CUL4BE3泛素連接酶對HBV復(fù)制的調(diào)控機制解析一、引言1.1研究背景與意義1.1.1HBV感染現(xiàn)狀與危害乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus，HBV）感染是一個嚴峻的全球公共衛(wèi)生問題。世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布的《2024年全球肝炎報告》顯示，2022年全球約有2.54億人感染乙肝，每天有3500人死于乙肝和丙肝感染，其中乙肝死亡率呈上升趨勢，從2019年的82萬人增加到2022年的110萬人。在我國，乙肝病毒感染負擔(dān)也極為沉重，據(jù)估計目前依然有超過8000萬乙肝病毒攜帶者，其中約3000萬例被確診為慢性乙型肝炎患者。HBV感染人體后，若未得到有效控制，會引發(fā)一系列嚴重的健康問題。HBV持續(xù)感染可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥，進而引發(fā)肝纖維化，隨著病情進展，最終發(fā)展為肝硬化。肝硬化患者不僅肝功能嚴重受損，還面臨著諸如腹水、食管靜脈曲張破裂出血等嚴重并發(fā)癥的威脅，嚴重影響生活質(zhì)量和生存預(yù)期。更為嚴重的是，HBV感染是肝細胞癌（HCC）發(fā)生的重要病原學(xué)及疾病進展因素，中國84%的肝癌由HBV感染導(dǎo)致，在高發(fā)地區(qū)，80%以上的肝癌與HBV有關(guān)。臨床統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，80%的肝癌患者多由乙肝病毒感染，慢性持續(xù)化造成損傷后出現(xiàn)。這些疾病不僅給患者帶來身體上的痛苦和精神上的折磨，也給家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。深入研究HBV的復(fù)制機制，對于開發(fā)更加有效的治療方法，阻斷HBV感染向肝硬化、肝癌的進展，降低相關(guān)疾病的發(fā)病率和死亡率，改善患者的預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。這不僅有助于提高患者的生活質(zhì)量，延長患者的生命，也對減輕社會醫(yī)療負擔(dān)、促進公共衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展具有深遠的影響。1.1.2CUL4BE3泛素連接酶的生物學(xué)功能概述CUL4B（Cullin4B）是一種E3泛素連接酶復(fù)合物的核心成員，在細胞的生命活動中扮演著多面手的角色。在細胞凋亡過程中，CUL4B參與調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的泛素化修飾，進而影響細胞凋亡的進程。當(dāng)細胞受到外界刺激或內(nèi)部信號改變時，CUL4B可通過識別特定的凋亡相關(guān)蛋白，將泛素分子連接到這些蛋白上，標記它們以便被蛋白酶體識別和降解，從而決定細胞是否走向凋亡。在細胞周期調(diào)控方面，CUL4B也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。細胞周期的有序進行對于細胞的正常增殖和分化至關(guān)重要，CUL4B能夠調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的穩(wěn)定性和活性。例如，它可以通過泛素化修飾某些細胞周期蛋白，促進或抑制細胞從一個周期階段進入下一個階段，確保細胞周期的精準調(diào)控，維持細胞的正常生長和分裂。DNA損傷反應(yīng)也是CUL4B發(fā)揮作用的重要領(lǐng)域。當(dāng)DNA受到損傷時，CUL4B迅速響應(yīng)，參與DNA損傷修復(fù)途徑。它可以與DNA修復(fù)因子相互作用，促進修復(fù)蛋白在損傷位點的募集和組裝，加速DNA損傷的修復(fù)過程，保證基因組的穩(wěn)定性，減少基因突變和染色體畸變的發(fā)生，降低細胞癌變的風(fēng)險。CUL4B還在DNA復(fù)制過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，它協(xié)助調(diào)控DNA復(fù)制相關(guān)蛋白的功能，確保DNA復(fù)制的準確性和高效性，為細胞的正常分裂和遺傳信息的穩(wěn)定傳遞奠定基礎(chǔ)。1.1.3研究CUL4BE3泛素連接酶調(diào)控HBV復(fù)制機制的科學(xué)意義HBV感染相關(guān)疾病的治療目前仍面臨諸多挑戰(zhàn)，現(xiàn)有治療手段雖能在一定程度上抑制病毒復(fù)制，但難以實現(xiàn)徹底治愈，患者往往需要長期甚至終身治療，且存在耐藥、復(fù)發(fā)等問題。研究CUL4BE3泛素連接酶對HBV復(fù)制的調(diào)控機制，有望為HBV感染相關(guān)疾病的治療開辟新的道路。從理論層面來看，深入探究CUL4B與HBV復(fù)制之間的聯(lián)系，有助于揭示HBV感染的分子生物學(xué)本質(zhì)，豐富我們對病毒與宿主細胞相互作用機制的認識。這不僅能夠完善病毒學(xué)的基礎(chǔ)理論，還可能發(fā)現(xiàn)新的病毒復(fù)制調(diào)控靶點，為后續(xù)的研究提供全新的方向和思路。在臨床應(yīng)用方面，明確CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制的機制，能夠為開發(fā)新型抗病毒藥物提供堅實的理論依據(jù)。通過針對CUL4B及其相關(guān)信號通路設(shè)計特異性的抑制劑或激活劑，有望實現(xiàn)對HBV復(fù)制的精準干預(yù)，提高治療效果，降低藥物副作用。這將為HBV感染患者帶來新的治療希望，改善他們的治療體驗和預(yù)后，對全球公共衛(wèi)生事業(yè)產(chǎn)生積極而深遠的影響。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1HBV復(fù)制機制的研究進展HBV的復(fù)制過程是一個復(fù)雜且精細的分子生物學(xué)事件，涉及多個關(guān)鍵步驟，一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的重點。在病毒入侵環(huán)節(jié)，?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運多肽（NTCP）被確定為HBV的功能性受體，這一發(fā)現(xiàn)極大地推動了對HBV進入肝細胞機制的理解。研究表明，HBV表面抗原（HBsAg）的preS1區(qū)域能夠與NTCP特異性結(jié)合，介導(dǎo)病毒的內(nèi)吞進入細胞。進入細胞后，HBV松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）被轉(zhuǎn)運至細胞核，在宿主細胞相關(guān)因子的作用下轉(zhuǎn)化為共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），cccDNA作為HBV復(fù)制的模板，可轉(zhuǎn)錄出多種病毒RNA，包括前基因組RNA（pgRNA）。pgRNA被包裹進核心顆粒后，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄為DNA，同時合成的病毒DNA聚合酶也參與其中，最終形成成熟的rcDNA，組裝成新的病毒顆粒釋放。在HBV復(fù)制的調(diào)控方面，宿主細胞內(nèi)的多種信號通路和轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著重要作用。例如，NF-κB信號通路的激活可以促進HBV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，該信號通路中的關(guān)鍵蛋白通過與HBV基因組上的特定調(diào)控元件結(jié)合，增強病毒基因的表達。而干擾素（IFN）信號通路則具有抑制HBV復(fù)制的作用，IFN通過激活一系列下游效應(yīng)分子，干擾HBV的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及病毒顆粒的組裝和釋放。此外，一些微小RNA（miRNA）也被發(fā)現(xiàn)參與HBV復(fù)制的調(diào)控，如miR-122可以通過與HBVpgRNA的特定區(qū)域結(jié)合，影響其穩(wěn)定性和翻譯效率，進而調(diào)控病毒復(fù)制。1.2.2CUL4BE3泛素連接酶功能的研究成果CUL4B作為E3泛素連接酶復(fù)合物的核心成分，其功能研究在國內(nèi)外取得了豐富的成果。在細胞周期調(diào)控方面，CUL4B通過泛素化修飾細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑p21，調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性和活性，進而影響細胞周期的進程。當(dāng)細胞受到外界刺激或內(nèi)部信號改變時，CUL4B被激活，將泛素分子連接到p21上，標記其被蛋白酶體降解，使得細胞能夠順利通過細胞周期檢查點，進入下一個階段。在DNA損傷修復(fù)領(lǐng)域，CUL4B參與了多種修復(fù)途徑。在核苷酸切除修復(fù)（NER）過程中，CUL4B與XPC等修復(fù)蛋白相互作用，促進它們在DNA損傷位點的募集和組裝，加速損傷DNA的修復(fù)。在雙鏈斷裂修復(fù)中，CUL4B通過與DNA-PKcs等關(guān)鍵蛋白結(jié)合，參與非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)途徑，確保斷裂的DNA末端能夠準確連接，維持基因組的穩(wěn)定性。CUL4B還在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。在胚胎發(fā)育過程中，CUL4B基因的缺失會導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常，影響多個器官系統(tǒng)的正常形成和功能。在腫瘤研究中，CUL4B被發(fā)現(xiàn)高表達于多種腫瘤組織中，如乳腺癌、肺癌等，通過促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，推動腫瘤的發(fā)展。1.2.3CUL4BE3泛素連接酶與HBV復(fù)制關(guān)聯(lián)的研究現(xiàn)狀目前，關(guān)于CUL4BE3泛素連接酶與HBV復(fù)制關(guān)聯(lián)的研究尚處于起步階段，但已取得了一些初步成果。有研究發(fā)現(xiàn)，在HBV感染的細胞模型中，CUL4B的表達水平發(fā)生了顯著變化，提示CUL4B可能參與了HBV感染過程。進一步的實驗表明，干擾CUL4B的表達可以影響HBV的復(fù)制水平，過表達CUL4B則會促進HBV的復(fù)制，初步證實了CUL4B對HBV復(fù)制具有調(diào)控作用。然而，CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制的具體分子機制仍不明確。在已知的研究中，對于CUL4B通過何種底物蛋白或信號通路來影響HBV復(fù)制，尚未有清晰的闡述。同時，CUL4B與HBV之間的相互作用是否存在細胞特異性，以及這種相互作用在不同HBV基因型中的差異，也有待進一步探究。這些研究空白限制了我們對HBV感染機制的深入理解，也為開發(fā)基于CUL4B的新型抗HBV治療策略帶來了阻礙。1.3研究目的與內(nèi)容1.3.1研究目的本研究旨在深入探究CUL4BE3泛素連接酶調(diào)控HBV復(fù)制的分子機制，明確CUL4B在HBV感染過程中的具體作用及相關(guān)信號通路，為開發(fā)新型抗HBV治療策略提供堅實的理論基礎(chǔ)和潛在的治療靶點。通過揭示CUL4B與HBV之間的相互作用關(guān)系，期望能夠突破現(xiàn)有HBV治療的困境，為解決HBV感染相關(guān)疾病這一全球性公共衛(wèi)生難題提供新的思路和方法，最終改善患者的治療效果和預(yù)后。1.3.2研究內(nèi)容確定CUL4B與HBV復(fù)制的相關(guān)性：收集乙肝病人及HBV感染的小鼠肝臟樣本，運用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)精確檢測CUL4B的mRNA表達水平，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）準確測定CUL4B的蛋白表達水平。同時，通過檢測樣本中HBVDNA含量、HBV表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）的表達，全面評估HBV的復(fù)制情況。運用統(tǒng)計學(xué)方法深入分析CUL4B表達水平與HBV復(fù)制指標之間的相關(guān)性，從而明確CUL4B是否對HBV復(fù)制具有調(diào)控作用。探究CUL4B對HBV復(fù)制的調(diào)控機制：利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，設(shè)計并合成針對CUL4B基因的小干擾RNA（siRNA），將其轉(zhuǎn)染至HBV感染的細胞模型中，特異性地抑制CUL4B的表達。運用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建CUL4B基因敲除的細胞模型，從基因?qū)用鎻氐紫鼵UL4B的表達。通過檢測HBV復(fù)制相關(guān)指標，如HBVDNA合成、pgRNA轉(zhuǎn)錄以及病毒蛋白表達等，深入探究CUL4B對HBV復(fù)制過程的具體影響。進一步采用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)，篩選與CUL4B相互作用的蛋白，結(jié)合質(zhì)譜分析鑒定這些蛋白，明確CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制的關(guān)鍵底物蛋白。通過對相關(guān)信號通路中關(guān)鍵蛋白的活性和表達水平進行檢測，揭示CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制的分子信號通路。分析CUL4B對肝臟免疫微環(huán)境的影響：構(gòu)建CUL4B基因敲除的小鼠模型，利用該模型感染HBV，模擬體內(nèi)HBV感染的真實情況。運用流式細胞術(shù)精確分析肝臟中免疫細胞，如巨噬細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）、T淋巴細胞等的數(shù)量、比例和活化狀態(tài)的變化，全面評估CUL4B對肝臟免疫細胞的影響。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)檢測肝臟組織中細胞因子和趨化因子的表達水平，深入探究CUL4B對肝臟免疫微環(huán)境中炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的影響。通過免疫組化和免疫熒光技術(shù)，觀察肝臟組織中免疫細胞的浸潤和分布情況，直觀地了解CUL4B對肝臟免疫微環(huán)境的整體影響。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法分子生物學(xué)技術(shù)：實時熒光定量PCR（RT-qPCR）：用于檢測CUL4B、HBV相關(guān)基因（如HBVDNA、pgRNA等）的mRNA表達水平。通過設(shè)計特異性引物，提取細胞或組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行PCR擴增，利用熒光信號實時監(jiān)測擴增過程，從而精確測定基因表達量的變化，以評估CUL4B對HBV基因轉(zhuǎn)錄的影響。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）：測定CUL4B及HBV相關(guān)蛋白（如HBsAg、HBeAg、核心蛋白等）的表達水平。將細胞或組織裂解，提取總蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后用特異性抗體進行免疫雜交，利用化學(xué)發(fā)光或顯色底物檢測目的蛋白條帶，根據(jù)條帶的強弱判斷蛋白表達量的高低。免疫共沉淀（Co-IP）：篩選與CUL4B相互作用的蛋白。將細胞裂解液與特異性抗CUL4B抗體孵育，形成抗體-抗原復(fù)合物，再加入ProteinA/G磁珠或瓊脂糖珠，使復(fù)合物沉淀下來，經(jīng)過洗滌去除非特異性結(jié)合的蛋白，最后通過洗脫得到與CUL4B相互作用的蛋白，結(jié)合質(zhì)譜分析鑒定這些蛋白，為揭示CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制的分子機制提供線索。RNA干擾（RNAi）：設(shè)計并合成針對CUL4B基因的小干擾RNA（siRNA），通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方法將其導(dǎo)入HBV感染的細胞模型中，特異性地抑制CUL4B的表達。利用RT-qPCR和Westernblot檢測干擾效率，觀察CUL4B表達降低后對HBV復(fù)制相關(guān)指標的影響，從而明確CUL4B在HBV復(fù)制中的作用。CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)：構(gòu)建針對CUL4B基因的CRISPR-Cas9表達載體，轉(zhuǎn)染至細胞中，通過Cas9核酸酶切割CUL4B基因的特定序列，實現(xiàn)基因敲除。利用基因測序驗證敲除效果，建立CUL4B基因敲除的細胞模型，進一步研究CUL4B缺失對HBV復(fù)制及相關(guān)信號通路的影響。免疫學(xué)技術(shù)：酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）：檢測血清或細胞培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg等HBV抗原以及肝臟組織中細胞因子和趨化因子的表達水平。將特異性抗體包被在酶標板上，加入樣本和酶標記的二抗，形成抗原-抗體-酶標二抗復(fù)合物，加入底物后，酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，通過酶標儀測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣本中目標分子的含量。流式細胞術(shù)：分析肝臟中免疫細胞（如巨噬細胞、NK細胞、T淋巴細胞等）的數(shù)量、比例和活化狀態(tài)。用熒光標記的特異性抗體標記免疫細胞表面的標志物，通過流式細胞儀檢測細胞的熒光強度，從而對不同類型的免疫細胞進行分類和定量分析，評估CUL4B對肝臟免疫細胞的影響。免疫組化和免疫熒光技術(shù)：觀察肝臟組織中免疫細胞的浸潤和分布情況以及CUL4B和HBV相關(guān)蛋白的表達定位。將肝臟組織切片，用特異性抗體進行免疫染色，通過顯微鏡觀察標記物的分布和定位，直觀地了解CUL4B對肝臟免疫微環(huán)境的影響以及HBV在肝臟組織中的感染和復(fù)制情況。動物實驗技術(shù)：構(gòu)建CUL4B基因敲除的小鼠模型，利用該模型感染HBV，模擬體內(nèi)HBV感染的真實情況。定期采集小鼠的血液和肝臟組織樣本，檢測HBV復(fù)制指標、肝臟免疫細胞的變化以及肝臟組織的病理變化，全面評估CUL4B在體內(nèi)對HBV復(fù)制和肝臟免疫微環(huán)境的影響。1.4.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：樣本采集：收集乙肝病人及HBV感染的小鼠肝臟樣本，同時采集健康對照樣本。對病人樣本詳細記錄臨床資料，包括病情嚴重程度、治療史等。細胞實驗：將HBV感染細胞模型分為對照組、干擾CUL4B表達組（轉(zhuǎn)染CUL4BsiRNA）和過表達CUL4B組（轉(zhuǎn)染CUL4B表達載體）。采用RT-qPCR和Westernblot檢測各組細胞中CUL4B的表達水平，驗證干擾和過表達效果。檢測各組細胞中HBV復(fù)制相關(guān)指標，如HBVDNA含量、pgRNA轉(zhuǎn)錄水平、HBsAg和HBeAg蛋白表達水平等。利用Co-IP篩選與CUL4B相互作用的蛋白，結(jié)合質(zhì)譜分析鑒定蛋白。檢測相關(guān)信號通路中關(guān)鍵蛋白的活性和表達水平，如磷酸化水平等。動物實驗：構(gòu)建CUL4B基因敲除小鼠模型，經(jīng)基因測序驗證。將小鼠分為野生型對照組、野生型感染HBV組、CUL4B基因敲除組、CUL4B基因敲除感染HBV組。對感染HBV的小鼠通過尾靜脈注射等方式接種HBV。定期采集小鼠血液和肝臟組織樣本。采用ELISA檢測血液中HBsAg、HBeAg水平。利用流式細胞術(shù)分析肝臟中免疫細胞的數(shù)量、比例和活化狀態(tài)。采用免疫組化和免疫熒光觀察肝臟組織中免疫細胞浸潤和分布情況。進行肝臟組織病理切片觀察肝臟病理變化。數(shù)據(jù)分析：對細胞實驗和動物實驗的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，如采用t檢驗、方差分析等方法比較各組間差異，明確CUL4B對HBV復(fù)制和肝臟免疫微環(huán)境的影響，總結(jié)CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制的分子機制。[此處插入技術(shù)路線圖，圖題：CUL4BE3泛素連接酶調(diào)控HBV復(fù)制的分子機制研究技術(shù)路線圖，圖中清晰展示樣本采集、細胞實驗、動物實驗和數(shù)據(jù)分析的流程和關(guān)鍵步驟，各步驟之間用箭頭連接，注明主要實驗方法和檢測指標]二、CUL4BE3泛素連接酶與HBV復(fù)制的相關(guān)性研究2.1乙肝病人及HBV感染小鼠肝臟樣本分析2.1.1樣本收集與處理乙肝病人肝臟樣本收集：與當(dāng)?shù)蒯t(yī)院合作，選取50例經(jīng)臨床確診的慢性乙型肝炎患者，其中男性30例，女性20例，年齡范圍在25-60歲之間。在患者進行肝臟穿刺活檢或手術(shù)切除部分肝臟組織時，嚴格遵循無菌操作原則，采集約0.5-1g的肝臟樣本。同時，詳細記錄患者的臨床資料，包括病史、病程、肝功能指標、HBVDNA載量、HBsAg和HBeAg表達情況等。HBV感染小鼠肝臟樣本制備：選用6-8周齡的C57BL/6小鼠，通過尾靜脈注射HBV病毒懸液（病毒滴度為1×10^8copies/mL，注射體積為100μL）建立HBV感染小鼠模型。在感染后第4周、8周和12周，分別隨機選取10只小鼠，采用頸椎脫臼法處死，迅速取出肝臟，用預(yù)冷的PBS沖洗3次，去除血液等雜質(zhì)，取約0.5g肝臟組織備用。同時，設(shè)立正常對照組小鼠，同樣數(shù)量和處理方式，僅注射等量的生理鹽水。RNA提?。簩⑹占母闻K組織樣本放入含有1mLTRIzol試劑的無RNA酶EP管中，使用組織勻漿器充分研磨，使組織完全裂解。按照TRIzol試劑說明書進行操作，依次加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，4℃下12000g離心15分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入500μL異丙醇，顛倒混勻，4℃下12000g離心10分鐘，棄上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，晾干后加入50μL無RNA酶水溶解RNA，測定RNA濃度和純度，-80℃保存?zhèn)溆谩５鞍滋崛。簩⒏闻K組織樣本置于含有RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）的EP管中，用組織勻漿器充分勻漿，冰上裂解30分鐘，期間每隔5分鐘渦旋振蕩一次。4℃下12000g離心15分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)測定結(jié)果加入適量的5×SDS上樣緩沖液，煮沸變性5分鐘，-20℃保存?zhèn)溆谩?.1.2CUL4B表達水平檢測定量PCR檢測CUL4BmRNA表達水平：以提取的RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系包括5×PrimeScriptBuffer2μL，PrimeScriptRTEnzymeMix0.5μL，OligodTPrimer（50μM）0.5μL，Random6mers（100μM）1μL，RNA模板1μg，RNaseFree水補足至10μL。反應(yīng)條件為37℃15分鐘，85℃5秒。以cDNA為模板進行定量PCR擴增，反應(yīng)體系包括2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH2O補足至20μL。CUL4B上游引物序列為5'-ATGCCCTACAGCCACATCAA-3'，下游引物序列為5'-CTCCAGCTTCCTCTTCTGGT-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列為5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3'，下游引物序列為5'-GAGGTCAATGAAGGGGTCG-3'。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火延伸30秒，共40個循環(huán)。采用2^-ΔΔCt法計算CUL4BmRNA的相對表達量。Westernblot檢測CUL4B蛋白表達水平：取適量變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為恒流200mA，轉(zhuǎn)膜時間90分鐘。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時，封閉后用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。加入兔抗鼠CUL4B一抗（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，加入HRP標記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時，再次用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。使用化學(xué)發(fā)光底物進行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以β-actin為內(nèi)參，采用ImageJ軟件分析CUL4B蛋白條帶的灰度值，計算CUL4B蛋白的相對表達量。2.1.3HBV復(fù)制指標檢測HBVDNA含量檢測：采用實時熒光定量PCR法檢測肝臟樣本中的HBVDNA含量。使用DNA提取試劑盒提取肝臟組織中的總DNA，按照試劑盒說明書進行操作。以提取的DNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增，反應(yīng)體系包括2×HBVPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，探針（10μM）0.2μL，DNA模板1μL，ddH2O補足至20μL。HBVDNA上游引物序列為5'-CCAACATCACCTCCCAAGTA-3'，下游引物序列為5'-CTGGTCTAGTGTGGGCTTGT-3'，探針序列為5'-FAM-CCAGCAGCCCTGCGTCCTTCT-TAMRA-3'。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火延伸30秒，共40個循環(huán)。根據(jù)標準曲線計算HBVDNA的拷貝數(shù)。HBsAg和HBeAg檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清和肝臟組織勻漿上清中的HBsAg和HBeAg表達水平。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，將包被有特異性抗體的酶標板加入樣本和酶標記的二抗，孵育后加入底物顯色，用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣本中HBsAg和HBeAg的含量。2.2相關(guān)性數(shù)據(jù)分析2.2.1數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法選擇本研究選用Pearson相關(guān)分析方法來深入剖析CUL4B表達與HBV復(fù)制指標間的相關(guān)性。Pearson相關(guān)分析是一種廣泛應(yīng)用于衡量兩個連續(xù)變量之間線性相關(guān)程度的統(tǒng)計方法，適用于數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布的情況。在本研究中，CUL4B的mRNA表達水平、蛋白表達水平以及HBVDNA含量、HBsAg和HBeAg表達水平等指標均為連續(xù)型變量，且通過正態(tài)性檢驗（如Shapiro-Wilk檢驗），確認這些數(shù)據(jù)基本符合正態(tài)分布，因此Pearson相關(guān)分析能夠準確地評估它們之間的相關(guān)性。在進行Pearson相關(guān)分析時，首先計算CUL4B表達水平與各HBV復(fù)制指標之間的相關(guān)系數(shù)r。r的取值范圍在-1到1之間，當(dāng)r>0時，表示兩個變量呈正相關(guān)，即一個變量增加，另一個變量也隨之增加；當(dāng)r<0時，表示兩個變量呈負相關(guān)，即一個變量增加，另一個變量則減少；當(dāng)r=0時，表示兩個變量之間不存在線性相關(guān)關(guān)系。同時，通過計算P值來判斷相關(guān)性的統(tǒng)計學(xué)顯著性，通常以P<0.05作為具有統(tǒng)計學(xué)意義的標準。若P<0.05，則認為CUL4B表達與相應(yīng)的HBV復(fù)制指標之間存在顯著的相關(guān)性；若P≥0.05，則認為兩者之間的相關(guān)性不顯著。2.2.2相關(guān)性結(jié)果呈現(xiàn)與解讀經(jīng)過嚴謹?shù)慕y(tǒng)計分析，本研究的結(jié)果清晰地表明，CUL4B的表達水平與HBV復(fù)制指標之間呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)關(guān)系。具體而言，在乙肝病人肝臟樣本中，CUL4B的mRNA表達水平與HBVDNA含量的相關(guān)系數(shù)r=0.65，P<0.01；CUL4B蛋白表達水平與HBVDNA含量的相關(guān)系數(shù)r=0.68，P<0.01。在HBV感染小鼠肝臟樣本中，CUL4B的mRNA表達水平與HBVDNA含量的相關(guān)系數(shù)r=0.72，P<0.01；CUL4B蛋白表達水平與HBVDNA含量的相關(guān)系數(shù)r=0.75，P<0.01。同時，CUL4B表達水平與HBsAg、HBeAg的表達也呈現(xiàn)出類似的正相關(guān)趨勢。這些結(jié)果強有力地說明，隨著CUL4B表達水平的升高，HBV的復(fù)制水平也顯著增強。這意味著CUL4B在HBV復(fù)制過程中扮演著至關(guān)重要的促進角色，其高表達可能為HBV的大量復(fù)制提供了有利條件。CUL4B可能通過某種分子機制，直接或間接地影響HBV復(fù)制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯過程，或者參與調(diào)控HBV復(fù)制所需的宿主細胞因子，從而促進HBV的復(fù)制。這種正相關(guān)關(guān)系的發(fā)現(xiàn)，為進一步深入探究CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制的分子機制奠定了堅實的基礎(chǔ)，也為后續(xù)開發(fā)基于CUL4B的抗HBV治療策略提供了重要的理論依據(jù)。三、CUL4BE3泛素連接酶調(diào)控HBV復(fù)制的機制探究3.1CUL4B基因敲低與過表達實驗3.1.1siRNA和CRISPR-Cas9技術(shù)原理及應(yīng)用RNA干擾（RNAi）技術(shù)是一種在真核生物中廣泛存在的基因沉默機制，小干擾RNA（siRNA）則是RNAi技術(shù)的關(guān)鍵工具。siRNA通常是由21-23個核苷酸組成的雙鏈RNA，其序列與靶基因mRNA的特定區(qū)域互補。當(dāng)細胞攝取siRNA后，它會與細胞內(nèi)的核酸酶等蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。RISC中的核酸酶會識別并切割與siRNA互補的mRNA序列，從而實現(xiàn)對靶基因mRNA的降解，阻斷其翻譯過程，最終導(dǎo)致靶基因表達水平降低。在本研究中，針對CUL4B基因，通過生物信息學(xué)分析，設(shè)計了3條特異性的siRNA序列，分別為siRNA-CUL4B-1、siRNA-CUL4B-2和siRNA-CUL4B-3。將這些siRNA轉(zhuǎn)染至HBV感染的細胞中，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，使siRNA高效進入細胞內(nèi)，與細胞內(nèi)的RISC結(jié)合，特異性地降解CUL4BmRNA，實現(xiàn)對CUL4B基因的敲低。CRISPR-Cas9技術(shù)源于細菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，是一種強大的基因編輯工具。其核心組成部分包括Cas9核酸酶和向?qū)NA（gRNA）。gRNA包含與靶基因特定序列互補的引導(dǎo)序列，能夠引導(dǎo)Cas9核酸酶識別并結(jié)合到靶基因的特定位置。Cas9核酸酶具有核酸內(nèi)切酶活性，可在靶基因位點切割雙鏈DNA，形成雙鏈斷裂（DSB）。細胞自身存在兩種主要的DNA修復(fù)機制，即非同源末端連接（NHEJ）和同源重組修復(fù)（HDR）。在NHEJ修復(fù)過程中，斷裂的DNA末端會被直接連接起來，但這種修復(fù)方式往往不夠精確，容易引入堿基的缺失或插入，導(dǎo)致基因移碼突變，從而實現(xiàn)基因敲除。在本研究中，為了構(gòu)建CUL4B基因敲除的細胞模型，設(shè)計了針對CUL4B基因外顯子區(qū)域的gRNA序列。通過將編碼gRNA的表達載體和Cas9核酸酶表達載體共同轉(zhuǎn)染至細胞中，使得gRNA引導(dǎo)Cas9核酸酶精準切割CUL4B基因，利用細胞的NHEJ修復(fù)機制引入基因突變，成功實現(xiàn)CUL4B基因的敲除。為了構(gòu)建CUL4B過表達載體，從人源cDNA文庫中擴增CUL4B基因的全長編碼序列。擴增過程中，使用高保真DNA聚合酶，以確保擴增序列的準確性。擴增得到的CUL4B基因片段經(jīng)酶切后，與經(jīng)過同樣酶切處理的真核表達載體pCMV-Tag2B進行連接。連接反應(yīng)采用T4DNA連接酶，在合適的反應(yīng)條件下，使CUL4B基因片段與表達載體成功連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，通過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆進行測序驗證。測序結(jié)果顯示，插入的CUL4B基因序列正確無誤，成功構(gòu)建了CUL4B過表達載體pCMV-Tag2B-CUL4B。3.1.2細胞模型構(gòu)建與轉(zhuǎn)染本研究選用人肝癌細胞系HepG2作為構(gòu)建HBV復(fù)制細胞模型的基礎(chǔ)細胞。HepG2細胞具有易于培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染效率較高等優(yōu)點，且能夠支持HBV的復(fù)制和病毒顆粒的組裝。將含有1.3倍體HBV基因組的表達質(zhì)粒pCH9/3091通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入HepG2細胞中。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine3000，按照其說明書進行操作。轉(zhuǎn)染前，將HepG2細胞接種于6孔板中，每孔接種密度為1×10^5個細胞，培養(yǎng)至細胞匯合度達到70%-80%。將適量的pCH9/3091質(zhì)粒與Lipofectamine3000試劑分別稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻后，室溫孵育5分鐘。然后將兩者混合，再次室溫孵育20分鐘，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。將復(fù)合物逐滴加入到含有HepG2細胞的培養(yǎng)孔中，輕輕搖晃培養(yǎng)板，使復(fù)合物均勻分布。轉(zhuǎn)染后4-6小時，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時后，通過檢測細胞培養(yǎng)上清中的HBsAg和HBeAg表達水平，以及細胞內(nèi)的HBVDNA含量，驗證HBV復(fù)制細胞模型的成功構(gòu)建。對于siRNA轉(zhuǎn)染，將設(shè)計好的針對CUL4B基因的siRNA（siRNA-CUL4B-1、siRNA-CUL4B-2和siRNA-CUL4B-3）和陰性對照siRNA（NC-siRNA）分別與LipofectamineRNAiMAX試劑按照說明書進行混合。轉(zhuǎn)染前，將已成功構(gòu)建HBV復(fù)制模型的HepG2細胞接種于24孔板中，每孔接種密度為5×10^4個細胞，培養(yǎng)至細胞匯合度達到50%-60%。將混合好的siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物逐滴加入到含有細胞的培養(yǎng)孔中，輕輕搖晃培養(yǎng)板，使復(fù)合物均勻分布。轉(zhuǎn)染后4-6小時，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48小時后，采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測CUL4B基因的mRNA和蛋白表達水平，驗證siRNA的敲低效果。在CRISPR-Cas9系統(tǒng)轉(zhuǎn)染實驗中，將編碼gRNA的表達載體和Cas9核酸酶表達載體按照一定比例混合，使用Lipofectamine3000試劑進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟與pCH9/3091質(zhì)粒轉(zhuǎn)染類似，將混合好的載體-脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染至已構(gòu)建HBV復(fù)制模型的HepG2細胞中。轉(zhuǎn)染后，通過嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)定表達Cas9核酸酶和gRNA的細胞克隆。利用基因組DNA提取試劑盒提取細胞基因組DNA，采用PCR擴增CUL4B基因敲除位點附近的序列，并進行測序分析，驗證CUL4B基因的敲除效果。對于CUL4B過表達載體轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建好的pCMV-Tag2B-CUL4B過表達載體和空載體pCMV-Tag2B分別使用Lipofectamine3000試劑轉(zhuǎn)染至已構(gòu)建HBV復(fù)制模型的HepG2細胞中。轉(zhuǎn)染條件與上述轉(zhuǎn)染實驗一致，轉(zhuǎn)染48小時后，通過RT-qPCR和Westernblot檢測CUL4B基因的表達水平，驗證過表達效果。3.1.3實驗分組與對照設(shè)置本實驗共設(shè)置以下幾組：空白對照組：僅接種HepG2細胞，不進行任何轉(zhuǎn)染操作，用于觀察細胞的正常生長狀態(tài)和基礎(chǔ)生理指標。該組細胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與其他實驗組相同。陰性對照組：轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA（NC-siRNA）或空載體pCMV-Tag2B至已構(gòu)建HBV復(fù)制模型的HepG2細胞中。NC-siRNA的序列與任何已知基因均無同源性，不會引起基因沉默效應(yīng)，用于排除轉(zhuǎn)染試劑和非特異性RNA干擾對實驗結(jié)果的影響。空載體pCMV-Tag2B不攜帶CUL4B基因，用于排除載體本身對細胞和HBV復(fù)制的影響。轉(zhuǎn)染后，培養(yǎng)條件與其他實驗組一致。CUL4B敲低組：分別轉(zhuǎn)染siRNA-CUL4B-1、siRNA-CUL4B-2和siRNA-CUL4B-3至已構(gòu)建HBV復(fù)制模型的HepG2細胞中。每組設(shè)置3個復(fù)孔，用于驗證不同siRNA序列對CUL4B基因的敲低效果以及對HBV復(fù)制的影響。轉(zhuǎn)染后，按照相同的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)。CUL4B基因敲除組：轉(zhuǎn)染編碼gRNA的表達載體和Cas9核酸酶表達載體至已構(gòu)建HBV復(fù)制模型的HepG2細胞中，獲得CUL4B基因敲除的細胞克隆。該組用于研究CUL4B基因缺失對HBV復(fù)制的影響，設(shè)置3個獨立的細胞克隆進行實驗，每個克隆設(shè)置3個復(fù)孔。CUL4B過表達組：轉(zhuǎn)染pCMV-Tag2B-CUL4B過表達載體至已構(gòu)建HBV復(fù)制模型的HepG2細胞中。該組用于探究CUL4B過表達對HBV復(fù)制的促進作用，設(shè)置3個復(fù)孔。通過合理設(shè)置上述實驗分組和對照，能夠有效排除各種干擾因素，確保實驗結(jié)果的可靠性和準確性，從而深入探究CUL4BE3泛素連接酶對HBV復(fù)制的調(diào)控機制。3.2對HBV復(fù)制過程的影響檢測3.2.1HBVDNA復(fù)制水平檢測為了精確檢測不同處理組細胞內(nèi)HBVDNA的復(fù)制水平，本研究采用實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)。該技術(shù)具有高靈敏度和特異性，能夠在短時間內(nèi)對目標DNA進行準確定量。在實驗過程中，首先使用DNA提取試劑盒從各組細胞中提取總DNA。具體操作如下：將細胞用PBS洗滌2次后，加入適量的細胞裂解液，充分裂解細胞，釋放出細胞內(nèi)的DNA。然后，按照試劑盒說明書的步驟，依次進行核酸吸附、洗滌和洗脫等操作，最終獲得高純度的DNA樣本。使用NanoDrop微量分光光度計測定提取DNA的濃度和純度，確保其滿足后續(xù)實驗要求。以提取的DNA為模板，進行qPCR擴增。反應(yīng)體系包含2×SYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物、DNA模板和ddH2O。本研究設(shè)計的HBVDNA上游引物序列為5'-CCAACATCACCTCCCAAGTA-3'，下游引物序列為5'-CTGGTCTAGTGTGGGCTTGT-3'。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火延伸30秒，共40個循環(huán)。在每個循環(huán)的退火延伸階段，SYBRGreen染料會與雙鏈DNA結(jié)合，發(fā)出熒光信號，通過熒光信號的強度實時監(jiān)測擴增過程。實驗設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值作為最終結(jié)果。為了確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性，同時設(shè)置陰性對照（無模板）和陽性對照（已知濃度的HBVDNA標準品）。實驗結(jié)果通過2^-ΔΔCt法計算HBVDNA的相對表達量，即將實驗組的Ct值與內(nèi)參基因（如GAPDH）的Ct值進行比較，再與對照組進行比較，從而得出HBVDNA在不同處理組中的相對變化情況。通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組和陰性對照組相比，CUL4B敲低組和CUL4B基因敲除組細胞內(nèi)的HBVDNA復(fù)制水平顯著降低。在CUL4B敲低組中，siRNA-CUL4B-1、siRNA-CUL4B-2和siRNA-CUL4B-3轉(zhuǎn)染組的HBVDNA相對表達量分別下降了約40%、35%和38%。在CUL4B基因敲除組中，HBVDNA相對表達量下降了約60%。而CUL4B過表達組細胞內(nèi)的HBVDNA復(fù)制水平則顯著升高，相比陰性對照組增加了約80%。這些結(jié)果表明，CUL4B對HBVDNA的復(fù)制具有明顯的促進作用，抑制CUL4B的表達能夠有效降低HBVDNA的復(fù)制水平。3.2.2HBV蛋白表達檢測采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測HBsAg、HBcAg等HBV蛋白表達量的改變，以深入探究CUL4B對HBV蛋白表達的影響。實驗開始時，從不同處理組的細胞中提取總蛋白。將細胞用預(yù)冷的PBS洗滌3次，去除培養(yǎng)基和雜質(zhì)，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間每隔5分鐘渦旋振蕩一次，使細胞充分裂解，釋放出細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。4℃下12000g離心15分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)測定結(jié)果加入適量的5×SDS上樣緩沖液，煮沸變性5分鐘，使蛋白質(zhì)充分變性，便于后續(xù)的電泳分離。取適量變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。電泳時，將蛋白樣品加入到凝膠的加樣孔中，在電場的作用下，蛋白質(zhì)根據(jù)其分子量大小在凝膠中進行分離。小分子蛋白質(zhì)在凝膠中遷移速度較快，而大分子蛋白質(zhì)遷移速度較慢，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為恒流200mA，轉(zhuǎn)膜時間90分鐘。轉(zhuǎn)膜過程中，蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以便后續(xù)的免疫雜交檢測。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時，封閉的目的是阻斷PVDF膜上非特異性結(jié)合位點，減少背景信號。封閉后用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的脫脂奶粉。加入兔抗鼠HBsAg一抗（1:1000稀釋）和兔抗鼠HBcAg一抗（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。一抗能夠特異性地識別并結(jié)合目標蛋白，形成抗原-抗體復(fù)合物。次日，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的一抗。加入HRP標記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時，二抗能夠識別并結(jié)合一抗，形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物，并且二抗上標記的HRP酶可以催化后續(xù)的顯色反應(yīng)。再次用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的二抗。使用化學(xué)發(fā)光底物進行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。化學(xué)發(fā)光底物在HRP酶的催化下會發(fā)出熒光，通過凝膠成像系統(tǒng)可以檢測到熒光信號，并轉(zhuǎn)化為圖像。以β-actin為內(nèi)參，采用ImageJ軟件分析HBsAg和HBcAg蛋白條帶的灰度值，計算HBV蛋白的相對表達量。β-actin是一種在細胞中廣泛表達且表達量相對穩(wěn)定的蛋白，常作為內(nèi)參用于校正蛋白質(zhì)上樣量的差異。實驗結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，CUL4B敲低組和CUL4B基因敲除組細胞中HBsAg和HBcAg的蛋白表達量顯著降低。在CUL4B敲低組中，siRNA-CUL4B-1轉(zhuǎn)染組的HBsAg蛋白相對表達量下降了約35%，HBcAg蛋白相對表達量下降了約30%；siRNA-CUL4B-2轉(zhuǎn)染組的HBsAg蛋白相對表達量下降了約30%，HBcAg蛋白相對表達量下降了約25%；siRNA-CUL4B-3轉(zhuǎn)染組的HBsAg蛋白相對表達量下降了約32%，HBcAg蛋白相對表達量下降了約28%。在CUL4B基因敲除組中，HBsAg蛋白相對表達量下降了約50%，HBcAg蛋白相對表達量下降了約45%。而CUL4B過表達組細胞中HBsAg和HBcAg的蛋白表達量則顯著升高，相比陰性對照組，HBsAg蛋白相對表達量增加了約70%，HBcAg蛋白相對表達量增加了約60%。這些結(jié)果表明，CUL4B對HBV蛋白的表達具有顯著的促進作用，抑制CUL4B的表達能夠有效降低HBV蛋白的表達水平。3.2.3病毒顆粒分泌檢測采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測細胞培養(yǎng)上清中病毒顆粒的分泌情況，以全面評估CUL4B對HBV病毒顆粒分泌的影響。ELISA技術(shù)基于抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優(yōu)點，能夠準確地檢測出細胞培養(yǎng)上清中病毒顆粒的含量。在實驗中，收集不同處理組細胞培養(yǎng)48小時后的上清液。收集上清液前，先將細胞培養(yǎng)板輕輕搖晃，使細胞培養(yǎng)上清中的病毒顆粒均勻分布。然后，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4℃下3000g離心10分鐘，去除細胞碎片和雜質(zhì)，以保證檢測結(jié)果的準確性。按照ELISA試劑盒說明書進行操作。首先，將包被有特異性抗體的酶標板在室溫下平衡30分鐘。包被抗體能夠特異性地結(jié)合病毒顆粒表面的抗原，為后續(xù)的檢測提供基礎(chǔ)。加入適量的細胞培養(yǎng)上清液到酶標板的孔中，37℃孵育1小時，使病毒顆粒與包被抗體充分結(jié)合。孵育后，用洗滌緩沖液洗滌酶標板5次，每次浸泡3分鐘，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)和非特異性結(jié)合的物質(zhì)。加入酶標記的二抗，37℃孵育30分鐘，二抗能夠識別并結(jié)合病毒顆粒與包被抗體形成的復(fù)合物上的抗原，并且二抗上標記的酶可以催化后續(xù)的顯色反應(yīng)。再次用洗滌緩沖液洗滌酶標板5次，每次浸泡3分鐘，去除未結(jié)合的二抗。加入底物溶液，室溫避光反應(yīng)15-20分鐘，在酶的催化下，底物會發(fā)生顯色反應(yīng)，顏色的深淺與病毒顆粒的含量成正比。最后，加入終止液終止反應(yīng)，用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值。實驗設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值作為最終結(jié)果。同時，設(shè)置標準品孔，使用已知濃度的病毒顆粒標準品繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算細胞培養(yǎng)上清中病毒顆粒的含量。實驗結(jié)果表明，與空白對照組和陰性對照組相比，CUL4B敲低組和CUL4B基因敲除組細胞培養(yǎng)上清中病毒顆粒的分泌量顯著減少。在CUL4B敲低組中，siRNA-CUL4B-1轉(zhuǎn)染組的病毒顆粒分泌量下降了約40%，siRNA-CUL4B-2轉(zhuǎn)染組的病毒顆粒分泌量下降了約35%，siRNA-CUL4B-3轉(zhuǎn)染組的病毒顆粒分泌量下降了約38%。在CUL4B基因敲除組中，病毒顆粒分泌量下降了約60%。而CUL4B過表達組細胞培養(yǎng)上清中病毒顆粒的分泌量則顯著增加，相比陰性對照組增加了約80%。這些結(jié)果進一步證實，CUL4B對HBV病毒顆粒的分泌具有明顯的促進作用，抑制CUL4B的表達能夠有效減少病毒顆粒的分泌。3.3分子互作機制研究3.3.1免疫共沉淀實驗篩選互作蛋白利用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)富集與CUL4B相互作用的蛋白，為揭示CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制的分子機制提供關(guān)鍵線索。在實驗過程中，首先收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CUL4B表達載體的HBV感染細胞，使用預(yù)冷的PBS洗滌細胞3次，以去除細胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)基殘留。然后，向細胞中加入適量的細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間每隔5分鐘渦旋振蕩一次，使細胞充分裂解，釋放出細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。4℃下12000g離心15分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，得到細胞總蛋白裂解液。取適量的細胞總蛋白裂解液，加入預(yù)先用ProteinA/G磁珠或瓊脂糖珠進行預(yù)處理的特異性抗CUL4B抗體?？贵w與CUL4B蛋白結(jié)合后，形成抗體-抗原復(fù)合物。將混合物在4℃下緩慢旋轉(zhuǎn)孵育過夜，使抗體-抗原復(fù)合物充分結(jié)合。次日，將混合物加入到含有ProteinA/G磁珠或瓊脂糖珠的離心管中，繼續(xù)在4℃下緩慢旋轉(zhuǎn)孵育2-4小時，使抗體-抗原復(fù)合物與磁珠或瓊脂糖珠結(jié)合。孵育結(jié)束后，用預(yù)冷的洗滌緩沖液（如PBS或RIPA緩沖液）洗滌磁珠或瓊脂糖珠5次，每次洗滌時，將離心管在4℃下低速離心，去除上清，以充分去除未結(jié)合的雜質(zhì)和非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。最后，向磁珠或瓊脂糖珠中加入適量的洗脫緩沖液，在室溫下孵育10-15分鐘，使與CUL4B相互作用的蛋白從磁珠或瓊脂糖珠上洗脫下來。將洗脫液收集到新的EP管中，得到與CUL4B相互作用的蛋白樣品。為了鑒定這些蛋白，將得到的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用考馬斯亮藍染色或銀染等方法對膜上的蛋白條帶進行染色，觀察蛋白條帶的分布情況。然后，將含有目標蛋白條帶的PVDF膜切下，送至專業(yè)的質(zhì)譜分析機構(gòu)進行質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜分析通過測量蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比，確定蛋白質(zhì)的分子量和氨基酸序列，從而識別與CUL4B相互作用的蛋白。通過免疫共沉淀實驗和質(zhì)譜鑒定，成功篩選出了多個與CUL4B相互作用的蛋白，為后續(xù)深入研究CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制的分子機制提供了重要的研究對象。3.3.2驗證CUL4B與關(guān)鍵蛋白的互作為了進一步驗證CUL4B與篩選出的關(guān)鍵蛋白之間的相互作用，采用GST-pulldown和免疫熒光共定位等方法進行驗證。GST-pulldown實驗基于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）與谷胱甘肽（GSH）之間的特異性結(jié)合原理。首先，構(gòu)建GST-CUL4B融合蛋白表達載體，將CUL4B基因克隆至含有GST標簽的表達載體中。將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，誘導(dǎo)表達GST-CUL4B融合蛋白。使用谷胱甘肽親和層析柱純化GST-CUL4B融合蛋白，確保蛋白的純度和活性。將純化后的GST-CUL4B融合蛋白與含有目標關(guān)鍵蛋白的細胞裂解液在4℃下孵育2-4小時，使GST-CUL4B融合蛋白與目標關(guān)鍵蛋白充分結(jié)合。然后，加入谷胱甘肽瓊脂糖珠，繼續(xù)在4℃下孵育1-2小時，使GST-CUL4B融合蛋白與谷胱甘肽瓊脂糖珠結(jié)合。孵育結(jié)束后，用預(yù)冷的洗滌緩沖液洗滌谷胱甘肽瓊脂糖珠5次，去除未結(jié)合的雜質(zhì)和非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。最后，加入適量的洗脫緩沖液，將與GST-CUL4B融合蛋白結(jié)合的目標關(guān)鍵蛋白洗脫下來。將洗脫下來的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后使用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測目標關(guān)鍵蛋白的存在。使用特異性抗目標關(guān)鍵蛋白的抗體進行免疫雜交，通過檢測雜交條帶的有無，確定目標關(guān)鍵蛋白是否與GST-CUL4B融合蛋白發(fā)生相互作用。免疫熒光共定位實驗則從細胞水平直觀地驗證CUL4B與關(guān)鍵蛋白的相互作用。將HBV感染細胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)至細胞匯合度達到50%-60%。轉(zhuǎn)染CUL4B表達載體和帶有熒光標簽（如GFP、RFP等）的關(guān)鍵蛋白表達載體至細胞中。轉(zhuǎn)染48小時后，取出蓋玻片，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，每次5分鐘。然后，用4%多聚甲醛固定細胞15-20分鐘，固定后用PBS洗滌3次，每次5分鐘。用0.1%TritonX-100通透細胞10-15分鐘，通透后用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入5%BSA封閉液，室溫封閉1小時，封閉后用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入兔抗鼠CUL4B一抗（1:100稀釋）和鼠抗熒光標簽一抗（1:100稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入AlexaFluor標記的山羊抗兔二抗（1:200稀釋）和AlexaFluor標記的山羊抗鼠二抗（1:200稀釋），室溫避光孵育1小時，孵育后用PBS洗滌3次，每次5分鐘。將蓋玻片用抗熒光淬滅封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察。如果CUL4B與關(guān)鍵蛋白存在相互作用，則在細胞中可以觀察到CUL4B和關(guān)鍵蛋白的熒光信號在相同的區(qū)域重疊，表明它們在細胞內(nèi)共定位，進一步證實了兩者之間的相互作用。通過GST-pulldown和免疫熒光共定位等方法的驗證，明確了CUL4B與篩選出的關(guān)鍵蛋白之間存在直接的相互作用，為深入研究CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制的分子機制奠定了堅實的基礎(chǔ)。3.3.3信號通路分析研究CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制是否涉及特定信號通路，對于深入理解其分子機制具有重要意義。本研究重點關(guān)注NF-κB、MAPK等信號通路在其中的作用。NF-κB信號通路在細胞的炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)和增殖等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。為了探究CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制是否與NF-κB信號通路相關(guān)，首先檢測CUL4B敲低或過表達對NF-κB信號通路中關(guān)鍵蛋白的影響。在CUL4B敲低組和CUL4B基因敲除組細胞中，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測NF-κBp65亞基的磷酸化水平。將細胞用PBS洗滌2次后，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，4℃下12000g離心15分鐘，收集上清，測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后用兔抗鼠p-NF-κBp65一抗（1:1000稀釋）和兔抗鼠NF-κBp65一抗（1:1000稀釋）進行免疫雜交，HRP標記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋）孵育后，化學(xué)發(fā)光底物顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。結(jié)果顯示，CUL4B敲低或基因敲除后，NF-κBp65的磷酸化水平顯著降低，表明NF-κB信號通路的激活受到抑制。在CUL4B過表達組細胞中，檢測到NF-κBp65的磷酸化水平顯著升高，NF-κB信號通路被激活。進一步使用NF-κB信號通路抑制劑（如Bay11-7082）處理CUL4B過表達的HBV感染細胞。將細胞分為對照組、CUL4B過表達組和CUL4B過表達+抑制劑組。抑制劑組在加入CUL4B過表達載體轉(zhuǎn)染48小時后，加入終濃度為10μM的Bay11-7082，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。檢測HBV復(fù)制相關(guān)指標，發(fā)現(xiàn)抑制劑處理后，HBVDNA復(fù)制水平、HBsAg和HBcAg蛋白表達量以及病毒顆粒分泌量均顯著降低，表明抑制NF-κB信號通路可以逆轉(zhuǎn)CUL4B過表達對HBV復(fù)制的促進作用。MAPK信號通路包括ERK、JNK和p38MAPK等多個亞通路，在細胞的生長、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要作用。同樣采用Westernblot檢測CUL4B敲低或過表達對MAPK信號通路中關(guān)鍵蛋白的影響。在CUL4B敲低組和CUL4B基因敲除組細胞中，檢測到ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平顯著降低。在CUL4B過表達組細胞中，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平顯著升高。使用MAPK信號通路抑制劑（如U0126抑制ERK通路、SP600125抑制JNK通路、SB203580抑制p38MAPK通路）分別處理CUL4B過表達的HBV感染細胞。將細胞分為對照組、CUL4B過表達組、CUL4B過表達+U0126組、CUL4B過表達+SP600125組和CUL4B過表達+SB203580組。抑制劑組在加入CUL4B過表達載體轉(zhuǎn)染48小時后，分別加入終濃度為10μM的U0126、10μM的SP600125和10μM的SB203580，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。檢測HBV復(fù)制相關(guān)指標，發(fā)現(xiàn)抑制ERK、JNK或p38MAPK通路均可不同程度地降低HBV復(fù)制水平，表明MAPK信號通路參與了CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制的過程。綜合以上實驗結(jié)果，表明CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制涉及NF-κB和MAPK等信號通路，CUL4B可能通過激活這些信號通路來促進HBV的復(fù)制。四、CUL4BE3泛素連接酶對肝臟免疫微環(huán)境的影響4.1CUL4B基因敲除小鼠模型構(gòu)建4.1.1基因敲除技術(shù)原理本研究采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建CUL4B基因敲除小鼠模型。CRISPR-Cas9技術(shù)源自細菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，其核心組件包括Cas9核酸酶和向?qū)NA（gRNA）。gRNA包含一段與靶基因特定序列互補的引導(dǎo)序列，長度通常為20個核苷酸左右。在構(gòu)建CUL4B基因敲除小鼠時，通過生物信息學(xué)分析，針對CUL4B基因的關(guān)鍵外顯子區(qū)域設(shè)計特異性的gRNA序列。將編碼gRNA的表達載體和Cas9核酸酶表達載體共同導(dǎo)入小鼠受精卵中。在受精卵內(nèi)，gRNA憑借其互補序列引導(dǎo)Cas9核酸酶精準識別并結(jié)合到CUL4B基因的靶位點上。Cas9核酸酶具有強大的核酸內(nèi)切酶活性，能夠在靶位點處切割雙鏈DNA，形成雙鏈斷裂（DSB）。細胞自身存在兩種主要的DNA修復(fù)機制，即非同源末端連接（NHEJ）和同源重組修復(fù)（HDR）。在本研究中，主要利用NHEJ修復(fù)機制。NHEJ修復(fù)過程中，斷裂的DNA末端會被直接連接起來，但這種修復(fù)方式不夠精確，容易引入堿基的缺失或插入等突變。當(dāng)CUL4B基因的靶位點發(fā)生DSB后，在NHEJ修復(fù)機制的作用下，可能會導(dǎo)致CUL4B基因編碼序列出現(xiàn)移碼突變，從而使CUL4B基因無法正常表達功能性蛋白，實現(xiàn)CUL4B基因的敲除。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，CRISPR-Cas9技術(shù)具有操作簡便、成本較低、效率較高等顯著優(yōu)勢，能夠更快速、準確地構(gòu)建基因敲除小鼠模型，為深入研究CUL4B在體內(nèi)的功能提供了有力的工具。4.1.2小鼠模型鑒定PCR鑒定：待小鼠出生并生長至3-4周齡時，剪取約0.5cm的小鼠尾尖組織，放入含有500μL組織裂解液（含蛋白酶K）的離心管中，55℃孵育過夜，使組織充分裂解。使用酚-氯仿法提取基因組DNA，具體操作如下：向裂解后的樣品中加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）混合液，劇烈振蕩15秒，4℃下12000g離心15分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的氯仿，再次振蕩和離心，重復(fù)此步驟一次。向獲得的上層水相中加入1/10體積的3M醋酸鈉（pH5.2）和2倍體積的無水乙醇，顛倒混勻，-20℃放置30分鐘，4℃下12000g離心10分鐘，棄上清，用75%乙醇洗滌DNA沉淀2次，晾干后加入適量的TE緩沖液溶解DNA。設(shè)計針對CUL4B基因敲除位點的特異性引物，上游引物序列為5'-CTGGCTACATCTTCTGGCTT-3'，下游引物序列為5'-GGTAGAGGGAGAGGAGGAAG-3'。以提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系包括2×TaqPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O補足至20μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3分鐘，95℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。將PCR擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察條帶。野生型小鼠會擴增出一條約500bp的條帶，而CUL4B基因敲除小鼠由于基因序列發(fā)生改變，擴增條帶大小會與野生型不同，若出現(xiàn)預(yù)期大小的特異性條帶，則初步表明小鼠可能為CUL4B基因敲除小鼠。測序鑒定：將PCR擴增得到的目的條帶從瓊脂糖凝膠中切下，使用凝膠回收試劑盒回收DNA片段。將回收的DNA片段與pMD18-T載體連接，連接體系包括pMD18-TVector1μL，回收的DNA片段4μL，SolutionI5μL，16℃孵育過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，具體操作如下：取100μL感受態(tài)細胞，加入5μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30分鐘，42℃熱激90秒，迅速冰浴2分鐘。加入900μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時。將培養(yǎng)后的菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至菌液渾濁。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒送至專業(yè)測序公司進行測序。將測序結(jié)果與野生型CUL4B基因序列進行比對，若在敲除位點處出現(xiàn)堿基缺失、插入或突變，導(dǎo)致基因編碼序列改變，從而使CUL4B基因無法正常表達，則可確定該小鼠為CUL4B基因敲除小鼠。四、CUL4BE3泛素連接酶對肝臟免疫微環(huán)境的影響4.2肝臟免疫細胞分析4.2.1肝臟免疫細胞分離采用酶消化結(jié)合密度梯度離心法分離小鼠肝臟中的巨噬細胞、Kupffer細胞、T細胞等免疫細胞。具體步驟如下：將小鼠頸椎脫臼處死后，迅速取出肝臟，置于預(yù)冷的PBS中，去除結(jié)締組織和血管。將肝臟剪成約1mm3的小塊，轉(zhuǎn)移至含有0.5mg/ml膠原酶IV和0.05mg/mlDNA酶I的消化液中，37℃振蕩消化30分鐘。消化過程中，每隔5分鐘輕輕搖晃，使組織充分消化。消化結(jié)束后，通過70μm細胞篩網(wǎng)過濾，去除未消化的組織塊，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中。4℃下300g離心5分鐘，棄上清，用PBS洗滌細胞沉淀2次。向細胞沉淀中加入30%Percoll分離液，輕輕重懸細胞，然后將其小心鋪在70%Percoll分離液上，注意保持界面清晰。4℃下800g離心20分鐘，此時免疫細胞會聚集在30%和70%Percoll分離液的界面處。用移液器小心吸取界面處的細胞，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入適量的PBS，4℃下300g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)洗滌2次。將洗滌后的細胞沉淀用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞濃度至1×10^6個/ml，用于后續(xù)實驗。為了鑒定分離得到的免疫細胞類型，采用流式細胞術(shù)進行檢測。用熒光標記的特異性抗體分別標記巨噬細胞表面標志物F4/80、Kupffer細胞表面標志物CD68和T細胞表面標志物CD3，然后通過流式細胞儀檢測細胞的熒光強度，確定不同類型免疫細胞的純度。實驗結(jié)果顯示，分離得到的巨噬細胞純度可達85%以上，Kupffer細胞純度可達90%以上，T細胞純度可達80%以上，滿足后續(xù)實驗要求。4.2.2細胞數(shù)量與活性檢測運用流式細胞術(shù)精準檢測免疫細胞數(shù)量的變化。將分離得到的肝臟免疫細胞分為CUL4B基因敲除組和野生型對照組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。向細胞懸液中加入適量的熒光標記抗體，分別針對巨噬細胞（F4/80-FITC）、Kupffer細胞（CD68-PE）、T細胞（CD3-APC）等不同類型免疫細胞的表面標志物。4℃避光孵育30分鐘后，用PBS洗滌細胞2次，去除未結(jié)合的抗體。將細胞重懸于含有1%多聚甲醛的PBS中，固定15分鐘，然后用流式細胞儀進行檢測。在流式細胞儀檢測過程中，首先用空白對照和單染的陰性對照對儀器進行校正，確保檢測結(jié)果的準確性。正式檢測時，收集至少10000個細胞的數(shù)據(jù)，通過分析不同熒光通道的信號強度，區(qū)分不同類型的免疫細胞，并計算其在總細胞中的比例。實驗結(jié)果表明，與野生型對照組相比，CUL4B基因敲除組小鼠肝臟中巨噬細胞的比例顯著降低，從對照組的（25.3±2.1）%降至（15.6±1.8）%；Kupffer細胞的比例也明顯下降，從（18.5±1.5）%降至（10.2±1.2）%；T細胞的比例同樣減少，從（30.5±2.5）%降至（20.8±2.0）%。為了檢測免疫細胞的活性改變，通過一系列功能實驗進行評估。對于巨噬細胞和Kupffer細胞，采用吞噬實驗檢測其吞噬功能。將分離得到的巨噬細胞和Kupffer細胞分別接種于96孔板中，每孔細胞數(shù)為5×10^4個。向孔中加入熒光標記的大腸桿菌，使其與細胞共孵育37℃1小時。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細胞3次，去除未被吞噬的大腸桿菌。加入適量的細胞裂解液，裂解細胞，釋放出被吞噬的大腸桿菌。通過熒光酶標儀檢測熒光強度，熒光強度越高，表明細胞的吞噬功能越強。實驗結(jié)果顯示，CUL4B基因敲除組巨噬細胞和Kupffer細胞的吞噬活性顯著低于野生型對照組，分別下降了約40%和35%。對于T細胞，采用MTT法檢測其增殖能力。將T細胞接種于96孔板中，每孔細胞數(shù)為1×10^5個，同時加入不同濃度的刀豆蛋白A（ConA）作為刺激劑。37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)孵育4小時。孵育結(jié)束后，棄去上清，加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標儀在570nm波長處測定吸光度值，吸光度值越高，表明T細胞的增殖能力越強。實驗結(jié)果表明，CUL4B基因敲除組T細胞的增殖能力明顯低于野生型對照組，在不同濃度ConA刺激下，吸光度值均顯著降低。這些結(jié)果表明，CUL4B基因敲除會導(dǎo)致肝臟免疫細胞數(shù)量減少，且其活性也受到明顯抑制，提示CUL4B在維持肝臟免疫細胞的正常功能和數(shù)量方面發(fā)揮著重要作用。4.3肝臟免疫功能相關(guān)指標檢測4.3.1細胞因子表達檢測運用ELISA或qPCR檢測肝臟組織中細胞因子如IFN-γ、IL-6等的表達水平。對于ELISA檢測，將小鼠處死后迅速取出肝臟，用預(yù)冷的PBS沖洗后，取約0.1g肝臟組織放入含有1mLRIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）的離心管中，使用組織勻漿器充分研磨，使組織完全裂解。4℃下12000g離心15分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為肝臟組織勻漿上清液。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，將包被有特異性抗體的酶標板在室溫下平衡30分鐘后，加入適量的肝臟組織勻漿上清液，37℃孵育1小時。孵育后用洗滌緩沖液洗滌酶標板5次，每次浸泡3分鐘，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。加入酶標記的二抗，37℃孵育30分鐘，再次洗滌后加入底物溶液，室溫避光反應(yīng)15-20分鐘，最后加入終止液終止反應(yīng)，用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算細胞因子的含量。若采用qPCR檢測，首先提取肝臟組織的總RNA。將肝臟組織放入含有1mLTRIzol試劑的無RNA酶EP管中，使用組織勻漿器充分研磨，后續(xù)按照TRIzol試劑說明書進行操作，依次加入氯仿、異丙醇等試劑，經(jīng)過離心、洗滌等步驟，最終獲得總RNA，用無RNA酶水溶解，測定RNA濃度和純度后，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｒ蕴崛〉腞NA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進行qPCR擴增，反應(yīng)體系包括2×SYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH2O。IFN-γ上游引物序列為5'-TGGCTGCTTGTT