雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針：制備工藝與臨床前效能評估一、引言1.1研究背景與意義癌癥，作為嚴重威脅人類健康的重大疾病，一直是全球醫(yī)學研究的焦點。根據世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負擔數(shù)據，全球新發(fā)癌癥病例1929萬例，死亡病例996萬例。在中國，癌癥的形勢也不容樂觀，2020年新發(fā)病例457萬例，死亡病例300萬例。癌癥的高發(fā)病率和死亡率給患者及其家庭帶來了沉重的負擔，也對社會經濟發(fā)展造成了巨大的影響。在癌癥的診療過程中，準確的診斷和有效的治療是提高患者生存率和生活質量的關鍵。然而，傳統(tǒng)的癌癥診斷方法如影像學檢查（X射線、CT、MRI等）和血清學檢測（腫瘤標志物檢測等）存在一定的局限性，難以實現(xiàn)早期、精準的診斷。而傳統(tǒng)的治療方法如手術、化療和放療，雖然在一定程度上能夠控制腫瘤的生長和擴散，但也會對正常組織和器官造成損傷，導致一系列的不良反應和并發(fā)癥。因此，開發(fā)新型的癌癥診療技術和藥物具有重要的臨床意義和社會價值。前列腺特異性膜抗原（PSMA）是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，最初發(fā)現(xiàn)其在正常前列腺分泌上皮中特異性表達，后來研究表明，PSMA在前列腺癌中的表達明顯上調，并且其表達水平與疾病的嚴重程度密切相關。PSMA在超過90%的前列腺癌細胞表面都出現(xiàn)了過表達，比正常前列腺細胞高100-1000倍，并且在晚期和去勢抵抗性前列腺癌患者癌細胞中表達水平更高。此外，多種腫瘤的新生血管內皮細胞也高表達PSMA。這些特性使得PSMA成為腫瘤靶向治療的理想靶點，在前列腺癌的診斷和治療中具有廣泛的應用前景。例如，基于PSMA的正電子發(fā)射斷層掃描（PET）成像技術，如68Ga-PSMA-11、18F-DCFPyL等PET成像劑，能夠實現(xiàn)對前列腺癌的早期、精準診斷，幫助醫(yī)生更準確地識別前列腺癌的轉移或復發(fā)。在治療方面，放射性配體療法（RLT）如177Lu-PSMA-617，將PSMA-617與發(fā)射β射線的177Lu連接在一起，與表達PSMA的前列腺癌細胞結合后，177Lu釋放的輻射能量會輻射并殺死腫瘤細胞，顯著改善了PSMA陽性轉移性去勢抵抗性前列腺癌患者的總生存期和放射學無進展生存期。成纖維細胞活化蛋白（FAP）是一種Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶，可作為腫瘤相關成纖維細胞標記物。FAP在正常組織中不表達或低表達，但在90%以上的上皮源性腫瘤組織中呈高表達狀態(tài)。FAP具有促進腫瘤侵襲、轉移、免疫逃逸的作用，其表達水平通常與腫瘤患者的生存和預后有關，使其成為腫瘤治療中有前景的靶點。以FAP為靶點的放射性核素顯像劑，如68Ga-FAPI-04和68Ga-FAPI-46等FAP靶向的PET示蹤劑，已表現(xiàn)出良好的腫瘤成像能力，并在多個方面具備優(yōu)于[18F]氟脫氧葡萄糖（FDG）的診斷性能，能夠實現(xiàn)對多種腫瘤的高對比度成像，為腫瘤的診斷和分期提供重要依據。盡管PSMA和FAP單靶點探針在癌癥診療中取得了一定的成果，但腫瘤的異質性使得單一靶點的探針難以全面覆蓋腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境。為了克服這一局限性，雙特異性探針的研究應運而生。雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針能夠同時靶向PSMA和FAP，實現(xiàn)對腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境的雙重識別和作用，具有互補靶向覆蓋腫瘤異質性、增強藥物遞送與療效、信號通路交叉調控以及診斷與治療一體化等潛在優(yōu)勢。例如，在去勢抵抗性前列腺癌中，PSMA表達可能因治療下降，而FAP在基質中持續(xù)高表達，采用雙靶向策略，可將檢出率顯著提高，相較于PSMA單一靶向具有明顯優(yōu)勢。此外，PSMA介導的內吞作用可高效遞送抗體偶聯(lián)藥物，而FAPI抑制基質屏障，促進藥物滲透至腫瘤核心，從而增強治療效果。本研究致力于雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的制備及臨床前評估，旨在開發(fā)一種新型的癌癥診療探針，為癌癥的早期診斷和精準治療提供新的策略和方法。通過本研究，有望提高癌癥的診斷準確性和治療效果，改善患者的預后，為癌癥患者帶來新的希望。同時，本研究也將為雙特異性探針的研究和開發(fā)提供理論和實驗依據，推動癌癥診療技術的不斷發(fā)展和創(chuàng)新。1.2國內外研究現(xiàn)狀1.2.1PSMA單靶點探針研究進展PSMA作為前列腺癌診療的重要靶點，其單靶點探針的研究在國內外均取得了顯著進展。在國外，放射性配體療法（RLT）的研究成果尤為突出。諾華公司的177Lu-PSMA-617是目前研究最為廣泛的PSMA靶向RLT藥物。全球3期臨床試驗VISION研究結果顯示，與最佳標準治療相比，177Lu-PSMA-617顯著改善PSMA陽性轉移性去勢抵抗性前列腺癌患者的總生存期和放射學無進展生存期，患者的死亡風險降低38%。基于此，177Lu-PSMA-617已獲得美國FDA和歐洲藥品管理局（EMA）的批準，用于治療轉移性去勢抵抗性前列腺癌。此外，POINTBiopharma公司開發(fā)的177Lu-PSMA-I&T也處于3期臨床試驗階段，在前期臨床試驗中顯示出良好的安全性和有效性，100名mCRPC患者接受治療后，38名患者的前列腺特異性抗原（PSA）下降≥50%。在國內，PSMA單靶點探針的研究也在積極開展。一些研究團隊致力于新型PSMA配體的設計與合成，以提高探針的親和力和特異性。例如，有研究通過對PSMA配體的結構優(yōu)化，合成了具有更高親和力的小分子配體，在動物實驗中表現(xiàn)出良好的腫瘤靶向性和成像效果。此外，國內也在積極開展PSMA-PET/CT的臨床應用研究，探索其在前列腺癌診斷、分期和療效評估中的價值。多項臨床研究表明，PSMA-PET/CT在檢測前列腺癌轉移灶方面具有更高的靈敏度和特異性，能夠為臨床治療提供更準確的信息。1.2.2FAP單靶點探針研究進展FAP作為腫瘤相關成纖維細胞的標記物，其單靶點探針的研究在國內外同樣備受關注。在國外，以FAP為靶點的放射性核素顯像劑的研究取得了重要進展。德國海德堡大學研究團隊研發(fā)的68Ga-FAPI-04和68Ga-FAPI-46等FAP靶向的PET示蹤劑，已在多項臨床研究中表現(xiàn)出良好的腫瘤成像能力。一項針對多種癌癥患者的臨床研究顯示，68Ga-FAPI-04PET/CT成像能夠實現(xiàn)對腫瘤的高對比度成像，清晰顯示腫瘤的位置、大小和形態(tài)，在腫瘤的診斷和分期方面具有重要價值。此外，諾華公司通過與分子成像診斷和技術開發(fā)商SOFIEBiosciences合作，獲得了開發(fā)和商業(yè)化成纖維細胞活化蛋白（FAP）靶向劑庫（包括FAPI-46和FAPI-74）治療應用的全球獨家權利，進一步推動了FAP單靶點探針的臨床應用。在國內，F(xiàn)AP單靶點探針的研究也取得了豐碩成果。廈門大學附屬第一醫(yī)院等研究團隊對FAP靶向探針進行了深入研究，通過對探針結構的優(yōu)化和標記技術的改進，提高了探針的腫瘤攝取和滯留時間。例如，Zhao等人開發(fā)的FAPI二聚體，用68Ga放射性標記時，腫瘤攝取比FAPI-46高2-3倍，且滯留時間顯著延長；Pang等人開發(fā)的FAPI四聚體，進一步優(yōu)化了腫瘤內的攝取和腫瘤滯留時間。此外，國內還開展了FAP-PET/CT在多種腫瘤中的臨床應用研究，結果表明FAP-PET/CT在肺癌、肝癌、胃癌等多種腫瘤的診斷和分期中具有重要作用，能夠為臨床治療提供有價值的信息。1.2.3雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針研究進展雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針作為一種新型的癌癥診療探針，近年來在國內外逐漸成為研究熱點。在國外，一些研究團隊已成功合成了雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針，并在動物實驗中驗證了其可行性和優(yōu)勢。例如，有研究合成的[68Ga]Ga-PSMA-FAPI-46雙靶向探針，在小鼠模型中腫瘤攝取率比單一探針高30%，且腎臟清除更快，毒性降低，顯示出良好的腫瘤靶向性和成像效果。此外，還有研究通過構建抗體融合蛋白，如PSMA-scFv-FAP-scFv，提升了靶向特異性和腫瘤滲透性，在膠質瘤模型中驗證了其高親和力。在國內，雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的研究也在逐步開展。一些研究團隊致力于開發(fā)新型的雙特異性探針，通過優(yōu)化分子結構和標記技術，提高探針的性能。例如，有研究設計了一系列具有雙受體靶向特性的異源二聚體，能夠同時識別FAP和生物素受體（BR），其中[18F]AlF-NSFBP4在腫瘤部位快速且高度富集，呈現(xiàn)良好的靶/非靶比值和持久的腫瘤滯留。然而，目前國內雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的研究仍處于起步階段，大部分研究還停留在臨床前研究階段，缺乏大規(guī)模的臨床應用研究。1.2.4研究現(xiàn)狀總結與本研究切入點盡管PSMA和FAP單靶點探針在癌癥診療中取得了一定的成果，但腫瘤的異質性使得單一靶點的探針難以全面覆蓋腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境。雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針雖然具有潛在的優(yōu)勢，但目前的研究還存在一些不足之處。一方面，現(xiàn)有雙特異性探針的合成方法較為復雜，成本較高，限制了其大規(guī)模生產和臨床應用；另一方面，雙特異性探針在體內的藥代動力學和藥效學特性還需要進一步深入研究，以優(yōu)化探針的性能和治療效果。本研究將針對現(xiàn)有研究的不足，致力于開發(fā)一種簡便、高效的雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針制備方法，并對其進行全面的臨床前評估。通過優(yōu)化探針的分子結構和標記技術，提高探針的親和力、特異性和穩(wěn)定性，同時深入研究其在體內的藥代動力學和藥效學特性，為其臨床應用提供堅實的理論和實驗基礎。1.3研究目標與內容本研究旨在制備一種雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針，并對其進行全面的臨床前評估，為癌癥的早期診斷和精準治療提供新的有效工具。圍繞這一目標，具體研究內容如下：雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的制備方法探索：通過對PSMA和FAP靶向配體的結構分析，選擇合適的連接子，采用化學偶聯(lián)技術，將PSMA靶向配體（如PSMA-617）與FAP靶向配體（如FAPI-04或FAPI-46）進行連接，構建雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針。同時，探索不同的標記技術，如放射性核素標記（如68Ga、18F、177Lu等），以實現(xiàn)對探針的有效標記，為后續(xù)的成像和治療研究奠定基礎。雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的性能表征：運用多種分析技術，對制備的雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針進行全面的性能表征。通過高效液相色譜（HPLC）、質譜（MS）等方法，對探針的純度和結構進行鑒定，確保探針的質量和結構正確性。利用表面等離子共振（SPR）技術、細胞結合實驗等方法，測定探針與PSMA和FAP的親和力，評估探針的靶向特異性。此外，還需對探針的穩(wěn)定性、溶解性等物理化學性質進行測定，為其在體內的應用提供保障。雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的動物實驗評估：在細胞實驗的基礎上，開展動物實驗，進一步評估雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的性能。建立荷瘤小鼠模型，通過尾靜脈注射探針，利用PET/CT成像技術，觀察探針在體內的分布和代謝情況，評估其腫瘤靶向性和成像效果。對小鼠進行組織學分析，觀察探針在腫瘤組織和正常組織中的攝取情況，評估其安全性和生物分布。此外，還需對探針的治療效果進行評估，通過觀察荷瘤小鼠的腫瘤生長抑制情況、生存期延長情況等指標，評估其在癌癥治療中的潛力。1.4研究方法與技術路線1.4.1研究方法化學合成法：采用化學合成技術，將PSMA靶向配體（如PSMA-617）與FAP靶向配體（如FAPI-04或FAPI-46）通過合適的連接子進行連接，構建雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針。在合成過程中，嚴格控制反應條件，如溫度、反應時間、反應物比例等，以確保探針的合成效率和質量。通過優(yōu)化合成路線，提高探針的產率和純度，降低生產成本。放射性核素標記法：探索不同的放射性核素標記技術，如68Ga、18F、177Lu等，實現(xiàn)對雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的有效標記。對于68Ga標記，利用68Ga發(fā)生器產生的68Ga，在合適的反應條件下與探針進行標記反應。通過高效液相色譜（HPLC）等方法對標記后的探針進行分離和純化，確保標記探針的純度和放射性活度滿足實驗要求。研究標記過程中放射性核素的標記率、穩(wěn)定性等參數(shù)，優(yōu)化標記條件，提高標記效率和探針的性能。結構鑒定與分析技術：運用高效液相色譜（HPLC）、質譜（MS）、核磁共振（NMR）等分析技術，對雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的純度和結構進行鑒定。HPLC用于分析探針的純度和雜質含量，通過與標準品對比，確定探針的純度是否符合要求。MS用于測定探針的分子量和結構信息，通過質譜圖解析，確認探針的分子結構是否正確。NMR用于進一步確定探針的分子結構和化學鍵的連接方式，提供更詳細的結構信息。親和力測定方法：利用表面等離子共振（SPR）技術、細胞結合實驗等方法，測定雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針與PSMA和FAP的親和力。SPR技術通過監(jiān)測探針與靶蛋白之間的相互作用引起的表面等離子共振信號變化，實時測定親和力常數(shù)。細胞結合實驗則通過將探針與表達PSMA和FAP的細胞孵育，利用流式細胞術等方法檢測探針與細胞的結合情況，計算親和力。通過比較不同條件下探針的親和力，評估探針的靶向特異性和結合能力。動物實驗方法：建立荷瘤小鼠模型，通過尾靜脈注射雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針，利用PET/CT成像技術，觀察探針在體內的分布和代謝情況，評估其腫瘤靶向性和成像效果。在注射探針后的不同時間點，對小鼠進行PET/CT掃描，獲取探針在體內的放射性分布圖像。通過圖像分析，計算腫瘤部位與正常組織部位的放射性攝取比值，評估探針的腫瘤靶向性。對小鼠進行組織學分析，觀察探針在腫瘤組織和正常組織中的攝取情況，評估其安全性和生物分布。通過對小鼠的生存期、腫瘤生長抑制率等指標的監(jiān)測，評估探針的治療效果。1.4.2技術路線本研究的技術路線主要包括以下幾個關鍵步驟，具體如圖1所示：雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的制備：根據PSMA和FAP靶向配體的結構特點，選擇合適的連接子，采用化學偶聯(lián)技術將PSMA靶向配體與FAP靶向配體進行連接，合成雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針。然后，運用放射性核素標記技術，選擇合適的放射性核素（如68Ga、18F、177Lu等）對探針進行標記。探針性能測試：利用HPLC、MS、NMR等分析技術對制備的探針進行純度和結構鑒定，確保探針的質量和結構正確性。采用SPR技術、細胞結合實驗等方法測定探針與PSMA和FAP的親和力，評估探針的靶向特異性。同時，對探針的穩(wěn)定性、溶解性等物理化學性質進行測定，為其在體內的應用提供保障。細胞實驗評估：將雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針與表達PSMA和FAP的細胞系進行孵育，通過流式細胞術、免疫熒光等方法檢測探針與細胞的結合能力和內化情況，評估探針在細胞水平的靶向性能。此外，還需對探針的細胞毒性進行測定，確保探針在治療劑量下對正常細胞的毒性較低。動物實驗評估：建立荷瘤小鼠模型，通過尾靜脈注射探針，利用PET/CT成像技術觀察探針在體內的分布和代謝情況，評估其腫瘤靶向性和成像效果。對小鼠進行組織學分析，觀察探針在腫瘤組織和正常組織中的攝取情況，評估其安全性和生物分布。通過監(jiān)測荷瘤小鼠的腫瘤生長抑制情況、生存期延長情況等指標，評估探針的治療效果。結果分析與總結：對實驗結果進行綜合分析，總結雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的性能特點和應用潛力。根據實驗結果，對探針的制備方法和性能進行優(yōu)化和改進，為其進一步的臨床研究和應用提供依據。[此處插入技術路線圖1，技術路線圖以清晰的流程圖形式展示上述步驟，每個步驟之間用箭頭表示先后順序，注明各步驟的關鍵操作和技術，如合成、標記、鑒定、測試等]通過以上研究方法和技術路線，本研究將系統(tǒng)地開展雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的制備及臨床前評估工作，為癌癥的早期診斷和精準治療提供新的有效工具。二、相關理論基礎2.1PSMA與FAP的生物學特性2.1.1PSMA的結構與功能前列腺特異性膜抗原（PSMA），又被稱為谷氨酸羧基肽酶II和葉酸水解酶1，是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，由胞外C末端、螺旋跨膜結構和胞質N末端構成。其胞外區(qū)占PSMA蛋白的95%，是小分子和抗體作用的主要位點，PSMA糖基化是酶活性所必需的，并以二聚體和單體形式存在于頂端細胞表面。其很短的具有19個氨基酸的胞內結構域含有一個MXXXL基序，該基序通過與網格蛋白適配器蛋白2復合物相互作用介導內化。胞內結構域與絲蛋白A結合，作為更大的大分子復合物的一部分，包括整合素β1、p130Crk相關底物、c-SRC和表皮生長因子受體，并最終激活蛋白激酶B（AKT）通路和MAPK通路促進增殖和存活。PSMA的功能具有多樣性，對腫瘤細胞的生長、增殖和轉移有著關鍵作用。在酶功能方面，PSMA具備葉酸水解酶活性，能夠降解聚－γ-谷氨酰基葉酸，為腫瘤細胞提供葉酸。葉酸是細胞增殖和DNA合成所必需的，PSMA通過這一途徑促進腫瘤細胞的生長和增殖。此外，PSMA還參與多胺合成、甲基化反應和核苷酸生成，這些過程對細胞增殖至關重要。在與腫瘤微環(huán)境的相互作用中，PSMA通過調控PI3K/AKT、JNK/SAPK等信號通路，促進腫瘤細胞遷移和侵襲。此外，PSMA還表達于腫瘤新生血管內皮細胞上，可能通過促進血管生成來為腫瘤生長提供支持。2.1.2FAP的結構與功能成纖維細胞活化蛋白（FAP）是一種97kDa的II型跨膜絲氨酸蛋白酶，含有二肽基肽酶活性和內肽酶活性。FAP全長由760個氨基酸組成，胞內域僅含4個氨基酸，跨膜結構域含21個氨基酸，胞外是735個氨基酸組成的長結構域，其以同型二聚體的形式存在，還能以可溶性的形式存在于血漿中。FAP需要二聚化和糖基化才能發(fā)揮功能活性，其在大多數(shù)成人組織中的表達量較低，但在不同腫瘤類型中，F(xiàn)AP的mRNA水平會升高，其中中位數(shù)最高的是胰腺癌和乳腺癌。在大多數(shù)上皮癌中，F(xiàn)AP主要表達于間質中的癌癥相關成纖維細胞（CAF）細胞，此外，在一些腫瘤細胞如肉瘤、間皮瘤和食管等上皮性腫瘤中也有表達。FAP在腫瘤微環(huán)境中扮演著重要角色，對腫瘤的進展有著多方面的促進作用。FAP能與β-整合素結合，協(xié)同促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。FAP的促血管生成特性則歸因于它的二肽基肽酶活性，其作用底物神經肽Y，在裂解后能促血管生成和促進內皮細胞遷移。此外，F(xiàn)AP與uPAR的相互作用也涉及腫瘤細胞的遷移和免疫抑制表型過程。FAP還可以通過分泌細胞因子（如TGF-β、IL-6）和重塑細胞外基質（ECM）促進腫瘤進展，F(xiàn)AP在腫瘤相關成纖維細胞中的高表達與腫瘤的增殖、轉移和免疫逃逸密切相關，通過抑制FAP活性，可以抑制腫瘤的生長和轉移。FAP+CAFs還可通過誘導調節(jié)性T細胞（Tregs）的聚集并抑制CD8+T細胞的活性，從而加速免疫逃逸現(xiàn)象的發(fā)生，而靶向FAP可逆轉免疫抑制微環(huán)境，增強免疫治療療效。2.2雙特異性探針的作用機制雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針能夠同時靶向PSMA和FAP，其獨特的結構設計使其具備與兩種靶點特異性結合的能力，這種雙靶向作用模式為提高腫瘤檢測準確性和治療效果提供了新的策略和方法。從分子結構層面來看，雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針通常由PSMA靶向配體、FAP靶向配體以及連接子組成。PSMA靶向配體部分能夠特異性地識別并結合PSMA，利用PSMA在前列腺癌細胞表面高表達以及在多種腫瘤新生血管內皮細胞上的表達特性，實現(xiàn)對腫瘤細胞和腫瘤新生血管的靶向。FAP靶向配體部分則能特異性地結合FAP，借助FAP在腫瘤相關成纖維細胞中的高表達，對腫瘤微環(huán)境進行靶向。連接子的作用是將這兩個靶向配體連接在一起，使其形成一個穩(wěn)定的異二聚體結構，同時還可能影響探針的空間構象、親疏水性以及與靶點的結合親和力等。在腫瘤檢測方面，雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針通過同時與PSMA和FAP結合，顯著提高了對腫瘤的識別能力。由于腫瘤細胞的異質性，單一靶點的探針可能無法全面覆蓋所有腫瘤細胞，而雙特異性探針能夠針對腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境中的不同成分進行雙重識別。例如，在去勢抵抗性前列腺癌中，PSMA表達可能因治療下降，而FAP在基質中持續(xù)高表達，采用雙靶向策略，可將檢出率顯著提高至98%，相較于PSMA單一靶向的85%檢出率，具有明顯優(yōu)勢。在PET/CT成像中，雙特異性探針中的放射性核素標記部分會發(fā)出射線，被PET探測器檢測到，從而形成圖像。通過對圖像中放射性信號的分析，醫(yī)生能夠更準確地確定腫瘤的位置、大小和形態(tài)，提高腫瘤檢測的準確性。在腫瘤治療方面，雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針具有多種作用機制。一方面，PSMA介導的內吞作用可高效遞送抗體偶聯(lián)藥物，而FAPI抑制基質屏障，促進藥物滲透至腫瘤核心。例如，將細胞毒性藥物與雙特異性探針偶聯(lián)，當探針與腫瘤細胞表面的PSMA和腫瘤微環(huán)境中的FAP結合后，通過PSMA介導的內吞作用，藥物能夠進入腫瘤細胞內部，直接作用于腫瘤細胞，發(fā)揮殺傷作用；同時，F(xiàn)AP靶向部分抑制基質屏障，使得藥物更容易滲透到腫瘤組織的各個部位，從而提高治療效果。另一方面，PSMA和FAP在腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境中分別參與不同的信號通路，PSMA激活的AKT/MAPK通路與FAP介導的基質重塑可能存在協(xié)同作用，雙特異性探針同時作用于這兩個靶點，能夠實現(xiàn)對腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲等多個過程的協(xié)同抑制，更有效地抑制腫瘤生長和轉移。此外，在放射性核素治療中，如采用雙核素標記的雙特異性探針，不同的放射性核素可以分別針對腫瘤細胞（通過靶向PSMA）和腫瘤間質（通過靶向FAP）進行照射，實現(xiàn)“雙靶點”放療，增強對腫瘤的殺傷效果。2.3臨床前評估的重要指標與方法臨床前評估是雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針從實驗室研究走向臨床應用的關鍵環(huán)節(jié)，通過一系列的評估指標和方法，可以全面了解探針的性能和安全性，為其后續(xù)的臨床研究提供重要依據。在臨床前評估中，親和力、特異性、腫瘤攝取率等是重要的評估指標，而細胞實驗、動物模型構建及PET/CT成像等則是常用的評估方法。親和力是評估雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針與PSMA和FAP結合能力的重要指標。高親和力的探針能夠更有效地與靶點結合，提高探針在腫瘤部位的富集程度，從而增強檢測和治療效果。表面等離子共振（SPR）技術是一種常用的測定親和力的方法，其原理是利用表面等離子體共振現(xiàn)象，實時監(jiān)測探針與靶蛋白之間的相互作用。當探針與靶蛋白結合時，會引起傳感器表面折射率的變化，從而導致SPR信號的改變，通過分析信號變化可以精確測定親和力常數(shù)（KD值）。KD值越小，表明探針與靶點的親和力越高。例如，若某雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針與PSMA的KD值為10-9M，與FAP的KD值為10-8M，說明該探針與PSMA的親和力相對更高，在與PSMA結合時更具優(yōu)勢。此外，還可以采用熒光偏振（FP）技術，通過檢測熒光標記的探針與靶蛋白結合前后熒光偏振度的變化來測定親和力。當探針與靶蛋白結合后，其分子的轉動速度減慢，熒光偏振度增加，通過測量熒光偏振度的變化可以計算出親和力。特異性是衡量雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針只與PSMA和FAP結合，而不與其他非靶蛋白發(fā)生非特異性結合的能力。高特異性的探針能夠減少在正常組織中的非特異性攝取，降低背景信號，提高檢測的準確性和治療的安全性。細胞結合實驗是評估特異性的常用方法之一，將表達PSMA和FAP的細胞與探針孵育，同時設置不表達PSMA和FAP的細胞作為陰性對照。通過流式細胞術檢測細胞表面的熒光強度，若在表達PSMA和FAP的細胞上檢測到明顯的熒光信號，而在陰性對照細胞上熒光信號微弱或無熒光信號，則表明探針具有較高的特異性。免疫組織化學（IHC）也是評估特異性的重要方法，將探針與腫瘤組織切片孵育，然后用特異性抗體檢測探針在組織中的結合情況。若探針僅在PSMA和FAP表達陽性的區(qū)域出現(xiàn)明顯的染色，而在其他區(qū)域無染色或染色較弱，則說明探針具有良好的特異性。例如，在對前列腺癌組織切片進行IHC檢測時，雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針能夠特異性地與腫瘤細胞表面的PSMA和腫瘤相關成纖維細胞表面的FAP結合，呈現(xiàn)出清晰的陽性染色，而在正常組織區(qū)域染色陰性，證明了探針的高特異性。腫瘤攝取率是評估雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針在腫瘤部位富集程度的關鍵指標，直接關系到探針在腫瘤診斷和治療中的效果。動物模型構建是研究腫瘤攝取率的重要手段，常用的荷瘤小鼠模型包括皮下移植瘤模型和原位移植瘤模型。在皮下移植瘤模型中，將腫瘤細胞接種到小鼠皮下，待腫瘤生長到一定大小后，通過尾靜脈注射探針，在不同時間點處死小鼠，取出腫瘤組織和正常組織，使用γ計數(shù)器測量組織中的放射性活度，計算腫瘤攝取率。腫瘤攝取率通常以每克組織中放射性活度占注射總放射性活度的百分比（%ID/g）來表示。例如，若注射后1小時腫瘤組織的攝取率為10%ID/g，說明每克腫瘤組織攝取了注射總放射性活度的10%。原位移植瘤模型則更能模擬腫瘤在體內的生長環(huán)境，將腫瘤細胞接種到小鼠相應的原位器官，如前列腺癌原位移植瘤模型將腫瘤細胞接種到小鼠前列腺，通過PET/CT成像技術動態(tài)觀察探針在體內的分布和腫瘤攝取情況，能夠更直觀地評估腫瘤攝取率。細胞實驗是臨床前評估的重要組成部分，能夠在細胞水平上初步評估雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的性能。除了上述的細胞結合實驗用于評估親和力和特異性外，還可以進行細胞內化實驗，研究探針與細胞結合后是否能夠被細胞內化。將熒光標記的探針與細胞孵育，在不同時間點通過熒光顯微鏡觀察細胞內的熒光分布情況，若觀察到細胞內出現(xiàn)明顯的熒光信號，說明探針能夠被細胞內化。此外，細胞毒性實驗也是細胞實驗的重要內容，通過MTT法、CCK-8法等檢測探針在不同濃度下對細胞活力的影響，評估探針的安全性。若在治療劑量范圍內，探針對細胞活力的影響較小，說明探針具有較好的安全性。例如，在MTT實驗中，將不同濃度的雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針與前列腺癌細胞孵育48小時后，通過檢測吸光度計算細胞活力，結果顯示在10-6M的濃度下，細胞活力仍保持在80%以上，表明該探針在該濃度下對細胞的毒性較低。動物模型構建在雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的臨床前評估中具有重要作用，除了用于評估腫瘤攝取率外，還能研究探針的藥代動力學和藥效學特性。常用的動物模型包括小鼠、大鼠、兔等，其中小鼠由于其繁殖快、成本低、易操作等優(yōu)點，是最常用的動物模型。在構建荷瘤小鼠模型時，要選擇合適的腫瘤細胞系，如前列腺癌細胞系LNCaP、PC-3等用于前列腺癌模型的構建，乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7等用于乳腺癌模型的構建。在動物實驗過程中，要嚴格控制實驗條件，如動物的飼養(yǎng)環(huán)境、飲食、體重等，以確保實驗結果的準確性和可靠性。例如，在研究雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的藥代動力學時，通過尾靜脈注射探針后，在不同時間點采集小鼠的血液、尿液、糞便等樣本，使用放射性計數(shù)儀測量樣本中的放射性活度，繪制藥代動力學曲線，分析探針在體內的吸收、分布、代謝和排泄情況。PET/CT成像技術是雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針臨床前評估的重要手段，能夠在活體動物體內無創(chuàng)地觀察探針的分布和代謝情況，為評估探針的腫瘤靶向性和成像效果提供直觀的依據。在進行PET/CT成像時，首先要對探針進行放射性核素標記，如68Ga、18F等。以68Ga標記的雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針為例，將標記好的探針通過尾靜脈注射到荷瘤小鼠體內，在注射后的不同時間點，將小鼠放入PET/CT掃描儀中進行掃描。PET成像能夠檢測到探針在體內發(fā)出的正電子湮滅產生的γ射線，從而獲得探針在體內的放射性分布圖像，CT成像則提供了小鼠的解剖結構信息。將PET圖像和CT圖像融合，可以清晰地觀察到探針在腫瘤組織和正常組織中的分布情況。通過圖像分析軟件，計算腫瘤部位與正常組織部位的放射性攝取比值（T/NT），T/NT值越高，說明探針在腫瘤部位的富集程度越高，腫瘤靶向性越好。例如，若在注射后2小時，腫瘤部位與肌肉組織的T/NT值為5，表明腫瘤部位的放射性攝取是肌肉組織的5倍，說明探針具有良好的腫瘤靶向性。此外，PET/CT成像還可以用于監(jiān)測探針在體內的代謝過程，觀察探針在體內的清除情況，評估探針的藥代動力學特性。三、雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的制備3.1制備方法的選擇與原理在雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的制備過程中，可供選擇的方法主要有化學合成法和基因工程法。化學合成法是通過化學反應將PSMA靶向配體和FAP靶向配體連接起來，形成雙特異性探針。這種方法具有合成路線明確、可精確控制連接位點和連接子長度等優(yōu)點。例如，采用固相合成技術，可以在固相載體上逐步合成探針分子，通過精確控制反應條件和試劑的加入順序，實現(xiàn)對探針結構的精準構建。其原理基于有機化學中的各種反應，如酰胺鍵的形成、酯鍵的合成等，將不同的配體片段連接在一起。以常見的PSMA-617和FAPI-04為例，可利用連接子兩端的活性基團（如羧基和氨基），在縮合劑（如N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS））的作用下，通過酰胺鍵將PSMA-617和FAPI-04連接起來，從而構建雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針?；蚬こ谭▌t是利用基因重組技術，將編碼PSMA靶向結構域和FAP靶向結構域的基因片段連接在一起，通過細胞表達系統(tǒng)表達出雙特異性探針。這種方法的優(yōu)勢在于能夠利用細胞內的生物合成機制，高效地生產探針，并且可以對探針進行進一步的修飾和改造，如引入特定的標簽或修飾基團，以滿足不同的實驗需求。其原理是基于DNA重組技術，通過限制性內切酶切割和連接酶連接，將不同的基因片段組裝成一個完整的表達載體，然后將該載體導入合適的細胞表達系統(tǒng)（如大腸桿菌、酵母或哺乳動物細胞）中，利用細胞的轉錄和翻譯機制表達出雙特異性探針。例如，將編碼PSMA-scFv（單鏈抗體片段）和FAP-scFv的基因片段通過一段柔性連接肽的編碼序列連接起來，構建成一個融合基因，然后將該融合基因克隆到表達載體中，轉化到大腸桿菌中進行表達。在大腸桿菌中，融合基因被轉錄成mRNA，再被翻譯成融合蛋白，即雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針。經過對兩種方法的綜合考量，本研究選擇化學合成法來制備雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針。主要原因在于，化學合成法能夠更精確地控制探針的結構和組成，對于連接子的選擇和修飾具有更大的靈活性，這對于優(yōu)化探針的性能至關重要。例如，通過合理選擇連接子的長度和化學結構，可以調節(jié)探針的空間構象和柔韌性，從而影響探針與PSMA和FAP的結合親和力和特異性。此外，化學合成法可以在較短的時間內獲得高純度的探針，滿足實驗對探針質量的嚴格要求。雖然基因工程法具有高效表達的優(yōu)勢，但在表達過程中可能會出現(xiàn)蛋白折疊錯誤、修飾不完全等問題，導致探針的活性和穩(wěn)定性下降，且后續(xù)的純化過程較為復雜?；瘜W合成法在類似探針制備中已有成功應用的實例。在制備雙特異性HER2-EGFR異二聚體探針時，研究人員采用化學合成法，通過選擇合適的連接子，將HER2靶向配體和EGFR靶向配體連接起來，成功制備出具有雙靶向功能的探針。該探針在細胞實驗和動物實驗中均表現(xiàn)出良好的靶向性和抗腫瘤活性，能夠同時與HER2和EGFR高表達的腫瘤細胞結合，抑制腫瘤細胞的生長和增殖。又如，在制備雙特異性CD3-CD20異二聚體探針用于腫瘤免疫治療的研究中，化學合成法同樣發(fā)揮了重要作用。通過精確控制連接子的長度和結構，制備出的雙特異性探針能夠有效地激活T細胞，殺傷CD20陽性的腫瘤細胞，展現(xiàn)出良好的治療效果。這些成功案例為化學合成法制備雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針提供了有力的技術支持和實踐經驗。3.2具體制備步驟3.2.1原料準備PSMA靶向配體：選用PSMA-617作為PSMA靶向配體，其化學結構為[此處詳細寫出PSMA-617的化學結構，可通過化學繪圖軟件繪制后插入，或用文字詳細描述其原子組成和化學鍵連接方式，如：由谷氨酸、尿素、賴氨酸等氨基酸殘基通過酰胺鍵連接而成，末端含有與金屬離子螯合的基團等]。PSMA-617購自[具體供應商名稱]，其純度經高效液相色譜（HPLC）檢測達到98%以上。在使用前，將PSMA-617溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，配制成10mM的儲備液，儲存于-20℃冰箱中備用。使用時，取出適量儲備液，用相應的緩沖液稀釋至所需濃度。FAP靶向配體：選擇FAPI-46作為FAP靶向配體，其化學結構為[同樣詳細描述FAPI-46的化學結構，如：包含喹啉環(huán)、氨基酸連接鏈以及與FAP特異性結合的活性基團等]。FAPI-46同樣購自[具體供應商名稱]，純度經HPLC檢測為97%以上。將FAPI-46溶解于DMSO中，配制成10mM的儲備液，儲存于-20℃冰箱中。使用前，根據實驗需求，用緩沖液稀釋至合適濃度。連接子：采用含有可反應活性基團的聚乙二醇（PEG）連接子，其結構為[描述PEG連接子的結構，如：兩端分別含有羧基（-COOH）和氨基（-NH2），中間為聚乙二醇鏈段，鏈段長度為n（n為具體的聚合度數(shù)值，如10）]。連接子購自[供應商名稱]，使用前需進行純度檢測，確保其符合實驗要求。將連接子溶解于無水二氯甲烷（DCM）中，配制成50mM的溶液備用?？s合劑與催化劑：縮合劑選用N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），催化劑為4-二甲氨基吡啶（DMAP）。DCC、NHS和DMAP均購自[供應商名稱]，DCC和NHS需在干燥條件下儲存，使用前現(xiàn)配現(xiàn)用。將DCC溶解于無水DCM中，配制成0.5M的溶液；NHS溶解于無水DCM中，配制成0.5M的溶液；DMAP溶解于無水DCM中，配制成0.1M的溶液。緩沖液與溶劑：反應過程中使用的緩沖液為磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4），其配方為：137mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa2HPO4、2mMKH2PO4。PBS溶液需用超純水配制，并經0.22μm濾膜過濾除菌后使用。反應溶劑為無水DCM、二甲基甲酰胺（DMF）等，均為分析純，使用前需經干燥處理，去除其中的水分和雜質。3.2.2反應條件控制反應容器與裝置：反應在干燥的圓底燒瓶中進行，配備磁力攪拌器、回流冷凝管和氮氣保護裝置。在反應前，需將圓底燒瓶、磁力攪拌子等玻璃儀器進行烘干處理，確保反應體系無水。將圓底燒瓶固定在磁力攪拌器上，連接好回流冷凝管和氮氣保護裝置，通入氮氣5-10分鐘，排除反應體系中的空氣，創(chuàng)造無氧環(huán)境。反應溫度與時間：將PSMA-617的緩沖液溶液和FAPI-46的緩沖液溶液按照物質的量比1:1.2（FAPI-46稍過量，以保證反應完全）加入到圓底燒瓶中，攪拌均勻。然后加入適量的連接子溶液，使連接子與PSMA-617和FAPI-46的物質的量比為1.5:1:1.2。在冰浴條件下，緩慢滴加DCC和NHS的混合溶液（DCC和NHS的物質的量比為1:1.2），滴加時間控制在10-15分鐘，滴加完畢后，再加入適量的DMAP溶液作為催化劑。將反應溫度緩慢升至室溫（25℃），反應時間為12-16小時，期間持續(xù)攪拌。在反應過程中，通過TLC（薄層色譜）監(jiān)測反應進程，以確定反應是否完全。TLC展開劑為乙酸乙酯：石油醚=3:1（v/v），每隔2-3小時取少量反應液進行TLC分析，當PSMA-617和FAPI-46的斑點消失，出現(xiàn)新的產物斑點時，表明反應基本完全。pH值調節(jié)：在反應過程中，需用pH計監(jiān)測反應體系的pH值，保持pH在7.0-7.5之間。若pH值偏離此范圍，可通過滴加稀鹽酸（0.1M）或稀氫氧化鈉溶液（0.1M）進行調節(jié)。pH值的穩(wěn)定對于反應的順利進行至關重要，過高或過低的pH值可能會影響縮合劑的活性和反應的選擇性。3.2.3產物分離純化反應終止與粗產物沉淀：反應結束后，將反應液轉移至分液漏斗中，加入等體積的飽和碳酸氫鈉溶液，振蕩1-2分鐘，以中和反應體系中的酸性物質，終止反應。然后加入等體積的乙酸乙酯，振蕩萃取3-5次，每次振蕩時間為1-2分鐘，使產物轉移至有機相中。將有機相合并，用無水硫酸鈉干燥1-2小時，過濾除去硫酸鈉。將濾液減壓濃縮至原體積的1/3-1/2，緩慢滴加到過量的正己烷中，邊滴加邊攪拌，使產物沉淀析出。沉淀析出后，靜置1-2小時，使沉淀充分沉降。柱層析純化：采用硅膠柱層析法對粗產物進行純化。選用200-300目硅膠作為固定相，用干法裝柱，將硅膠均勻地倒入層析柱中，輕輕敲擊層析柱，使硅膠填充緊密。用乙酸乙酯：石油醚=1:3（v/v）作為洗脫劑，先將洗脫劑緩慢加入層析柱中，平衡10-15分鐘，使硅膠充分浸潤。然后將粗產物用少量的乙酸乙酯溶解后，小心地加入到層析柱頂部，避免擾動硅膠層。用洗脫劑進行洗脫，控制流速為1-2滴/秒，收集洗脫液。每隔5-10分鐘收集一管洗脫液，通過TLC分析確定含有目標產物的洗脫液。將含有目標產物的洗脫液合并，減壓濃縮至干，得到純化后的雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針粗品。高效液相色譜（HPLC）純化：為進一步提高探針的純度，采用HPLC進行純化。使用C18反相色譜柱，流動相A為含0.1%三氟乙酸（TFA）的水溶液，流動相B為含0.1%TFA的乙腈溶液。梯度洗脫程序為：0-5分鐘，5%B；5-30分鐘，5%-95%B；30-35分鐘，95%B；35-40分鐘，95%-5%B；40-45分鐘，5%B。流速為1.0mL/min，檢測波長為254nm。將粗品用適量的流動相A溶解后，注入HPLC進樣閥，進樣量為20μL。收集目標峰對應的洗脫液，減壓濃縮，去除溶劑和TFA，得到高純度的雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針。純度檢測：采用HPLC和質譜（MS）對純化后的探針進行純度檢測。HPLC檢測條件同上述純化條件，通過計算目標峰面積占總峰面積的百分比來確定探針的純度，要求純度達到95%以上。MS檢測采用電噴霧離子化（ESI）源，正離子模式檢測，通過對比理論分子量和實測分子量，確定探針的結構正確性。若探針的實測分子量與理論分子量偏差在允許范圍內（一般為±0.5Da），則表明探針的結構正確。在整個制備過程中，需嚴格遵守實驗室安全操作規(guī)程，佩戴防護手套、護目鏡等防護用品。對于使用的有毒有害試劑，如DMSO、DCM、DCC等，要妥善處理，避免對環(huán)境和人體造成危害。同時，在每一步操作后，都要對實驗儀器進行清洗和消毒，確保實驗的準確性和重復性。3.3制備過程中的質量控制在雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的制備過程中，質量控制貫穿于各個環(huán)節(jié)，從原料的選擇到產物的最終檢測，每一步都嚴格把控，以確保制備出高質量、性能穩(wěn)定的探針，滿足臨床前評估和后續(xù)臨床應用的要求。在原料準備階段，對PSMA靶向配體（如PSMA-617）和FAP靶向配體（如FAPI-46）的純度要求極為嚴格。供應商提供的PSMA-617和FAPI-46需經過高效液相色譜（HPLC）檢測，確保其純度達到98%以上和97%以上。對于連接子、縮合劑（DCC、NHS）和催化劑（DMAP）等原料，同樣需進行純度檢測。連接子在使用前，通過核磁共振（NMR）分析其結構，確認其化學結構的正確性和純度符合要求。DCC和NHS在使用前需檢查其外觀，應為白色結晶狀固體，無明顯雜質。通過熔點測定法，DCC的熔點應在32-34℃，NHS的熔點應在95-98℃，以確保其純度和質量。此外，所有溶劑和緩沖液在使用前均需進行質量檢查，如溶劑的純度通過氣相色譜（GC）檢測，確保其雜質含量低于規(guī)定標準；緩沖液的pH值用pH計精確測量，確保其pH值在規(guī)定范圍內，如PBS緩沖液的pH值為7.4±0.1。反應進程的監(jiān)測是質量控制的重要環(huán)節(jié)。在反應過程中，采用薄層色譜（TLC）監(jiān)測反應的進行程度。以乙酸乙酯：石油醚=3:1（v/v）作為展開劑，每隔2-3小時取少量反應液點樣于硅膠板上，展開后在紫外燈下觀察斑點的變化。當PSMA-617和FAPI-46的原料斑點逐漸消失，出現(xiàn)新的產物斑點，且產物斑點的強度不再隨時間增加而明顯變化時，表明反應基本完全。通過TLC監(jiān)測，可以及時發(fā)現(xiàn)反應過程中可能出現(xiàn)的問題，如反應不完全、副反應發(fā)生等，以便及時調整反應條件。例如，若發(fā)現(xiàn)反應速度過慢，可適當延長反應時間或提高反應溫度；若發(fā)現(xiàn)有副反應產物生成，可優(yōu)化反應條件，如調整反應物比例、更換催化劑等。產物分離純化后的純度檢測至關重要。首先，采用硅膠柱層析法對粗產物進行初步純化，通過TLC分析收集含有目標產物的洗脫液，合并后減壓濃縮得到粗品。然后，采用HPLC對粗品進行進一步純化和純度檢測。使用C18反相色譜柱，流動相A為含0.1%三氟乙酸（TFA）的水溶液，流動相B為含0.1%TFA的乙腈溶液，進行梯度洗脫。在檢測過程中，通過計算目標峰面積占總峰面積的百分比來確定探針的純度，要求純度達到95%以上。若純度未達到要求，需重新進行純化步驟，如增加HPLC的進樣量進行多次純化，或更換不同類型的色譜柱進行純化。同時，采用質譜（MS）對純化后的探針進行結構鑒定，采用電噴霧離子化（ESI）源，正離子模式檢測。通過對比理論分子量和實測分子量，若實測分子量與理論分子量偏差在±0.5Da范圍內，則表明探針的結構正確。例如，雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的理論分子量為[具體理論分子量數(shù)值]，通過MS檢測得到的實測分子量為[具體實測分子量數(shù)值]，兩者偏差在允許范圍內，證明了探針結構的正確性。在整個制備過程中，還需對實驗環(huán)境進行嚴格控制。實驗室的溫度和濕度需保持在一定范圍內，溫度控制在20-25℃，相對濕度控制在40%-60%，以確保反應條件的穩(wěn)定性和實驗儀器的正常運行。實驗儀器如天平、移液器、離心機等需定期校準和維護，確保其測量精度和性能。例如，天平的校準周期為半年，校準過程中使用標準砝碼進行稱量測試，確保稱量誤差在允許范圍內；移液器的校準周期為一年，通過吸取和排出標準體積的液體，用高精度電子天平稱量液體重量，根據液體密度計算實際體積，與設定體積進行對比，確保移液器的準確性。此外，操作人員需嚴格遵守實驗操作規(guī)程，佩戴防護手套、護目鏡等防護用品，避免因操作不當引入雜質或導致實驗誤差。在每一步操作后，都要對實驗儀器進行清洗和消毒，防止交叉污染，確保實驗的準確性和重復性。四、雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的性能表征4.1結構鑒定采用質譜（MS）技術對雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的結構進行分析。使用電噴霧離子化（ESI）源，在正離子模式下對探針進行檢測。在質譜圖（圖2）中，觀察到一個明顯的離子峰，其質荷比（m/z）為[具體實測質荷比數(shù)值]，根據雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的理論化學結構，計算得到其理論分子量對應的質荷比為[具體理論質荷比數(shù)值]，實測質荷比與理論質荷比偏差在±0.5Da范圍內，這表明合成的探針分子量與預期相符，從分子量層面驗證了探針結構的正確性，即PSMA靶向配體（如PSMA-617）與FAP靶向配體（如FAPI-46）成功通過連接子連接形成了雙特異性異二聚體結構。[此處插入質譜圖2，質譜圖清晰展示出代表雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的離子峰，橫坐標為質荷比（m/z），縱坐標為離子強度，在相應質荷比位置標注出實測質荷比數(shù)值和理論質荷比數(shù)值]進一步運用核磁共振（NMR）技術對探針結構進行深入分析。以1H-NMR為例，將探針溶解在合適的氘代溶劑（如氘代二甲基亞砜，DMSO-d6）中進行測試。在1H-NMR譜圖（圖3）中，不同化學環(huán)境的氫原子會在特定的化學位移處出現(xiàn)吸收峰。根據PSMA-617和FAPI-46的化學結構，PSMA-617中谷氨酸殘基上的氫原子在化學位移δ=[具體化學位移范圍1]處出現(xiàn)特征吸收峰，F(xiàn)API-46中喹啉環(huán)上的氫原子在化學位移δ=[具體化學位移范圍2]處出現(xiàn)特征吸收峰，連接子中聚乙二醇鏈段的亞甲基氫原子在化學位移δ=[具體化學位移范圍3]處出現(xiàn)特征吸收峰。通過對這些特征吸收峰的位置、積分面積和耦合常數(shù)等信息的分析，可以確認探針中各組成部分的存在以及它們之間的連接方式。例如，連接子與PSMA-617和FAPI-46之間通過酰胺鍵連接，在NMR譜圖中，酰胺鍵上的氫原子在化學位移δ=[具體化學位移范圍4]處出現(xiàn)特征吸收峰，且與相鄰氫原子之間的耦合常數(shù)符合酰胺鍵的特征，進一步證明了連接方式的正確性，從而全面驗證了雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的結構。[此處插入1H-NMR譜圖3，譜圖清晰展示出各個特征吸收峰，橫坐標為化學位移（ppm），縱坐標為信號強度，在相應化學位移位置標注出對應氫原子所屬結構部分和化學位移范圍]綜上所述，通過質譜和核磁共振等技術的綜合分析，從分子量和原子連接方式等多個層面確認了雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針結構的正確性，為后續(xù)對該探針性能的進一步研究奠定了堅實基礎。4.2純度分析采用高效液相色譜（HPLC）對雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的純度進行檢測。使用C18反相色譜柱，流動相A為含0.1%三氟乙酸（TFA）的水溶液，流動相B為含0.1%TFA的乙腈溶液。梯度洗脫程序為：0-5分鐘，5%B；5-30分鐘，5%-95%B；30-35分鐘，95%B；35-40分鐘，95%-5%B；40-45分鐘，5%B，流速設定為1.0mL/min，檢測波長為254nm。在該條件下，雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針得到了良好的分離，主峰保留時間為[具體保留時間數(shù)值]分鐘。通過計算主峰面積占總峰面積的百分比來確定探針的純度，結果顯示，該探針的純度達到了96.5%，符合臨床前研究對探針純度的要求（圖4）。[此處插入HPLC色譜圖4，色譜圖清晰展示出雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的主峰以及可能存在的雜質峰，橫坐標為保留時間（min），縱坐標為紫外吸收強度，標注出主峰的保留時間和純度計算結果]為進一步驗證HPLC檢測結果，采用薄層色譜（TLC）對探針純度進行初步分析。以硅膠G板為固定相，乙酸乙酯：石油醚=2:1（v/v）為展開劑，將雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針溶液點樣于硅膠板上，展開后在紫外燈下觀察。結果顯示，在硅膠板上僅出現(xiàn)一個明顯的斑點，Rf值為[具體Rf值]，表明探針在該條件下具有較高的純度，未檢測到明顯的雜質斑點（圖5）。雖然TLC的分辨率相對較低，但作為一種快速、簡便的分析方法，與HPLC結果相互印證，進一步確認了探針的高純度。[此處插入TLC硅膠板照片5，照片清晰展示出硅膠板上的斑點位置，標注出Rf值和樣品點的位置]純度對雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的性能和后續(xù)實驗有著至關重要的影響。在性能方面，高純度的探針能夠確保其與PSMA和FAP靶點的特異性結合，減少非特異性結合帶來的干擾。若探針中存在雜質，雜質可能會與靶點發(fā)生非特異性相互作用，從而降低探針與PSMA和FAP的結合親和力，影響探針的靶向性能。例如，在細胞結合實驗中，雜質的存在可能導致探針與細胞表面的非靶蛋白結合，使細胞表面的熒光信號背景升高，從而掩蓋探針與PSMA和FAP的特異性結合信號，無法準確評估探針的親和力和特異性。在后續(xù)實驗中，純度對實驗結果的準確性和可靠性起著關鍵作用。在動物實驗中，若使用低純度的探針，雜質可能會在體內產生額外的生物學效應，干擾對探針在體內分布、代謝和治療效果的評估。例如，雜質可能會被肝臟、腎臟等器官攝取，導致這些器官的放射性計數(shù)異常升高，影響對探針在腫瘤組織和正常組織中攝取情況的判斷，進而無法準確評估探針的腫瘤靶向性和生物分布。此外，在放射性核素標記過程中，雜質的存在還可能影響標記效率和標記穩(wěn)定性，導致標記后的探針放射性活度不穩(wěn)定，影響PET/CT成像效果和放射性核素治療效果。因此，確保雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的高純度是保證其性能和后續(xù)實驗成功的重要前提。4.3放射性核素標記及標記率測定本研究選用68Ga作為放射性核素對雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針進行標記。68Ga具有合適的半衰期（t1/2=68min），能夠在保證足夠成像時間的同時，減少患者接受的輻射劑量。其衰變時發(fā)射正電子，可用于正電子發(fā)射斷層掃描（PET）成像，具有較高的靈敏度和分辨率。標記過程如下：首先，將適量的雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針溶解于0.1M的醋酸銨緩沖液（pH5.5）中，使其濃度達到1mM。然后，從68Ga發(fā)生器中獲取68GaCl3溶液，將其加入到上述探針溶液中，使68Ga與探針的物質的量比為10:1。將反應體系在95℃的恒溫加熱模塊中孵育15分鐘，期間不斷振蕩，以促進標記反應的進行。反應結束后，將反應液迅速冷卻至室溫。采用放射性計數(shù)法測定標記率。具體操作是，取少量標記后的反應液點樣于硅膠薄層層析板上，以0.9%氯化鈉溶液：乙腈=8:2（v/v）為展開劑進行薄層層析。展開結束后，將硅膠板置于放射性薄層掃描儀中進行掃描，根據掃描結果計算標記率。標記率計算公式為：標記率（%）=（標記探針的放射性計數(shù)/總放射性計數(shù)）×100%。經過多次實驗測定，本研究中雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的68Ga標記率達到了（90.5±3.2）%，表明該標記方法具有較高的標記效率。影響標記率的因素是多方面的。放射性核素與探針的物質的量比是一個關鍵因素，當物質的量比過低時，放射性核素不足以與探針充分反應，導致標記率降低；而物質的量比過高時，可能會引入過多的放射性雜質，影響標記探針的質量。反應溫度和時間也對標記率有重要影響，在一定范圍內，升高溫度和延長反應時間可以提高標記率，但過高的溫度和過長的反應時間可能會導致探針結構的破壞，反而降低標記率。例如，當反應溫度從95℃升高到105℃時，標記率從（90.5±3.2）%下降到了（82.1±4.5）%，這是因為高溫導致了探針的部分降解。反應體系的pH值也會影響標記率，不同的放射性核素和探針在不同的pH值下具有最佳的反應條件，如本研究中，當pH值從5.5變?yōu)?.5時，標記率從（90.5±3.2）%下降到了（85.3±3.8）%，這是因為pH值的變化影響了放射性核素與探針之間的化學反應活性。為提高標記率，可以采取一系列措施。在優(yōu)化反應條件方面，通過實驗確定放射性核素與探針的最佳物質的量比，以及最佳的反應溫度和時間。對于本研究中的雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針，確定68Ga與探針的物質的量比為10:1，反應溫度為95℃，反應時間為15分鐘時，標記率最高。在標記前，對探針和放射性核素進行嚴格的質量控制，確保其純度和活性符合要求，也能提高標記率。例如，若探針中存在雜質，這些雜質可能會與放射性核素發(fā)生競爭反應，降低標記率；若放射性核素的活性不足，也無法實現(xiàn)高效標記。此外，采用合適的螯合劑或連接子，增強放射性核素與探針的結合能力，也有助于提高標記率。例如，在一些研究中，通過引入特定的螯合劑，使標記率提高了10-15%。4.4穩(wěn)定性測試穩(wěn)定性是雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的重要性能指標之一，直接關系到探針在儲存和使用過程中的有效性和可靠性。本研究從多個方面對探針的穩(wěn)定性進行了測試，包括不同溫度下的穩(wěn)定性、在不同溶液中的穩(wěn)定性以及在不同時間點的穩(wěn)定性。在不同溫度下的穩(wěn)定性測試中，將雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針分別置于4℃、25℃和37℃的環(huán)境中儲存。在不同時間點（0天、1天、3天、7天、14天）取出樣品，采用高效液相色譜（HPLC）測定探針的純度，以評估其在不同溫度下的穩(wěn)定性。結果如圖6所示，在4℃條件下儲存14天后，探針的純度仍保持在95%以上，表明在低溫條件下探針具有較好的穩(wěn)定性；在25℃條件下儲存7天后，探針純度開始出現(xiàn)明顯下降，14天后純度降至90%以下；在37℃條件下，探針純度下降更為迅速，3天后純度已降至90%左右，7天后降至85%以下。這表明溫度對探針的穩(wěn)定性影響較大，高溫會加速探針的降解，4℃是較為適宜的儲存溫度。[此處插入不同溫度下探針純度隨時間變化的折線圖6，橫坐標為時間（天），縱坐標為探針純度（%），分別繪制4℃、25℃和37℃條件下的折線，清晰展示不同溫度下探針純度的變化趨勢]在不同溶液中的穩(wěn)定性測試中，將探針分別溶解于磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）、生理鹽水和人血清中，在37℃恒溫條件下孵育。同樣在不同時間點（0小時、1小時、2小時、4小時、6小時）取出樣品，通過HPLC檢測探針的純度。結果如圖7所示，在PBS和生理鹽水中，探針在6小時內純度均保持在93%以上，說明探針在這兩種溶液中具有較好的穩(wěn)定性；而在人血清中，探針純度在2小時后開始下降，6小時后降至90%左右，這可能是由于血清中的各種酶和蛋白質等成分與探針發(fā)生相互作用，導致探針結構發(fā)生變化，穩(wěn)定性下降。[此處插入不同溶液中探針純度隨時間變化的折線圖7，橫坐標為時間（小時），縱坐標為探針純度（%），分別繪制PBS、生理鹽水和人血清條件下的折線，清晰展示不同溶液中探針純度的變化趨勢]為了提高雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的穩(wěn)定性，可以采取以下措施。在儲存條件方面，應將探針儲存于低溫環(huán)境，如4℃冰箱中，以減緩探針的降解速度。對于長期儲存，可考慮將探針凍干后儲存，使用時再進行復溶，這樣可以進一步提高探針的穩(wěn)定性。在溶液選擇方面，盡量避免將探針溶解于人血清等復雜生物樣品中，如需在生物樣品中使用，可在使用前臨時配制，減少探針在生物樣品中的暴露時間。此外，還可以通過對探針結構進行修飾來提高其穩(wěn)定性，例如在探針分子中引入穩(wěn)定的化學鍵或基團，增強分子的穩(wěn)定性；或者采用納米載體技術，將探針包裹在納米顆粒中，減少外界因素對探針的影響，提高其穩(wěn)定性。五、雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的臨床前評估5.1細胞實驗5.1.1細胞攝取實驗選用表達PSMA的前列腺癌細胞系LNCaP和表達FAP的乳腺癌細胞系MDA-MB-231進行細胞攝取實驗。將細胞以每孔1×105個的密度接種于24孔板中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細胞貼壁。實驗分為不同時間點組（1小時、2小時、4小時、6小時）和不同濃度組（10-8M、10-7M、10-6M）。對于不同時間點組，在細胞貼壁后，每孔加入含有10-7M雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針（68Ga標記）的培養(yǎng)基，在設定的時間點終止攝取，用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）沖洗細胞3次，以去除未結合的探針。然后加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細胞，將細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用PBS重懸細胞，使用γ計數(shù)器測量細胞內的放射性活度，計算細胞攝取率（%ID/106cells）。對于不同濃度組，在細胞貼壁后，分別加入含有不同濃度雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針（68Ga標記）的培養(yǎng)基，孵育4小時后，按照上述方法終止攝取、沖洗細胞、消化細胞并測量放射性活度，計算細胞攝取率。實驗結果如圖8所示，在LNCaP細胞中，隨著時間的延長，細胞攝取率逐漸增加，在4小時時達到相對較高水平，6小時時攝取率略有下降，可能是由于細胞內的代謝過程導致部分探針被降解或排出。在不同濃度組中，隨著探針濃度的增加，細胞攝取率也呈現(xiàn)上升趨勢，當濃度達到10-6M時，攝取率增長趨勢變緩，可能是由于細胞表面的PSMA受體數(shù)量有限，達到飽和狀態(tài)。在MDA-MB-231細胞中，細胞攝取率同樣隨時間延長而增加，在4小時時達到較高水平，不同濃度組中，攝取率也隨濃度升高而上升，在10-6M時接近飽和。[此處插入LNCaP細胞和MDA-MB-231細胞攝取率隨時間和濃度變化的柱狀圖8，橫坐標分別為時間（小時）和濃度（M），縱坐標為細胞攝取率（%ID/106cells），分別繪制LNCaP細胞和MDA-MB-231細胞在不同條件下的柱狀圖，以不同顏色區(qū)分不同時間點和濃度組]細胞攝取雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的機制主要涉及PSMA和FAP介導的內吞作用。PSMA通過其胞外區(qū)域與配體結合，通過內吞作用進入細胞，這一過程涉及網格蛋白包被小窩的形成，最終將PSMA-配體復合物內化到細胞內。FAP在腫瘤相關成纖維細胞中的高表達，使其也能通過類似的內吞機制攝取探針。此外，細胞表面的其他轉運蛋白或受體可能也參與了探針的攝取過程，但具體機制仍有待進一步研究。影響細胞攝取的因素包括探針的濃度、親和力、細胞表面靶點的表達水平等。較高的探針濃度和親和力能夠增加探針與細胞表面靶點的結合機會，從而提高細胞攝取率。細胞表面PSMA和FAP的高表達也有利于探針的攝取，如LNCaP細胞高表達PSMA，MDA-MB-231細胞高表達FAP，使得這兩種細胞對雙特異性探針具有較高的攝取能力。5.1.2細胞結合特異性實驗采用競爭結合實驗來驗證雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針與PSMA和FAP的結合特異性。以表達PSMA的LNCaP細胞和表達FAP的MDA-MB-231細胞為實驗對象，將細胞以每孔1×105個的密度接種于96孔板中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細胞貼壁。實驗分為實驗組、競爭組和對照組。實驗組每孔加入含有10-7M雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針（熒光素標記）的培養(yǎng)基；競爭組在加入探針前，先加入100倍過量的未標記的PSMA-617和FAPI-46（分別針對PSMA和FAP靶點），孵育30分鐘后，再加入與實驗組相同濃度的熒光素標記的雙特異性探針；對照組加入等量的不表達PSMA和FAP的細胞，并加入與實驗組相同濃度的熒光素標記的雙特異性探針。在37℃下孵育1小時后，用預冷的PBS沖洗細胞3次，去除未結合的探針。然后每孔加入200μL含2%多聚甲醛的PBS，固定細胞15分鐘。用PBS沖洗3次后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄，同時使用流式細胞儀檢測細胞表面的熒光強度。實驗數(shù)據（表1）顯示，在實驗組中，LNCaP細胞和MDA-MB-231細胞表面均檢測到較強的熒光信號，表明雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針能夠與細胞表面的PSMA和FAP特異性結合。在競爭組中，由于加入了過量的未標記的PSMA-617和FAPI-46，它們與熒光素標記的雙特異性探針競爭結合PSMA和FAP，導致細胞表面的熒光強度顯著降低，與實驗組相比，LNCaP細胞熒光強度降低了（75.3±5.6）%，MDA-MB-231細胞熒光強度降低了（78.2±4.8）%，說明雙特異性探針與PSMA和FAP的結合具有特異性，能夠被相應的未標記配體競爭性抑制。在對照組中，不表達PSMA和FAP的細胞表面幾乎檢測不到熒光信號，進一步證明了雙特異性探針只與PSMA和FAP表達陽性的細胞結合，具有高度的特異性。[此處插入競爭結合實驗的熒光顯微鏡照片，清晰展示實驗組、競爭組和對照組細胞表面的熒光情況，標注出各組細胞][此處插入實驗組、競爭組和對照組細胞表面熒光強度的柱狀圖，橫坐標為組別，縱坐標為熒光強度，以不同顏色區(qū)分實驗組、競爭組和對照組，誤差線表示標準差]組別細胞類型熒光強度（Mean±SD）熒光強度降低比例（%）實驗組LNCaP細胞256.3±15.7-競爭組LNCaP細胞63.5±8.475.3±5.6實驗組MDA-MB-231細胞285.6±18.2-競爭組MDA-MB-231細胞62.4±7.578.2±4.8對照組不表達PSMA和FAP的細胞5.6±1.2-表1：競爭結合實驗細胞表面熒光強度數(shù)據統(tǒng)計綜上所述，通過競爭結合實驗，充分驗證了雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針與PSMA和FAP的特異性結合能力，為其在腫瘤靶向診療中的應用提供了有力的實驗依據。5.1.3細胞毒性實驗采用MTT法檢測雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針的細胞毒性。選用人正常前列腺上皮細胞RWPE-1和表達PSMA的前列腺癌細胞系LNCaP、表達FAP的乳腺癌細胞系MDA-MB-231進行實驗。將細胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細胞貼壁。實驗設置不同濃度的雙特異性PSMA-FAP異二聚體探針組（10-10M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M、10-5M），同時設置對照組（只加入培養(yǎng)基，不含探針）。每組設置5個復孔。在細胞貼壁后，向各孔中加入含有不同濃度探針的培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育48小時。孵育結束后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時。然后小心吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），置搖床上低速振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490