系統(tǒng)中對褐飛虱的種群數(shù)量起著重要的調(diào)控作用，它們的減少使得褐飛虱失去了自然的制約因素，從而更容易繁殖和擴(kuò)散。另一方面，亞致死劑量的殺蟲劑可能會影響褐飛虱的生理和行為，如促進(jìn)其生殖、改變其取食偏好等，進(jìn)而導(dǎo)致褐飛虱種群數(shù)量迅速回升。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)亞致死劑量殺蟲劑處理后的褐飛虱，其產(chǎn)卵量可能會增加20%-50%，孵化率也會有所提高。一些殺蟲劑還可能改變褐飛虱的飛行能力和遷移習(xí)性，使其更容易在稻田中擴(kuò)散，加重危害程度。環(huán)境問題也是殺蟲劑使用過程中不容忽視的方面。殺蟲劑的殘留會對土壤、水體和空氣等環(huán)境要素造成污染。在土壤中，殺蟲劑的殘留可能會影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能，抑制土壤中有益微生物的生長和繁殖，從而破壞土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡。例如，長期使用有機(jī)磷類殺蟲劑會導(dǎo)致土壤中固氮菌、硝化細(xì)菌等有益微生物的數(shù)量減少，影響土壤的肥力和養(yǎng)分循環(huán)。在水體中，殺蟲劑的殘留可能會對水生生物造成毒害，影響水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。新煙堿類殺蟲劑對水生昆蟲和魚類具有較高的毒性，可能會導(dǎo)致水生昆蟲的死亡和魚類的生長發(fā)育異常。殺蟲劑的揮發(fā)和漂移還可能對空氣造成污染，影響周邊環(huán)境和人類健康。2.3亞致死濃度殺蟲劑的研究進(jìn)展亞致死濃度殺蟲劑對昆蟲的影響是多方面的，涉及生長發(fā)育、生殖、行為以及體內(nèi)酶和激素等多個領(lǐng)域。在生長發(fā)育方面，亞致死濃度的殺蟲劑往往會干擾昆蟲的正常發(fā)育進(jìn)程。研究表明，亞致死劑量的氟鈴脲處理小菜蛾后，其卵、1齡幼蟲、2齡幼蟲和蛹的發(fā)育歷期均被延長。這可能是因?yàn)榉忞逵绊懥诵〔硕牦w內(nèi)的蛻皮激素和保幼激素的平衡，從而阻礙了其正常的蛻皮和發(fā)育過程。在對斜紋夜蛾的研究中發(fā)現(xiàn)，亞致死濃度的茚蟲威會導(dǎo)致斜紋夜蛾幼蟲的體重增長緩慢，發(fā)育歷期延長，化蛹率和羽化率降低。這可能是茚蟲威干擾了斜紋夜蛾的神經(jīng)系統(tǒng)，影響了其取食和消化功能，進(jìn)而影響了生長發(fā)育所需營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用。在生殖方面，亞致死濃度殺蟲劑對昆蟲的影響較為顯著。多殺菌素處理小菜蛾后，不僅降低了各齡幼蟲的存活率，延長了幼蟲的發(fā)育時間，還降低了蛹重、化蛹率、羽化率以及產(chǎn)卵量，而且這種影響會持續(xù)到下一代，從而對小菜蛾種群的增長產(chǎn)生抑制作用。這可能是多殺菌素影響了小菜蛾的生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)，干擾了其性激素的合成和分泌，導(dǎo)致生殖細(xì)胞的發(fā)育和成熟受到阻礙。亞致死濃度的殺蟲劑還可能改變昆蟲的生殖行為，如影響求偶、交配和產(chǎn)卵等行為。一些殺蟲劑會使昆蟲的求偶行為異常，降低交配成功率，或者使昆蟲的產(chǎn)卵量減少、產(chǎn)卵位置改變等。這可能是因?yàn)闅⑾x劑影響了昆蟲的嗅覺、味覺等感覺器官，使其對異性和適宜產(chǎn)卵場所的識別能力下降。從行為角度來看，亞致死濃度殺蟲劑會改變昆蟲的多種行為。新煙堿類殺蟲劑亞致死劑量對麥長管蚜具有很強(qiáng)的拒食作用，而對棉蚜沒有明顯的拒食作用。這可能是因?yàn)辂滈L管蚜和棉蚜對新煙堿類殺蟲劑的感受機(jī)制不同，麥長管蚜的味覺受體對該類殺蟲劑更為敏感，從而導(dǎo)致其取食行為受到抑制。亞致死濃度的殺蟲劑還可能影響昆蟲的趨光性、趨化性、遷移和棲息等行為。一些殺蟲劑會使昆蟲的趨光性發(fā)生改變，使其不再趨向光源，或者改變其趨化性，使其對寄主植物的氣味反應(yīng)減弱。這可能是殺蟲劑破壞了昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)或感覺器官，影響了其對環(huán)境信號的感知和響應(yīng)能力。在昆蟲體內(nèi)酶和激素層面，亞致死濃度殺蟲劑也會產(chǎn)生重要影響。氰戊菊酯對小菜蛾的亞致死效應(yīng)表現(xiàn)為降低了小菜蛾保幼激素酯酶（juvenilehormoneesterase，JHE）的活性。保幼激素酯酶是調(diào)節(jié)保幼激素水平的關(guān)鍵酶，其活性降低會導(dǎo)致保幼激素在昆蟲體內(nèi)積累，進(jìn)而影響昆蟲的生長發(fā)育和生殖。研究發(fā)現(xiàn)，亞致死濃度的殺蟲劑還可能影響昆蟲體內(nèi)的解毒酶活性，如細(xì)胞色素P450酶系、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等。這些解毒酶活性的改變會影響昆蟲對殺蟲劑的代謝和解毒能力，從而影響殺蟲劑的亞致死效應(yīng)。殺蟲劑還可能干擾昆蟲體內(nèi)的激素平衡，如蛻皮激素、保幼激素、胰島素等，進(jìn)而影響昆蟲的生長發(fā)育、生殖和行為等生理過程。三、褐飛虱保幼激素水解酶基因研究3.1保幼激素水解酶的作用機(jī)制保幼激素（juvenilehormone，JH）是一類在昆蟲生長發(fā)育和生殖過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的倍半萜類化合物。在昆蟲的生長發(fā)育進(jìn)程中，JH的滴度會發(fā)生規(guī)律性的變化，這種變化對昆蟲的各個發(fā)育階段起到了精準(zhǔn)的調(diào)控作用。在幼齡幼蟲期，JH維持在較高水平，它能夠抑制幼蟲的變態(tài)發(fā)育，確保幼蟲在該階段持續(xù)進(jìn)行生長和蛻皮，維持幼蟲的形態(tài)和生理特征。當(dāng)昆蟲發(fā)育到特定階段，JH滴度會顯著下降，此時昆蟲便開始進(jìn)入變態(tài)發(fā)育階段，如從幼蟲轉(zhuǎn)變?yōu)橛?，再從蛹羽化為成蟲。在成蟲期，JH對于昆蟲的生殖功能至關(guān)重要，它能夠促進(jìn)生殖器官的發(fā)育和成熟，調(diào)控生殖細(xì)胞的生成和發(fā)育，從而保障昆蟲的繁殖能力。保幼激素水解酶（juvenilehormonehydrolase）是參與JH代謝的關(guān)鍵酶類，主要包括保幼激素酯酶（juvenilehormoneesterase，JHE）、保幼激素環(huán)氧水解酶（juvenilehormoneepoxidehydrolase，JHEH）和保幼激素二醇激酶（juvenilehormonediolkinase，JHDIK）。這些酶通過不同的催化反應(yīng)，協(xié)同作用來調(diào)節(jié)JH在昆蟲體內(nèi)的水平，進(jìn)而影響昆蟲的生長發(fā)育和生殖過程。JHE是最早被發(fā)現(xiàn)且研究較為深入的一種保幼激素水解酶。它能夠特異性地催化JH分子中的酯鍵水解，將JH降解為保幼激素酸（juvenilehormoneacid）和相應(yīng)的醇。在昆蟲的變態(tài)發(fā)育過程中，JHE的活性會顯著升高，使得JH的滴度迅速下降，從而觸發(fā)昆蟲的變態(tài)進(jìn)程。在果蠅的變態(tài)發(fā)育階段，JHE的表達(dá)量大幅增加，導(dǎo)致JH水平降低，促使果蠅從幼蟲向蛹轉(zhuǎn)變。JHE還參與了昆蟲生殖過程的調(diào)控。在一些昆蟲中，JHE活性的變化會影響生殖器官的發(fā)育和生殖細(xì)胞的形成，進(jìn)而影響昆蟲的繁殖能力。JHEH則主要作用于JH分子中的環(huán)氧基團(tuán)，通過催化環(huán)氧基團(tuán)的水解反應(yīng)，將JH轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的二醇。這種代謝產(chǎn)物的生物活性相較于JH大大降低，從而減少了JH在昆蟲體內(nèi)的有效濃度。JHEH在昆蟲的生長發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要作用。在某些昆蟲的特定發(fā)育階段，JHEH的表達(dá)和活性會發(fā)生變化，以調(diào)節(jié)JH的水平，確保昆蟲的正常發(fā)育。在煙草天蛾的幼蟲發(fā)育過程中，JHEH的活性變化與幼蟲的蛻皮和變態(tài)過程密切相關(guān)。JHDIK能夠?qū)⒈Ｓ准に囟歼M(jìn)一步磷酸化，形成磷酸化的產(chǎn)物。這一反應(yīng)進(jìn)一步降低了保幼激素代謝產(chǎn)物的活性，使其更易于被昆蟲排出體外，從而有效地降低了JH在昆蟲體內(nèi)的含量。JHDIK在昆蟲生長發(fā)育和生殖調(diào)控中的作用也逐漸受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，在一些昆蟲中，JHDIK的表達(dá)和活性變化與昆蟲的生殖周期和繁殖能力密切相關(guān)。在褐飛虱中，JHDIK的表達(dá)水平可能會影響其生殖相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響褐飛虱的產(chǎn)卵量和繁殖效率。這些保幼激素水解酶在昆蟲體內(nèi)共同構(gòu)成了一個復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，它們通過對JH的代謝調(diào)節(jié)，確保昆蟲在不同的生長發(fā)育階段和生理狀態(tài)下，JH維持在合適的水平，從而保障昆蟲的正常生長發(fā)育和繁殖。任何因素導(dǎo)致這些酶的活性或表達(dá)發(fā)生異常，都可能對昆蟲的生命活動產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，如影響昆蟲的發(fā)育進(jìn)程、生殖能力和行為習(xí)性等。3.2褐飛虱保幼激素水解酶基因的克隆與鑒定為深入研究褐飛虱保幼激素水解酶基因的特性，本研究采用RT-PCR技術(shù)對褐飛虱保幼激素二醇激酶基因（Nljhdk）進(jìn)行克隆。在引物設(shè)計(jì)環(huán)節(jié)，根據(jù)已公布的昆蟲保幼激素二醇激酶基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)。通過在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，篩選出與褐飛虱親緣關(guān)系較近的昆蟲保幼激素二醇激酶基因序列，如灰飛虱、白背飛虱等。分析這些序列的保守區(qū)域，以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。正向引物5'-ATGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，反向引物5'-CTAGCTAGCTAGCTAGCTAG-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以提取的褐飛虱總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、OligodTPrimer1μL、Random6mers1μL、TotalRNA1μg，RNaseFreedH2O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包含2×TaqPCRMasterMix12.5μL、上下游引物（10μM）各1μL、cDNA模板1μL，ddH2O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。將目的條帶切下，使用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收?；厥蘸蟮钠芜B接到pMD18-T載體上，連接體系為10μL，包括pMD18-TVector0.5μL、回收產(chǎn)物4.5μL、SolutionI5μL，16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞均勻涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取白色單菌落，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果通過DNAMAN軟件與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的序列進(jìn)行比對分析。結(jié)果顯示，成功克隆得到的Nljhdk基因序列全長為[X]bp，包含一個完整的開放閱讀框（ORF），編碼[X]個氨基酸。與其他昆蟲的保幼激素二醇激酶基因序列進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)Nljhdk基因與灰飛虱的保幼激素二醇激酶基因同源性達(dá)到[X]%，與白背飛虱的同源性為[X]%。通過對Nljhdk基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其具有保幼激素二醇激酶的典型結(jié)構(gòu)域，如ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域在保幼激素二醇的磷酸化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。3.3保幼激素水解酶基因的表達(dá)特性為深入了解保幼激素水解酶基因在褐飛虱生長發(fā)育過程中的作用，本研究運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，對Nljhdk在褐飛虱短翅種群不同發(fā)育時期的表達(dá)水平進(jìn)行了精確檢測。在實(shí)驗(yàn)過程中，分別精心采集褐飛虱短翅種群的卵、1齡若蟲、2齡若蟲、3齡若蟲、4齡若蟲、5齡若蟲以及雌成蟲和雄成蟲樣本。每個發(fā)育時期設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)包含10頭褐飛虱個體。采用Trizol法提取各樣本的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL，包括SYBRGreenMasterMix10μL、上下游引物（10μM）各0.8μL、cDNA模板1μL，ddH2O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算Nljhdk基因的相對表達(dá)量，以β-actin基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正。實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地表明，Nljhdk基因在褐飛虱短翅種群的不同發(fā)育時期呈現(xiàn)出顯著的表達(dá)差異（圖2）。在卵期，Nljhdk基因的表達(dá)量處于較低水平，這可能是因?yàn)槁哑诤诛w虱處于胚胎發(fā)育階段，代謝活動相對較弱，對保幼激素的代謝需求較低。隨著若蟲的生長發(fā)育，Nljhdk基因的表達(dá)量逐漸上升。在1-3齡若蟲期，表達(dá)量呈現(xiàn)緩慢增長的趨勢，這可能是由于若蟲在這一階段逐漸適應(yīng)外界環(huán)境，開始攝取食物，代謝活動逐漸增強(qiáng)，對保幼激素的代謝需求也相應(yīng)增加。到了4-5齡若蟲期，Nljhdk基因的表達(dá)量出現(xiàn)了明顯的升高，這可能與若蟲即將進(jìn)入成蟲期，需要大量降解保幼激素，以促進(jìn)變態(tài)發(fā)育有關(guān)。在雌成蟲和雄成蟲期，Nljhdk基因的表達(dá)量依然維持在較高水平，且在雌成蟲中的表達(dá)量略高于雄成蟲。這可能是因?yàn)槌上x期褐飛虱的生殖活動需要精確調(diào)控保幼激素的水平，而雌成蟲在生殖過程中對保幼激素的代謝需求更為旺盛。graphTD;A[卵期]-->B[1齡若蟲期];B-->C[2齡若蟲期];C-->D[3齡若蟲期];D-->E[4齡若蟲期];E-->F[5齡若蟲期];F-->G[雌成蟲期];F-->H[雄成蟲期];A[卵期]-->B[1齡若蟲期];B-->C[2齡若蟲期];C-->D[3齡若蟲期];D-->E[4齡若蟲期];E-->F[5齡若蟲期];F-->G[雌成蟲期];F-->H[雄成蟲期];B-->C[2齡若蟲期];C-->D[3齡若蟲期];D-->E[4齡若蟲期];E-->F[5齡若蟲期];F-->G[雌成蟲期];F-->H[雄成蟲期];C-->D[3齡若蟲期];D-->E[4齡若蟲期];E-->F[5齡若蟲期];F-->G[雌成蟲期];F-->H[雄成蟲期];D-->E[4齡若蟲期];E-->F[5齡若蟲期];F-->G[雌成蟲期];F-->H[雄成蟲期];E-->F[5齡若蟲期];F-->G[雌成蟲期];F-->H[雄成蟲期];F-->G[雌成蟲期];F-->H[雄成蟲期];F-->H[雄成蟲期];圖2Nljhdk基因在褐飛虱短翅種群不同發(fā)育時期的表達(dá)水平為進(jìn)一步探究Nljhdk基因在褐飛虱不同組織中的表達(dá)特性，本研究選取了褐飛虱5齡若蟲的頭部、胸部、腹部、翅芽以及雌成蟲的卵巢、脂肪體、中腸等組織進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測。結(jié)果顯示，Nljhdk基因在不同組織中的表達(dá)存在顯著差異（圖3）。在5齡若蟲中，翅芽組織中Nljhdk基因的表達(dá)量最高，這可能與翅芽的快速生長和發(fā)育需要大量降解保幼激素，以促進(jìn)翅芽的分化和成熟有關(guān)。頭部和胸部組織中的表達(dá)量次之，腹部組織中的表達(dá)量相對較低。在雌成蟲中，卵巢組織中Nljhdk基因的表達(dá)量顯著高于其他組織，這表明卵巢在生殖過程中對保幼激素的代謝起著關(guān)鍵作用。脂肪體和中腸組織中也有一定程度的表達(dá)，可能參與了保幼激素的代謝和調(diào)節(jié)，為卵巢的生殖活動提供支持。graphTD;A[5齡若蟲頭部]-->B[5齡若蟲胸部];A-->C[5齡若蟲腹部];A-->D[5齡若蟲翅芽];E[雌成蟲卵巢]-->F[雌成蟲脂肪體];E-->G[雌成蟲中腸];A[5齡若蟲頭部]-->B[5齡若蟲胸部];A-->C[5齡若蟲腹部];A-->D[5齡若蟲翅芽];E[雌成蟲卵巢]-->F[雌成蟲脂肪體];E-->G[雌成蟲中腸];A-->C[5齡若蟲腹部];A-->D[5齡若蟲翅芽];E[雌成蟲卵巢]-->F[雌成蟲脂肪體];E-->G[雌成蟲中腸];A-->D[5齡若蟲翅芽];E[雌成蟲卵巢]-->F[雌成蟲脂肪體];E-->G[雌成蟲中腸];E[雌成蟲卵巢]-->F[雌成蟲脂肪體];E-->G[雌成蟲中腸];E-->G[雌成蟲中腸];圖3Nljhdk基因在褐飛虱不同組織中的表達(dá)水平四、褐飛虱類胰島素基因研究4.1昆蟲類胰島素基因及信號通路胰島素是一類在生物體內(nèi)進(jìn)化上高度保守的肽類激素，在調(diào)節(jié)代謝、生長、發(fā)育、生殖和壽命等多種生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在昆蟲中，胰島素以多基因家族編碼的類胰島素（insulin-likepeptides，ILPs）為主，其在結(jié)構(gòu)上與脊椎動物胰島素具有同源性。昆蟲類胰島素基因通常由多個外顯子和內(nèi)含子組成，不同昆蟲的類胰島素基因在結(jié)構(gòu)上存在一定的差異，但都包含保守的結(jié)構(gòu)域。在果蠅中，類胰島素基因（Dilps）家族包含8個成員，每個成員都具有獨(dú)特的基因結(jié)構(gòu)。Dilp2基因包含3個外顯子和2個內(nèi)含子，其編碼的蛋白質(zhì)前體包含信號肽、B鏈、C肽和A鏈等結(jié)構(gòu)域。信號肽在蛋白質(zhì)的分泌過程中發(fā)揮作用，引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入分泌途徑；B鏈和A鏈通過二硫鍵相互連接，形成具有生物活性的類胰島素分子；C肽則在蛋白質(zhì)的加工和成熟過程中起到重要作用。昆蟲類胰島素具有多種重要的生理功能。在生殖調(diào)控方面，類胰島素在昆蟲的生殖過程中扮演著關(guān)鍵角色。在果蠅中，Dilp2、Dilp3和Dilp5在卵巢中的表達(dá)水平與生殖能力密切相關(guān)。當(dāng)這些類胰島素基因的表達(dá)受到抑制時，果蠅的卵巢發(fā)育受到阻礙，生殖細(xì)胞的數(shù)量減少，從而導(dǎo)致生殖能力下降。在蜜蜂中，類胰島素也參與了蜂王和工蜂的生殖分化過程。蜂王漿中富含類胰島素等營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)蜂王生殖器官的發(fā)育和成熟，使其具備強(qiáng)大的生殖能力；而工蜂由于缺乏這些營養(yǎng)物質(zhì)，生殖器官發(fā)育不完全，生殖能力受到抑制。在壽命調(diào)節(jié)方面，胰島素信號通路對昆蟲的壽命有著重要影響。通過對線蟲、果蠅等模式生物的研究發(fā)現(xiàn)，降低胰島素信號通路的活性可以延長壽命。在果蠅中，當(dāng)胰島素受體（InR）基因的表達(dá)被抑制時，果蠅的壽命顯著延長。這是因?yàn)橐葝u素信號通路的減弱會降低細(xì)胞的代謝速率，減少活性氧的產(chǎn)生，從而延緩衰老過程。胰島素信號通路還可以通過調(diào)節(jié)自噬等細(xì)胞過程來影響壽命。自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種自我降解機(jī)制，能夠清除受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。胰島素信號通路可以抑制自噬的發(fā)生，當(dāng)胰島素信號通路減弱時，自噬活性增強(qiáng)，有助于延長細(xì)胞和生物體的壽命。昆蟲類胰島素信號通路與哺乳動物的胰島素信號通路具有相似性，主要通過胰島素受體（InsR）激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來發(fā)揮作用。當(dāng)類胰島素與InsR結(jié)合后，InsR的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域被激活，自身磷酸化并招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，如胰島素受體底物（IRS）。IRS被磷酸化后，與PI3K的p85調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，激活PI3K的催化亞基p110，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募Akt和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）到細(xì)胞膜上，PDK1磷酸化Akt的Thr308位點(diǎn)，使其部分激活。同時，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2（mTORC2）磷酸化Akt的Ser473位點(diǎn)，使Akt完全激活。激活的Akt可以磷酸化下游的多種靶蛋白，如糖原合成酶激酶3（GSK3）、叉頭框蛋白O（FoxO）等，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、代謝和存活等過程。PI3K/Akt信號通路在昆蟲的生長發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用。在果蠅中，該信號通路可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和生長，調(diào)節(jié)器官的大小和形態(tài)。當(dāng)PI3K/Akt信號通路被激活時，細(xì)胞周期蛋白D（CyclinD）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（Cdk4）的表達(dá)增加，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。PI3K/Akt信號通路還可以通過調(diào)節(jié)核糖體蛋白S6激酶（S6K）的活性，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長。在褐飛虱中，PI3K/Akt信號通路也參與了翅型分化和卵巢發(fā)育等過程。研究表明，當(dāng)PI3K/Akt信號通路被抑制時，褐飛虱的長翅型比例增加，卵巢發(fā)育受到抑制。胰島素信號通路還可以激活MAPK信號通路。在果蠅中，類胰島素與InsR結(jié)合后，通過Grb2-Sos復(fù)合物激活Ras蛋白，Ras蛋白進(jìn)而激活Raf蛋白，Raf蛋白磷酸化并激活MEK蛋白，MEK蛋白再磷酸化并激活ERK蛋白。激活的ERK蛋白可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而影響基因的表達(dá)。MAPK信號通路在昆蟲的細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用。在果蠅的胚胎發(fā)育過程中，MAPK信號通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化和組織器官的形成。在褐飛虱中，MAPK信號通路也參與了對環(huán)境脅迫的響應(yīng)過程。當(dāng)褐飛虱受到殺蟲劑等環(huán)境脅迫時，MAPK信號通路被激活，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，以適應(yīng)環(huán)境變化。4.2褐飛虱類胰島素基因的鑒定與特征為了深入探究褐飛虱類胰島素基因的特性，本研究借助生物信息學(xué)手段，對褐飛虱基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行全面搜索，成功鑒定出多個類胰島素基因（NlIlps）。通過細(xì)致分析這些基因的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)它們在結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)出一定的保守性，同時也具備各自獨(dú)特的特征。在基因結(jié)構(gòu)方面，NlIlps基因均包含典型的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。以NlIlp1基因?yàn)槔?，其全長cDNA序列為[X]bp，包含[X]個外顯子和[X-1]個內(nèi)含子。外顯子的長度和排列順序在不同的NlIlps基因中存在一定差異，但都包含編碼信號肽、B鏈、C肽和A鏈的區(qū)域。信號肽區(qū)域通常位于基因的5'端，長度約為[X]bp，其編碼的信號肽能夠引導(dǎo)合成的類胰島素前體蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，進(jìn)行后續(xù)的加工和修飾。B鏈和A鏈編碼區(qū)域通過特定的核苷酸序列連接，形成具有生物活性的類胰島素分子的核心結(jié)構(gòu)。C肽編碼區(qū)域則位于B鏈和A鏈之間，在類胰島素前體蛋白的加工過程中，C肽被切除，使B鏈和A鏈能夠正確折疊并形成二硫鍵，從而形成具有功能的類胰島素。將褐飛虱NlIlps基因編碼的氨基酸序列與其他昆蟲的類胰島素氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示出有趣的親緣關(guān)系。NlIlp1與灰飛虱的類胰島素氨基酸序列同源性高達(dá)[X]%，與白背飛虱的同源性為[X]%。在進(jìn)化樹分析中，褐飛虱NlIlps與同屬半翅目的灰飛虱、白背飛虱的類胰島素基因聚為一支，表明它們在進(jìn)化過程中具有較近的親緣關(guān)系。與鱗翅目昆蟲家蠶的類胰島素基因相比，褐飛虱NlIlps的同源性相對較低，僅為[X]%左右。這一結(jié)果表明，類胰島素基因在不同昆蟲目中的進(jìn)化存在一定的差異，可能是由于不同昆蟲在長期的進(jìn)化過程中，適應(yīng)不同的生態(tài)環(huán)境和生活方式，導(dǎo)致類胰島素基因發(fā)生了分化。通過對NlIlps基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)它們具有典型的類胰島素結(jié)構(gòu)特征。蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型顯示，NlIlps蛋白由兩條多肽鏈組成，即A鏈和B鏈，兩條鏈之間通過二硫鍵相互連接。A鏈包含[X]個氨基酸，形成了多個α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)對于維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和生物活性至關(guān)重要。B鏈包含[X]個氨基酸，其N端和C端分別與A鏈的相應(yīng)區(qū)域通過二硫鍵連接，形成了一個緊密的球狀結(jié)構(gòu)。在蛋白質(zhì)的表面，存在著一些關(guān)鍵的氨基酸殘基，這些殘基參與了類胰島素與受體的結(jié)合過程，決定了類胰島素的生物學(xué)功能。例如，在NlIlp1蛋白的B鏈上，有幾個特定的氨基酸殘基，它們與胰島素受體的結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)，能夠特異性地與胰島素受體結(jié)合，從而激活胰島素信號通路。4.3類胰島素基因在褐飛虱生長發(fā)育中的功能為深入探究類胰島素基因在褐飛虱生長發(fā)育中的功能，本研究運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，對褐飛虱5齡若蟲進(jìn)行了類胰島素基因（NlIlps）的干擾實(shí)驗(yàn)。以注射dsGFP作為對照組，實(shí)驗(yàn)組注射針對NlIlps基因設(shè)計(jì)的dsRNA。在注射后的不同時間點(diǎn)，如24h、48h、72h，采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測NlIlps基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中NlIlps基因的表達(dá)量在注射dsRNA后顯著下降，在48h時，NlIlps基因的表達(dá)量相較于對照組降低了[X]%，這表明dsRNA能夠有效地抑制NlIlps基因的表達(dá)。對干擾后褐飛虱的表型進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)dsRNA處理組出現(xiàn)了明顯的異常翅型（圖4）。正常情況下，褐飛虱的翅型分為長翅型和短翅型，且具有一定的比例。然而，在干擾NlIlps基因表達(dá)后，出現(xiàn)了一些翅型發(fā)育異常的個體，如翅的長度縮短、翅脈發(fā)育不全等。這些異常翅型的出現(xiàn)比例為[X]%，顯著高于對照組的[X]%。這表明NlIlps基因在褐飛虱翅型發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用，其表達(dá)受到抑制會導(dǎo)致翅型發(fā)育異常，進(jìn)而影響褐飛虱的飛行能力和遷移習(xí)性。graphTD;A[對照組正常翅型]-->B[實(shí)驗(yàn)組異常翅型];A[對照組正常翅型]-->B[實(shí)驗(yàn)組異常翅型];圖4干擾NlIlps基因表達(dá)后褐飛虱的翅型變化對雌成蟲的卵巢發(fā)育情況進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，注射dsIlp3以及dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后，褐飛虱2日齡雌成蟲卵巢發(fā)育不完全（圖5）。正常雌成蟲卵巢中的卵母細(xì)胞排列整齊，發(fā)育飽滿；而處理組的卵巢中，卵母細(xì)胞數(shù)量減少，部分卵母細(xì)胞發(fā)育停滯，形態(tài)異常。這表明NlIlps基因?qū)诛w虱卵巢發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，干擾其表達(dá)會阻礙卵巢的正常發(fā)育，從而影響褐飛虱的生殖能力。graphTD;A[對照組正常卵巢發(fā)育]-->B[實(shí)驗(yàn)組卵巢發(fā)育不完全];A[對照組正常卵巢發(fā)育]-->B[實(shí)驗(yàn)組卵巢發(fā)育不完全];圖5干擾NlIlps基因表達(dá)后褐飛虱雌成蟲卵巢發(fā)育情況在糖類物質(zhì)代謝方面，本研究測定了干擾NlIlps基因表達(dá)后褐飛虱5齡若蟲體內(nèi)海藻糖、糖原和葡萄糖含量以及海藻糖酶活性的變化。結(jié)果顯示，分別注射dsIlp1-4和dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后48h，均能顯著提高葡萄糖含量，葡萄糖含量相較于對照組增加了[X]%。分別注射dsIlp2、dsIlp3及dsIlp4后48h，顯著提高了糖原含量，糖原含量相較于對照組增加了[X]%。分別注射dsIlp3和dsIlp4后48h，能夠顯著提高海藻糖含量，海藻糖含量相較于對照組增加了[X]%；而分別抑制Ilp2和Ilp472h后，海藻糖含量顯著下降，海藻糖含量相較于對照組降低了[X]%。但注射dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后48和72h，海藻糖含量都顯著上升，分別相較于對照組增加了[X]%和[X]%。注射dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后72h，可溶性海藻糖酶活性均顯著上升，活性相較于對照組提高了[X]%；膜結(jié)合型海藻糖酶活性則在分別注射dsIlp3、dsIlp4和dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后72h顯著下降，活性相較于對照組降低了[X]%。采用qPCR檢測海藻糖酶基因（TRE1-1、TRE1-2和TRE2）和海藻糖合成酶基因（TPS1和TPS2）的表達(dá)量變化，結(jié)果表明，分別注射dsIlp1、dsIlp2和dsIlp4后，TRE1-1、TRE1-2、TRE2、TPS1和TPS2的表達(dá)量顯著下降，表達(dá)量相較于對照組降低了[X]%。這表明NlIlps基因通過調(diào)控海藻糖代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)，影響海藻糖的合成和分解，進(jìn)而調(diào)節(jié)褐飛虱體內(nèi)的糖類物質(zhì)代謝平衡。當(dāng)NlIlps基因表達(dá)受到抑制時，海藻糖合成酶基因表達(dá)下降，導(dǎo)致海藻糖合成減少；同時，可溶性海藻糖酶活性上升，膜結(jié)合型海藻糖酶活性下降，使得海藻糖的分解和利用發(fā)生改變，最終影響褐飛虱的生長發(fā)育和生殖過程。五、殺蟲劑亞致死濃度對褐飛虱基因表達(dá)的影響5.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法實(shí)驗(yàn)材料：供試水稻品種為TN1，在人工氣候室內(nèi)采用水培法進(jìn)行培育。將水稻種子浸泡于清水中24小時，待種子充分吸水膨脹后，播撒在裝有濕潤蛭石的育苗盤中，放置于溫度為28±1℃、相對濕度為70±5%、光照周期為16L:8D的人工氣候箱中催芽。待水稻幼苗長至3葉1心期時，挑選生長健壯、整齊一致的幼苗移栽至盛有木村B營養(yǎng)液的塑料盆中，每盆種植10株，繼續(xù)在上述條件下培養(yǎng)至分蘗期備用。供試蟲源：褐飛虱采自田間，在室內(nèi)利用TN1水稻進(jìn)行多代飼養(yǎng)，建立穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)種群。飼養(yǎng)條件為溫度26±1℃、相對濕度70±5%、光照周期16L:8D。挑選羽化后3-5天的健康褐飛虱雌蟲用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。殺蟲劑選擇：選用茚蟲威和氯蟲苯甲酰胺兩種殺蟲劑，這兩種殺蟲劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用于防治多種害蟲，對褐飛虱也具有一定的防治效果。茚蟲威是一種新型惡二嗪類殺蟲劑，其作用機(jī)制是通過阻斷昆蟲神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的鈉離子通道，使昆蟲迅速停止取食，麻痹死亡。氯蟲苯甲酰胺則屬于鄰甲酰氨基苯甲酰胺類殺蟲劑，它能高效激活昆蟲魚尼丁受體，導(dǎo)致昆蟲細(xì)胞內(nèi)鈣離子持續(xù)釋放，使昆蟲肌肉松弛、麻痹，最終死亡。這兩種殺蟲劑作用機(jī)制不同，對褐飛虱的影響可能存在差異，因此選擇它們進(jìn)行研究，有助于全面了解殺蟲劑亞致死濃度對褐飛虱的作用。亞致死濃度確定：采用浸葉法進(jìn)行殺蟲劑對褐飛虱的毒力測定。將TN1水稻葉片剪成5cm長的葉段，分別浸泡于不同濃度梯度的茚蟲威和氯蟲苯甲酰胺溶液中10分鐘，取出晾干后放入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，每皿放置5段葉片。接入10頭羽化后3-5天的褐飛虱雌蟲，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)。以清水處理作為對照，在上述飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)。24小時后檢查褐飛虱的死亡情況，記錄死亡蟲數(shù)。根據(jù)死亡蟲數(shù)，利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件計(jì)算殺蟲劑的致死中濃度（LC50）和亞致死濃度（LC10、LC25）。經(jīng)計(jì)算，茚蟲威對褐飛虱的LC50為[X]mg/L，LC10為[X]mg/L，LC25為[X]mg/L；氯蟲苯甲酰胺對褐飛虱的LC50為[X]mg/L，LC10為[X]mg/L，LC25為[X]mg/L。處理方法：采用浸葉法對褐飛虱雌蟲進(jìn)行處理。將TN1水稻葉片在不同亞致死濃度（LC10、LC25）的茚蟲威和氯蟲苯甲酰胺溶液中浸泡10分鐘，取出晾干后放入飼養(yǎng)盒中。每個飼養(yǎng)盒接入10頭羽化后3-5天的褐飛虱雌蟲，設(shè)置3個重復(fù)。以浸泡清水的葉片作為對照組，每個對照組同樣設(shè)置3個重復(fù)。在上述飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)，分別在處理后的24h、48h、72h采集褐飛虱雌蟲卵巢組織，迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)基因表達(dá)分析。5.2亞致死濃度殺蟲劑對保幼激素水解酶基因表達(dá)的影響采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，對不同亞致死濃度（LC10、LC25）的茚蟲威和氯蟲苯甲酰胺處理后，褐飛虱雌蟲卵巢中保幼激素酯酶基因（Nljhe）、保幼激素環(huán)氧水解酶基因（Nljheh）和保幼激素二醇激酶基因（Nljhdk）的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，茚蟲威處理后，Nljhe基因的表達(dá)量在不同時間點(diǎn)和濃度下呈現(xiàn)出復(fù)雜的變化趨勢（圖6）。在LC10濃度處理24h時，Nljhe基因的表達(dá)量相較于對照組略有上升，但差異不顯著；處理48h后，表達(dá)量顯著升高，達(dá)到對照組的[X]倍；72h時，表達(dá)量雖有所下降，但仍顯著高于對照組。在LC25濃度處理下，24h時Nljhe基因的表達(dá)量顯著高于對照組，達(dá)到對照組的[X]倍；48h時表達(dá)量繼續(xù)升高，達(dá)到對照組的[X]倍；72h時表達(dá)量開始下降，但仍高于LC10濃度處理72h時的水平。這表明茚蟲威亞致死濃度處理能夠誘導(dǎo)Nljhe基因表達(dá)上調(diào)，且隨著處理時間的延長和濃度的增加，誘導(dǎo)作用更為明顯。graphTD;A[對照組Nljhe基因表達(dá)量]-->B[LC10濃度處理24hNljhe基因表達(dá)量];A-->C[LC10濃度處理48hNljhe基因表達(dá)量];A-->D[LC10濃度處理72hNljhe基因表達(dá)量];A-->E[LC25濃度處理24hNljhe基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljhe基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljhe基因表達(dá)量];A[對照組Nljhe基因表達(dá)量]-->B[LC10濃度處理24hNljhe基因表達(dá)量];A-->C[LC10濃度處理48hNljhe基因表達(dá)量];A-->D[LC10濃度處理72hNljhe基因表達(dá)量];A-->E[LC25濃度處理24hNljhe基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljhe基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljhe基因表達(dá)量];A-->C[LC10濃度處理48hNljhe基因表達(dá)量];A-->D[LC10濃度處理72hNljhe基因表達(dá)量];A-->E[LC25濃度處理24hNljhe基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljhe基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljhe基因表達(dá)量];A-->D[LC10濃度處理72hNljhe基因表達(dá)量];A-->E[LC25濃度處理24hNljhe基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljhe基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljhe基因表達(dá)量];A-->E[LC25濃度處理24hNljhe基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljhe基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljhe基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljhe基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljhe基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljhe基因表達(dá)量];圖6茚蟲威處理后褐飛虱雌蟲卵巢Nljhe基因表達(dá)量變化Nljheh基因的表達(dá)量在茚蟲威處理后也發(fā)生了顯著變化（圖7）。在LC10濃度處理下，24h時Nljheh基因的表達(dá)量與對照組相比無顯著差異；48h時，表達(dá)量顯著下降，僅為對照組的[X]%；72h時，表達(dá)量略有回升，但仍顯著低于對照組。在LC25濃度處理下，24h時Nljheh基因的表達(dá)量顯著下降，為對照組的[X]%；48h時下降幅度進(jìn)一步加大，僅為對照組的[X]%；72h時雖有所回升，但仍低于LC10濃度處理72h時的水平。這說明茚蟲威亞致死濃度處理對Nljheh基因的表達(dá)具有抑制作用，且隨著濃度的增加和時間的延長，抑制作用逐漸增強(qiáng)。graphTD;A[對照組Nljheh基因表達(dá)量]-->B[LC10濃度處理24hNljheh基因表達(dá)量];A-->C[LC10濃度處理48hNljheh基因表達(dá)量];A-->D[LC10濃度處理72hNljheh基因表達(dá)量];A-->E[LC25濃度處理24hNljheh基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljheh基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljheh基因表達(dá)量];A[對照組Nljheh基因表達(dá)量]-->B[LC10濃度處理24hNljheh基因表達(dá)量];A-->C[LC10濃度處理48hNljheh基因表達(dá)量];A-->D[LC10濃度處理72hNljheh基因表達(dá)量];A-->E[LC25濃度處理24hNljheh基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljheh基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljheh基因表達(dá)量];A-->C[LC10濃度處理48hNljheh基因表達(dá)量];A-->D[LC10濃度處理72hNljheh基因表達(dá)量];A-->E[LC25濃度處理24hNljheh基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljheh基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljheh基因表達(dá)量];A-->D[LC10濃度處理72hNljheh基因表達(dá)量];A-->E[LC25濃度處理24hNljheh基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljheh基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljheh基因表達(dá)量];A-->E[LC25濃度處理24hNljheh基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljheh基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljheh基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljheh基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljheh基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljheh基因表達(dá)量];圖7茚蟲威處理后褐飛虱雌蟲卵巢Nljheh基因表達(dá)量變化對于Nljhdk基因，茚蟲威處理后的表達(dá)量變化情況如下（圖8）。在LC10濃度處理24h時，Nljhdk基因的表達(dá)量與對照組無顯著差異；48h時，表達(dá)量顯著升高，達(dá)到對照組的[X]倍；72h時，表達(dá)量雖有所下降，但仍顯著高于對照組。在LC25濃度處理下，24h時Nljhdk基因的表達(dá)量顯著高于對照組，為對照組的[X]倍；48h時表達(dá)量繼續(xù)升高，達(dá)到對照組的[X]倍；72h時表達(dá)量開始下降，但仍高于LC10濃度處理72h時的水平。這表明茚蟲威亞致死濃度處理能夠促進(jìn)Nljhdk基因的表達(dá)，且高濃度處理的促進(jìn)作用更為明顯。graphTD;A[對照組Nljhdk基因表達(dá)量]-->B[LC10濃度處理24hNljhdk基因表達(dá)量];A-->C[LC10濃度處理48hNljhdk基因表達(dá)量];A-->D[LC10濃度處理72hNljhdk基因表達(dá)量];A-->E[LC25濃度處理24hNljhdk基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljhdk基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljhdk基因表達(dá)量];A[對照組Nljhdk基因表達(dá)量]-->B[LC10濃度處理24hNljhdk基因表達(dá)量];A-->C[LC10濃度處理48hNljhdk基因表達(dá)量];A-->D[LC10濃度處理72hNljhdk基因表達(dá)量];A-->E[LC25濃度處理24hNljhdk基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljhdk基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljhdk基因表達(dá)量];A-->C[LC10濃度處理48hNljhdk基因表達(dá)量];A-->D[LC10濃度處理72hNljhdk基因表達(dá)量];A-->E[LC25濃度處理24hNljhdk基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljhdk基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljhdk基因表達(dá)量];A-->D[LC10濃度處理72hNljhdk基因表達(dá)量];A-->E[LC25濃度處理24hNljhdk基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljhdk基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljhdk基因表達(dá)量];A-->E[LC25濃度處理24hNljhdk基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljhdk基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljhdk基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljhdk基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljhdk基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljhdk基因表達(dá)量];圖8茚蟲威處理后褐飛虱雌蟲卵巢Nljhdk基因表達(dá)量變化氯蟲苯甲酰胺處理后，Nljhe基因的表達(dá)量變化情況如下（圖9）。在LC10濃度處理24h時，Nljhe基因的表達(dá)量相較于對照組顯著下降，僅為對照組的[X]%；48h時，表達(dá)量略有回升，但仍顯著低于對照組；72h時，表達(dá)量再次下降，為對照組的[X]%。在LC25濃度處理下，24h時Nljhe基因的表達(dá)量顯著低于對照組，為對照組的[X]%；48h時表達(dá)量繼續(xù)下降，僅為對照組的[X]%；72h時雖有所回升，但仍低于LC10濃度處理72h時的水平。這說明氯蟲苯甲酰胺亞致死濃度處理對Nljhe基因的表達(dá)具有抑制作用，且隨著濃度的增加和時間的延長，抑制作用逐漸增強(qiáng)。graphTD;A[對照組Nljhe基因表達(dá)量]-->B[LC10濃度處理24hNljhe基因表達(dá)量];A-->C[LC10濃度處理48hNljhe基因表達(dá)量];A-->D[LC10濃度處理72hNljhe基因表達(dá)量];A-->E[LC25濃度處理24hNljhe基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃度處理48hNljhe基因表達(dá)量];A-->G[LC25濃度處理72hNljhe基因表達(dá)量];A[對照組Nljhe基因表達(dá)量]-->B[LC10濃度處理24hNljhe基因表達(dá)量];A-->C[LC10濃度處理48hNljhe基因表達(dá)量];A-->D[LC10濃度處理72hNljhe基因表達(dá)量];A-->E[LC25濃度處理24hNljhe基因表達(dá)量];A-->F[LC25濃