免疫組化技術(shù)操作流程與實驗規(guī)范免疫組織化學(xué)技術(shù)（IHC）通過抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，借助顯色劑（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶）定位組織或細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白，在病理診斷、腫瘤研究、藥物靶點驗證等領(lǐng)域發(fā)揮核心作用。規(guī)范的操作流程與實驗質(zhì)控體系是保障結(jié)果可靠性、重復(fù)性的關(guān)鍵，本文結(jié)合臨床與科研實踐，梳理IHC技術(shù)的核心操作環(huán)節(jié)與實驗規(guī)范要點。一、標(biāo)本處理與前期準(zhǔn)備（一）標(biāo)本固定新鮮組織離體后需及時固定（≤30分鐘），常用10%中性緩沖福爾馬林（NBF），固定時間依組織類型調(diào)整（如小組織塊4-6小時，大組織或?qū)嶓w瘤12-24小時）。固定不足易致抗原彌散，過度固定則可能封閉抗原位點。穿刺標(biāo)本、細(xì)胞爬片可采用4%多聚甲醛固定，需注意避免組織干燥或擠壓。（二）脫水與包埋固定后組織經(jīng)梯度乙醇（70%→80%→95%→100%）脫水、二甲苯透明、石蠟浸透后包埋。脫水不徹底會導(dǎo)致切片時組織碎裂，透明時間過長則可能使組織變脆。包埋時需確保組織方位正確，便于后續(xù)切片定位目標(biāo)區(qū)域。（三）切片與貼片石蠟切片厚度通常為3-5μm，冰凍切片（用于新鮮組織或抗原易降解樣本）厚度6-8μm。切片需貼于經(jīng)APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）或多聚賴氨酸處理的防脫載玻片上，37℃烤片1-2小時（或60℃烤片30分鐘），增強組織與玻片的結(jié)合力，防止脫片。二、免疫染色核心步驟（一）脫蠟與水化石蠟切片經(jīng)二甲苯（Ⅰ、Ⅱ各10分鐘）脫蠟，梯度乙醇（100%→95%→80%→70%）水化至蒸餾水，每步5分鐘。冰凍切片直接用PBS沖洗，去除包埋劑或冰晶干擾。（二）抗原修復(fù)根據(jù)抗原特性選擇修復(fù)方式：熱修復(fù)：常用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）或EDTA緩沖液（pH8.0），將切片置于修復(fù)盒中，微波爐高火加熱至沸騰后，中火維持10-15分鐘，自然冷卻至室溫。熱修復(fù)可打開抗原表位，適用于大多數(shù)蛋白抗原。酶修復(fù)：如胰蛋白酶（0.1%，37℃10-20分鐘）或胃蛋白酶（0.4%，37℃5-10分鐘），適用于熱修復(fù)效果不佳的抗原（如某些核抗原），需注意酶濃度與孵育時間，避免過度消化導(dǎo)致組織形態(tài)破壞。（三）內(nèi)源性酶封閉3%過氧化氫（H?O?）室溫孵育10分鐘，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性（若采用HRP顯色系統(tǒng)）。對于冰凍切片或含血細(xì)胞的組織，需延長封閉時間至15分鐘，防止紅細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶干擾。（四）非特異性封閉5%-10%正常血清（與二抗來源一致）或牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉10-30分鐘，減少抗體與組織的非特異性結(jié)合。封閉液需覆蓋組織，避免干涸。（五）一抗孵育根據(jù)抗原豐度與抗體說明書，選擇合適的稀釋度（如1:50-1:200），4℃過夜（或37℃1-2小時）。一抗需用封閉液稀釋，避免PBS直接稀釋導(dǎo)致蛋白變性。孵育后用PBS（含0.05%Tween-20）沖洗3次，每次5分鐘，去除未結(jié)合的一抗。（六）二抗孵育選擇與一抗種屬匹配的二抗（如兔抗一抗用goatanti-rabbit），室溫孵育30分鐘（或37℃15分鐘）。二抗?jié)舛韧ǔ?:100-1:500，需注意避免交叉反應(yīng)（如多克隆二抗可能與組織內(nèi)源性IgG結(jié)合，需用封閉液預(yù)處理）。孵育后同法沖洗。（七）顯色反應(yīng)根據(jù)二抗標(biāo)記的酶選擇顯色劑：HRP系統(tǒng)用DAB（3,3'-二氨基聯(lián)苯胺），AP系統(tǒng)用BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸/硝基藍(lán)四氮唑）。顯色時間需嚴(yán)格控制（DAB通常3-10分鐘），顯微鏡下觀察顯色強度，適時終止（用蒸餾水沖洗），避免背景過深。（八）復(fù)染與封片蘇木精復(fù)染細(xì)胞核（1-3分鐘），鹽酸乙醇分化（數(shù)秒），自來水返藍(lán)。梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片。若需長期保存，需確保封片膠無氣泡，組織無褶皺。三、實驗規(guī)范與質(zhì)量控制（一）試劑管理抗體保存：一抗、二抗需按說明書要求保存（通常-20℃或4℃），避免反復(fù)凍融。使用前需平衡至室溫，輕柔混勻。顯色劑新鮮配制：DAB需現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存；H?O?需定期更換（開封后保質(zhì)期≤1個月）。緩沖液質(zhì)控：PBS需現(xiàn)配或使用商品化即用型，pH值穩(wěn)定在7.2-7.4，含0.05%Tween-20以減少非特異性吸附。（二）對照設(shè)置陽性對照：選擇已知表達(dá)目標(biāo)抗原的組織（如乳腺癌檢測HER-2時用已知陽性的乳腺癌組織），確保實驗體系有效。陰性對照：用封閉液替代一抗（空白對照）或用同型IgG（替代對照），排除非特異性染色。若一抗為兔源，陰性對照用兔IgG，濃度與一抗一致。（三）操作規(guī)范實驗環(huán)境：保持操作臺清潔，避免灰塵、纖維污染切片。染色過程中組織需始終被液體覆蓋，防止干涸導(dǎo)致抗原失活或非特異性結(jié)合。時間與溫度控制：孵育時間、溫度需嚴(yán)格遵循說明書，如4℃過夜孵育需確保恒溫箱穩(wěn)定，避免溫度波動影響抗體結(jié)合。切片標(biāo)記：每張切片需清晰標(biāo)記編號、抗體信息，便于結(jié)果追溯。（四）安全防護(hù)生物安全：病理標(biāo)本（尤其是腫瘤、傳染性疾病標(biāo)本）需按生物安全二級（BSL-2）要求處理，操作時戴手套、口罩，避免氣溶膠吸入。化學(xué)安全：二甲苯、甲醛等有機溶劑需在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，DAB為潛在致癌物，需戴手套、護(hù)目鏡，廢液需專門收集處理。四、常見問題與解決方案（一）非特異性染色原因：封閉不充分、抗體濃度過高、內(nèi)源性酶未完全封閉。解決：延長封閉時間（如用10%血清封閉30分鐘），降低一抗?jié)舛龋ㄌ荻认♂寖?yōu)化），增加H?O?封閉時間（15分鐘），或在一抗、二抗孵育液中加入0.5%BSA。（二）染色強度不足原因：抗原修復(fù)不充分、一抗孵育時間短、抗體效價低。解決：更換修復(fù)液（如EDTA緩沖液替代檸檬酸鹽），延長一抗孵育時間（4℃過夜改為37℃2小時+4℃過夜），更換高純度抗體或優(yōu)化稀釋度。（三）組織脫片原因：玻片防脫處理不當(dāng)、烤片時間不足、沖洗力度過大。解決：重新處理玻片（APES或多聚賴氨酸包被），延長烤片時間（60℃1小時），沖洗時用緩流PBS，避免直接沖擊組織。（四）背景深、邊緣效應(yīng)原因：抗體未充分沖洗、顯色時間過長、切片邊緣干涸。解決：增加PBS沖洗次數(shù)（4次，每次5分鐘），嚴(yán)格控制顯色時間（顯微鏡下實時觀察），確保孵育液覆蓋整個組織（可滴加少量封閉液防止邊緣干涸）。五、總結(jié)免疫組化技術(shù)的準(zhǔn)確性依賴于標(biāo)