《分子克隆技術(shù)》

實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)

Tliymirw<7>

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CXwcyT<KMW

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Hydroyoribond

李香花吳昌銀邢永忠

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院

課程簡(jiǎn)介

分子克隆技術(shù)是指DNA口勺無(wú)性繁殖技術(shù)。分子克隆技術(shù)課程主程天

針對(duì)生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)、生物科學(xué)專(zhuān)業(yè)、生命科學(xué)與技術(shù)基地班本科生及4

物學(xué)類(lèi)專(zhuān)業(yè)碩士?而開(kāi)設(shè)的試驗(yàn)課。試驗(yàn)內(nèi)容涉及分子克降的某些基本片

施及基本操作技巧，主要涉及分子克隆、分子雜交和體現(xiàn)檢測(cè)三部分

分子克隆技術(shù)是指-DNA晌無(wú)?性繁殖技術(shù)0分子克隆技術(shù)課程主要方

針對(duì)生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)、生物科學(xué)專(zhuān)業(yè)、生命科學(xué)弓技術(shù)基地班木科牛.及4

物學(xué)類(lèi)專(zhuān)業(yè)碩士而開(kāi)設(shè)的試臉課u試驗(yàn)內(nèi)容涉及分子克隆的某些基本護(hù)

施及基本操作技巧，.主要涉及分子克隆、分子雜交和體現(xiàn)檢測(cè)三部分

抽提、外源DNA的準(zhǔn)儕、筋切、連接及感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接產(chǎn)

轉(zhuǎn)化以及陽(yáng)性克隆了?的鑒定和臉證等U

分子雜交技術(shù)：試臉定常用口勺分子雜交技術(shù)主要在Sout

blolling.Northernblolling,邛。6lornbloiling及DolblotIi川

Southernblotting是經(jīng)過(guò)用,種或多種限制性?xún)?nèi)切酶消化基肉組

他起源H勺DNA,經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳按大小分離酶切所得的片段，

DM在原位發(fā)生變性并從凝膠轉(zhuǎn)移到?固相支持物.上（硝酸纖維素

尼龍膜DNA物移至固相支持物H勺過(guò)程中各DW||勺相對(duì)?位置保持彳

學(xué)和基因操作口勺主要內(nèi)容。本試驗(yàn)經(jīng)過(guò)RT-PCR技術(shù)訓(xùn)練學(xué)生掌握RNA

H勺抽提、反轉(zhuǎn)錄及PCR技術(shù)等。

體現(xiàn)檢測(cè)：在轉(zhuǎn)錄水平上研究和了和基因的體現(xiàn)本調(diào)控是分是生物

學(xué)和基因操作口勺主要內(nèi)容u木試物經(jīng)過(guò)R4PQR一技術(shù)訓(xùn)練學(xué)生掌握RNA

H勺抽提、反轉(zhuǎn)錄及PCR技術(shù)等u

分子克與技術(shù)試臉課是從事生命科學(xué)有關(guān)研究的學(xué)生從課堂走進(jìn)

試驗(yàn)宛，順利開(kāi)展科研口枷勾必經(jīng)之路u希望學(xué)生經(jīng)過(guò)以上三個(gè)試驗(yàn)的

綜合訓(xùn)練能夠?yàn)樘嵘龑?shí)際動(dòng)手能力和試臉自主設(shè)計(jì)能力打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)U

目錄

帶格式的：段落間距段前：2.5被

系列一分子克隆技術(shù)I

試驗(yàn)一質(zhì)粒時(shí)制備..........................................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。4

試驗(yàn)二DNAI向瓊脂糖凝膠電泳..............................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。5

試依?：外源DNA片段在質(zhì)粒載體中II勺克隆.....................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。3

試驗(yàn)四感受態(tài)細(xì)胞的制備....................................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。9

CaCL修爻態(tài)細(xì)胞啊制備試驗(yàn)環(huán)節(jié).........................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽.粕

電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)與胞的試驗(yàn)環(huán)憶—二＞二二-錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽,W

試物」L質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及咕化廠的鑒定...........................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。U

熱激法轉(zhuǎn)化讀驗(yàn)陣也......................................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽.拉

系列二Soulhern技術(shù)...........................................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽.44

一、植物總DNA的迅速少許抽提：CTAB法》..................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽.戶(hù)

二、總DNA質(zhì)吊抬測(cè)及糊切..................................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽.安

電泳、轉(zhuǎn)膜..................................................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽.安

探針標(biāo)識(shí)及雜交..............................................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽.20

措施放射性..........................................錯(cuò)誤:未定義書(shū)去.30

同位素標(biāo)識(shí)探針啊Soulhcm雜交...........................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。20

措施二地高辛標(biāo)識(shí)探針的Souihern雜交試驗(yàn)環(huán)節(jié)：...........................22

措蓋一地高辛桁HR扭炸上的!Si錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽.23

試物?RNAExtraction(miniprep)..............................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。36

試驗(yàn)二RT-PCR(ReverseiranscrimionPCR).......................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽.興

試驗(yàn)三：RNA/J電泳.轉(zhuǎn)朦和雜交...............................................31

試驗(yàn)：._RNA_/j電油.具膜和雜交..............................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽.M

一細(xì)菌培養(yǎng)試劑...........................................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽.R

二質(zhì)粒抽提試劑...........................................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽?數(shù)

.：DNA操作試劑...........................................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽.科

四RNA操作試劑...........................................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽.可

SlockSolulion:..............................................錯(cuò)誤!未定義定簽.朝

WorkSoEion..............................................錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。4Q

帶格式的：段落間距段前：2.5磅

系列一分子克隆技術(shù)

試驗(yàn)一質(zhì)粒的制備

質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或體現(xiàn)的主要我體.它在基因操作中具有

主要作用。質(zhì)粒的分離與提取是最常用、最基本H勺試驗(yàn)技術(shù)。

質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或體現(xiàn)的主要載體，它在基因操作中系有

主要作用U質(zhì)粒內(nèi)分離與提取是最常用-L最基本U勺試聆技術(shù)L

質(zhì)粒的提取措施諸多，大多涉及3個(gè)主要環(huán)節(jié)：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的搜集和裂

試驗(yàn)?zāi)康模赫莆諌A裂解法抽提質(zhì)粒的原理、環(huán)節(jié)及各試劑的作用。

試驗(yàn)材料：具有質(zhì)粒PUC18（或pUCI%）-我體的關(guān)腸桿菌篇液，克隆在水稻外源片

段叫BAGm揭樣菌■苗海一

試喉原理UpH12.0..12.6堿性環(huán)境中L細(xì)菌夬分子呈染色體-DNA-變性分開(kāi)—而

并存高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分手R%RNA

和柒白應(yīng)在上海劑SR際向作用.卜用.成沉淀「而郎粒QNA-?依然內(nèi)可溶狀

態(tài).經(jīng)過(guò)離心，可除去人部分細(xì)胞碎片,染色體DNA、RNA及蛋門(mén)質(zhì),

----------------臉---------------------------------辛----------------

素或氯霉素的LA培養(yǎng)基上劃線分離單菌落,37c培養(yǎng)過(guò)夜：

I.取只在pUC18（或pUC19）質(zhì)?；蚍从褺AC的大腸桿菌菌液分別于含氨芾青霜

素或氯霉素的LA培養(yǎng)西上劃線分離單菌落，37c培養(yǎng)過(guò)夜：

2.用接種環(huán)或無(wú)菌牙簽挑取單菌落，接種于從右相應(yīng)抗生索H勺LB拜養(yǎng)基中，跳手

轉(zhuǎn)速~25O，min晌搖床?培養(yǎng)過(guò)夜:…

3.吸收1.5ml菌液，12023rpm■離心2分鐘L搜集菌體-倒掉菌海一再吸收T5同

鄙vTiT布TX-工JT后*TJ一磨T?xJ心U暫F-J閨r一T再Ti必z\M，身M）、J抻乂K年VL苗EI伍T(mén),，二*1將UV芮n1沛1A.同早伸IiIi沽I1冷J?-

4.加入300在溶液「重新懸浮細(xì)胞集黑能■上混句（注意：應(yīng)徹底4脛?dòng)鳌鲶w沉■港以

?加入300刊■溶液“，輕柔顛倒海勻，放置至清亮，一般不超出5■分鐘：

8.吸收800（1上清液（注意：不要「及收到飄浮的雜質(zhì)）轉(zhuǎn)至另一1.5ml離心管中，加

入2/3體積的異丙醇，室溫下放置5分鐘：

8.吸收8003上清液（注意：不要吸收到飄浮［向雜質(zhì)）轉(zhuǎn)至另一1.5同離心管中,

加入2/3體積的外內(nèi)醉，空溫下放匿5分鐘：

10.倒盡上清，加75%乙醇浸洗除鹽（放置片刻或離心3分鐘后倒去上清）；

10.倒盡上清，加75%乙酹浸洗除鹽（放也片刻或離心3分鐘后倒餐上消”

12.加40j.il滅菌超純水或TE溶解：

13.質(zhì)粒、BAC口勺質(zhì)量檢測(cè),于-20'C保存。

13.質(zhì)粒'BACH勺質(zhì)量檢測(cè)，于2O'C保存u

附注：質(zhì)粒檢測(cè)

------------------：---------------------R---------1^---------W

型

電泳檢測(cè)：質(zhì)粒電泳?般右?:條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開(kāi)環(huán)、線型?:種構(gòu)

型

吸光值檢測(cè)：采用分光光度葉檢測(cè)260nm、280nm波長(zhǎng)吸光/，若吸光值

260nm/280nm的比值介于48=1：9之間闡明質(zhì)檢質(zhì)量很好78為最桂l低孑闡明

存蛋白質(zhì)污染，高了闡明有RNA污染°

試驗(yàn)二DNA的瓊脂糖凝膠電泳

帶電荷的物旗在電場(chǎng)中的趨向運(yùn)動(dòng)稱(chēng)為電泳。電泳的種類(lèi)多.應(yīng)用非常廣泛,

它已成為分子生物學(xué)技術(shù)中分離生物大分子的主要手段。瓊脂糖凝膠電泳因?yàn)槠洳?/p>

作簡(jiǎn)樸、迅速、敏捷等優(yōu)點(diǎn),已成為分離和鑒定核酸的常用措施。

帶電荷I內(nèi)物質(zhì)在電場(chǎng)中I句趨向運(yùn)動(dòng)稱(chēng)為電泳,，電泳的種類(lèi)多，應(yīng)用非常廣泛，

它已成為分子生物學(xué)技術(shù)中分離生物大分子的主要手段u瓊脂糖凝膠電泳因?yàn)槠洳?/p>

4m

試驗(yàn)?zāi)康模赫莆窄傊悄z電泳的原理「學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的操作J

盤(pán)MHtv岫xz.日?-?H的J-?“六?楣二1?。骸】趇T3T料J「X仔%［H乂小"山IS夕PTkk】l?崗1"雁、，珅：匕，.歲j?:酢nil?TH*HrW好Cu比X?,I由SP%j*k1M*JiJ>/T垃<I竹r'二

試驗(yàn)材料：順粒DNA、BAG、植物總PNA■或它仰內(nèi)陶切產(chǎn)物，.

試驗(yàn)原理：在pH值為8.0~8.3時(shí)，核酸分子堿基幾乎不解離，磷嵇個(gè)部解離,

分了帶負(fù)電，在電泳時(shí)向正極移動(dòng)口采用合適濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳

試驗(yàn)環(huán)節(jié)：

3.稱(chēng)取024H瓊脂糖于30ml0.5XTBE中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷

卻至45?50℃時(shí)倒入制膠板中；

3L稱(chēng)聯(lián)?2kg瓊脂糖于30ml0.5XTBE中微波爐中-使瓊脂糖顆粒完仝溶解，冷

卻至4654G時(shí)倒入制膠板中；

4.凝膠凝固后，小心拔去椀門(mén)搠下膠帶：

DUC18:5ulDNA+3ulddH2O+2ul漢酚藍(lán)共10ul于0.5mltube中混混后點(diǎn)樣：

pUCI8：5口1DNA+3HlddHq-型澳酚藍(lán)共10懼于0.5疝【ube中混混后后樣:

BAC1加+2什濱酚藍(lán)于05mHHbe■中混合后點(diǎn)樣

6.將制膠板放入電泳槽中，加入。￡XT曲-電泳緩沖液至網(wǎng)剛淹沒(méi)凝膠,打訐電泳

4^~使核酸樣品由負(fù)極向正極泳動(dòng)：

10—15min,清水漂洗后置于紫外透射儀上觀察電泳成果，并攝影統(tǒng)計(jì)。

電泳完畢后切斷電源、一展出凝膠1浜人0￡中幽山向洪化名錠-（邱-"溶液■中染色

10—15min,清水漂洗后置于紫外透射儀上觀察電泳成果,并攝影統(tǒng)計(jì)。一

附注：

1.影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的原因：

1.影響DNA-在瓊脂糖凝膠中遷移速率的原因:

移率,（為膠濃度、Kr為介質(zhì)阻滯系數(shù)。不同日勺凝膠濃度,辨別不同范圍於JDNA

2）瓊脂糖濃度：logU-logUuKrr膠濃度，U為遷移率，U。為DNA的門(mén)由電泳遷

移率t為膠濃度，心為介質(zhì)阻滯系數(shù)寸不同的凝膠濃度海硼不同范腳勺DNA

—Agamset-----——--------------—（W^-kb

-k2%^——04-74^---------■-0.2-3kb.

為一DNA■構(gòu)條??般?遷移?速率超螺旋環(huán)狀4級(jí)狀當(dāng)條件變化時(shí),-恃況會(huì)相反,

還與瓊脂腳內(nèi)濃度Ife流強(qiáng)以,離子強(qiáng)度及EB■含量有關(guān)。

4）-啪田星I總回現(xiàn)T狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比“使冊(cè)別

效果好,凝膠上所加電壓不應(yīng)超出§必油

分-堿堪構(gòu)成與溫度l，般影響不尖4T0-籌

6）嵌入染料的存在：除低線性DNA遷移率，（不提倡加在電泳液中）

7A電泳緩沖液-（05X曲畫(huà)內(nèi)構(gòu)成及其離子強(qiáng)度影響DNA■內(nèi)遷移率,無(wú)離子存

在#1匹基本不泳動(dòng)，離子強(qiáng)度過(guò)大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并造成DNA變性,

?股采用1XTAE,1XTBE.IXTPE（均含EDTApH8.03

2.'演化乙錠（EB）為致癌劑，操作時(shí)應(yīng)戴手套，盡量降低臺(tái)而污染，

藍(lán)紫色：二甲苯晴（xylenecvanoLXc）呈藍(lán)色，它攜帶H勺電荷量比溪酚藍(lán)少，在

凝膠中的時(shí)遷移率比濱酚藍(lán)慢,

3.電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑在兩種，沮酚藍(lán)（bre^ephenel-blueT^）呈

藍(lán)紫色：二甲二和（*y]eneYiH）呈藍(lán)色，它攜帶H勺電荷量比艱酚藍(lán)少，

試驗(yàn)三外源DNA片段在質(zhì)粒載體中的克隆

DNA重組技術(shù)涉及載體及外源DNA片段的所切消化、目的片段向取得及純化、

目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選和鑒定等內(nèi)容。DNA片段的克隆技

術(shù)是分子操作的關(guān)鍵部分。

試驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)DNA的酶切、純化及外源片段與載體的連接，將BAC克隆所攜帶

的外源D、A酶切片段亞克隆到PUC18載體上。

試驗(yàn)■目的一方j(luò)DNA的幅切、留訛黑-外源片段與軟體的連接，將BAC克隆所攜帶

［內(nèi)外源?NA-醇毋片段4.隆到”生J-

w*Vwxxzi,jdn-?川IWv瘴zJ'^Hi?T四-X.小^1^白1I?iI和忍、rj耙DNA旺??干㈢乂卜I［hjRuA,r己7L?仔七總王而心讓了“，旺i?七宏X.，.市，j匕Tr軍.天彳人?（I木'1"，力Np+um丸n

源片段,經(jīng)純化處理后的DNA用于連接反應(yīng)；選擇克隆載體pUC隆多

克隆位點(diǎn)上相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶切割,并用堿性磷酸酶處理預(yù)防載體自

連;在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實(shí)現(xiàn)外源片段的克隆。

片段，經(jīng)純化處理后他DNA用于連接反應(yīng)：選擇克隆載體pUC18多克

一優(yōu)點(diǎn)、上相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶切額并用堿件磷酸酶處理預(yù)防載體自

連：住連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實(shí)現(xiàn)外源片段的克隆,,

試驗(yàn)環(huán)節(jié)：

(50《反應(yīng)體系，用1.5mllube,冰上操作)：

R.E(lOU/pl)Igl

10Xbuffer5pl

ddH2O14pl

37c反應(yīng)1-12小時(shí)，分別取8(1外源片段片切產(chǎn)物和5(lpUCI8酶切產(chǎn)物于?

1.0%凝膠檢測(cè)酶切是否完全；按2—5步純化、回收DNA

"C反應(yīng)I~2小時(shí)，分別設(shè)8+1-外源片段酶切產(chǎn)物和5甲1-pUGI&酶切產(chǎn)物

于1.0%凝膠檢測(cè)胸切足否完仝；按25-步純-冬一先DNA

2.加入LSO-H-ddH2。(擴(kuò)大致枳T加入200葉氯仿，異戊醉(24:4),傾倒混勻，

3.吸收上清，加卜4。?體枳》f-NaAe和兩倍體枳無(wú)水乙解,-20"C放罟.45■分鐘以上:

5.倒去上清，用75%乙醇浸洗沉淀,風(fēng)干后外源DNA溶于10(IddH2O.pUCl8溶

J20(lddH2O：

倒去上消l用-芬％■乙醇浸洗沉錠—KT后外源DNA溶于103ddH?。，pUCI8

洛丁?20川ddXO^-

■比I1磕m

cy;jv,力.*???Ir后^匿；T^E個(gè)氣r浮T太T白j」「i^父^以?F<‘Ar房r臺(tái)T艮^

CIAP(TaKaRa)0.5pl

10xbuffer4.0pl

ddH2O15.5pl

50c反應(yīng)30min以上

7.70c水浴lOmin,使CIAP失活;

8.按2—5步純化載體.溶于l0（lddH2O；

8.按月=5■步純化載體,一?溶于-陽(yáng)卅遍出6-

9.連接反應(yīng)（103體系）：

pUC18載體2.5pl

5xbuffer1.5pl

T4ligase（3U，il）1M1

16c水浴過(guò)夜

10.轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞

II.轉(zhuǎn)化子的鑒定

附注：

1.根據(jù)試驗(yàn)日H勺和外源片段的不同可選用不同的載體，采用不同粘性末端H勺雙酶

切可實(shí)現(xiàn)外源片段1內(nèi)定向克隆,

1.根據(jù)試聆目的和外源片段附不同可選用不同向載體l采用不同粘性耒端H勺雙醉

切可實(shí)現(xiàn)外源片段的定向克隆，

J1市廣匚I至八J”津J/1幾UI.利I-11工_*N"、JI隨，??

限制性?xún)?nèi)切酶H勺?種活性單位（1U）：指在50（1反應(yīng)體系中，37℃下，經(jīng)過(guò)1

小時(shí)的反應(yīng)將MgDNA完全切割所需要I內(nèi)酶量。

限制性?xún)?nèi)切能的?種活性單位（IU）：指在503反應(yīng)體系中，37℃下，勢(shì)過(guò)1

小呻梅應(yīng)將"QN4完鈉割廊需要的酶量廣

細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）和牛小腸堿性磷酸的（CIAP）都能催化水解DNA、

RNA、dNTP和NTP上的5'一磷酸殘基。比較而言,CIAP更常用，因其可在70'C10'

內(nèi)加熱滅活或經(jīng)過(guò)茶酚抽提而變性失活,同步CIAPH勺活性比BAP的總10—20倍。

它主要:用于：（1〉克隆時(shí)清除載體的5'-P,以防載體自連：（2）在用Kinase進(jìn)行5'

末端標(biāo)識(shí)前.清除DNAI向5'-P。

細(xì)的堿性磷酸4（BAP）和牛小腸堿性.磷酸胸（CIAP）都能催化水耕DNAi

RNASNTP和麗■上I打竽一磷酸殘基bfe較而占,GAP■更常用十因共可2TG'CT。

內(nèi)加熱滅活或經(jīng)過(guò)茶酚抽提而變性失活，同步CIAP的活性比BAP的高10—20f譏

它主要用手：（4）克隆時(shí)清除載體的的P,以防載體門(mén)連：（2）在用-Kina綸進(jìn)行第

末端標(biāo)識(shí)前，濟(jì)除DNAH勺51Pu

體外催化磷酸二酯鍵的形成可使用兩種酣：大腸桿菌連接酶和T4噬菌體連接

酶.但.幾乎在全部的克隆中T4噬菌體連接施都是首選II勺酹.因其能在正常的反應(yīng)條

件下能有效I內(nèi)將平端連接起來(lái)。

酶，?但幾乎在?全部H勺克隆中以噬菌體連接酶都是首選購(gòu)酪,因其能在正常的反應(yīng)條

件不能俏黜用邛端連接起來(lái)、

J氯仿對(duì)眼睛、皮膚、粘膜及呼吸道都彳剌激作用，它是致癌劑并可損傷肝臟和

腎臟，操作時(shí)需戴手套、安仝境并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。苯酚是強(qiáng)腐蝕劑，能用起

嚴(yán)重?zé)齻?操作時(shí)應(yīng)戴手套、黃仝鏡、穿防護(hù)服，并在通風(fēng)櫥中逆行飛

試驗(yàn)四感受態(tài)細(xì)胞的制備

體外連接的DNA市組分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞才下大量增量。為了提升受體菌

攝取外源DNAI向能力，提升轉(zhuǎn)化效率以取得更多I向轉(zhuǎn)化子，人們探索出了不同的措

施處理細(xì)菌，使其處于感受態(tài)。目前主:要采用電轉(zhuǎn)化法和CaC12法將外源DNA導(dǎo)入

受體細(xì)胞中，并需要相應(yīng)地制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞和CaC12感受態(tài)細(xì)抱。

體外連接向DNA事組分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞才干大量增殖，為了提升受體菌

試驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)感受態(tài)細(xì)胞的制備過(guò)程

試驗(yàn)?zāi)繒r(shí)學(xué)習(xí)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)制備速程

試瞥％貽靈￡材IQ料TT.?Zkx.7JT7T?FI茵葡I7!'1/1I?III'C^iR，

1.前夜接種受體菌（DH5（或DH1OB）,挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37c搖床培養(yǎng)過(guò)

夜（約16小時(shí)）：

1.前夜接種受體菌（DH5a或DH1OE）,挑取單菌落于LB培芥菜中37c搖床培養(yǎng)過(guò)夜

4-------------------------------------------B4---------）---------

2.5-3小時(shí)（250-300rpm）；

2.5-3小時(shí)g段=&2共將上_

4.吸收L5ml培養(yǎng)好時(shí)菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘：

4.吸收45ml培養(yǎng)好的菌液至4加1離心管中，在冰上冷卻10分鐘：

6棄去上潔，加入100（1預(yù)冷0.1MCaC12溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使

細(xì)胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；

6.弁去上清，加入100,預(yù)冷0.IMCaCL溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使

8.棄去上清，加入100（1預(yù)冷OIMCaC12溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使

細(xì)胞市.新懸浮：

細(xì)的市新BI懸，0、浮i.

電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的試驗(yàn)環(huán)節(jié)

L前夜接種受體菌（DH5（或DH10B）,挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37c搖床培養(yǎng)過(guò)

夜：

1.前夜接種受體菌（DH5a或叫10B）,挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37'C扁床培養(yǎng)過(guò)夜:

取2ml過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接了200HtiLR培養(yǎng)基中，在37X?搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至。鼠,

=0.6（約2.24謝》-

4吸收L5ml培養(yǎng)好的菌液至L5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘：

8.棄去上清，加入750（1冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重

新懸濘?:

J棄去上清，加入750M冰冷的1俄甘油，用移液搶輕輕■呼吸動(dòng)打勻,?使細(xì)胞重新懸浮:

10.加入20（1冰冷10鄧”|?油，用移液器輕輕上卜吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞用新懸浮：

10.加入20儀冰冷10%的甘油，用移液器輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞更新懸?。?/p>

附注：

影響感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的原因及實(shí)際操作過(guò)程中應(yīng)注意的事項(xiàng)：

影響感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率向原因及實(shí)際操作逑程中應(yīng)注意的事項(xiàng)丁

1）細(xì)菌II勺生長(zhǎng)狀態(tài)：成驗(yàn)中同親密注視細(xì)菌I句生長(zhǎng)狀態(tài)和密質(zhì)，盡量使用對(duì)數(shù)

生長(zhǎng)久的細(xì)胞Y=般經(jīng)過(guò)檢測(cè)~O9減來(lái)控制菌株QD謝為85■肝州胞

3）經(jīng)CaCI2處理的細(xì)胞,在脩溫條件卜：一定H勺時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而

增長(zhǎng)，：十四小時(shí)達(dá)成最高,之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是因?yàn)榭偟幕罹鷶?shù)隨時(shí)

間延長(zhǎng)而降低造成的）：

3）經(jīng)ca。工處利即J細(xì)胞TE-假溫條件下4MmW

增長(zhǎng)，二十四小時(shí)達(dá)成最高，之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是因?yàn)榭偟幕罹鷶?shù)隨時(shí)

——————————————灤————）——

或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提升

（100-1（XX）倍）：

明—化合物及無(wú)機(jī)離子的影響：在Q2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金尿離子（如

或6e-）、DM$O或還原劑竽物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提:升（1001000

DNA：

—1英*《I卜J-夫4*及492也IN為好南］：~~井｝J?4專(zhuān)4fclhJ收主螃，蜒R、J-DZA：—

7)~一-定范圍內(nèi)，一轉(zhuǎn)4七效率■與外源DNAII勺濃度呈正比:一

試驗(yàn)五質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的鑒定

質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)?；蛞运鼮槲殷w構(gòu)建II勺用組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。將連接產(chǎn)

物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中,實(shí)現(xiàn)重?組克隆的增殖.便于后續(xù)分子操作。能夠采用多種措

施篩選和鑒定目的克隆。

物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)再組克隆的增殖，便于后續(xù)分r操作u能夠采用多種

措施篩選和鑒定目晌克隆L

試驗(yàn)?zāi)康模赫莆諢峒しɑ螂娹D(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化子的鑒定措施。

試驗(yàn)?zāi)康模赫莆諢峒しɑ螂娹D(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化子的鑒定措施］

卡哈木!米［一々卜斗直升?［芬1"印彳木Ml而■除*慟I-k市冰或上本片

?中J?/I'"】、)I中人J7人IY-八J，上JX，RV11I【八丁心?-人心'?川QLZ.n-

試驗(yàn)原理LW-熱豳腸用粕Utt€4恁滲溶液中膨脹成＜形一

轉(zhuǎn)化混?物中的DNA形成抗DNase的洋克一鈍磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞

表面，經(jīng)42c短時(shí)間4沖擊處理，增進(jìn)細(xì)胞吸收DN4復(fù)合物，在豐富

培養(yǎng)基上生.氏數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞,原并分裂增殖：在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中,

4；-制備選擇性培養(yǎng)基■平板:-在融■化啊250mlLA培養(yǎng)些中35aMMmp(400所針向?),

250pHXgal(20mg/ml),25mlpTG(200mg/?一混勻后倒入滅菌培養(yǎng)期中：

2年」(￥)」ilI成印；《勿1監(jiān)1加I人CCno1否［“DNA_4牛下4卜，lll九1口彳T克八“例一I4【川君14甲夠；

TT~ifTrX1人丁卜is，二，一人,心'：1“TJDL/7I【/YTJ工1八嘻「火「J.*■八、/刀▼"、，、T刃、《

勻，在泳卜.放置30分鐘：

冰鎮(zhèn)l迅速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴廣放忍4-2分鐘L

ST^L每等加400M6*培養(yǎng)基黃E3TC搖床溫和搖動(dòng)溫育4多分鐘，使細(xì)菌名

8.培養(yǎng)：倒置培養(yǎng)皿，于370培養(yǎng)12—16小時(shí)即可觀察到藍(lán)白相間口勺菌落(其中

白色菌落為具杓外源插入片題為轉(zhuǎn)化子，藍(lán)色菌落是載體自連的轉(zhuǎn)化子)

質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞操作環(huán)節(jié)

帶格式的：縮進(jìn)：左仰：0阻米，能掛縮進(jìn)：3.6

1.制備選擇性培養(yǎng)基平板：將融化的250mlLA培養(yǎng)基冷卻至50℃左右,加入250"字符，段落間距段前：2.5崎，多級(jí)符號(hào)+級(jí)別：1

+編號(hào)樣式：L2.3,???十起始編號(hào)：1+對(duì)齊方

式-左惻+對(duì)齊位置-。74用米+制表符后于?

1.3厘米，縮進(jìn)〃置：1.3厘米,制卷位：1.71

(IAmp(lOOme/inl),250(IX-￡al(20mg/ml),25(IIPTG(200mR/ml),混勻后迅速字符，左對(duì)齊+不在2字符+3.5字符

倒入滅菌培養(yǎng)皿中(注意：溫度太高,抗牛?素失活.溫度太低.培養(yǎng)基易凝固)；

H-制備選擇性■培養(yǎng)基平板l將融北的-25GmLLA■培養(yǎng)基冷卻至5CTC4右，加入250

2）取出制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放右冰上融化：

5.將要轉(zhuǎn)化的混合物加入預(yù)冷的1mm的電轉(zhuǎn)化杯中,立即按下按紐電擊：

7）L一將細(xì)胞轉(zhuǎn)入合適的培養(yǎng)管中37。（2培養(yǎng)1小時(shí)：

明生—吸收合適體枳的菌液涂布已倒好的選擇培養(yǎng)基平板：

9.370c培養(yǎng)過(guò)夜,觀察成果。

的田G培養(yǎng)過(guò)夜，觀察成果。

附注：

1.利用氨節(jié)青騫素抗性篩選轉(zhuǎn)化子時(shí),用轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪平板的密度要低（90mm平板

上不得超出105個(gè)菌落），同步37℃培養(yǎng)不應(yīng)超出20小時(shí),具氨葦青霉素抗性的

轉(zhuǎn)化體可將（一內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中.迅速滅活菌落周?chē)目股?從而造成

對(duì)氨葦青川素敏感的衛(wèi)星菌落的出現(xiàn)。

1，利用氨葦音毒索抗性篩選轉(zhuǎn)化子時(shí)，用轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪平板的密度要低（90mm平板

上不得超出10+個(gè)菌落），同步3TG培美不應(yīng)超W20小時(shí)，只氨節(jié)青霉素抗性的轉(zhuǎn)

化體可將。一內(nèi)瞌胺酶分泌到培養(yǎng)基中，迅速滅活菌落周?chē)目股豑Uj-造成對(duì)

氨￥清霉素敏感I內(nèi)衛(wèi)星菌落Ml；虬

2.鑒定轉(zhuǎn)化子中是否同存外源DNA-片段常用的措施杓：

2）雜交篩選;

3）插入失活（某些老質(zhì)粒如pBR322等）；

4）小量提取質(zhì)粒酶切檢測(cè)、PCR檢測(cè)

系列二Southern技術(shù)

［帶格式的：字體：四號(hào)~j

（轉(zhuǎn)基因植物的陽(yáng)性鑒定及插入的外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)）?帶格式的：居中，段落間距段前：2.5磅j

▲”......................”■■▼rr____________________

帶格式的二字體：四號(hào)1

主要經(jīng)過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)基閃植物中招入的外源基因拷貝數(shù)訓(xùn)練Southern雜交的有關(guān).:帶格式的：段落間距段前：2.5磅j

技術(shù)。即經(jīng)過(guò)選擇合適H勺限制性?xún)?nèi)切隨消化基因組或其他起源的DNA,利用瓊脂糖

凝膠電泳按大小分離醐切所得的片段，隨即DKA在原位發(fā)生變性并從凝膠轉(zhuǎn)移到?

固和支持物（如尼龍膜）上。DNA轉(zhuǎn)移至固相支持物I內(nèi)過(guò)程中各DNA的相對(duì)位,置保

持不變，用?定措施（如放射性同位素、地高辛等）標(biāo)識(shí)MJDNA探針與固著在膜I：

H勺DNA雜交，經(jīng)X-光片白顯影或顯色反應(yīng)顯現(xiàn)出與探針D\A互補(bǔ)I向D\A電泳條帶的

位置及數(shù)量。

工要?經(jīng)過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中插入B勺外源基因拷貝數(shù)做Sowhan柒交訓(xùn)

練分子Southern雜交的?存關(guān)技術(shù),」Southern雜交是即經(jīng)過(guò)用選擇合適口勺限制性?xún)?nèi)

口勺片段，隨即DNA在原位發(fā)牛.變性并從凝膠轉(zhuǎn)移到一固相支持物上（一般是硝酸纖

維素膜或如尼龍膜）上」DNA轉(zhuǎn)移至柄相支拉物的逑程中各4%U向相對(duì)位置保排不

變，用一定措施-31放那姓同位素,地高于等）標(biāo)UWJDNA探針與固若在膜上的書(shū)NA

雜交，經(jīng)X-光片自顯影或顯色反應(yīng)品現(xiàn)#「后探針DXA互補(bǔ)的DNA電泳?條帶的位置及

試驗(yàn)?zāi)康模?/p>

:帶格式的：字體：加祖

試驗(yàn)?zāi)颗?/p>

試驗(yàn)原理：

試驗(yàn)原理L

「DNA-抖得k卜六烷幫三中幫浜化鏤）是--種非離子占污劑，植物材料在

GFAB■的處理下，結(jié)門(mén)65。（2水浴使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)變性、DNA■被群放例來(lái),GFAB

,與核酸形成笈合物，此笈合物由高鹽（XUmM）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，?但4低

鹽濃度（0.1-0.5mMNaQ）下CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低幅沉淀寸-不法部分

的蛋白質(zhì)及多肺等仍溶解了溶液中“?經(jīng)離心棄上清后,GFAB■核酸復(fù)合物再用??◎一

75%酒厚浸泡可洗脫掉GTAB：再經(jīng)過(guò)氯仿/異戊解（244”抽提清除蛋門(mén)質(zhì)「多糖l

色素等來(lái)純化PNA,一朵終經(jīng)異內(nèi)酣或乙爵等DNA沉淀劑將DNA■沉淀分離出來(lái)”,

CTAB法簡(jiǎn)便,迅速，DNA產(chǎn)呆忘（純度稍次，合用于一般分子生物學(xué)操心_

:帶格式的：字體：四號(hào)

2.*DNA質(zhì)最檢測(cè)l_____________________________________________

帶格式的：字體：四號(hào)

,在pH值為8：0二8.3此核酸紀(jì)子破遢幾平工解離,磅酸全部解離，核

酸分子帶負(fù)電，在電泳時(shí)向止極移動(dòng)u采用合適濃度的凝膠介質(zhì)作為電

泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)泉不同的核汽妗子泳動(dòng)

率出現(xiàn)姣大的差別L從而-達(dá)城分離核酸片段檢測(cè)共大小的目的p-核酸分

子中嵌入熒光染料.（如EB）后，在紫外燈卜可觀察到核酸片段所在的位

置.雖然一般瓊脂糖凝膠無(wú)法辨別不小于50kb的DNA,但經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝

膠電泳能夠初步判斷得到的植物總DNA片段H'W4L

3.限制性?xún)?nèi)切酶與探針組合H勺選擇：根據(jù)導(dǎo)入植物中H勺外源基因H勺序列,

選擇合適口勺能夠區(qū)別出外源基因插入口勺拷貝數(shù)的探針力艮制性?xún)?nèi)切酶組

合。

眼齪揚(yáng)揀郵轆幅信蟹姍繃她哪強(qiáng)低睡留聊的插雌嬲鐮陽(yáng)蝌躺聆

4.轉(zhuǎn)膜:

帶格式的：的體

fc-Wfe

經(jīng)毛細(xì)管（巨細(xì)吸附）作用，把DNA從凝膠上轉(zhuǎn)到膜上…DNA轉(zhuǎn)到膜I?.是要

制膠上I內(nèi)帶型，仔8（M00℃真空卜燥0.5-4小跖或紫外鐵鏈儀中照射淀時(shí)間，即可

I，片巨D(zhuǎn)NA。一

口勺靶DNA雜交，經(jīng)放射自顯影（放射性同位素）或免疫顯色反應(yīng)（地高辛標(biāo)識(shí)）擬

定靶DNA的位也。

根據(jù)堿.基配對(duì)原期「用族射■性同■停案標(biāo)中或地高辛標(biāo)識(shí)的DNA探知-，與固若在腴上

的靶RN4雜交,..一經(jīng)放射.門(mén)顯影放射性網(wǎng)位索-）或免疫顯色疾?底?（?地商辛標(biāo)識(shí)）-擬

定剃!DNA-I對(duì)位留；。

5：.探針的標(biāo)識(shí)：隨機(jī)引物標(biāo)識(shí)法思在DNA聚合幅的作用下，真核件酸經(jīng)過(guò)與單鏈

購(gòu)模板配對(duì)能夠開(kāi)啟DN—H勺合成的毒理設(shè)計(jì)內(nèi)，假如實(shí)核件假序列是代■raur」

（heierogeneouQ,引物中涉及全都可能的隨機(jī)序列（由L基引物則存￥=4096■種“

能夠與任意模板序列相限對(duì)在許多位■置影成雜突鏈—四種核井酸底物中存…:種■是用

映林性同伴表標(biāo)訓(xùn)對(duì)或用她高舉標(biāo)識(shí)的aadUTP替代dTTP,-則可產(chǎn)生均分用高

比活放射'性物深卜或地高辛標(biāo)以H勺探計(jì)°罕heklenow-fragmenl-消除j'E,CelDNA

Dohmemsel的多'—T'內(nèi)外切酪活性,.具右§，.-?二'的麋合梅話性及3’--5'

外切酶活性：—標(biāo)識(shí)I內(nèi)探針DNA的平均長(zhǎng)度與弓I物的淘度城反比mkMnPc^LPe

是班物［內(nèi)濃度％.般可產(chǎn)牛紂40030■附內(nèi)標(biāo)識(shí)注物l模板-PNA一般采用線狀■以

連DNA」環(huán)狀DNA聯(lián)|船制二］心,必切一眸14成一線『林Tj

劑結(jié)合位點(diǎn)，加入探針后，探針DNA分子將會(huì)結(jié)合在這些位點(diǎn)上，造成雜交背景深,

偵雜交的目的是用非特異性DNA分:（穌精DNA）及其他高分廣?化合物（封閉劑）

將待雜交膜中口勺非特異性位點(diǎn)封閉，從而降低雜交背景。

小稹雜突和雜交：膜上存許多沒(méi)右結(jié)。DNA分門(mén)內(nèi)地方，若不在雜交前用某些時(shí)

I除I齊||々44“一一力11入1簾鉗■后-徐針DMA4＞工汕個(gè)":今力:過(guò)此心占卜一濫出不小丑導(dǎo)

深-L預(yù)雜■婦用■!啊是用H特升件.DNA分r（鯉精DNA）及建他高分「化令物（封

閉種書(shū)待雜交膜中的非特異性位點(diǎn)封閉而降低雜交背"

?雜曲謝鄰拼助I領(lǐng)軟冊(cè)在定滯雯像件卜制衡與陽(yáng)小領(lǐng)腱超國(guó)酣4跳蛤雛■起

雜交的探針

洗膜:一用不同構(gòu)成股離子強(qiáng)度的"嚴(yán)謹(jǐn)度■然溶液,一洗去膜上的封陽(yáng)劑及用特異性雜

婦科探針

放射門(mén)顯影或顯色：用同位索標(biāo)以的探針根據(jù)信■小強(qiáng)弱一將洗好啊盡衣脫光片

或磷麻一定時(shí)間后，沖洗.光片或打描磷屏取得雜交圖像：若使用地高中標(biāo)識(shí)|內(nèi)探

帶格式的：字體：非加粗

■T■是將洗好II勺朵交膜進(jìn)行一系列免疫品色反總得孕躲交圖像「

帶格式的：上標(biāo)

放射性同仁索：SotHhem-雜類(lèi)試驗(yàn)常用的是二P4＞印屏中麗產(chǎn)P半哀期■是1429人

〔帶格式的：字體：非加粗-1

或變放NB粒;最大能量L709Me,是大輻射范困:空氣中610cm，水中0.8cm,存

機(jī)玻璃中0.76em：—

帶格式的：字體：非加注

加高■辛“）1在0.你疝9-跳口-是從洋她.黃類(lèi)植物中提聯(lián)的類(lèi)國(guó)醇“$附043.物唳,…因

帶格式的：字體：年加祖

j也號(hào)標(biāo)i/DNA、_R^A~或-Qligemideetkles

3）成果顯小所需時(shí)間短,無(wú)需幾小時(shí)抗至兒人的門(mén)顯影過(guò)程：

—成果顯示屏需時(shí)網(wǎng)短時(shí)其至凡曲明全顯影過(guò)程L

—泰金卑境保護(hù)，不接觸放射性翱?jī)?cè),不會(huì)對(duì)埠境造成污染一

—探針可反可使用，至少轉(zhuǎn)夠稔定能存一年；

試驗(yàn)材料及試劑：

試驗(yàn)材料及試劑-

水稻葉片，液氮，L5XCTAB,氯/短異戊解任4Mx95%乙密或無(wú)水乙醉等

用ndIH「瓊脂糖，尼龍腴,

帶格式的：正文，左，縮進(jìn)：左犯：0照米，首行

地高辛標(biāo)識(shí)試劑盒.地高辛檢測(cè)試劑盒縮進(jìn)：o兩米，段落間距段前：2.5就行距：?jiǎn)伪?/p>

行距

地島辛標(biāo)識(shí)試劑盒，地高辛檢測(cè)試劑盒

試驗(yàn)環(huán)節(jié)：

國(guó)格史的：字體：四號(hào)

試驗(yàn)環(huán)節(jié)二

帶格式的：兩端對(duì)齊,段落間距段的：2.5磅）

二試驗(yàn)=」植物總DNA的迅速少許抽提（CTAB法）

【帶格式的：段落間距段前：2.5嶗]

b采集適量幼嫩葉片，用液N＞研成粉木，0.4口裝入1.5ml離心管中（（注意T

量取材幼嫩葉片,如太號(hào)酚類(lèi)網(wǎng)偵多須用40-FRMWJ。-ME-處理,初除k2g

2L預(yù)熱HXGTAB-到95°C,加4同.到裝有咋片粉才

次混勻（注意:一偵防禰融

3.立即置于65（水浴30面nL每字分鐘-1：下顛倒I二次，」

5.吸收上清液約600U1轉(zhuǎn)至,新1.5ml離心管，加入等體枳（600口1）氯仿/異戊醇

（24:1）.輕輕地I：下顛倒屢次，至下層液相呈深綠色為止（注意：抽提時(shí)動(dòng)作應(yīng)輕

一，轉(zhuǎn)移用的槍頭最佳是剪寬門(mén)1勺1

一吸收k清液約600由■轉(zhuǎn)至一新小第一離心管，加入等體積（60（24）新優(yōu)/異段酹

■4:44L輕輕地上下傾倒屢次,至下6液相發(fā)深綠色如卜.（注博「hlf提呼勖件國(guó)

.監(jiān)柔一伴移用內(nèi)槍頭最隹是剪宛二口電兀_

7取450口1上潔卜一新1.5ml離心管，加入1ml95%乙醉或無(wú)水乙辭，混勻，室溫放

置,lOmin。

7.取450td卜潔「?新1.5同離心管，加入卜ml95%乙解或無(wú)水乙醉和45Hl10M

NH$AG）,混勻，室溫放置JOffliRu

8.12023mm離心10m足，吸去上潔，用加500Ml75%自O(shè)H乙靜浸洗沉就5-10分

鐘，介6％乙醉，將首子放人離心機(jī)和哲離心，小心吸去.殘留的乙醉，白然丁

燥約30minU欠土-DNAL

9.加入50Mll/10TE或無(wú)菌水（妖仃10瞬的1的RNaBeA）,置于4'。過(guò)依，待DNA

'溶解后.檢測(cè)DN4濃度物巨量l

<帶格式的：段落間跑段前：2.5礪

1.鴕I5ulDNA于（）.*h凝膜電濁檢測(cè)一

1.—用紫外分光兆變討?hù)岢鼶NA-濃度

2.4仔細(xì)閱讀將所使用內(nèi)海廣,晶剛明竹,,熟悉反應(yīng)條件及腳Y映二存濃/上（KX_J5CUfij）J~~:豕配￡汨弋劑:

—I,r算:k反1過(guò)條件所彳，4i，l弛用—（0.5mltube中）

10xbufferreaction1.5pl

EftgyffleHindlll（1§-OU/pb（冰上）

ddH2O2.7pl

混勻，短暫離心：

YrckvyNXnrrj.u;

4.齊電米浴或溫箱中溫浴恪切12hrs（f^DNA）或10hrs（租制DNA）：

5.加入1〃。?體枳H勺卜。X」三樣緩沖液終4k酶切反應(yīng)r也皿-65右加熱10mH硬胸變性

每個(gè)樣品取中。.量體軸內(nèi)醯切彥物用瓊脂林申赫檢測(cè)L制膜及■點(diǎn)樣措施同上~b

域果分析.帶格式的：字體：小四.（國(guó)際）宋體,降低fit2.5

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制樣，點(diǎn)樣：DNA樣晶中指示劑量稍多