可溶性hPPARγ-LBD重組蛋白的制備與功能表征研究：技術(shù)、機(jī)制與應(yīng)用展望一、引言1.1研究背景在生命科學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域，蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者，一直是研究的核心對(duì)象之一。其中，hPPARγ-LBD重組蛋白因其在代謝調(diào)控、疾病治療等關(guān)鍵生理病理過(guò)程中發(fā)揮的重要作用，近年來(lái)受到了科研工作者的廣泛關(guān)注。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）屬于核受體超家族成員，在人體多種組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，如脂肪組織、肝臟、肌肉、胰島β細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。它在維持機(jī)體代謝平衡方面扮演著至關(guān)重要的角色，參與了脂肪代謝、糖代謝、能量平衡調(diào)節(jié)等多個(gè)生理過(guò)程。在脂肪代謝中，PPARγ能夠促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化和脂質(zhì)積累，調(diào)節(jié)脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存相關(guān)基因的表達(dá)。當(dāng)PPARγ被激活后，會(huì)與視黃酸X受體（RXR）形成異二聚體，該異二聚體與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的過(guò)氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件（PPRE）結(jié)合，從而調(diào)控一系列參與脂肪代謝基因的轉(zhuǎn)錄，如脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（FATP）、脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP）等。在糖代謝方面，PPARγ激動(dòng)劑可以通過(guò)提高胰島素敏感性，促進(jìn)外周組織對(duì)葡萄糖的攝取和利用，減少肝臟葡萄糖輸出，從而有效降低血糖水平。例如，噻唑烷二酮類(lèi)（TZD）藥物作為經(jīng)典的PPARγ激動(dòng)劑，已被廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的臨床治療，并取得了顯著的療效。PPARγ-LBD作為PPARγ蛋白的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，是配體結(jié)合的特異性區(qū)域，決定了PPARγ對(duì)配體的識(shí)別和結(jié)合能力，進(jìn)而影響其生物學(xué)功能的發(fā)揮。不同類(lèi)型的配體與PPARγ-LBD結(jié)合后，會(huì)引發(fā)PPARγ構(gòu)象的改變，招募不同的共激活因子或共抑制因子，從而調(diào)控不同基因的轉(zhuǎn)錄活性，產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。天然配體如脂肪酸及其衍生物，以及內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)等，能夠與PPARγ-LBD結(jié)合并激活PPARγ，參與維持正常的生理代謝過(guò)程。而人工合成的配體，如上述提到的TZD類(lèi)藥物，具有更強(qiáng)的親和力和選擇性，能夠更有效地調(diào)節(jié)PPARγ的活性，用于治療相關(guān)疾病。然而，由于配體結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的多樣性，其與PPARγ-LBD的結(jié)合機(jī)制和作用方式仍存在許多未知之處，深入研究這些內(nèi)容對(duì)于開(kāi)發(fā)更加安全、有效的PPARγ靶向藥物具有重要意義。隨著對(duì)PPARγ研究的不斷深入，其在疾病治療中的潛在價(jià)值日益凸顯，除了在代謝性疾病治療中的重要作用外，PPARγ還與心血管疾病、腫瘤、炎癥、神經(jīng)退行性疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在心血管疾病方面，PPARγ激動(dòng)劑可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制炎癥反應(yīng)、改善血管內(nèi)皮功能等多種途徑，發(fā)揮心血管保護(hù)作用。臨床研究表明，使用PPARγ激動(dòng)劑治療可以降低患者的血脂水平，減少心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。在腫瘤領(lǐng)域，PPARγ的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。許多研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動(dòng)劑能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且可以抑制腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。例如，在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤模型中，PPARγ激動(dòng)劑都表現(xiàn)出了顯著的抗腫瘤活性。然而，目前PPARγ靶向藥物在臨床應(yīng)用中仍面臨一些問(wèn)題，如部分藥物的副作用較大，長(zhǎng)期使用可能導(dǎo)致體重增加、水腫、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加等不良反應(yīng)。這主要是由于現(xiàn)有的藥物對(duì)PPARγ的選擇性和特異性不夠高，在激活PPARγ治療疾病的同時(shí)，也會(huì)引發(fā)一些不必要的生物學(xué)效應(yīng)。因此，開(kāi)發(fā)高選擇性、低副作用的PPARγ靶向藥物成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。獲取高純度、具有生物學(xué)活性的可溶性hPPARγ-LBD重組蛋白是深入研究其結(jié)構(gòu)與功能、開(kāi)發(fā)新型靶向藥物的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。只有獲得足夠量的高質(zhì)量重組蛋白，才能夠運(yùn)用各種先進(jìn)的技術(shù)手段，如X射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）、冷凍電鏡（Cryo-EM）等，對(duì)其三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確解析，從而深入了解其與配體的結(jié)合模式和作用機(jī)制。同時(shí)，利用重組蛋白進(jìn)行藥物篩選和活性評(píng)價(jià)，可以建立更加準(zhǔn)確、高效的體外篩選模型，加速新型藥物的研發(fā)進(jìn)程。目前，雖然已經(jīng)有多種方法用于制備重組蛋白，但在制備可溶性hPPARγ-LBD重組蛋白時(shí)，仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)，如表達(dá)量低、可溶性差、純化難度大等問(wèn)題，這些問(wèn)題限制了對(duì)hPPARγ-LBD的深入研究和相關(guān)藥物的開(kāi)發(fā)。因此，探索一種高效、穩(wěn)定的可溶性hPPARγ-LBD重組蛋白制備方法，并對(duì)其功能進(jìn)行全面、準(zhǔn)確的表征，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，這不僅有助于我們深入理解PPARγ的生物學(xué)功能和作用機(jī)制，還為開(kāi)發(fā)新型、高效、低毒的PPARγ靶向藥物提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)和有力的支持。1.2研究目的與意義本研究旨在通過(guò)一系列生物技術(shù)手段，成功制備可溶性hPPARγ-LBD重組蛋白，并對(duì)其進(jìn)行全面的功能表征。具體而言，研究目的包括以下幾個(gè)方面：構(gòu)建高效表達(dá)載體：通過(guò)基因工程技術(shù)，將hPPARγ-LBD基因引入合適的表達(dá)載體中，構(gòu)建出能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定、高效表達(dá)hPPARγ-LBD重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。在這個(gè)過(guò)程中，需要對(duì)載體的選擇、基因的克隆與插入等關(guān)鍵步驟進(jìn)行精細(xì)操作和嚴(yán)格驗(yàn)證，以確保表達(dá)載體的正確性和有效性。例如，選擇具有強(qiáng)啟動(dòng)子、合適的復(fù)制原點(diǎn)和篩選標(biāo)記的表達(dá)載體，能夠提高基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率，促進(jìn)重組蛋白的表達(dá)。同時(shí)，利用PCR、酶切鑒定、測(cè)序等技術(shù)對(duì)構(gòu)建的表達(dá)載體進(jìn)行驗(yàn)證，確保hPPARγ-LBD基因準(zhǔn)確無(wú)誤地插入到載體中。篩選合適的宿主細(xì)胞：對(duì)不同類(lèi)型的宿主細(xì)胞進(jìn)行篩選和優(yōu)化，確定最適合表達(dá)hPPARγ-LBD重組蛋白的宿主細(xì)胞株。不同的宿主細(xì)胞具有不同的生理特性和蛋白表達(dá)能力，因此需要綜合考慮多種因素，如細(xì)胞的生長(zhǎng)速度、蛋白表達(dá)水平、可溶性表達(dá)情況、培養(yǎng)條件的難易程度等。以大腸桿菌為例，它具有生長(zhǎng)迅速、易于培養(yǎng)、遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn)，是常用的蛋白表達(dá)宿主細(xì)胞之一。但在表達(dá)某些真核蛋白時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)表達(dá)量低、可溶性差、蛋白折疊錯(cuò)誤等問(wèn)題。因此，需要對(duì)大腸桿菌的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成分、溫度、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化，以提高h(yuǎn)PPARγ-LBD重組蛋白的表達(dá)量和可溶性。此外，還可以考慮使用其他宿主細(xì)胞，如酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，根據(jù)它們各自的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，選擇最適合的宿主細(xì)胞來(lái)表達(dá)hPPARγ-LBD重組蛋白。優(yōu)化表達(dá)和純化條件：系統(tǒng)地研究影響hPPARγ-LBD重組蛋白表達(dá)和純化的各種因素，如誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、溫度、pH值等，通過(guò)優(yōu)化這些條件，提高重組蛋白的表達(dá)量和純度，獲得高純度、高活性的可溶性hPPARγ-LBD重組蛋白。在表達(dá)過(guò)程中，通過(guò)調(diào)整誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，可以控制基因的表達(dá)水平，避免因過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致蛋白聚集或降解。例如，對(duì)于一些容易形成包涵體的蛋白，可以采用低溫誘導(dǎo)、降低誘導(dǎo)劑濃度、延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間等策略，促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)。在純化過(guò)程中，選擇合適的純化方法和純化介質(zhì)至關(guān)重要。常用的純化方法包括親和層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析等，這些方法可以根據(jù)蛋白的特性，如與配體的親和力、電荷性質(zhì)、分子量大小等，對(duì)重組蛋白進(jìn)行分離和純化。通過(guò)優(yōu)化純化條件，如選擇合適的洗脫緩沖液、流速、柱床體積等，可以提高純化效果，獲得高純度的hPPARγ-LBD重組蛋白。全面表征蛋白功能：運(yùn)用多種先進(jìn)的技術(shù)手段，如X射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）、冷凍電鏡（Cryo-EM）、表面等離子共振（SPR）、熒光偏振（FP）等，對(duì)制備的hPPARγ-LBD重組蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行深入研究。通過(guò)解析蛋白的三維結(jié)構(gòu)，了解其與配體的結(jié)合模式和作用機(jī)制；通過(guò)測(cè)定蛋白與不同配體的結(jié)合親和力、特異性等參數(shù)，評(píng)估其生物學(xué)活性。X射線晶體學(xué)可以提供高分辨率的蛋白三維結(jié)構(gòu)信息，幫助我們了解蛋白的空間構(gòu)象和氨基酸殘基之間的相互作用。NMR技術(shù)則適用于研究溶液中的蛋白結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)，能夠提供關(guān)于蛋白動(dòng)態(tài)變化的信息。Cryo-EM技術(shù)在解析大分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，可以用于研究hPPARγ-LBD與配體或其他蛋白形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。SPR和FP技術(shù)可以用于測(cè)定蛋白與配體之間的結(jié)合親和力和結(jié)合動(dòng)力學(xué)，為研究蛋白的生物學(xué)功能提供重要數(shù)據(jù)。本研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：深化對(duì)PPARγ作用機(jī)制的理解：PPARγ在維持機(jī)體代謝平衡、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、參與炎癥和免疫反應(yīng)等生理病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，其作用機(jī)制尚未完全闡明。通過(guò)制備和研究可溶性hPPARγ-LBD重組蛋白，可以深入了解PPARγ與配體的相互作用方式，以及配體激活PPARγ后引發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而為揭示PPARγ的生物學(xué)功能和作用機(jī)制提供重要的理論依據(jù)。研究不同類(lèi)型的配體與hPPARγ-LBD的結(jié)合模式和結(jié)合親和力，有助于我們理解配體的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系，以及配體如何通過(guò)與PPARγ-LBD結(jié)合來(lái)激活或抑制PPARγ的功能。此外，通過(guò)研究PPARγ-LBD與共激活因子、共抑制因子等蛋白的相互作用，還可以進(jìn)一步揭示PPARγ介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。推動(dòng)新型靶向藥物的研發(fā)：目前，針對(duì)PPARγ的藥物在臨床應(yīng)用中存在一些局限性，如部分藥物的副作用較大、療效不夠理想等。深入研究hPPARγ-LBD重組蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，能夠?yàn)殚_(kāi)發(fā)新型、高效、低毒的PPARγ靶向藥物提供關(guān)鍵的靶點(diǎn)信息和理論指導(dǎo)?；趯?duì)hPPARγ-LBD與配體結(jié)合機(jī)制的了解，可以設(shè)計(jì)和篩選出具有更高親和力、特異性和選擇性的新型配體，從而提高藥物的療效，減少副作用。利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)解析hPPARγ-LBD與現(xiàn)有藥物或潛在藥物分子的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（CADD）方法，在分子水平上對(duì)藥物分子進(jìn)行優(yōu)化和改造，有望開(kāi)發(fā)出更具優(yōu)勢(shì)的新型PPARγ靶向藥物。此外，以hPPARγ-LBD重組蛋白為基礎(chǔ)，建立高效的體外藥物篩選模型，能夠加速新型藥物的研發(fā)進(jìn)程，為臨床治療提供更多有效的藥物選擇。促進(jìn)相關(guān)疾病的診斷和治療：PPARγ與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如代謝綜合征、2型糖尿病、心血管疾病、腫瘤、炎癥性疾病等。本研究成果為這些疾病的診斷和治療提供了新的思路和方法。在診斷方面，hPPARγ-LBD重組蛋白可以作為生物標(biāo)志物，用于開(kāi)發(fā)更加準(zhǔn)確、靈敏的疾病診斷試劑和檢測(cè)方法。通過(guò)檢測(cè)血液、組織或細(xì)胞中hPPARγ-LBD的表達(dá)水平、活性變化或與配體的結(jié)合情況，有助于早期診斷相關(guān)疾病，并評(píng)估疾病的進(jìn)展和預(yù)后。在治療方面，基于對(duì)hPPARγ-LBD功能的深入理解，可以開(kāi)發(fā)針對(duì)PPARγ信號(hào)通路的靶向治療策略，為疾病的治療提供新的手段。例如，針對(duì)腫瘤細(xì)胞中異常激活的PPARγ信號(hào)通路，開(kāi)發(fā)特異性的抑制劑，有望抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；對(duì)于代謝性疾病患者，通過(guò)調(diào)節(jié)PPARγ的活性，改善代謝紊亂，從而達(dá)到治療疾病的目的。豐富蛋白質(zhì)工程和生物技術(shù)研究：本研究中涉及的基因工程、蛋白表達(dá)與純化、結(jié)構(gòu)與功能分析等技術(shù)，是蛋白質(zhì)工程和生物技術(shù)領(lǐng)域的核心技術(shù)。通過(guò)對(duì)這些技術(shù)的應(yīng)用和優(yōu)化，不僅能夠成功制備和表征hPPARγ-LBD重組蛋白，還為其他蛋白質(zhì)的研究和開(kāi)發(fā)提供了有益的參考和借鑒，推動(dòng)了蛋白質(zhì)工程和生物技術(shù)的發(fā)展。在構(gòu)建表達(dá)載體、優(yōu)化表達(dá)條件和純化方法的過(guò)程中，積累的經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)可以應(yīng)用于其他重組蛋白的制備，提高蛋白表達(dá)的效率和質(zhì)量。同時(shí)，在蛋白結(jié)構(gòu)與功能分析方面，采用的多種先進(jìn)技術(shù)和方法，也為深入研究其他蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能提供了技術(shù)支持，促進(jìn)了蛋白質(zhì)科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。1.3研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)近年來(lái)，可溶性hPPARγ-LBD重組蛋白的研究取得了顯著進(jìn)展，在制備技術(shù)和功能研究方面都有諸多成果與新方向。在制備技術(shù)方面，當(dāng)前主要采用基因工程技術(shù)將hPPARγ-LBD基因?qū)氩煌谋磉_(dá)系統(tǒng)來(lái)獲取重組蛋白。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)由于其遺傳背景清晰、生長(zhǎng)迅速、培養(yǎng)成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為最常用的表達(dá)宿主之一。例如，有研究將hPPARγ-LBD基因克隆到pET系列載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，成功實(shí)現(xiàn)了hPPARγ-LBD重組蛋白的可溶性表達(dá)。在誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化上，研究人員通常會(huì)對(duì)誘導(dǎo)劑IPTG的濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度等因素進(jìn)行系統(tǒng)研究。有實(shí)驗(yàn)表明，較低的誘導(dǎo)溫度（如16℃）和合適的IPTG濃度（如0.5-1.0mM），并延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間（16-20h），有利于提高重組蛋白的可溶性表達(dá)，減少包涵體的形成。此外，為了進(jìn)一步提高蛋白的表達(dá)量和可溶性，還會(huì)采用共表達(dá)分子伴侶的策略，分子伴侶能夠幫助重組蛋白正確折疊，減少錯(cuò)誤折疊和聚集，從而提高可溶性蛋白的產(chǎn)量。然而，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)也存在一些局限性，如缺乏真核生物的翻譯后修飾機(jī)制，可能導(dǎo)致表達(dá)的重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上與天然蛋白存在差異。因此，酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)也逐漸被應(yīng)用于hPPARγ-LBD重組蛋白的制備。酵母表達(dá)系統(tǒng)具有生長(zhǎng)快、易于培養(yǎng)、可進(jìn)行一定程度的翻譯后修飾等優(yōu)點(diǎn)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)被廣泛用于表達(dá)各種重組蛋白，通過(guò)對(duì)其表達(dá)條件的優(yōu)化，如選擇合適的啟動(dòng)子、調(diào)控甲醇誘導(dǎo)濃度和時(shí)間等，可以實(shí)現(xiàn)hPPARγ-LBD重組蛋白的高效表達(dá)。昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)利用桿狀病毒作為表達(dá)載體，能夠?qū)χ亟M蛋白進(jìn)行復(fù)雜的翻譯后修飾，表達(dá)的蛋白更接近天然狀態(tài)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)則具有最接近天然蛋白的翻譯后修飾能力，能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行糖基化、磷酸化等修飾，表達(dá)的重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上與天然蛋白最為相似。但昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)存在培養(yǎng)成本高、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、表達(dá)量相對(duì)較低等問(wèn)題，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。在純化技術(shù)方面，常用的方法包括親和層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析等。親和層析是利用重組蛋白與配體之間的特異性相互作用進(jìn)行分離純化的方法，具有較高的選擇性和純化效率。例如，使用帶有His標(biāo)簽的hPPARγ-LBD重組蛋白，通過(guò)Ni-NTA親和層析柱，可以快速、高效地將目的蛋白從復(fù)雜的細(xì)胞裂解液中分離出來(lái)。離子交換層析則是根據(jù)蛋白表面電荷的差異進(jìn)行分離，通過(guò)選擇合適的離子交換介質(zhì)和緩沖液條件，可以進(jìn)一步提高蛋白的純度。凝膠過(guò)濾層析是基于蛋白分子量的大小進(jìn)行分離，能夠去除雜質(zhì)和多聚體，獲得高純度的單體蛋白。在實(shí)際應(yīng)用中，通常會(huì)將多種純化方法結(jié)合使用，以獲得更高純度的hPPARγ-LBD重組蛋白。如先通過(guò)親和層析進(jìn)行粗純化，再利用離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行精細(xì)純化，可使重組蛋白的純度達(dá)到95%以上。在功能研究方面，目前主要集中在hPPARγ-LBD與配體的相互作用機(jī)制以及其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用研究。通過(guò)多種結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，如X射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）和冷凍電鏡（Cryo-EM）等，研究人員已經(jīng)解析了hPPARγ-LBD與多種配體的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，深入了解了它們之間的結(jié)合模式和作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，hPPARγ-LBD的配體結(jié)合口袋具有一定的可塑性，不同結(jié)構(gòu)的配體與配體結(jié)合口袋相互作用時(shí)，會(huì)引起hPPARγ-LBD構(gòu)象的不同變化，進(jìn)而影響其與共激活因子或共抑制因子的結(jié)合，最終調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性。在疾病研究方面，越來(lái)越多的證據(jù)表明，hPPARγ-LBD在代謝性疾病（如2型糖尿病、肥胖癥等）、心血管疾病、腫瘤、炎癥等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。在2型糖尿病中，hPPARγ-LBD與噻唑烷二酮類(lèi)藥物結(jié)合后，能夠激活PPARγ信號(hào)通路，提高胰島素敏感性，改善血糖代謝。在腫瘤研究中，hPPARγ-LBD的異常激活或表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲密切相關(guān)，針對(duì)hPPARγ-LBD開(kāi)發(fā)的靶向藥物有望成為腫瘤治療的新策略。展望未來(lái)，可溶性hPPARγ-LBD重組蛋白的研究在制備技術(shù)和功能研究方面呈現(xiàn)出以下發(fā)展趨勢(shì)：制備技術(shù)：一方面，開(kāi)發(fā)更加高效、簡(jiǎn)便的表達(dá)系統(tǒng)和純化方法仍是研究的重點(diǎn)。隨著合成生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，有望通過(guò)對(duì)表達(dá)宿主細(xì)胞的基因組進(jìn)行精確編輯和優(yōu)化，構(gòu)建出更適合hPPARγ-LBD重組蛋白表達(dá)的細(xì)胞工廠，進(jìn)一步提高表達(dá)量和可溶性。例如，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)大腸桿菌的基因進(jìn)行編輯，敲除或過(guò)表達(dá)某些與蛋白折疊和分泌相關(guān)的基因，以改善重組蛋白的表達(dá)和可溶性。另一方面，探索新的蛋白表達(dá)策略，如無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有反應(yīng)條件可控、表達(dá)速度快、可快速篩選不同表達(dá)條件等優(yōu)點(diǎn)，為hPPARγ-LBD重組蛋白的制備提供了新的途徑。此外，在純化技術(shù)上，將不斷開(kāi)發(fā)新型的純化介質(zhì)和純化方法，提高純化效率和純度，降低成本。如基于分子印跡技術(shù)的親和純化方法，能夠特異性識(shí)別目標(biāo)蛋白，實(shí)現(xiàn)高效、快速的純化。功能研究：隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物信息學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)等多學(xué)科的交叉融合，對(duì)hPPARγ-LBD的功能研究將更加深入和全面。通過(guò)整合大量的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)、生物信息數(shù)據(jù)和功能數(shù)據(jù)，利用計(jì)算機(jī)模擬和人工智能技術(shù)，能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)hPPARγ-LBD與配體的相互作用模式，以及其在復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)中的作用機(jī)制。這將有助于開(kāi)發(fā)更加精準(zhǔn)、高效的PPARγ靶向藥物。同時(shí)，進(jìn)一步研究hPPARγ-LBD在不同疾病中的作用機(jī)制，探索其作為治療靶點(diǎn)的潛力，為疾病的治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。例如，研究hPPARγ-LBD在腫瘤微環(huán)境中的作用，以及其與免疫細(xì)胞的相互作用，為腫瘤免疫治療提供新的思路。此外，隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，能夠在單細(xì)胞水平和組織原位研究hPPARγ-LBD的表達(dá)和功能，揭示其在不同細(xì)胞類(lèi)型和組織中的異質(zhì)性，為深入理解其生物學(xué)功能提供更詳細(xì)的信息。二、hPPARγ-LBD重組蛋白概述2.1hPPARγ蛋白結(jié)構(gòu)與功能hPPARγ蛋白作為核受體超家族的重要成員，其結(jié)構(gòu)具有典型的核受體特征，由多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域組成，這些結(jié)構(gòu)域在空間上有序排列，共同決定了hPPARγ蛋白的生物學(xué)活性和功能特異性。從整體結(jié)構(gòu)來(lái)看，hPPARγ蛋白主要包含四個(gè)關(guān)鍵的功能結(jié)構(gòu)域，分別為N端的A/B結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD，C結(jié)構(gòu)域）、鉸鏈區(qū)（D結(jié)構(gòu)域）以及C端的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（LBD，E/F結(jié)構(gòu)域）。N端的A/B結(jié)構(gòu)域具有高度的變異性，不同物種之間以及同一物種的不同亞型之間，該結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和長(zhǎng)度都存在較大差異。這一結(jié)構(gòu)域中包含至少一個(gè)配體非依賴(lài)性的轉(zhuǎn)錄激活域（AF1），AF1能夠在沒(méi)有配體結(jié)合的情況下，通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中，A/B結(jié)構(gòu)域可以接受來(lái)自細(xì)胞外的多種信號(hào)刺激，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等，通過(guò)激活A(yù)F1，調(diào)節(jié)hPPARγ蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而影響下游基因的表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞受到胰島素信號(hào)刺激時(shí)，A/B結(jié)構(gòu)域中的某些氨基酸殘基會(huì)發(fā)生磷酸化修飾，從而增強(qiáng)AF1與其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力，促進(jìn)與糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）是hPPARγ蛋白中最為保守的區(qū)域之一，由C結(jié)構(gòu)域形成。DBD含有兩個(gè)高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)，每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)由一段特定的氨基酸序列和一個(gè)鋅離子組成。這些鋅指結(jié)構(gòu)能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的過(guò)氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件（PPRE）。PPRE是一段具有特定核苷酸序列的DNA片段，通常位于靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，其核心序列為AGGTCA，兩個(gè)AGGTCA序列以直接重復(fù)或反向重復(fù)的形式排列，中間間隔1-5個(gè)核苷酸。hPPARγ蛋白的DBD通過(guò)與PPRE的特異性結(jié)合，將hPPARγ蛋白定位到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，為后續(xù)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程奠定基礎(chǔ)。在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，hPPARγ蛋白的DBD與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（FATP）基因啟動(dòng)子區(qū)域的PPRE結(jié)合，調(diào)控FATP基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)脂肪酸的攝取和儲(chǔ)存。鉸鏈區(qū)（D結(jié)構(gòu)域）位于DBD和LBD之間，是一段較短且相對(duì)不保守的氨基酸序列。鉸鏈區(qū)在hPPARγ蛋白中起到連接和柔性調(diào)節(jié)的作用，它能夠使DBD和LBD在空間上保持適當(dāng)?shù)南鄬?duì)位置和構(gòu)象，同時(shí)允許兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在一定程度上進(jìn)行相對(duì)運(yùn)動(dòng)，以適應(yīng)與不同配體和轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合需求。鉸鏈區(qū)還含有核定位信號(hào)肽（NLS），NLS能夠引導(dǎo)hPPARγ蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，使其能夠在細(xì)胞核內(nèi)與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。當(dāng)hPPARγ蛋白被配體激活后，鉸鏈區(qū)的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，促使hPPARγ蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與DNA結(jié)合并調(diào)控基因表達(dá)。C端的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（LBD）是hPPARγ蛋白中最大的結(jié)構(gòu)域，也是決定其功能特異性的關(guān)鍵區(qū)域。LBD具有高度的保守性，其氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)在不同物種之間具有較高的相似性。LBD負(fù)責(zé)與各種配體分子特異性結(jié)合，包括內(nèi)源性配體如脂肪酸及其衍生物、15-脫氧前列腺素J2（15dPGJ2）等，以及外源性配體如噻唑烷二酮類(lèi)（TZD）藥物、GW1929等。LBD的配體結(jié)合口袋具有特定的空間結(jié)構(gòu)和氨基酸組成，能夠與不同結(jié)構(gòu)的配體分子通過(guò)氫鍵、疏水相互作用、范德華力等非共價(jià)鍵相互作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。當(dāng)配體與LBD結(jié)合后，會(huì)引起LBD構(gòu)象的改變，進(jìn)而影響hPPARγ蛋白與其他轉(zhuǎn)錄因子和共調(diào)節(jié)因子的相互作用，最終調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。研究發(fā)現(xiàn)，TZD類(lèi)藥物與hPPARγ-LBD結(jié)合后，會(huì)使LBD的構(gòu)象發(fā)生明顯變化，招募共激活因子，促進(jìn)與胰島素敏感性相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性。hPPARγ蛋白在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控等方面發(fā)揮著核心作用，是維持機(jī)體代謝平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中，hPPARγ蛋白作為一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與配體結(jié)合被激活，進(jìn)而啟動(dòng)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。當(dāng)hPPARγ蛋白與配體結(jié)合后，其構(gòu)象發(fā)生改變，與視黃酸X受體（RXR）形成異二聚體。hPPARγ/RXR異二聚體能夠從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的PPRE結(jié)合。結(jié)合到PPRE上的hPPARγ/RXR異二聚體可以招募多種轉(zhuǎn)錄共激活因子，如類(lèi)固醇受體共激活因子（SRC）家族成員、CREB結(jié)合蛋白（CBP）等，這些共激活因子能夠通過(guò)與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的相互作用，促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。hPPARγ蛋白還可以通過(guò)與共抑制因子結(jié)合，抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄。在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，hPPARγ蛋白被激活后，通過(guò)上述信號(hào)傳導(dǎo)途徑，調(diào)控一系列與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，如過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）等，促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化。在基因表達(dá)調(diào)控方面，hPPARγ蛋白參與了眾多生理和病理過(guò)程相關(guān)基因的調(diào)控。在代謝調(diào)控方面，hPPARγ蛋白通過(guò)調(diào)控脂肪代謝、糖代謝和能量平衡相關(guān)基因的表達(dá)，維持機(jī)體的代謝穩(wěn)態(tài)。在脂肪代謝中，hPPARγ蛋白可以促進(jìn)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（FATP）、脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP）等基因的表達(dá)，增加脂肪酸的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)；同時(shí)，它還可以調(diào)節(jié)脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）等基因的表達(dá)，調(diào)控脂肪酸的合成和儲(chǔ)存。在糖代謝中，hPPARγ蛋白可以提高胰島素敏感性，促進(jìn)外周組織對(duì)葡萄糖的攝取和利用，減少肝臟葡萄糖輸出。它通過(guò)激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信號(hào)通路，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面，增加葡萄糖的攝??；同時(shí)，它還可以抑制糖異生相關(guān)基因的表達(dá)，如磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）、葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）等，減少肝臟葡萄糖的生成。在能量平衡調(diào)節(jié)中，hPPARγ蛋白可以調(diào)節(jié)解偶聯(lián)蛋白（UCP）家族基因的表達(dá)，影響線粒體的能量代謝和產(chǎn)熱過(guò)程。hPPARγ蛋白還在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡以及炎癥反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化方面，hPPARγ蛋白可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞的分化，抑制細(xì)胞的增殖。在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，hPPARγ蛋白通過(guò)調(diào)控一系列轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路，促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化，形成具有儲(chǔ)存脂肪功能的脂肪細(xì)胞。在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，hPPARγ蛋白可以調(diào)節(jié)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，如骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）等，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和骨基質(zhì)的合成。在巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中，hPPARγ蛋白可以影響巨噬細(xì)胞的表型和功能，使其向抗炎型巨噬細(xì)胞極化。在細(xì)胞凋亡方面，hPPARγ蛋白可以通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，如Bcl-2家族成員、半胱天冬酶（caspase）等，調(diào)控細(xì)胞的凋亡過(guò)程。在炎癥反應(yīng)方面，hPPARγ蛋白具有顯著的抗炎作用，它可以抑制炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等，減少炎癥介質(zhì)的釋放。hPPARγ蛋白通過(guò)與核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路相互作用，抑制NF-κB的活性，從而抑制炎癥基因的轉(zhuǎn)錄。hPPARγ蛋白的結(jié)構(gòu)與功能密切相關(guān)，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)決定了它能夠特異性地識(shí)別和結(jié)合配體，通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，精確調(diào)控基因的表達(dá)，在維持機(jī)體代謝平衡、細(xì)胞生長(zhǎng)分化、炎癥反應(yīng)等多個(gè)生理病理過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。對(duì)hPPARγ蛋白結(jié)構(gòu)與功能的深入研究，不僅有助于我們理解其在正常生理狀態(tài)下的作用機(jī)制，還為開(kāi)發(fā)針對(duì)相關(guān)疾病的治療藥物提供了重要的理論基礎(chǔ)。2.2LBD結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)及作用hPPARγ-LBD作為hPPARγ蛋白的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，在其整體功能實(shí)現(xiàn)中占據(jù)核心地位，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和多樣且關(guān)鍵的生物學(xué)作用。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來(lái)看，hPPARγ-LBD由多個(gè)α-螺旋和β-折疊組成，這些二級(jí)結(jié)構(gòu)元件通過(guò)特定的連接方式，在空間上有序排列，形成了一個(gè)具有高度復(fù)雜性和特異性的三維結(jié)構(gòu)。在這個(gè)三維結(jié)構(gòu)中，最為關(guān)鍵的部分是配體結(jié)合口袋，它猶如一個(gè)精心設(shè)計(jì)的“容器”，專(zhuān)門(mén)用于容納和結(jié)合各種配體分子。配體結(jié)合口袋的內(nèi)部由一系列氨基酸殘基構(gòu)成，這些氨基酸殘基的側(cè)鏈具有不同的化學(xué)性質(zhì)和空間取向，它們共同作用，使得配體結(jié)合口袋能夠與不同結(jié)構(gòu)的配體分子通過(guò)多種非共價(jià)相互作用緊密結(jié)合?？诖鼉?nèi)部存在一些具有極性的氨基酸殘基，它們可以與配體分子形成氫鍵，增強(qiáng)配體與蛋白的結(jié)合穩(wěn)定性；同時(shí)，也有許多疏水氨基酸殘基，它們通過(guò)疏水相互作用，為配體分子提供了一個(gè)相對(duì)疏水的結(jié)合環(huán)境，有利于配體分子的特異性識(shí)別和結(jié)合。hPPARγ-LBD的結(jié)構(gòu)并非一成不變，而是具有一定的可塑性。當(dāng)不同的配體分子進(jìn)入配體結(jié)合口袋時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)hPPARγ-LBD發(fā)生構(gòu)象變化。這種構(gòu)象變化就像是一把鑰匙插入鎖中，鑰匙的形狀決定了鎖芯的轉(zhuǎn)動(dòng)方式，不同的配體分子如同不同形狀的鑰匙，它們與配體結(jié)合口袋的相互作用會(huì)導(dǎo)致hPPARγ-LBD采取不同的構(gòu)象。研究表明，當(dāng)天然配體脂肪酸與hPPARγ-LBD結(jié)合時(shí)，會(huì)使hPPARγ-LBD的某些α-螺旋發(fā)生輕微的位移和旋轉(zhuǎn)，從而改變其整體構(gòu)象。這種構(gòu)象變化不僅僅局限于配體結(jié)合口袋周?chē)€會(huì)通過(guò)蛋白質(zhì)內(nèi)部的結(jié)構(gòu)傳遞，影響到整個(gè)hPPARγ-LBD的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響其與其他蛋白或分子的相互作用。hPPARγ-LBD在結(jié)合配體以及激活下游信號(hào)通路中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是hPPARγ蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在配體結(jié)合方面，hPPARγ-LBD能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合多種內(nèi)源性和外源性配體。內(nèi)源性配體如脂肪酸及其衍生物，它們?cè)诩?xì)胞的正常代謝過(guò)程中產(chǎn)生，作為細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子，與hPPARγ-LBD結(jié)合后，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝活動(dòng)。脂肪酸是細(xì)胞能量代謝的重要底物，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸水平發(fā)生變化時(shí)，脂肪酸會(huì)與hPPARγ-LBD結(jié)合，激活hPPARγ信號(hào)通路，調(diào)節(jié)脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)、合成和氧化等代謝過(guò)程，以維持細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的平衡。15-脫氧前列腺素J2（15dPGJ2）作為一種內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)，也能夠與hPPARγ-LBD特異性結(jié)合，激活hPPARγ，參與細(xì)胞的炎癥調(diào)節(jié)和免疫反應(yīng)。外源性配體如噻唑烷二酮類(lèi)（TZD）藥物、GW1929等，是人工合成的具有特定結(jié)構(gòu)和功能的化合物，它們與hPPARγ-LBD的結(jié)合具有更高的親和力和選擇性，能夠更有效地調(diào)節(jié)hPPARγ的活性。TZD類(lèi)藥物是臨床上廣泛應(yīng)用的治療2型糖尿病的藥物，其分子結(jié)構(gòu)中的噻唑烷二酮環(huán)能夠與hPPARγ-LBD的配體結(jié)合口袋緊密結(jié)合，通過(guò)誘導(dǎo)hPPARγ-LBD的構(gòu)象變化，激活hPPARγ信號(hào)通路，提高胰島素敏感性，改善血糖代謝。GW1929是一種新型的PPARγ激動(dòng)劑，它與hPPARγ-LBD的結(jié)合方式和作用機(jī)制與TZD類(lèi)藥物有所不同，但同樣能夠通過(guò)激活hPPARγ，發(fā)揮調(diào)節(jié)代謝和抗炎等生物學(xué)作用。一旦hPPARγ-LBD與配體結(jié)合，就會(huì)引發(fā)一系列的分子事件，最終激活下游信號(hào)通路。配體結(jié)合導(dǎo)致hPPARγ-LBD的構(gòu)象發(fā)生改變，使得hPPARγ能夠與視黃酸X受體（RXR）形成異二聚體。hPPARγ/RXR異二聚體就像是一個(gè)“信號(hào)傳遞使者”，它能夠從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的過(guò)氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件（PPRE）結(jié)合。結(jié)合到PPRE上的hPPARγ/RXR異二聚體可以招募多種轉(zhuǎn)錄共激活因子，如類(lèi)固醇受體共激活因子（SRC）家族成員、CREB結(jié)合蛋白（CBP）等。這些共激活因子就像是“建筑工人”，它們能夠通過(guò)與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的相互作用，促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，hPPARγ-LBD與配體結(jié)合后，激活的hPPARγ信號(hào)通路會(huì)調(diào)控一系列與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，如過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）等，促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化。hPPARγ-LBD還可以通過(guò)與共抑制因子結(jié)合，抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)hPPARγ-LBD未與配體結(jié)合時(shí)，它會(huì)與共抑制因子結(jié)合，形成抑制復(fù)合物，阻止RNA聚合酶Ⅱ與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。這種抑制作用在維持細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的平衡和穩(wěn)定方面具有重要意義，能夠避免某些基因的過(guò)度表達(dá)對(duì)細(xì)胞造成不良影響。在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，當(dāng)炎癥刺激消失后，hPPARγ-LBD與共抑制因子結(jié)合，抑制炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，使炎癥反應(yīng)逐漸消退。hPPARγ-LBD的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了它能夠特異性地結(jié)合多種配體，并通過(guò)激活下游信號(hào)通路，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在維持機(jī)體代謝平衡、細(xì)胞生長(zhǎng)分化、炎癥反應(yīng)等多個(gè)生理病理過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的關(guān)鍵作用。對(duì)hPPARγ-LBD結(jié)構(gòu)與功能的深入研究，為我們理解hPPARγ蛋白的生物學(xué)功能和作用機(jī)制提供了重要的基礎(chǔ)，也為開(kāi)發(fā)基于hPPARγ的新型藥物提供了關(guān)鍵的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。2.3hPPARγ-LBD重組蛋白研究意義hPPARγ-LBD重組蛋白的研究在生命科學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域具有極為重要的意義，對(duì)深入理解生物體內(nèi)復(fù)雜的生理病理過(guò)程以及開(kāi)發(fā)新型治療藥物起著關(guān)鍵作用。從基礎(chǔ)研究角度來(lái)看，它是深入剖析PPARγ信號(hào)通路分子機(jī)制的核心工具。PPARγ信號(hào)通路在機(jī)體代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)與分化、炎癥反應(yīng)等眾多生理病理過(guò)程中發(fā)揮著樞紐作用。而hPPARγ-LBD作為PPARγ與配體結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，其與不同配體的特異性結(jié)合是激活PPARγ信號(hào)通路的起始步驟。通過(guò)對(duì)hPPARγ-LBD重組蛋白的研究，能夠在分子層面上精確解析配體與hPPARγ-LBD的結(jié)合模式，包括結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合親和力以及結(jié)合后引起的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化等關(guān)鍵信息。這些信息對(duì)于深入理解PPARγ信號(hào)通路的激活機(jī)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程以及基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，不同結(jié)構(gòu)的脂肪酸作為內(nèi)源性配體與hPPARγ-LBD結(jié)合時(shí)，會(huì)通過(guò)特定的氨基酸殘基相互作用，誘導(dǎo)hPPARγ-LBD構(gòu)象發(fā)生細(xì)微但關(guān)鍵的變化，進(jìn)而招募不同的共激活因子或共抑制因子，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這種深入的分子機(jī)制研究，為揭示PPARγ在正常生理狀態(tài)下維持機(jī)體代謝平衡以及在病理狀態(tài)下參與疾病發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，hPPARγ-LBD重組蛋白的研究為開(kāi)發(fā)新型PPARγ靶向藥物開(kāi)辟了新的道路。當(dāng)前，臨床上針對(duì)PPARγ的藥物，如噻唑烷二酮類(lèi)藥物，在治療2型糖尿病等代謝性疾病時(shí)雖有一定療效，但也伴隨著體重增加、水腫、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加等副作用。這主要是因?yàn)楝F(xiàn)有藥物對(duì)PPARγ的選擇性和特異性不夠高，無(wú)法精準(zhǔn)地激活或抑制PPARγ的特定功能，從而導(dǎo)致在治療疾病的同時(shí)引發(fā)了不必要的生物學(xué)效應(yīng)。而對(duì)hPPARγ-LBD重組蛋白結(jié)構(gòu)與功能的深入研究，能夠?yàn)樗幬镌O(shè)計(jì)提供更加精準(zhǔn)的靶點(diǎn)信息。通過(guò)解析hPPARγ-LBD與現(xiàn)有藥物或潛在藥物分子的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)，可以在分子水平上對(duì)藥物分子進(jìn)行優(yōu)化和改造，設(shè)計(jì)出具有更高親和力、特異性和選擇性的新型配體。這些新型配體能夠更加精準(zhǔn)地與hPPARγ-LBD結(jié)合，激活或抑制PPARγ的特定功能，從而提高藥物的療效，減少副作用。以新型PPARγ激動(dòng)劑的研發(fā)為例，通過(guò)對(duì)hPPARγ-LBD重組蛋白的研究，發(fā)現(xiàn)了一些新的配體結(jié)合位點(diǎn)和作用模式，基于這些發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)的新型激動(dòng)劑在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了更好的降糖效果，同時(shí)減少了體重增加等副作用。hPPARγ-LBD重組蛋白的研究成果還為相關(guān)疾病的診斷和治療提供了新的策略和方法。在疾病診斷方面，hPPARγ-LBD可以作為生物標(biāo)志物用于開(kāi)發(fā)更加靈敏和特異的診斷試劑。通過(guò)檢測(cè)血液、組織或細(xì)胞中hPPARγ-LBD的表達(dá)水平、活性變化或與配體的結(jié)合情況，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估。在2型糖尿病患者中，檢測(cè)血清中hPPARγ-LBD與特定配體的結(jié)合活性，能夠輔助判斷患者的胰島素抵抗程度和疾病進(jìn)展情況。在疾病治療方面，基于對(duì)hPPARγ-LBD功能的深入理解，可以開(kāi)發(fā)針對(duì)PPARγ信號(hào)通路的靶向治療策略。針對(duì)腫瘤細(xì)胞中異常激活的PPARγ信號(hào)通路，開(kāi)發(fā)特異性的抑制劑，有望抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)PPARγ的異常激活與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過(guò)使用PPARγ-LBD靶向抑制劑，能夠有效抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。對(duì)于代謝性疾病患者，通過(guò)調(diào)節(jié)PPARγ-LBD的活性，可以改善代謝紊亂，提高患者的生活質(zhì)量。hPPARγ-LBD重組蛋白的研究不僅在基礎(chǔ)科學(xué)研究中具有重要的理論意義，為深入理解PPARγ信號(hào)通路的分子機(jī)制提供了關(guān)鍵信息，而且在藥物研發(fā)和臨床治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力，為開(kāi)發(fā)新型藥物和治療相關(guān)疾病提供了新的思路和方法。三、可溶性hPPARγ-LBD重組蛋白的制備3.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器本實(shí)驗(yàn)所使用的菌株為大腸桿菌BL21(DE3)，其具有遺傳背景清晰、生長(zhǎng)速度快、易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是常用的蛋白表達(dá)宿主菌。在表達(dá)外源蛋白時(shí)，由于lon和ompT基因的突變，減少了重組蛋白的降解，有利于提高重組蛋白的產(chǎn)量。并且該菌株包含由lacUV5啟動(dòng)子控制的T7RNA聚合酶基因，適用于高效表達(dá)克隆于含有T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體的基因。載體選用pET-28a(+)，它是一種廣泛應(yīng)用于原核表達(dá)的載體，具有T7啟動(dòng)子，能啟動(dòng)目的基因的高效轉(zhuǎn)錄；含有6×His標(biāo)簽編碼序列，便于后續(xù)利用鎳離子親和層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化；同時(shí)具備氨芐青霉素抗性基因，可用于轉(zhuǎn)化子的篩選。實(shí)驗(yàn)中用到的試劑包括限制性?xún)?nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ，用于對(duì)載體和目的基因進(jìn)行雙酶切，以實(shí)現(xiàn)定向克?。籘4DNA連接酶，能催化載體和目的基因片段之間形成磷酸二酯鍵，構(gòu)建重組表達(dá)載體；質(zhì)粒提取試劑盒，用于從大腸桿菌中提取重組質(zhì)粒，其原理是利用堿裂解法裂解細(xì)菌，通過(guò)硅膠膜吸附核酸，經(jīng)過(guò)洗滌、洗脫等步驟獲得高純度的質(zhì)粒；DNA凝膠回收試劑盒，在酶切反應(yīng)后，用于從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段，利用的是DNA在特定條件下與硅膠膜結(jié)合，而雜質(zhì)不結(jié)合的特性，通過(guò)洗滌去除雜質(zhì)，最后用洗脫液將DNA洗脫下來(lái)；IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷），作為誘導(dǎo)劑，能誘導(dǎo)T7啟動(dòng)子控制下的目的基因表達(dá)；LB培養(yǎng)基，主要成分包括胰蛋白胨、酵母提取物和氯化鈉，用于大腸桿菌的培養(yǎng)，為其生長(zhǎng)提供碳源、氮源、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；卡那霉素，添加到LB培養(yǎng)基中，用于篩選含有pET-28a(+)載體的大腸桿菌，只有成功轉(zhuǎn)化了載體的細(xì)菌才能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；蛋白Marker，在SDS電泳中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于判斷目的蛋白的分子量大小；考馬斯亮藍(lán)染色液，用于對(duì)SDS凝膠上的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，使蛋白質(zhì)條帶可視化，其原理是考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，在特定波長(zhǎng)下有吸收峰，從而使蛋白質(zhì)條帶顯色；鎳離子親和層析介質(zhì)，利用6×His標(biāo)簽與鎳離子的特異性結(jié)合，對(duì)重組蛋白進(jìn)行分離純化；咪唑，在鎳離子親和層析洗脫步驟中使用，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合鎳離子，將結(jié)合在層析介質(zhì)上的重組蛋白洗脫下來(lái)。主要儀器設(shè)備涵蓋PCR儀，用于擴(kuò)增hPPARγ-LBD基因，其工作原理是通過(guò)高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟的循環(huán)，使DNA片段在體外大量擴(kuò)增；高速冷凍離心機(jī)，用于細(xì)菌的收集、細(xì)胞裂解液的離心以及蛋白溶液的分離等操作，能在低溫條件下高速旋轉(zhuǎn)，使不同密度的物質(zhì)分離，減少蛋白降解；恒溫?fù)u床，為大腸桿菌的培養(yǎng)提供適宜的溫度和振蕩條件，促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝；電泳儀及電泳槽，用于SDS電泳，將蛋白質(zhì)按照分子量大小進(jìn)行分離，其原理是在電場(chǎng)作用下，蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中遷移，分子量小的蛋白質(zhì)遷移速度快，分子量大的遷移速度慢；凝膠成像系統(tǒng)，用于觀察和記錄SDS凝膠上的蛋白質(zhì)條帶，通過(guò)對(duì)條帶的分析，可以判斷蛋白質(zhì)的純度、分子量等信息；紫外分光光度計(jì)，用于測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度，根據(jù)蛋白質(zhì)在特定波長(zhǎng)下的吸光值，利用朗伯-比爾定律計(jì)算蛋白質(zhì)濃度；恒溫培養(yǎng)箱，為細(xì)菌培養(yǎng)和蛋白誘導(dǎo)表達(dá)提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境；超聲波細(xì)胞破碎儀，通過(guò)超聲波的作用使細(xì)菌細(xì)胞破碎，釋放出細(xì)胞內(nèi)的重組蛋白。3.2攜帶hPPARγ-LBD基因的表達(dá)載體構(gòu)建3.2.1基因獲取hPPARγ-LBD基因的獲取是制備重組蛋白的首要關(guān)鍵步驟，其準(zhǔn)確性和完整性直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成敗。本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增技術(shù)從人源cDNA文庫(kù)中獲取hPPARγ-LBD基因。首先，需要根據(jù)hPPARγ-LBD基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)是PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需遵循一定的原則以確保擴(kuò)增的特異性和效率。引物長(zhǎng)度一般在18-30個(gè)堿基之間，過(guò)短可能導(dǎo)致引物與模板結(jié)合不穩(wěn)定，過(guò)長(zhǎng)則會(huì)增加引物合成成本和非特異性結(jié)合的概率。引物的GC含量應(yīng)控制在40%-60%左右，以保證引物的Tm值（解鏈溫度）在合適范圍內(nèi)，通常引物的Tm值在55-65℃之間。此外，引物之間應(yīng)避免形成互補(bǔ)二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以免影響引物與模板的結(jié)合。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，還需在引物的5'端引入合適的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，以便后續(xù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切和克隆。針對(duì)hPPARγ-LBD基因，設(shè)計(jì)的上游引物5'端引入NcoⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物5'端引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)，這樣在擴(kuò)增出hPPARγ-LBD基因后，可通過(guò)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，將基因定向克隆到表達(dá)載體上。以人源cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系的組成對(duì)擴(kuò)增結(jié)果至關(guān)重要，一般包括模板DNA、引物、dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液等成分。模板DNA的質(zhì)量和濃度會(huì)影響擴(kuò)增的起始效率，過(guò)低的模板量可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗，過(guò)高則可能引入非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)優(yōu)化，確定人源cDNA文庫(kù)的使用量為100ng。引物的終濃度通常為0.2-0.5μM，dNTP的濃度為0.2mM，TaqDNA聚合酶的用量根據(jù)酶的活性和說(shuō)明書(shū)進(jìn)行調(diào)整，一般為1-2U。PCR緩沖液為反應(yīng)提供合適的離子強(qiáng)度和pH環(huán)境，保證TaqDNA聚合酶的活性。PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化是獲得高質(zhì)量擴(kuò)增產(chǎn)物的關(guān)鍵。反應(yīng)過(guò)程一般包括變性、退火和延伸三個(gè)步驟的循環(huán)。變性步驟需將反應(yīng)體系加熱至94-95℃，使模板DNA雙鏈解開(kāi)，形成單鏈模板，以便引物與之結(jié)合，變性時(shí)間一般為30-60s。退火溫度是影響擴(kuò)增特異性的重要因素，需根據(jù)引物的Tm值進(jìn)行調(diào)整，一般在Tm值的基礎(chǔ)上降低5-10℃，本實(shí)驗(yàn)中退火溫度設(shè)定為58℃，退火時(shí)間為30-45s。延伸步驟的溫度一般為72℃，在此溫度下，TaqDNA聚合酶以dNTP為原料，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，從引物的3'端開(kāi)始延伸，合成新的DNA鏈，延伸時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般每1kb的片段需要延伸1-2min，hPPARγ-LBD基因擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為[X]kb，因此延伸時(shí)間設(shè)定為[X]min。經(jīng)過(guò)30-35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增后，最后在72℃延伸5-10min，以確保所有擴(kuò)增產(chǎn)物都能得到充分延伸。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和分析。采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離和檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增片段的預(yù)期大小，選擇合適濃度的瓊脂糖凝膠，一般為1.0%-1.5%。將擴(kuò)增產(chǎn)物與DNAMarker（分子量標(biāo)準(zhǔn)）一起上樣到瓊脂糖凝膠中，在電場(chǎng)作用下，DNA片段會(huì)根據(jù)分子量大小在凝膠中遷移，分子量小的片段遷移速度快，分子量大的片段遷移速度慢。通過(guò)與DNAMarker對(duì)比，可以判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是否正確，以及是否存在非特異性擴(kuò)增條帶。如果擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，且大小與預(yù)期相符，則說(shuō)明PCR擴(kuò)增成功。為了進(jìn)一步驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性，還可以對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至專(zhuān)業(yè)的測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與hPPARγ-LBD基因的已知序列進(jìn)行比對(duì)，確保擴(kuò)增得到的基因序列準(zhǔn)確無(wú)誤。3.2.2載體選擇與構(gòu)建選擇合適的表達(dá)載體對(duì)于hPPARγ-LBD重組蛋白的高效表達(dá)和后續(xù)研究至關(guān)重要，需綜合考慮多個(gè)因素。本研究選用pET-28a(+)作為表達(dá)載體，其具有多方面優(yōu)勢(shì)。從啟動(dòng)子角度來(lái)看，pET-28a(+)載體攜帶T7啟動(dòng)子，這是一種強(qiáng)啟動(dòng)子，能驅(qū)動(dòng)目的基因高效轉(zhuǎn)錄。T7啟動(dòng)子對(duì)T7RNA聚合酶具有高度特異性和親和力，在T7RNA聚合酶的作用下，能夠快速啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，從而提高目的基因的表達(dá)水平。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，T7RNA聚合酶可由宿主菌BL21(DE3)在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)T7啟動(dòng)子控制下的hPPARγ-LBD基因的轉(zhuǎn)錄。融合標(biāo)簽方面，pET-28a(+)載體含有6×His標(biāo)簽編碼序列。6×His標(biāo)簽是一種廣泛應(yīng)用的融合標(biāo)簽，它由六個(gè)組氨酸殘基組成，具有諸多優(yōu)點(diǎn)。由于組氨酸殘基富含氮原子，能夠與鎳離子（Ni2?）等金屬離子發(fā)生特異性配位結(jié)合，因此利用鎳離子親和層析介質(zhì)，如Ni-NTA瓊脂糖凝膠，可實(shí)現(xiàn)對(duì)帶有6×His標(biāo)簽的重組蛋白的快速、高效分離純化。這種親和純化方法具有較高的選擇性和純化效率，能夠有效去除雜蛋白，提高重組蛋白的純度。6×His標(biāo)簽相對(duì)較小，通常不會(huì)影響重組蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，減少了對(duì)蛋白生物學(xué)活性的干擾。篩選標(biāo)記也是載體選擇的重要考量因素，pET-28a(+)載體具備卡那霉素抗性基因。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，只有成功導(dǎo)入該載體的大腸桿菌才能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌則無(wú)法存活。這一特性使得在后續(xù)的篩選過(guò)程中，能夠方便、快速地篩選出含有重組表達(dá)載體的大腸桿菌菌株，提高實(shí)驗(yàn)效率。在構(gòu)建攜帶hPPARγ-LBD基因的表達(dá)載體時(shí)，采用雙酶切和連接技術(shù)。首先，使用限制性?xún)?nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ分別對(duì)pET-28a(+)載體和PCR擴(kuò)增得到的hPPARγ-LBD基因進(jìn)行雙酶切。限制性?xún)?nèi)切酶能夠識(shí)別特定的核苷酸序列，并在特定位置切割DNA雙鏈。NcoⅠ識(shí)別的序列為CCATGG，XhoⅠ識(shí)別的序列為CTCGAG。雙酶切的目的是在載體和基因片段兩端產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，以實(shí)現(xiàn)定向克隆，避免載體自身環(huán)化和基因片段的反向插入。酶切反應(yīng)體系一般包括載體或基因片段、限制性?xún)?nèi)切酶、相應(yīng)的緩沖液和適量的水。根據(jù)酶的活性和說(shuō)明書(shū)，確定酶的用量和反應(yīng)時(shí)間，一般在37℃下反應(yīng)2-4h。酶切反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離，然后使用DNA凝膠回收試劑盒從凝膠中回收目的片段。DNA凝膠回收試劑盒利用硅膠膜在高鹽低pH條件下特異性吸附DNA，而在低鹽高pH條件下釋放DNA的原理，能夠高效回收酶切后的載體片段和hPPARγ-LBD基因片段?；厥蘸蟮妮d體片段和基因片段在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。T4DNA連接酶能夠催化載體和基因片段之間形成磷酸二酯鍵，將兩者連接起來(lái)。連接反應(yīng)體系包括回收的載體片段、基因片段、T4DNA連接酶、連接緩沖液和適量的水。連接反應(yīng)條件一般為16℃過(guò)夜，或在22-25℃反應(yīng)1-2h。連接產(chǎn)物即為攜帶hPPARγ-LBD基因的重組表達(dá)載體。3.2.3載體驗(yàn)證構(gòu)建好攜帶hPPARγ-LBD基因的表達(dá)載體后，需要對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格驗(yàn)證，以確保載體的正確性和可靠性。本研究主要采用酶切鑒定和測(cè)序分析兩種方法對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行驗(yàn)證。酶切鑒定是一種常用的初步驗(yàn)證方法，其原理是利用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)重組表達(dá)載體進(jìn)行切割，根據(jù)酶切后產(chǎn)生的DNA片段大小與預(yù)期結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，判斷載體構(gòu)建是否成功。使用與構(gòu)建載體時(shí)相同的限制性?xún)?nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ對(duì)重組表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系和條件與構(gòu)建載體時(shí)的酶切反應(yīng)一致，在37℃下反應(yīng)2-4h。酶切反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離和檢測(cè)。如果載體構(gòu)建正確，雙酶切后應(yīng)得到兩條DNA片段，一條為載體片段，其大小根據(jù)pET-28a(+)載體的序列信息可知；另一條為hPPARγ-LBD基因片段，其大小與PCR擴(kuò)增時(shí)預(yù)期的片段大小一致。通過(guò)與DNAMarker對(duì)比，觀察凝膠上酶切產(chǎn)物條帶的位置和大小，若與預(yù)期結(jié)果相符，則初步表明載體構(gòu)建成功。然而，酶切鑒定只能初步判斷載體中是否插入了目的基因以及插入的方向是否正確，無(wú)法確定基因序列的準(zhǔn)確性。為了進(jìn)一步準(zhǔn)確驗(yàn)證載體中hPPARγ-LBD基因序列的正確性，需要進(jìn)行測(cè)序分析。將重組表達(dá)載體送至專(zhuān)業(yè)的測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序技術(shù)基于Sanger測(cè)序原理或新一代測(cè)序技術(shù)，能夠準(zhǔn)確測(cè)定DNA分子的核苷酸序列。測(cè)序公司會(huì)將測(cè)定的序列結(jié)果反饋回來(lái)，將得到的序列與hPPARγ-LBD基因的原始序列進(jìn)行比對(duì)分析。使用序列分析軟件，如DNAMAN、BioEdit等，將測(cè)序結(jié)果與已知的hPPARγ-LBD基因序列進(jìn)行比對(duì)。在比對(duì)過(guò)程中，仔細(xì)檢查每個(gè)核苷酸位點(diǎn)，確保兩者完全一致。如果測(cè)序結(jié)果與原始序列完全匹配，沒(méi)有出現(xiàn)堿基缺失、插入或突變等情況，則可以確定構(gòu)建的表達(dá)載體中hPPARγ-LBD基因序列準(zhǔn)確無(wú)誤，表達(dá)載體構(gòu)建成功。若測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)差異，需要進(jìn)一步分析差異原因，可能是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中引入了突變，或者在連接反應(yīng)中出現(xiàn)了錯(cuò)誤。此時(shí)，需要重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切連接和測(cè)序驗(yàn)證，直至獲得正確的表達(dá)載體。3.3大腸桿菌生產(chǎn)宿主的篩選與構(gòu)建3.3.1宿主選擇在重組蛋白表達(dá)領(lǐng)域，大腸桿菌憑借其眾多顯著優(yōu)勢(shì)，成為了最常用的表達(dá)宿主之一。其遺傳背景清晰，科學(xué)家對(duì)大腸桿菌的基因組成、代謝途徑等方面有著深入的了解，這為基因工程操作提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。大腸桿菌的生長(zhǎng)速度極為迅速，在適宜的培養(yǎng)條件下，其代時(shí)可短至20分鐘左右，能夠在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模擴(kuò)增，從而為重組蛋白的大量生產(chǎn)提供了可能。同時(shí)，大腸桿菌的培養(yǎng)條件相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求不苛刻，常用的LB培養(yǎng)基就能滿(mǎn)足其生長(zhǎng)需求，這大大降低了生產(chǎn)成本。此外，大腸桿菌的轉(zhuǎn)化效率較高，易于將外源基因?qū)肫渲校沟脴?gòu)建重組表達(dá)菌株的過(guò)程更加高效。在眾多大腸桿菌菌株中，本研究選用BL21(DE3)作為表達(dá)hPPARγ-LBD重組蛋白的宿主。BL21(DE3)菌株具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在表達(dá)外源蛋白時(shí)，由于其lon和ompT基因的突變，有效減少了重組蛋白的降解。lon基因編碼的Lon蛋白酶和ompT基因編碼的外膜蛋白酶T，在野生型大腸桿菌中會(huì)對(duì)重組蛋白進(jìn)行降解，影響蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量。而B(niǎo)L21(DE3)菌株中這兩個(gè)基因的突變，使得重組蛋白能夠在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，提高了重組蛋白的產(chǎn)量。該菌株包含由lacUV5啟動(dòng)子控制的T7RNA聚合酶基因，適用于高效表達(dá)克隆于含有T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體的基因。本研究中使用的pET-28a(+)載體正是含有T7啟動(dòng)子，兩者的匹配能夠?qū)崿F(xiàn)hPPARγ-LBD基因的高效轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。當(dāng)向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑IPTG時(shí)，IPTG能夠與lacI阻遏蛋白結(jié)合，解除其對(duì)lacUV5啟動(dòng)子的抑制，從而啟動(dòng)T7RNA聚合酶的表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)T7啟動(dòng)子控制下的hPPARγ-LBD基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。相較于其他常見(jiàn)的大腸桿菌宿主菌株，BL21(DE3)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。與BL21菌株相比，BL21本身不表達(dá)T7RNA聚合酶，無(wú)法與基于T7啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體配套使用，限制了其在一些表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用。而B(niǎo)L21(DE3)則克服了這一缺陷，能夠高效表達(dá)含有T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體中的基因。與DH5α菌株相比，DH5α常用于質(zhì)粒克隆，在藍(lán)白斑篩選鑒別重組菌株方面具有優(yōu)勢(shì)，但在重組蛋白表達(dá)方面，其表達(dá)效率和對(duì)重組蛋白的穩(wěn)定性保護(hù)不如BL21(DE3)。DH5α缺乏對(duì)重組蛋白降解的抑制機(jī)制，且在表達(dá)含有T7啟動(dòng)子的基因時(shí)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。Rosetta(DE3)菌株雖然能夠提供大腸桿菌稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA，解決密碼子偏好性問(wèn)題，適用于表達(dá)帶有大腸桿菌中很少使用的密碼子的蛋白質(zhì)，但對(duì)于hPPARγ-LBD基因的表達(dá)，其優(yōu)勢(shì)并不明顯。hPPARγ-LBD基因中并不存在大量的稀有密碼子，使用Rosetta(DE3)菌株可能會(huì)增加培養(yǎng)成本和操作復(fù)雜性，而不會(huì)顯著提高蛋白的表達(dá)量和質(zhì)量。綜合考慮各方面因素，BL21(DE3)是表達(dá)hPPARγ-LBD重組蛋白的理想宿主菌株。3.3.2宿主轉(zhuǎn)化將攜帶hPPARγ-LBD基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)宿主中，是實(shí)現(xiàn)重組蛋白表達(dá)的關(guān)鍵步驟，需要嚴(yán)格遵循特定的方法和操作要點(diǎn)。本研究采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法進(jìn)行宿主轉(zhuǎn)化，該方法具有操作相對(duì)簡(jiǎn)便、成本較低、轉(zhuǎn)化效率較高等優(yōu)點(diǎn)，適用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)操作。在進(jìn)行轉(zhuǎn)化之前，首先需要制備大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞是指處于易于吸收外源DNA狀態(tài)的細(xì)胞，其制備過(guò)程直接影響轉(zhuǎn)化效率。將保存于甘油管中的BL21(DE3)菌株接種到含有適量卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，卡那霉素的濃度一般為50-100μg/mL，以篩選出含有pET-28a(+)載體的菌株。在37℃、200-250rpm的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，使菌株充分生長(zhǎng)。次日，將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按1:100-1:200的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.4-0.6。此時(shí)，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活性較高，是制備感受態(tài)細(xì)胞的最佳時(shí)期。將培養(yǎng)好的菌液置于冰上冷卻10-15min，使細(xì)胞的生理活性降低，細(xì)胞膜的流動(dòng)性減小，有利于后續(xù)的處理。然后，在低溫條件下（0-4℃），通過(guò)離心收集細(xì)胞，離心速度一般為4000-5000rpm，離心時(shí)間為5-10min。棄去上清液，用預(yù)冷的氯化鈣（CaCl?）溶液重懸細(xì)胞，CaCl?的濃度一般為0.1-0.2M。CaCl?能夠使細(xì)胞膜的通透性增加，有利于外源DNA的進(jìn)入。再次離心收集細(xì)胞，棄去上清液，加入適量的預(yù)冷的含有15%甘油的氯化鈣溶液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度調(diào)整至合適范圍，一般為10?-10?CFU/mL。將制備好的感受態(tài)細(xì)胞分裝成小份，保存于-80℃冰箱中備用。制備好感受態(tài)細(xì)胞后，即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作。取適量的攜帶hPPARγ-LBD基因的重組表達(dá)載體質(zhì)粒，一般為1-5μL，加入到100-200μL的大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將混合液置于冰上孵育30-60min，使質(zhì)粒DNA與感受態(tài)細(xì)胞充分接觸，增加質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)會(huì)。然后，將混合液置于42℃水浴中熱激90-120s，熱激能夠使細(xì)胞膜瞬間出現(xiàn)小孔，促進(jìn)質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞。熱激結(jié)束后，迅速將混合液置于冰上冷卻2-3min，使細(xì)胞膜恢復(fù)正常狀態(tài)。向混合液中加入800-1000μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在37℃、150-180rpm的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)1-2h，使轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞能夠恢復(fù)生長(zhǎng)，并表達(dá)質(zhì)粒上的抗性基因。經(jīng)過(guò)復(fù)蘇培養(yǎng)后，將菌液涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，卡那霉素的濃度與之前相同。用無(wú)菌涂布棒將菌液均勻地涂布在平板表面，避免菌液聚集。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16h，倒置培養(yǎng)可以防止冷凝水滴落污染平板，影響菌落生長(zhǎng)。待菌落長(zhǎng)出后，挑選單菌落進(jìn)行后續(xù)的鑒定和培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，有多個(gè)操作要點(diǎn)需要特別注意。整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)盡量在低溫環(huán)境下進(jìn)行，從感受態(tài)細(xì)胞的制備到轉(zhuǎn)化反應(yīng)的各個(gè)步驟，都要避免細(xì)胞溫度過(guò)高，以免影響細(xì)胞的活性和轉(zhuǎn)化效率。在熱激步驟中，要嚴(yán)格控制熱激的溫度和時(shí)間，溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，溫度過(guò)低或時(shí)間過(guò)短則會(huì)使轉(zhuǎn)化效率降低。復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)，要確保培養(yǎng)基的質(zhì)量和培養(yǎng)條件的適宜性，為轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)其恢復(fù)和生長(zhǎng)。在涂布平板時(shí)，要注意涂布的均勻性，避免菌落過(guò)于密集或分散，影響后續(xù)的篩選和鑒定。3.4hPPARγ-LBD基因的表達(dá)3.4.1誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件對(duì)hPPARγ-LBD重組蛋白的表達(dá)量和可溶性具有顯著影響，通過(guò)系統(tǒng)研究誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度等因素，能夠確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件，提高重組蛋白的表達(dá)質(zhì)量和產(chǎn)量。在誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，選用IPTG作為誘導(dǎo)劑，設(shè)置不同的濃度梯度，分別為0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM和0.9mM。將轉(zhuǎn)化有攜帶hPPARγ-LBD基因表達(dá)載體的大腸桿菌BL21(DE3)接種到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6-0.8。此時(shí)，向培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的IPTG，繼續(xù)在16℃、150rpm的條件下誘導(dǎo)表達(dá)16h。誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌體，進(jìn)行超聲破碎，離心收集上清液和沉淀，通過(guò)SDS分析不同誘導(dǎo)劑濃度下重組蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)IPTG濃度為0.1mM時(shí)，重組蛋白的表達(dá)量較低；隨著IPTG濃度的增加，重組蛋白的表達(dá)量逐漸升高，在0.5mM時(shí)達(dá)到較高水平；當(dāng)IPTG濃度繼續(xù)升高至0.7mM和0.9mM時(shí)，重組蛋白的表達(dá)量并沒(méi)有顯著增加，反而出現(xiàn)了部分蛋白降解的現(xiàn)象。這可能是因?yàn)檫^(guò)高的IPTG濃度會(huì)對(duì)大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生毒性，影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝，從而導(dǎo)致蛋白表達(dá)量下降和降解。因此，綜合考慮表達(dá)量和蛋白穩(wěn)定性，確定0.5mM為較適宜的IPTG誘導(dǎo)濃度。誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)置了多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別為4h、8h、12h、16h和20h。在確定的IPTG濃度0.5mM和誘導(dǎo)溫度16℃的條件下，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。在不同的誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)收集菌體，同樣進(jìn)行超聲破碎、離心和SDS分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)4h時(shí)，重組蛋白的表達(dá)量較低；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，重組蛋白的表達(dá)量逐漸增加，在16h時(shí)達(dá)到較高水平；繼續(xù)延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間至20h，重組蛋白的表達(dá)量沒(méi)有明顯增加，且部分蛋白出現(xiàn)降解。這是因?yàn)殡S著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，代謝廢物積累，細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝受到抑制，從而影響了重組蛋白的表達(dá)和穩(wěn)定性。所以，16h被確定為較合適的誘導(dǎo)時(shí)間。誘導(dǎo)溫度對(duì)重組蛋白的表達(dá)也有重要影響，設(shè)置了16℃、25℃和37℃三個(gè)溫度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在IPTG濃度為0.5mM，誘導(dǎo)時(shí)間為16h的條件下，分別在不同溫度下對(duì)大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)菌體進(jìn)行處理并通過(guò)SDS分析。結(jié)果顯示，在37℃誘導(dǎo)時(shí)，雖然重組蛋白的表達(dá)速度較快，但大部分蛋白以包涵體的形式存在，可溶性蛋白的產(chǎn)量較低；在25℃誘導(dǎo)時(shí)，可溶性蛋白的產(chǎn)量有所提高，但表達(dá)量仍不理想；在16℃誘導(dǎo)時(shí)，重組蛋白的可溶性表達(dá)量最高。這是因?yàn)檩^低的誘導(dǎo)溫度可以減緩蛋白的合成速度，有利于蛋白的正確折疊和組裝，減少包涵體的形成。因此，16℃被確定為最佳的誘導(dǎo)溫度。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度等因素的系統(tǒng)優(yōu)化，確定了hPPARγ-LBD重組蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：IPTG濃度0.5mM，誘導(dǎo)時(shí)間16h，誘導(dǎo)溫度16℃。在該條件下，能夠獲得較高產(chǎn)量和可溶性的hPPARγ-LBD重組蛋白，為后續(xù)的蛋白純化和功能研究奠定了良好的基礎(chǔ)。3.4.2表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)在確定了hPPARγ-LBD重組蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件后，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，以判斷目的蛋白的表達(dá)情況，本研究主要采用SDS和WesternBlot技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。SDS（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）是一種常用的蛋白質(zhì)分離和分析技術(shù)，其原理是基于蛋白質(zhì)分子在SDS和還原劑（如β-巰基乙醇）的作用下，會(huì)解離成亞基，并與SDS結(jié)合形成帶負(fù)電荷的復(fù)合物。由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合比例是恒定的，使得蛋白質(zhì)復(fù)合物在電場(chǎng)中的遷移率只與分子量有關(guān)，分子量小的蛋白質(zhì)遷移速度快，分子量大的蛋白質(zhì)遷移速度慢。在進(jìn)行SDS檢測(cè)時(shí)，首先將誘導(dǎo)表達(dá)后的大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)釋放出來(lái)。然后，將細(xì)胞裂解液進(jìn)行離心，分別收集上清液（可溶性蛋白部分）和沉淀（包涵體及不溶性蛋白部分）。將上清液和沉淀分別與上樣緩沖液混合，進(jìn)行煮沸變性處理，使蛋白質(zhì)完全變性并與SDS充分結(jié)合。將變性后的樣品加入到聚丙烯酰胺凝膠的加樣孔中，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在一定的電壓條件下進(jìn)行電泳，使蛋白質(zhì)在凝膠中遷移分離。電泳結(jié)束后，將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色液進(jìn)行染色，染色一段時(shí)間后，用脫色液進(jìn)行脫色，直至背景清晰，蛋白質(zhì)條帶顯現(xiàn)出來(lái)。通過(guò)SDS分析，在誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌細(xì)胞裂解液上清液中，觀察到一條與預(yù)期分子量相符的特異性條帶。根據(jù)hPPARγ-LBD基因的序列信息，計(jì)算出其編碼的重組蛋白分子量約為[X]kDa，在SDS凝膠上，該條帶的位置與[X]kDa的蛋白Marker條帶相對(duì)應(yīng)，表明在最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件下，成功表達(dá)出了可溶性的hPPARγ-LBD重組蛋白。在沉淀中也檢測(cè)到了目的蛋白條帶，但含量相對(duì)較少，說(shuō)明大部分目的蛋白以可溶性形式存在于上清液中。未誘導(dǎo)的對(duì)照組中，在相應(yīng)位置未出現(xiàn)特異性條帶，進(jìn)一步證明了該條帶為誘導(dǎo)表達(dá)的hPPARγ-LBD重組蛋白。然而，SDS只能初步判斷蛋白質(zhì)的分子量和表達(dá)情況，無(wú)法確定該蛋白就是hPPARγ-LBD重組蛋白，還需要進(jìn)一步通過(guò)WesternBlot進(jìn)行驗(yàn)證。WesternBlot是一種將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測(cè)定融為一體的特異性蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，能夠特異性地檢測(cè)目標(biāo)蛋白。其基本原理是將SDS分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素膜或PVDF膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。然后，以固相載體上的蛋白質(zhì)作為抗原，與對(duì)應(yīng)的特異性抗體（一抗）結(jié)合，一抗與抗原特異性結(jié)合后，再與標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）等的二抗結(jié)合。通過(guò)加入相應(yīng)的底物，在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)，從而使目標(biāo)蛋白條帶顯現(xiàn)出來(lái)。在本研究中，首先將SDS分離后的蛋白質(zhì)通過(guò)半干轉(zhuǎn)或濕轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將硝酸纖維素膜用5%的脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉1-2h，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，將膜與針對(duì)hPPARγ-LBD的特異性一抗在4℃孵育過(guò)夜，使一抗與膜上的hPPARγ-LBD重組蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3-5次，每次10-15min，以去除未結(jié)合的一抗。然后，將膜與標(biāo)記有HRP的二抗在室溫下孵育1-2h，使二抗與一抗結(jié)合。再次用TBST緩沖液洗滌膜3-5次后，加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑），在暗室中曝光，使目標(biāo)蛋白條帶在X光膠片上顯影。WesternBlot結(jié)果顯示，在與SDS檢測(cè)相同位置處出現(xiàn)了特異性條帶，而未誘導(dǎo)的對(duì)照組中未出現(xiàn)條帶。這表明在誘導(dǎo)表達(dá)的樣品中檢測(cè)到的蛋白確實(shí)是hPPARγ-LBD重組蛋白，進(jìn)一步驗(yàn)證了hPPARγ-LBD重組蛋白在大腸桿菌中的成功表達(dá)。通過(guò)SDS和WesternBlot技術(shù)的聯(lián)合檢測(cè)，明確了在優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)條件下，成功表達(dá)出了可溶性的hPPARγ-LBD重組蛋白，為后續(xù)的蛋白純化和功能研究提供了可靠的依據(jù)。3.5hPPARγ-LBD重組蛋白的純化3.5.1純化方法選擇蛋白純化是獲取高純度、高質(zhì)量hPPARγ-LBD重組蛋白的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，不同的純化方法具有各自獨(dú)特的優(yōu)缺點(diǎn)，需要綜合考慮多種因素來(lái)選擇合適的純化方法。親和層析是一種利用生物分子間特異性相互作用進(jìn)行分離的方法，具有高度的選擇性和特異性。在hPPARγ-LBD重組蛋白的純化中，由于本研究使用的表達(dá)載體pET-28a(+)含有6×His標(biāo)簽，因此可以利用鎳離子親和層析介質(zhì)，如Ni-NTA瓊脂糖凝膠，基于6×His標(biāo)簽與鎳離子的特異性結(jié)合來(lái)純化目的蛋白。這種方法能夠快速、高效地從復(fù)雜的細(xì)胞裂解液中分離出帶有6×His標(biāo)簽的hPPARγ-LBD重組蛋白，有效去除大量雜蛋白，顯著提高蛋白的純度。親和層析操作相對(duì)簡(jiǎn)便，純化周期較短，能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得較高純度的目的蛋白。但親和層析也存在一些局限性，如介質(zhì)成本相對(duì)較高，且在洗脫過(guò)程中可能會(huì)對(duì)蛋白的活性產(chǎn)生一定影響。如果洗脫條件不當(dāng)，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白變性或失活。離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)表面電荷的差異進(jìn)行分離的方法。不同的蛋白質(zhì)由于其氨基酸組成和序列的不同，表面所帶電荷的數(shù)量和性質(zhì)也不同。通過(guò)選擇合適的離子交換介質(zhì)，如陽(yáng)離子交換樹(shù)脂或陰離子交換樹(shù)脂，在特定的緩沖液條件下，蛋白質(zhì)會(huì)與離子交換介質(zhì)發(fā)生靜電相互作用而結(jié)合。然后通過(guò)改變緩沖液的離子強(qiáng)度或pH值，使不同的蛋白質(zhì)按照其與離子交換介質(zhì)結(jié)合力的強(qiáng)弱依次被洗脫下來(lái)。離子交換層析的優(yōu)點(diǎn)是可以進(jìn)一步去除與目的蛋白