《敷料中重組膠原蛋白的檢測(cè)液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》編制說明1本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)化工學(xué)會(huì)提出并歸口，由西安巨用質(zhì)?；虿《据d體將目的基因帶入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞（細(xì)菌、酵母和其他真核細(xì)胞等）中，表達(dá)并翻譯成膠原蛋白或類似膠原蛋白的多肽，經(jīng)過提取和純化等步驟制備而成。由于其具有良好的生物相容性、生物功近幾年，隨著化妝品、醫(yī)美等下游應(yīng)用領(lǐng)域的飛速發(fā)展，重組膠原蛋白產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)欣欣向榮的景象，對(duì)單鏈或有三螺旋結(jié)構(gòu)的三聚體，全長(zhǎng)、片段或片段編輯拼接等。產(chǎn)品中重組膠原蛋白的含量和特性是影響考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）以及紫外-可見分光光度法，但是以上方法均是常規(guī)的蛋《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品膠原蛋白基于特征多肽測(cè)定的膠原蛋日用化學(xué)產(chǎn)品中的重組膠原蛋白是存在于復(fù)雜基質(zhì)中，應(yīng)用以上方法均難以鑒別和準(zhǔn)確檢測(cè)。導(dǎo)致市場(chǎng)上日用化學(xué)產(chǎn)品存在微量添加、含量不清、質(zhì)量良莠不齊等問題，所以急需制定相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)來規(guī)范行業(yè)的發(fā)2在標(biāo)準(zhǔn)編制過程中，起草工作組收集了以下資料，包括但不限于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、期刊文獻(xiàn)等：—胡歡,李云蘭,張蕻,等.重組膠原蛋白在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用[J/OL].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1-27—程娟,劉雯恩,黃敏菊,等.雙縮脲法測(cè)定膠原貼敷料中Ⅰ型膠原蛋白含量[J].中國(guó)醫(yī)療器械信標(biāo)項(xiàng)要求，開展了產(chǎn)品指標(biāo)數(shù)據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)起草單位為西安巨子生物基因技術(shù)股份有限公司、陜西巨子生物技術(shù)有限公司、陜西巨麗康生物3本標(biāo)準(zhǔn)的編制過程遵循規(guī)范性、功能特性、可證實(shí)性、可操作性、科學(xué)性、合理性以及持續(xù)改進(jìn)等基技術(shù)層面上，參考了YY/T1849-2022《重組膠原蛋白》、國(guó)家藥監(jiān)局發(fā)布的《蛋白類產(chǎn)品的表征和質(zhì)量控制》等，為膠原蛋白類產(chǎn)品的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供了參考，由此開展相關(guān)起草重組膠原蛋白作為一種重要的生物材料，在醫(yī)療、美容護(hù)膚等多個(gè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和市場(chǎng)需求的增長(zhǎng)，相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)制定顯得尤為重要。本分析旨在探討敷料中重組膠原蛋白定性定企業(yè)資助等渠道進(jìn)行，主要投入于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證的材料費(fèi)、差旅費(fèi)、儀器運(yùn)行費(fèi)等，目前本標(biāo)準(zhǔn)中所涉及生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)成本，加之在膠原蛋白醫(yī)藥等大健康產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展下，對(duì)相關(guān)產(chǎn)品的促進(jìn)作用也日益顯著，據(jù)一，通過準(zhǔn)確判斷重組膠原蛋白的含量和特性對(duì)敷重組膠原蛋白產(chǎn)品市場(chǎng)將達(dá)到2193.8億元，市場(chǎng)將實(shí)現(xiàn)蓬勃發(fā)展，技術(shù)重組膠原蛋白型別分類較多，不同重組膠原蛋白具有不同功效，目前以重組膠原蛋白為標(biāo)志性成分的原料在敷料領(lǐng)域已使用多年，但各廠家檢測(cè)重組膠原蛋白的方法多種，差異較大，重組膠原蛋白種類也沒有對(duì)應(yīng)的鑒別要求，導(dǎo)致市場(chǎng)上原料質(zhì)量參差不齊，主要原因是沒有統(tǒng)一且特異性的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其原料進(jìn)行質(zhì)量規(guī)定。該項(xiàng)目主要涉及建立法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)重組膠原蛋白類敷料原料進(jìn)行規(guī)范化質(zhì)量檢測(cè)管理。使相關(guān)產(chǎn)品中重組膠原蛋白類別、含量的指標(biāo)明確化，杜絕各企業(yè)對(duì)其原料混淆消費(fèi)者視聽，進(jìn)行夸大宣傳。隨著目前行業(yè)中對(duì)重組膠原蛋白檢測(cè)手段更加成熟準(zhǔn)確，涵蓋范圍更廣泛，建立適合重組膠原蛋白敷料原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有必要性及可行性。該項(xiàng)目落地實(shí)現(xiàn)后，將有利于重組膠原蛋白類相關(guān)原料的各質(zhì)量指標(biāo)清晰化管理，為其他敷料原料定性定量檢測(cè)管理提供模板和思路，有利于促進(jìn)該行業(yè)的健康發(fā)展，創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效4基于特征多肽測(cè)定的膠原蛋白含量檢測(cè)—液相色譜-質(zhì)譜法》、YY/T1849-2022《重組膠原蛋白》、YY/T1888-2023《重組人源化膠原蛋白》等現(xiàn)行的法律法規(guī)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)以及期刊論文的基礎(chǔ)上，提供的作為敷料用重組膠原蛋白原料的定性定量檢測(cè)方法，有利于完善重關(guān)于重組膠原蛋白相關(guān)的法律法規(guī)主要包括以國(guó)家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：目前國(guó)內(nèi)還未發(fā)布有關(guān)重組膠原蛋白領(lǐng)域的強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有特征多肽測(cè)定的膠原蛋白含量檢測(cè)—液相色譜-質(zhì)譜法》、YY/T0954-2015《無源植入劑》以及YY/T1888-2023《重檢測(cè)指標(biāo)及其方法，以及相關(guān)產(chǎn)品如膠原蛋白植入劑的要求和檢驗(yàn)方法等。本標(biāo)準(zhǔn)在以上標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上提供相關(guān)法律法規(guī)：包括但不限于《重組膠原蛋白生物材料命名指導(dǎo)原則》、《重組膠原蛋白類醫(yī)療產(chǎn)品分類界定原則》、《重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》以及《化妝品監(jiān)督管理?xiàng)l例》等，這些法律法規(guī)為敷料中重組膠原蛋白的定性定量檢測(cè)提供了科學(xué)的評(píng)估方法、依據(jù)和規(guī)范，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和產(chǎn)品開發(fā)整體來看，該項(xiàng)《敷料中重組膠原蛋白的定性定量檢測(cè)—液相色譜-質(zhì)譜法》的標(biāo)準(zhǔn)與相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、法律法規(guī)相互配套，共同構(gòu)成了一個(gè)完整的監(jiān)管體系，旨在確保產(chǎn)品的安全性、有效性和合規(guī)性，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)的5通過社交媒體、電商平臺(tái)、行業(yè)網(wǎng)站發(fā)布相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施信息，并開展網(wǎng)上授課等方式對(duì)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施進(jìn)行在公司內(nèi)部、或地區(qū)范圍內(nèi)進(jìn)行相關(guān)人員培訓(xùn)，在科研機(jī)構(gòu)院校，鼓勵(lì)科學(xué)研究過程中使用該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)6A.1.1儀器和設(shè)備液相色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（粒徑5μm，150mm×2.1mm）。其它見標(biāo)準(zhǔn)正文的A.1.2供試品、對(duì)照品及試劑供試品：醫(yī)用重組III型膠原蛋白噴劑敷料（以下簡(jiǎn)稱為噴劑敷料，液體狀）、醫(yī)用重組III型膠原蛋白修復(fù)敷料（以下簡(jiǎn)稱為修復(fù)敷料，乳膏狀）、醫(yī)用重基質(zhì)對(duì)照樣品：對(duì)應(yīng)于三種敷料的供試品基質(zhì)（除重組III型膠原蛋白原料之外的所A.1.3溶液配制A.2定性鑒別和定量檢測(cè)方法A.2.1特征多肽設(shè)計(jì)和確認(rèn)按正文6.1條款的要求進(jìn)行供試品特異性特征多肽的設(shè)列以胰蛋白酶進(jìn)行理論酶切，收集所有肽段信息，利用BioFinder軟件進(jìn)行分析，檢索高度匹配的重組III型膠原蛋白肽段，與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中不同種屬來源和不同型別的膠原文6.1條款的篩選原則，篩選僅存在于供試品（人III型膠原蛋白）的肽段，且不存在于常見的哺乳動(dòng)物的肽段作為重組III型膠原蛋白供試品特異性的特征肽段，并且將供試品所含重組膠原蛋白原料按正文6.4條款進(jìn)行胰品特異性特征多肽具有足夠的信號(hào)強(qiáng)度和良好的分離度，譜峰清晰，理論塔板數(shù)4000。特征多肽確認(rèn)A.2.1.1色譜條件流動(dòng)相A相為含0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B相為含0.1%甲酸乙腈溶液；色譜柱為Peptid70222A.2.1.2質(zhì)譜條件scanevent1為fullscan，掃描范圍：m/z400-2000，分辨率：60000，RFLens：4AGCTarget：300%，最大離子注入時(shí)間為：100ms；scanevent2為datadependentMS/MS，分辨率：15000，IsolationWindow：m/z1.6，最大離子注入時(shí)間為；200ms，NormalizedAGCTarget：100%，碰撞能量：30％，A.2.2方法學(xué)確認(rèn)按正文6.2條款的要求進(jìn)行樣品準(zhǔn)備，具體見A.2.3.4和A.2A.2.3樣品前處理A.2.3.1供試品樣品精密量取噴劑敷料（液體狀）2mL于10mL離心管中；精密稱取修復(fù)敷料（乳膏狀）和醫(yī)凝膠敷料（凝膠狀）各2g，分別置于10mL離心管中，冷凍干燥。向凍干后的噴劑敷料中加入0.1mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液2mL，磁力攪拌20～30min，使敷料基質(zhì)充分溶解并混合均勻，備用；分別向8修復(fù)敷料和敷料液中分別加入0.1mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液4mL，磁力攪拌20～30min，使敷料A.2.3.2標(biāo)準(zhǔn)樣品母液8.0）溶解，轉(zhuǎn)移至10mL容量A.2.3.3基質(zhì)對(duì)照樣品A.2.3.3.1噴劑敷料基質(zhì)對(duì)照樣品溶液準(zhǔn)確量取5mL噴劑敷料基質(zhì)對(duì)照樣品，冷凍干燥，加入5力攪拌20～30min，使敷料組分充分溶A.2.3.3.2修復(fù)敷料基質(zhì)對(duì)照樣品溶液準(zhǔn)確量取2g修復(fù)敷料基質(zhì)對(duì)照樣品，冷凍干燥，加入4mL0.1mol/LTris-HCl（pH8.0）復(fù)溶，A.2.3.3.3敷料液基質(zhì)對(duì)照樣品溶液準(zhǔn)確量取2g敷料液基質(zhì)對(duì)照樣品，冷凍干燥，加入4mA.2.3.4檢測(cè)限和定量限確認(rèn)樣品A.2.3.4.3敷料液基質(zhì)對(duì)照樣品中添加重組III型膠原蛋白原料終濃度至0.1ng/g、0.5ng/g、1ng/g、A.2.3.5檢測(cè)回收率分析樣品A.2.3.5.1在噴劑敷料的基質(zhì)對(duì)照樣μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL，按與A.2.3.5.2在修復(fù)敷料和敷料液的基質(zhì)對(duì)照樣品中分別添加高中低劑量的重組III型膠原蛋白原料，如：10μg/g、50μg/g、100μg/g和200μgA.2.4.1樣品溶解9A.2.4.2樣品酶解A.2.4.2.1標(biāo)準(zhǔn)樣品酶解及標(biāo)準(zhǔn)工作液配制A.2.4.2.1.2精密吸取適量的重組III型膠原蛋白原料酶解液[A.2.4.2.1.1]，分別用[A.相應(yīng)基質(zhì)對(duì)照樣品溶液稀釋成濃度為0.100μg/mL、200μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)A.2.4.2.1.3將A.2.4.2.1.2中的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液繼續(xù)用基質(zhì)對(duì)照樣品溶A.2.4.2.2供試品樣品酶解），），A.2.4.2.3檢測(cè)限和定量限確認(rèn)樣品酶解取前處理后的檢測(cè)限和定量限確認(rèn)樣品[A.2.3.4],按[A.2.4.2取前處理后的檢測(cè)回收率分析樣品[A.2A.2.4.3色譜質(zhì)譜條件A.2.4.3.1色譜條件），555注：以上液相色譜操作條件是典型操作參數(shù)，可根據(jù)不同儀器的特點(diǎn)，對(duì)操作參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整，以獲A.2.4.3.2質(zhì)譜條件根據(jù)不同的質(zhì)譜儀器設(shè)定相應(yīng)的參數(shù)，參考條件見表A.526.71注2：優(yōu)先選擇受試物相對(duì)應(yīng)的子離子碎片，推薦使用受試物m/z526.71→625.21作為定量離子通道。A.2.5定性鑒別和定量檢測(cè)A.3.1特征多肽設(shè)計(jì)和確認(rèn)m/z526.79042的二級(jí)質(zhì)譜圖（圖A.3）的碎片離子與多肽GEAGIPGVPGAK的理論碎片離子高度匹配，因此，該樣品中存在多肽GEAGIPGVPGAK。通過Blast多序列比對(duì)及Uniprot網(wǎng)站搜索，此多肽不存在于人的其它類型膠原蛋白及其它常見哺乳動(dòng)物（牛、豬、大鼠、小鼠、馬、兔子等）的膠原蛋白序列中。因此，多肽GEAGIPGVPGAK可作為本示例中供試品重組III型膠原蛋白原料的特異NL:NL:2.89E9TICMSPF-III_20230421.2222.1828.7127.3551.6751.5751.7051.7551.5751.7051.7551.5351.4751.8955.9149.7456.0859.6567.782.262.304.624028.9229.9628.9229.9631.8846.8577.2269.8877.2269.8800102030圖A.2重組III型膠原蛋白原料酶解產(chǎn)物中m/圖A.3重組III型膠原蛋白原料酶解產(chǎn)物中A.3.2方法學(xué)驗(yàn)證A.3.2.1檢測(cè)限和定量限的確認(rèn)A.3.2.1.1噴劑敷料中添加重組III型膠原蛋白原料終濃度為0.5ng/mL、1ng/mL的質(zhì)譜圖見圖A.4。A.3.2.1.2敷料液中添加重組III型膠原蛋白原料終濃度為0.5ng/g、1ng/g的質(zhì)譜圖見圖A.5。終濃度為1ng/g的特征多肽質(zhì)譜信噪比S/N為10，終濃度為0.5ng/g的特圖A.5凝膠敷料中重組III型膠原蛋白原料終濃度為0.5ng/g（AA.3.2.1.3修復(fù)敷料中添加重組III型膠原蛋白原料終濃度為1ng/g、2ng/g的質(zhì)譜圖見圖A.6。終濃圖A.6修復(fù)敷料中重組III型膠原蛋白原料終濃度為1ng/g（AA.3.2.2添加回收率確認(rèn)A.3.2.2.1噴劑敷料得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖A.7。添加濃度為100μg/mL和200μg/mL的醫(yī)用重組III型膠原蛋白噴劑敷料的特征多肽質(zhì)譜圖見圖A.8；添加濃度為10μg/mL和50μg/mL的醫(yī)用重組III型膠原蛋白噴劑敷料的特征多肽質(zhì)譜圖見圖A.9；利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到醫(yī)用重組III型膠原蛋的重組III型膠原蛋白原料的回收率均在79%~88%之間，平均回收率PF-IIIY=75184+37679.7*XR^2=0.9933W:Equal70000006000000Area5000000Area40000003000000200000010000000050100150ug/mlgg42.8441.795356540.6040.15A.3.2.2.2敷料液PF-IIIY=144003+19184.3*XR^2=0.9931W:Equal35000003000000Area2500000Area2000000150000010000005000000050100圖A.11敷料液空白基質(zhì)中重組III型膠原蛋白原料添加濃度為