GB/T31270.10-XXXX

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的

規(guī)定起草。

本文件是GB/T31270《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》的第10部分。GB/T31270已經(jīng)發(fā)布

了以下部分：

——第1部分：土壤代謝試驗(yàn)；

——第2部分：水解試驗(yàn)；

——第3部分：水中直接光解試驗(yàn)；

——第4部分：土壤吸附/解吸試驗(yàn)；

——第5部分：土壤淋溶試驗(yàn)；

——第6部分：揮發(fā)性試驗(yàn)；

——第7部分：生物富集試驗(yàn)；

——第8部分：水-沉積物系統(tǒng)代謝試驗(yàn)；

——第9部分：鳥類短期飼喂毒性試驗(yàn)；

——第10部分：蜜蜂急性毒性試驗(yàn)；

——第11部分：家蠶急性毒性試驗(yàn)；

——第12部分：魚類急性毒性試驗(yàn)；

——第13部分：溞類急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)；

——第14部分：藻類生長抑制試驗(yàn)；

——第15部分：蚯蚓急性毒性試驗(yàn)；

——第16部分：土壤微生物毒性試驗(yàn)；

——第17部分：天敵赤眼蜂急性毒性試驗(yàn)；

——第18部分：天敵兩棲類急性毒性試驗(yàn)；

——第19部分：非靶標(biāo)植物影響試驗(yàn)；

——第20部分：家畜短期飼喂毒性試驗(yàn)；

——第21部分：大型甲殼類生物毒性試驗(yàn)；

——第22部分：土壤表面光解試驗(yàn)；

——第23部分：鳥類急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。

本文件代替GB/T31270.10-2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第10部分：蜜蜂急性毒

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GB/T31270.10-XXXX

性試驗(yàn)》，與GB/T31270.10-2014相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動(dòng)外，主要技術(shù)變化如下：

a)增加了蜜蜂幼蟲單次暴露毒性試驗(yàn)方法（見4.3、5.2、6.1、6.2.2、6.3、7.2、7.3、7.6、

8.2、9.3、10.2、11.2、12.2）；

b)增加了規(guī)范性引用文件一章（見第2章）；

c)更改了術(shù)語與定義，新增了蜜蜂幼蟲、成年工蜂、子脾的定義，刪除了被試物、化學(xué)農(nóng)

藥、原藥、制劑、有效成分、參比物質(zhì)（見3.2、3.3、3.4，2014版的2.2、2.3、2.4、2.5、

2.6、2.7）；

d)增加了試劑或材料一章，列出了試驗(yàn)所需的試劑（見第6章）；

e)增加了樣品一章，增加了參比物相關(guān)要求（見8.2，2014年版的4.1.2）；

f)更改了試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法（見第10章，2014版本的4.3.1、4.3.2、4.3.3、4.3.4）；

g)刪除質(zhì)量控制中，投喂藥品及飼養(yǎng)期間,供試物含量不能低于規(guī)定含量的80%的要求（見

第11章，2014年版的4.4）；

h)刪除了農(nóng)藥對(duì)蜜蜂毒性等級(jí)劃分（見2014年版的附錄A）；

i)增加了附錄A：蜂王產(chǎn)卵控制器示意圖（見附錄A）；

j)增加了附錄B：蜜蜂幼蟲飼養(yǎng)單元孔示意圖（見附錄B）；

k)增加了附錄C：蜜蜂幼蟲急性毒性試驗(yàn)流程圖（見附錄C）。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。

本文件由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出并歸口。

本文件起草單位：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。

本文件主要起草人：袁善奎、朱麗珍、吳遲、陳朗、周艷明、蒼濤、卜元卿、劉瓊、趙常升、

張海情、朱昱璇、廖建華。

本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：

——2014年首次發(fā)布為GB/T31270.10-2014。

——本次為第一次修訂。

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化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則

第10部分：蜜蜂急性毒性試驗(yàn)

警示——使用本標(biāo)準(zhǔn)的人員應(yīng)有正規(guī)實(shí)驗(yàn)室工作的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。本標(biāo)準(zhǔn)并未指出所有可能的安

全問題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧?，并保證符合國家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件。

1范圍

本文件規(guī)定了蜜蜂急性毒性試驗(yàn)的試驗(yàn)條件、試劑或材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗(yàn)步驟、試

驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、質(zhì)量控制以及試驗(yàn)報(bào)告等的基本要求。

本文件適用于為化學(xué)農(nóng)藥登記而進(jìn)行的蜜蜂急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、急性接觸毒性試驗(yàn)和蜜蜂幼

蟲單次暴露毒性試驗(yàn)。本文件不適用于易揮發(fā)的化學(xué)農(nóng)藥。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引

用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修

改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

NY/T4195.1農(nóng)藥登記環(huán)境影響試驗(yàn)生物試材培養(yǎng)第1部分：蜜蜂

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

半致死劑量medianlethaldose

指在急性經(jīng)口試驗(yàn)和急性接觸以及急性幼蟲毒性試驗(yàn)中，引起50％的受試生物死亡時(shí)被試物

劑量，用LD50表示.

注：單位為μg./蜂或μg./幼蟲。

蜜蜂幼蟲larvaofhoneybee

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指蜜蜂卵孵化后至變態(tài)化蛹前的蟲態(tài)。

成年工蜂Adultforagerhoneybee

在蜜蜂種群繁殖期，指蜂群中具備外勤采集能力和行為的蜜蜂。

子脾Broodcomb

蜂群中包含大量蜂卵、不同日齡幼蟲以及蛹的巢脾。

4原理

蜜蜂急性經(jīng)口毒性

將不同劑量的被試物分散在蔗糖溶液中飼喂成年工蜂，藥液消耗完后測定藥液的消耗量，并

換喂不含被試物的蔗糖溶液。觀察、記錄48h內(nèi)蜜蜂的中毒癥狀及死亡數(shù)，處理組24h和48h

的死亡率差異＞10%時(shí)，觀察時(shí)間還應(yīng)延長至最多96h。求出24h、48h和試驗(yàn)延長后72h、96h

的LD50值及其95%置信區(qū)間。

蜜蜂急性接觸毒性

在蜜蜂被麻醉后，將不同濃度試驗(yàn)藥液點(diǎn)滴在受試蜜蜂的中胸背板處，待溶劑揮發(fā)后，將蜜

蜂轉(zhuǎn)入試驗(yàn)籠中，用不含被試物的蔗糖溶液飼喂。觀察、記錄48h內(nèi)蜜蜂的中毒癥狀及死亡數(shù)，

處理組24h和48h的死亡率差異＞10%時(shí)，觀察時(shí)間還應(yīng)延長至最多96h。求出24h、48h和試

驗(yàn)延長后72h、96h的LD50值及其95%置信區(qū)間。

蜜蜂幼蟲單次暴露毒性試驗(yàn)

在試驗(yàn)第1天（D1），分別從3個(gè)繁殖蜂群中移取1日齡蜜蜂幼蟲至育王臺(tái)基，然后一并放

入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在板孔中人工標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)。在試驗(yàn)第4天（D4），將被試物按不同濃度梯

度與人工飼料混合，按單次劑量一次性投喂蜜蜂幼蟲。記錄試驗(yàn)第5天（D5）、第6天（D6）和

第7天（D7）蜜蜂幼蟲的中毒癥狀、異常行為以及死亡數(shù)。求出染毒72h的LD50及其95%置信

區(qū)間。

5試驗(yàn)條件

5.1蜜蜂急性經(jīng)口和急性接觸試驗(yàn)在溫度（25±2）C，相對(duì)濕度50%～70%，黑暗條件下進(jìn)行。

5

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5.2蜜蜂幼蟲急性毒性試驗(yàn)在溫度34℃~35℃，相對(duì)濕度95%，黑暗條件下進(jìn)行。觀察和飼喂時(shí)

溫度可出現(xiàn)一定的偏差，但不應(yīng)低于23℃或高于40℃，且每24h內(nèi)出現(xiàn)的偏差不應(yīng)超過一次，

持續(xù)時(shí)間不應(yīng)超過15min。

6試劑或材料

試劑

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的三級(jí)水。

6.1.1樂果（C5H12NO3PS2，CAS號(hào)：60-51-5）。

6.1.2硫酸鉀（K?SO?，CAS號(hào)：7778-80-5）。

6.1.3丙酮（C3H6OCAS號(hào)：67-64-1）。

6.1.4二甲基甲酰胺（C3H7NO，CAS號(hào)：68-12-2）。

6.1.5二甲基亞砜（C2H6OS，CAS號(hào)：67-68-5）。

6.1.6葡萄糖-D（C6H12O6，CAS號(hào)：50-99-7）。

6.1.7果糖-D（C6H12O6，CAS號(hào)57-48-7）。

6.1.8酵母提取物（CAS號(hào)：8013-01-2）。

6.1.9蔗糖（C12H22O11，CAS號(hào)：57-50-1）。

6.1.10蜂王漿（CAS號(hào)：8031-67-2）。

6.1.1175%酒精消毒液（CH3CH2OH，CAS號(hào)：64-17-5）。

供試生物

6.2.1蜜蜂成蜂的獲取

6.2.1.1應(yīng)采用同一蜂群的蜜蜂成年工蜂進(jìn)行試驗(yàn)，宜選用意大利蜜蜂（Apismellifera），按照NY/T

4195.1的要求飼養(yǎng)，受試蜜蜂應(yīng)為健康、大小一致的個(gè)體。用于急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)的蜜蜂應(yīng)在試

驗(yàn)前饑餓2h。

6.2.1.2不宜在早春和晚秋進(jìn)行蜜蜂試驗(yàn)，如在早春和晚秋進(jìn)行試驗(yàn)，應(yīng)在試驗(yàn)環(huán)境下以蜂巢花粉

飼喂1周；蜜蜂接受抗生素、抗螨蟲藥物后4周內(nèi)不得用于試驗(yàn)。

6.2.1.3供試蜜蜂應(yīng)在清晨或前1日傍晚收集，不宜直接在蜜蜂子脾上采集。

6.2.2蜜蜂幼蟲的獲取

6.2.2.1試驗(yàn)用蜜蜂幼蟲從3個(gè)不同的蜂群收集，蜂群健康，生活史和生理狀況已知。如果在試驗(yàn)

前對(duì)蜂群進(jìn)行了衛(wèi)生處理（如螨蟲或疾病治療），需要記錄處理日期和所用藥物的信息。在試驗(yàn)

開始前四周內(nèi)，不允許對(duì)蜂群進(jìn)行任何處理。

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6.2.2.2試驗(yàn)前將蜂王隔離在蜂箱中放置有空巢脾的蜂王產(chǎn)卵控制器（參見附錄A的圖A.1）內(nèi)，

該控制器應(yīng)避免放置在蜂箱邊緣。第2天檢查新卵產(chǎn)出情況，并從產(chǎn)卵控制器中移出蜂王，避免

在試驗(yàn)蜂脾上再次產(chǎn)卵。蜂王的隔離時(shí)間最多不超過30h。

6.2.2.3移蟲前將移蟲針、人工育工臺(tái)基浸沒在75%酒精（體積比）或其他消毒液中至少30min

進(jìn)行消毒后，晾干待用。蜂王產(chǎn)卵3d后用移蟲針將1日齡的幼蟲隨機(jī)轉(zhuǎn)移至育王臺(tái)基中（移蟲

環(huán)境溫度不低于20℃）。為了避免由幼蟲之間個(gè)體差異所產(chǎn)生的偏差，宜收集新孵化的幼蟲，即

還沒有變?yōu)椤癈”字形的幼蟲。每個(gè)臺(tái)基放入1頭幼蟲，在試驗(yàn)條件下，用人工飼料飼養(yǎng)。

人工飼料

6.3.1人工飼料組成

不同日齡蜜蜂幼蟲使用的3種飼料配方如下（均為質(zhì)量比）：

a）飼料A：酵母提取物：葡萄糖：果糖：無菌水：鮮蜂王漿=1：6：6：37：50；

b）飼料B：酵母提取物：葡萄糖：果糖：無菌水：鮮蜂王漿=1.5：7.5：7.5：33.5：50；

c）飼料C：酵母提取物：葡萄糖：果糖：無菌水：鮮蜂王漿=2：9：9：30：50。

6.3.2人工飼料配制與儲(chǔ)存

6.3.2.1應(yīng)待酵母提取物、葡萄糖、果糖完全溶解于無菌水后，再與蜂王漿混合。

6.3.2.2整個(gè)試驗(yàn)期間，在每次試驗(yàn)開始前配制好新鮮飼料并放置在≤5℃的冰箱中儲(chǔ)存。

7儀器設(shè)備

7.1試驗(yàn)蜂籠（易清潔、通風(fēng)好，材質(zhì)可為不銹鋼、金屬絲網(wǎng)、塑料、一次性木籠等，宜每籠10

只蜜蜂，試驗(yàn)籠的大小應(yīng)與蜜蜂的數(shù)量相稱，提供足夠的空間）

7.2蜂王產(chǎn)卵控制器，構(gòu)成見附錄A的圖A.1。

7.3移蟲針。

7.4恒溫恒濕培養(yǎng)箱。

7.5溫濕度記錄儀。

7.6聚苯乙烯或聚丙烯材質(zhì)的育王臺(tái)基，構(gòu)成見附錄B的圖B.1。

7.7分析天平（感量0.0001g及以上）。

7.8人工氣候室。

7.9微量點(diǎn)滴儀。

7.10紫外殺菌燈。

7.11飼喂器等。

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8樣品

被試物

農(nóng)藥原（母）藥或制劑。

a)水中溶解度；

b)有機(jī)溶劑中的溶解度；

c)代表性制劑的田間推薦施藥量及其使用次數(shù)等。

參比物

宜選用樂果原藥為參比物。

9試驗(yàn)步驟

蜜蜂急性經(jīng)口毒性

9.1.1預(yù)試驗(yàn)

按正式試驗(yàn)的條件，以較大間距設(shè)置4個(gè)～5個(gè)處理組，以確定正式試驗(yàn)的劑量范圍。

9.1.2正式試驗(yàn)

9.1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定的劑量范圍按一定比例間距（幾何級(jí)差應(yīng)控制在2.2以內(nèi)）設(shè)置5個(gè)~7個(gè)處

理組，并設(shè)空白對(duì)照組，使用有機(jī)溶劑、乳化劑、分散劑等助溶的還需增設(shè)溶劑對(duì)照組。每組3

個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)至少10只蜜蜂。

9.1.2.2試驗(yàn)藥液配制

如被試物可溶于水，直接用500g/L（50%w/v）蔗糖溶液配制。對(duì)于水溶性較低的被試物，

可使用有機(jī)溶劑、乳化劑或?qū)γ鄯涠拘暂^低的分散劑（如丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜等）

助溶。有機(jī)溶劑使用量不應(yīng)超過1%（v/v），且各處理組用量一致。

9.1.2.3染毒

將蜜蜂引入試驗(yàn)籠中，然后在飼喂器（如離心管，注射器等）中加入100μL~200μL試驗(yàn)藥

液。待藥液消耗完（通常需要3h~4h，最多延長至6h），將飼喂器取出，換喂不含被試物的蔗糖

水（不限量）。

9.1.2.4藥液消耗量測定

通過測定染毒前后食物重量計(jì)算藥液消耗量。

9.1.2.5觀察

觀察并記錄24h、48h后各個(gè)處理組和對(duì)照組的中毒癥狀和死亡數(shù)。在對(duì)照組的死亡率＜10%

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的情況下，處理組24h和48h后的死亡率差異＞10%時(shí)，還應(yīng)將觀察時(shí)間延長，最多至96h。

9.1.3限度試驗(yàn)

設(shè)置上限劑量100μga.i./蜂，即在被試物達(dá)100μga.i./蜂時(shí)仍未見蜜蜂死亡，則無需繼續(xù)試

驗(yàn)。

9.1.4參比物質(zhì)試驗(yàn)

定期（至少6個(gè)月一次）進(jìn)行參比物質(zhì)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。

9.2蜜蜂急性接觸毒性

9.2.1預(yù)試驗(yàn)

按正式試驗(yàn)的條件，以較大間距設(shè)置4個(gè)～5個(gè)處理組，以確定正式試驗(yàn)的劑量范圍。

9.2.2正式試驗(yàn)

9.2.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定的劑量范圍按一定比例間距（幾何級(jí)差應(yīng)控制在2.2以內(nèi)）設(shè)置5個(gè)～7個(gè)處

理組，同時(shí)設(shè)空白和溶劑對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)至少10只蜜蜂。

9.2.2.2試驗(yàn)藥液配制

被試物用丙酮等溶劑溶解，配制成不同濃度的藥液。

9.2.2.3染毒

用微量點(diǎn)滴儀將1.0μL試驗(yàn)藥液點(diǎn)滴至蜜蜂中胸背板處，晾干后轉(zhuǎn)入試驗(yàn)籠中，用50%蔗糖

水飼喂。

9.2.2.4觀察

觀察并記錄24h、48h后各個(gè)處理組和對(duì)照組的中毒癥狀和死亡數(shù)。在對(duì)照組的死亡率＜10%

的情況下，處理組24h和48h后的死亡率差異＞10%時(shí)，還應(yīng)將觀察時(shí)間延長，最多至96h。

9.2.3限度試驗(yàn)

設(shè)置上限劑量100μga.i./蜂，即在被試物達(dá)100μga.i./蜂時(shí)仍未見蜜蜂死亡，則無需繼續(xù)試

驗(yàn)。

9.2.4參比物質(zhì)試驗(yàn)

定期（至少6個(gè)月一次）進(jìn)行參比物質(zhì)急性接觸毒性試驗(yàn)。

9.3蜜蜂幼蟲單次暴露毒性試驗(yàn)方法

9.3.1暴露條件

按一定比例間距設(shè)置至少5個(gè)處理組（幾何級(jí)差應(yīng)控制在3以內(nèi)）。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組、

參比物對(duì)照組，使用溶劑助溶時(shí)還應(yīng)增設(shè)溶劑對(duì)照組。每組均設(shè)3個(gè)重復(fù)，3個(gè)重復(fù)受試幼蟲應(yīng)

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分別采自3個(gè)不同的蜂群。每個(gè)重復(fù)至少12只蜜蜂幼蟲，且各個(gè)重復(fù)所使用的幼蟲數(shù)應(yīng)一致，并

置于同一細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔一個(gè)育王臺(tái)基一只幼蟲。每組處理組用一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)板應(yīng)

隨機(jī)擺放。

9.3.2預(yù)試驗(yàn)

按正式試驗(yàn)的條件，以5倍~10倍幾何級(jí)差設(shè)置處理組，以確定正式試驗(yàn)的劑量范圍。

9.3.3限度試驗(yàn)

設(shè)置上限劑量100μga.i./幼蟲。處理組、對(duì)照組和參比物對(duì)照組均設(shè)3個(gè)重復(fù)，3個(gè)重復(fù)受試

幼蟲應(yīng)分別采自3個(gè)不同的蜂群。每個(gè)重復(fù)至少12只蜜蜂幼蟲，且各個(gè)重復(fù)所使用的幼蟲數(shù)應(yīng)一

致，并置于同一細(xì)胞培養(yǎng)板中。如果與空白對(duì)照組相比，死亡率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，應(yīng)

重新開展正式試驗(yàn)。

9.3.4參比物質(zhì)試驗(yàn)

每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)置參比物對(duì)照組，樂果暴露劑量為（8.8±0.5）μg/幼蟲。

9.3.5試驗(yàn)準(zhǔn)備

9.3.5.1含被試物飼料的配制

a）用無菌水或有機(jī)溶劑將被試物溶解并稀釋至不同濃度，將不同濃度被試物溶液分別與人

工飼料混合制成含被試物飼料。

b）用水溶解被試物的，飼料中被試物溶液的量不應(yīng)超過最終投喂飼料量的10%（例如，D4

投喂量為30μL最多只能加3μL被試物溶液）。

c）用有機(jī)溶劑溶解被試物的，飼料中被試物溶液的量不應(yīng)超過最終飼料投喂量的5%（例如，

D4投喂量為30μL，最多只能加人1.5μL被試物溶液）。如使用有機(jī)溶劑，應(yīng)增設(shè)溶劑

對(duì)照組。

9.3.5.2蜜蜂幼蟲的室內(nèi)飼養(yǎng)

在試驗(yàn)開始時(shí)將帶有1日齡幼蟲的蜂脾從蜂群中取出，置于隔離容器中轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室，在通

風(fēng)櫥或其他潔凈條件下，從蜂巢中用移蟲針或毛筆將幼蟲移入已投加飼料A的育王臺(tái)基，將裝有

幼蟲的育王臺(tái)分別放入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。每孔中可添加一段醫(yī)用牙科棉或脫脂棉用于墊高育王

臺(tái)基（參見附錄B）。所有幼蟲每天定時(shí)（±0.5h）投喂一次（除第2d），投喂前將飼料預(yù)熱至

20℃以上，但不得高于35℃。第1d每頭幼蟲投喂20μL飼料A。第2d不需要投喂，第3d每頭

幼蟲投喂20μL飼料B。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，盡可能密閉。

9.3.6染毒

試驗(yàn)流程見附錄C。蜜蜂幼蟲達(dá)到4日齡當(dāng)天，每頭幼蟲投喂30μL含被試物的飼料C。每

個(gè)培養(yǎng)板裝來自1個(gè)蜂群的12只幼蟲，放在培養(yǎng)箱中密封容器內(nèi)的單獨(dú)一層。在放進(jìn)培養(yǎng)板之前，

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該容器已在培養(yǎng)箱中調(diào)節(jié)到34℃~35℃。

9.3.7培養(yǎng)與觀察

9.3.7.1染毒后24h（D5）、48h（D6）每頭幼蟲分別投喂40μL、50μL不含被試物溶液的飼料C，

飼喂的同時(shí)檢查并記錄死亡數(shù)、中毒癥狀，取出死亡幼蟲。染毒后72h（D7）觀察和記錄死亡數(shù)、

中毒癥狀。

9.3.7.2判斷蜜蜂幼蟲死亡的標(biāo)準(zhǔn)為：僵硬不動(dòng)，或用移蟲針、毛筆觸碰無反應(yīng)。

9.3.7.3試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，記錄剩余飼料的情況。

9.3.8試驗(yàn)終止

在第7天（D7），在≤-10℃冷凍培養(yǎng)板，試驗(yàn)結(jié)束。

10試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

10.1蜜蜂急性經(jīng)口和急性接觸毒性試驗(yàn)

以表格形式總結(jié)數(shù)據(jù)，給出每個(gè)觀察時(shí)間，處理組和對(duì)照組中每個(gè)重復(fù)的受試蜜蜂數(shù)量、死

亡率和中毒癥狀。以濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以累積死亡百分率對(duì)應(yīng)的概率單位為縱坐標(biāo)，繪制每個(gè)

暴露周期內(nèi)的劑量-效應(yīng)曲線，并選擇適宜的統(tǒng)計(jì)方法和程序估算LD50及其95%置信區(qū)間。

10.2蜜蜂幼蟲單次暴露毒性試驗(yàn)

10.2.1通過Abbott公式校正后，按公式（1）計(jì)算死亡率:

P?T

?=×100................(1)

100?T

式中：

M--用死亡幼蟲數(shù)占初始總數(shù)（即試驗(yàn)開始時(shí)幼蟲總數(shù)）的百分比表示的校正后的死亡率（%）；

P--被試物處理組的死亡百分比（%）；

T--空白對(duì)照組死亡百分比（%）。

10.2.2列表匯總出每個(gè)被試物處理組、空白對(duì)照組和參比物程序?qū)φ战M的數(shù)據(jù)，記錄受試幼蟲的

數(shù)量，D5、D6和D7的死亡數(shù)（即分別為被試物處理后的24h、48h和72h）。用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)

學(xué)方法（如概率單位法、移動(dòng)平均、二項(xiàng)式概率等）分析死亡數(shù)據(jù)。在每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)繪制劑量

反應(yīng)曲線（即被試物處理后的24h、48h和72h）在95%置信限計(jì)算曲線斜率和半數(shù)致死量（LD50）。

用被試物質(zhì)量與幼蟲數(shù)量之比表示LD50，單位為ug/幼蟲。

11質(zhì)量控制

11.1蜜蜂急性經(jīng)口毒性和急性接觸毒性試驗(yàn)質(zhì)量控制條件包括：

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a)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組死亡率不超過10%；

b)參比物樂果對(duì)蜜蜂急性經(jīng)口試驗(yàn)結(jié)果LD50(24h)應(yīng)在0.10μga.i./蜂～0.35μga.i./蜂范圍之

內(nèi)，樂果對(duì)蜜蜂急性接觸試驗(yàn)結(jié)果LD50(24h)應(yīng)在0.10μga.i./蜂～0.30μga.i./蜂范圍之內(nèi)。

11.2蜜蜂幼蟲急性毒性試驗(yàn)質(zhì)量控制條件包括：

a)從第4天（D4）到第7天（D7），對(duì)照組的幼蟲累積校正死亡率應(yīng)≤15%；

b)到第7天（D7）、用參比物對(duì)照組中幼蟲累積死亡率應(yīng)＞50%。

12試驗(yàn)報(bào)告

12.1蜜蜂急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)和蜜蜂急性接觸毒性試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)至少包括下列內(nèi)容：

a）被試物:

1）供試農(nóng)藥的通用名、化學(xué)名稱、結(jié)構(gòu)式、CAS號(hào)、化學(xué)鑒定數(shù)據(jù)、純度、來源等；

2）被試物基本理化性質(zhì)（水中溶解性、溶劑中溶解性、蒸汽壓）等。

b）供試生物:

1）供試蜜蜂的引種來源、種屬、學(xué)名等基本情況；

2）收集試驗(yàn)用蜂的采集方法、采集日期、大概日齡（以周計(jì)算）、健康狀況、飼養(yǎng)情況、

預(yù)處理等。

c）試驗(yàn)條件:

1）試驗(yàn)室的溫度以及相對(duì)濕度；

2）試驗(yàn)容器條件，包括蜂籠類型、尺寸大小和材質(zhì)；

3）試驗(yàn)給藥方法，包括使用的載體溶劑、使用的試驗(yàn)溶液的體積、使用的麻醉方式等；

4）試驗(yàn)設(shè)計(jì)，例如，所使用試驗(yàn)濃度和數(shù)量，對(duì)照組數(shù)量，各處理籠重復(fù)數(shù)以及每籠中蜜

蜂數(shù)量；

5）試驗(yàn)開展的地點(diǎn)和日期。

d）試驗(yàn)結(jié)果:

1）預(yù)試驗(yàn)濃度范圍；

2）每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)死亡率的原始數(shù)據(jù)；

3）LD50統(tǒng)計(jì)分析方法；

4）試驗(yàn)藥液的濃度，LD50（24h）、LD50（48h）值和95%置信區(qū)間，在對(duì)照組的死亡率低

于10%的情況下，若處理24h和48h后的死亡率差異達(dá)到10%以上時(shí)，還需將觀察時(shí)間

最多延長至96h，并給出所采用的計(jì)算方法；

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GB/T31270.10-XXXX

5）對(duì)照組蜜蜂死亡數(shù)量及異常反應(yīng)；

6）觀察到的其他生物效應(yīng)，如受試蜜蜂的任何不正常的行為（包括供試物達(dá)到一定劑量時(shí)，

蜜蜂拒食情況）、處理組和對(duì)照組食物的消耗率、中毒癥狀等；

7）對(duì)本指南文件的任何偏離及其他相關(guān)信息情況的解釋。

12.2蜜蜂急性幼蟲毒性試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)至少包括下列內(nèi)容：

a）被試物:

1）供試農(nóng)藥的通用名、化學(xué)名稱、結(jié)構(gòu)式、CAS號(hào)、化學(xué)鑒定數(shù)據(jù)、純度、來源等；

2)被試物基本理化性質(zhì)（水中溶解性、溶劑中溶解性、蒸汽壓）等。

b）供試生物

1)蜜蜂的來源、種類及亞種、來源供應(yīng)商及所使用的培養(yǎng)條件；

2）試驗(yàn)所用蜂群的健康狀況；

c）試驗(yàn)條件

1）試驗(yàn)地點(diǎn)及日期；

2）幼蟲試驗(yàn)系統(tǒng)的描述：所用培養(yǎng)板的類型，每個(gè)處理組和對(duì)照組所用幼蟲的數(shù)量所用溶劑

及其濃度（如有）,被試物的試驗(yàn)濃度；

3）幼蟲試驗(yàn)培養(yǎng)條件：溫度（平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、最大值和最小值）、相對(duì)濕度及試驗(yàn)方

法；

4）在每個(gè)處理重復(fù)死亡的幼蟲數(shù)量和百分比，參比物（樂果）作為對(duì)照組的結(jié)果；

5）貯備液中被試物的配制濃度和實(shí)測濃度，實(shí)測濃度與配制濃度的偏差應(yīng)在20%范圍內(nèi)；

6）D5、D6和D7的死亡量和D7置信區(qū)間為95%的72h-LD50，擬合模型曲線圖，濃度-反應(yīng)

曲線的斜率和標(biāo)準(zhǔn)誤差，用于測定LD50的統(tǒng)計(jì)學(xué)/數(shù)學(xué)方法；

7）其他觀察到的現(xiàn)象，包括試驗(yàn)結(jié)束時(shí)未吃完的飼料；

8）對(duì)本文件的任何偏離及相關(guān)解釋。

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GB/T31270.10-XXXX

附錄A

(資料性)

蜂王產(chǎn)卵控制器示意圖

蜂王產(chǎn)卵控制器示意圖見圖A.1。

圖A.1蜂王產(chǎn)卵控制器示意圖

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附錄B

(資料性)

蜜蜂幼蟲飼養(yǎng)單元孔示意圖

B.1幼蟲應(yīng)在透明的聚苯乙烯材質(zhì)的育王臺(tái)基（內(nèi)直徑為8.8mm，深度為9.5mm）或聚丙烯材質(zhì)

的育王臺(tái)基（內(nèi)直徑為8.5mm，深度為8.3mm）中飼養(yǎng)。育王臺(tái)基在試驗(yàn)開始時(shí)進(jìn)行殺菌，如可

用酒精或其他殺菌溶液浸泡30min，取出后在通風(fēng)櫥中晾干，將育王臺(tái)基每個(gè)格放置于48孔細(xì)胞

培養(yǎng)板的一個(gè)小孔中。宜將一片牙科棉吸入加有150g/L甘油的殺菌液500μL放入孔的底部，使育

王臺(tái)基的頂部與培養(yǎng)板保持水平（見圖B.1）。

B.2將這些培養(yǎng)板放入密封的有機(jī)玻璃干燥器。為保持干燥器中空氣水分飽和，其中放一個(gè)盛有

硫酸鉀（K2SO4）飽和溶液的培養(yǎng)皿。將干燥器置于一個(gè)配有強(qiáng)制空氣循環(huán)系統(tǒng)的培養(yǎng)箱中，試

驗(yàn)期間，培養(yǎng)箱溫度保持在34℃~35℃。

B.3蜜蜂幼蟲毒性試驗(yàn)人工飼養(yǎng)單元孔構(gòu)成見圖B.1。

圖B.1蜜蜂幼蟲毒性試驗(yàn)人工飼養(yǎng)單元孔示意圖

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GB/T31270.10-XXXX

附錄C

(規(guī)范性)

蜜蜂幼蟲急性毒性試驗(yàn)流程圖

蜜蜂幼蟲急性毒性試驗(yàn)流程見圖C.1。

圖C.1蜜蜂幼蟲急性毒性試驗(yàn)流程圖

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GB/T31270.10-XXXX

參考文獻(xiàn)

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TestingofChemicals.

[2]OECD(1998b)Guideline214:Honeybees,acutecontacttoxicitytest,OECDGuidelinesforthe

TestingofChemicals.

[3]OECD(2013)Guideline237:Honeybee(Apismellifera)larvaltoxicitytest,singleexposure,

OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals.

17

ICS65.100

CCSB13

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/T31270.10—××××

代替GB/T31270.10-2014

化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則

第10部分：蜜蜂急性毒性試驗(yàn)

Testguidelinesonenvironmentalsafetyassessmentforchemicalpesticides-Part10:

Honeybeeacutetoxicitytest

（征求意見稿）

在提交反饋意見時(shí)，請將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

××××-××-××發(fā)布××××-××-××實(shí)施

GB/T31270.10-XXXX

化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則

第10部分：蜜蜂急性毒性試驗(yàn)

警示——使用本標(biāo)準(zhǔn)的人員應(yīng)有正規(guī)實(shí)驗(yàn)室工作的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。本標(biāo)準(zhǔn)并未指出所有可能的安

全問題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧⒈ＷC符合國家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件。

1范圍

本文件規(guī)定了蜜蜂急性毒性試驗(yàn)的試驗(yàn)條件、試劑或材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗(yàn)步驟、試

驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、質(zhì)量控制以及試驗(yàn)報(bào)告等的基本要求。

本文件適用于為化學(xué)農(nóng)藥登記而進(jìn)行的蜜蜂急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、急性接觸毒性試驗(yàn)和蜜蜂幼

蟲單次暴露毒性試驗(yàn)。本文件不適用于易揮發(fā)的化學(xué)農(nóng)藥。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引

用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修

改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

NY/T4195.1農(nóng)藥登記環(huán)境影響試驗(yàn)生物試材培養(yǎng)第1部分：蜜蜂

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

半致死劑量medianlethaldose

指在急性經(jīng)口試驗(yàn)和急性接觸以及急性幼蟲毒性試驗(yàn)中，引起50％的受試生物死亡時(shí)被試物

劑量，用LD50表示.

注：單位為μg./蜂或μg./幼蟲。

蜜蜂幼蟲larvaofhoneybee

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GB/T31270.10-XXXX

指蜜蜂卵孵化后至變態(tài)化蛹前的蟲態(tài)。

成年工蜂Adultforagerhoneybee

在蜜蜂種群繁殖期，指蜂群中具備外勤采集能力和行為的蜜蜂。

子脾Broodcomb

蜂群中包含大量蜂卵、不同日齡幼蟲以及蛹的巢脾。

4原理

蜜蜂急性經(jīng)口毒性

將不同劑量的被試物分散在蔗糖溶液中飼喂成年工蜂，藥液消耗完后測定藥液的消耗量，并

換喂不含被試物的蔗糖溶液。觀察、記錄48h內(nèi)蜜蜂的中毒癥狀及死亡數(shù)，處理組24h和48h

的死亡率差異＞10%時(shí)，觀察時(shí)間還應(yīng)延長至最多