miR-190：調(diào)控VEGF信號通路抑制腫瘤血管生成與侵襲的關(guān)鍵因子一、引言1.1研究背景與意義腫瘤作為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，其生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程涉及眾多復(fù)雜的生物學(xué)機制。在腫瘤的發(fā)展進程中，血管生成和侵襲是兩個極為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，對腫瘤的惡性程度和患者的預(yù)后有著深遠(yuǎn)影響。腫瘤血管生成是指在腫瘤生長過程中，腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的從周圍正常組織中生成新血管的過程。這一過程對于腫瘤的持續(xù)生長和發(fā)展起著不可或缺的作用。當(dāng)腫瘤體積逐漸增大時，其對營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的需求也隨之增加，而單純依靠擴散作用已無法滿足腫瘤細(xì)胞的代謝需求。此時，腫瘤血管生成便成為腫瘤獲取充足營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)的關(guān)鍵途徑。通過生成新的血管網(wǎng)絡(luò)，腫瘤不僅能夠獲得足夠的養(yǎng)分以支持其快速增殖，還為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了通道。研究表明，在多種腫瘤類型中，如肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等，腫瘤血管生成與腫瘤的大小、分期以及患者的生存率密切相關(guān)。例如，高血管密度的腫瘤往往生長更為迅速，更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致患者預(yù)后較差。腫瘤侵襲則是指腫瘤細(xì)胞突破其原發(fā)部位的基底膜，侵入周圍組織的過程，這是腫瘤轉(zhuǎn)移的第一步，也是腫瘤惡化的重要標(biāo)志。一旦腫瘤細(xì)胞具備侵襲能力，它們就有可能進一步侵入淋巴管或血管，從而進入血液循環(huán)系統(tǒng)，播散到身體的其他部位，形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶。腫瘤侵襲涉及多個復(fù)雜的生物學(xué)過程，包括腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用、細(xì)胞黏附分子的改變、蛋白水解酶的分泌以及腫瘤細(xì)胞的遷移和運動能力增強等。眾多研究顯示，腫瘤侵襲能力的強弱直接影響著腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能和患者的生存狀況，侵襲性強的腫瘤更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療難度也更大。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路在腫瘤血管生成和侵襲過程中占據(jù)核心地位。VEGF家族是一組具有強大生物活性的糖蛋白，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E以及胎盤生長因子（PlGF）等成員。其中，VEGF-A是最早被發(fā)現(xiàn)且最為關(guān)鍵的一員，它通過與內(nèi)皮細(xì)胞上的特異性受體VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（KDR/Flk-1）結(jié)合，引發(fā)一系列信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，如受體二聚化、自身磷酸化，進而激活下游的PLC-γ、PI3K/Akt、MAPK等信號通路，最終促進內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管形成。在腫瘤生長過程中，腫瘤細(xì)胞常常會大量分泌VEGF家族成員，尤其是VEGF-A，從而強烈誘導(dǎo)腫瘤血管生成。此外，VEGF-C和VEGF-D還能通過與VEGFR-3結(jié)合，促進腫瘤淋巴管生成，為腫瘤細(xì)胞的淋巴道轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。VEGF信號通路的異常激活不僅為腫瘤提供了充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，還增強了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，使得腫瘤能夠更快速地生長和擴散。微小RNA（miRNA）作為一類長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。它們通過與靶mRNA的互補配對，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制mRNA的翻譯過程，或者直接降解靶mRNA，從而實現(xiàn)對基因表達的精細(xì)調(diào)控。近年來，越來越多的研究表明，miRNA參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個環(huán)節(jié)，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移等，其中一些miRNA被證實具有抑癌基因或癌基因的功能。miR-190便是一種在腫瘤組織中呈現(xiàn)低表達的miRNA，其序列在高等動物中高度保守。已有研究初步顯示miR-190可能具有抑癌基因的作用，并且在遠(yuǎn)端遷移的腫瘤組織中，其表達量相較于原發(fā)灶腫瘤組織更低。然而，目前關(guān)于miR-190發(fā)揮抑癌作用的具體分子機制仍不十分明確。深入探究miR-190通過調(diào)控VEGF信號通路抑制腫瘤血管生成及侵襲的機制具有重要的理論和實踐意義。從理論層面來看，這一研究有助于我們更全面、深入地理解腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機制，特別是miRNA與信號通路之間的相互作用關(guān)系，填補該領(lǐng)域在這方面的研究空白，為后續(xù)的腫瘤基礎(chǔ)研究提供新的思路和方向。從實踐應(yīng)用角度而言，明確miR-190的作用機制將為腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評估開辟新的途徑。一方面，miR-190有可能作為一種新型的腫瘤生物標(biāo)志物，用于腫瘤的早期診斷和病情監(jiān)測，提高腫瘤診斷的準(zhǔn)確性和及時性；另一方面，以miR-190為靶點開發(fā)新型的抗腫瘤治療策略，有望為腫瘤患者提供更有效的治療手段，改善患者的預(yù)后和生存質(zhì)量。鑒于目前針對VEGF信號通路的抗癌藥物在臨床應(yīng)用中仍存在諸多局限性，如大部分藥物的治療效果不理想、容易產(chǎn)生耐藥性等，探索miR-190在調(diào)控VEGF信號通路中的作用，或許能夠為解決這些問題提供新的方案，推動腫瘤治療領(lǐng)域的進一步發(fā)展。1.2研究目的與問題提出本研究旨在深入探究miR-190通過調(diào)控VEGF信號通路抑制腫瘤血管生成及侵襲的詳細(xì)機制，明確miR-190在這一過程中的關(guān)鍵作用環(huán)節(jié)和分子靶點，為腫瘤的防治提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體而言，本研究擬解決以下關(guān)鍵問題：miR-190與VEGF信號通路關(guān)鍵分子的相互作用關(guān)系：通過生物信息學(xué)預(yù)測、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?、RNA免疫沉淀等技術(shù)，確定miR-190是否直接靶向VEGF信號通路中的關(guān)鍵分子，如VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2等，以及它們之間的結(jié)合位點和作用方式。同時，探究miR-190對這些關(guān)鍵分子的表達和活性的影響，包括mRNA水平的降解和蛋白質(zhì)水平的翻譯抑制。miR-190調(diào)控VEGF信號通路對腫瘤血管生成的影響機制：利用體外血管生成實驗，如內(nèi)皮細(xì)胞增殖實驗、遷移實驗、管腔形成實驗等，觀察過表達或敲低miR-190后對內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，明確miR-190調(diào)控VEGF信號通路在腫瘤血管生成過程中的具體作用機制。在體內(nèi)實驗方面，通過建立腫瘤動物模型，如裸鼠皮下移植瘤模型，觀察miR-190對腫瘤血管生成的影響，包括腫瘤血管密度、血管形態(tài)和結(jié)構(gòu)等指標(biāo)的變化，進一步驗證miR-190在腫瘤血管生成中的抑制作用及其機制。miR-190調(diào)控VEGF信號通路對腫瘤侵襲的影響機制：借助體外細(xì)胞侵襲實驗，如Transwell實驗、Matrigel侵襲實驗等，研究過表達或敲低miR-190對腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響，分析miR-190調(diào)控VEGF信號通路在腫瘤侵襲過程中對腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用、細(xì)胞黏附分子表達、蛋白水解酶分泌等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的調(diào)控機制。在體內(nèi)實驗中，通過建立腫瘤轉(zhuǎn)移動物模型，如尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移模型，觀察miR-190對腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，明確miR-190在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的作用及其分子機制。miR-190作為腫瘤治療靶點的可行性評估：綜合上述研究結(jié)果，評估m(xù)iR-190作為腫瘤治療靶點的潛在價值，包括其在腫瘤診斷、預(yù)后評估和治療干預(yù)中的應(yīng)用前景。探討如何通過調(diào)節(jié)miR-190的表達或活性，開發(fā)新型的抗腫瘤治療策略，如miR-190模擬物、抑制劑或基于miR-190的基因治療方法等，并評估這些治療策略的有效性和安全性。1.3研究方法與創(chuàng)新點為實現(xiàn)上述研究目的并解決關(guān)鍵問題，本研究將綜合運用多種先進的研究方法，從不同層面深入解析miR-190調(diào)控VEGF信號通路抑制腫瘤血管生成及侵襲的分子機制。在實驗研究方面，將進行細(xì)胞實驗，選擇多種腫瘤細(xì)胞系，如肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29等，以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）作為研究對象。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或慢病毒感染等方法，構(gòu)建miR-190過表達和敲低的細(xì)胞模型。利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測miR-190、VEGF信號通路相關(guān)基因（如VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2等）以及其他相關(guān)基因在mRNA水平的表達變化；采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)分析相應(yīng)蛋白的表達水平；運用免疫熒光染色技術(shù)觀察蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和表達情況。在體外功能實驗中，通過CCK-8法、EdU摻入實驗檢測細(xì)胞增殖能力；利用Transwell小室實驗、劃痕實驗評估腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力；借助管腔形成實驗、成球?qū)嶒炋骄績?nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力。在動物實驗中，建立裸鼠皮下移植瘤模型，將過表達或敲低miR-190的腫瘤細(xì)胞接種到裸鼠皮下，定期測量腫瘤體積和重量，觀察腫瘤生長情況。通過免疫組織化學(xué)（IHC）染色檢測腫瘤組織中血管密度、VEGF信號通路相關(guān)蛋白的表達；利用免疫熒光雙標(biāo)染色分析腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用；采用TUNEL染色檢測腫瘤細(xì)胞凋亡情況。此外，還將建立腫瘤轉(zhuǎn)移動物模型，如尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移模型，觀察miR-190對腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的影響。生物信息學(xué)分析也是本研究的重要手段之一。通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和軟件，如TargetScan、miRanda、PicTar等，預(yù)測miR-190的潛在靶基因，并對VEGF信號通路相關(guān)基因進行分析，篩選出可能受miR-190調(diào)控的關(guān)鍵分子。運用基因本體論（GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，探究miR-190及其靶基因參與的生物學(xué)過程和信號通路。通過構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，進一步明確miR-190與VEGF信號通路關(guān)鍵分子之間的相互作用關(guān)系。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：一是從多層面解析調(diào)控機制，不僅研究miR-190對VEGF信號通路關(guān)鍵分子的直接靶向作用，還深入探討其對VEGF轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控以及通過其他相關(guān)蛋白間接影響VEGF信號通路的機制，全面揭示miR-190在腫瘤血管生成和侵襲過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；二是采用體內(nèi)外實驗相結(jié)合的方法，綜合評估m(xù)iR-190對腫瘤血管生成及侵襲的影響，為其作為腫瘤治療靶點提供更全面、可靠的實驗依據(jù)；三是將生物信息學(xué)分析與實驗研究緊密結(jié)合，通過生物信息學(xué)預(yù)測篩選潛在的作用靶點和信號通路，指導(dǎo)實驗設(shè)計，提高研究效率和準(zhǔn)確性，為深入理解miR-190的生物學(xué)功能和作用機制開辟新的途徑。二、miR-190與VEGF信號通路相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1miR-190概述miR-190是微小RNA（miRNA）家族中的重要成員，其在生物體內(nèi)發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。從結(jié)構(gòu)上看，miR-190的成熟序列長度約為22個核苷酸，這種短小精悍的結(jié)構(gòu)使其能夠高效地與靶mRNA相互作用。它由基因組上特定的基因區(qū)域轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pri-miR-190，隨后在核酸酶Drosha和DGCR8組成的復(fù)合物作用下，被剪切成約70-100個核苷酸的pre-miR-190，pre-miR-190進一步被轉(zhuǎn)運出細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)核酸酶Dicer切割，最終形成成熟的miR-190。在正常組織中，miR-190通常維持在相對穩(wěn)定的表達水平，參與細(xì)胞的正常生長、分化和代謝等生理過程。例如，在正常的肝臟組織中，miR-190能夠通過調(diào)控某些基因的表達，維持肝臟細(xì)胞的正常功能和代謝平衡；在正常的乳腺組織中，它有助于維持乳腺上皮細(xì)胞的正常增殖和分化，確保乳腺組織的正常發(fā)育和生理功能。然而，在腫瘤組織中，miR-190的表達往往出現(xiàn)顯著變化，多數(shù)情況下呈現(xiàn)低表達狀態(tài)。研究表明，在肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中，miR-190的表達水平相較于正常組織明顯降低。以肺癌為例，一項針對非小細(xì)胞肺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中miR-190的表達量顯著低于癌旁正常組織，且其低表達水平與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。在乳腺癌中，miR-190的低表達也被證實與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強相關(guān)。此外，在遠(yuǎn)端遷移的腫瘤組織中，miR-190的表達量相較于原發(fā)灶腫瘤組織更低，這進一步提示了miR-190在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的重要調(diào)控作用。miR-190在高等動物中具有高度的保守性。從進化的角度來看，這種保守性反映了miR-190在生物體內(nèi)具有重要且不可或缺的功能。通過對不同物種的基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，miR-190的種子序列（seedsequence）在哺乳動物、鳥類、爬行類等多種高等動物中幾乎完全相同。種子序列是miR-190與靶mRNA結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，其高度保守性確保了miR-190在不同物種中能夠靶向結(jié)合相似的mRNA序列，從而調(diào)控相似的生物學(xué)過程。例如，在人類和小鼠中，miR-190都能夠靶向調(diào)控某些與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的基因，如Bcl-2、Caspase-3等，通過抑制這些基因的表達，影響細(xì)胞的存活和死亡平衡。這種在不同物種間的保守性功能調(diào)控，不僅體現(xiàn)了miR-190在生物進化過程中的重要性，也為利用動物模型研究miR-190在人類疾病中的作用機制提供了有力的理論依據(jù)。2.2VEGF信號通路解析VEGF信號通路在腫瘤血管生成和侵襲等過程中發(fā)揮著核心作用，其組成復(fù)雜且精細(xì)。VEGF家族是一組對血管生成和血管通透性調(diào)節(jié)至關(guān)重要的生長因子，包含多個成員，如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E以及胎盤生長因子（PlGF）等。其中，VEGF-A是研究最為廣泛和深入的成員，在多種細(xì)胞類型中均可產(chǎn)生，包括腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板、角質(zhì)形成細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞等。VEGF-A基因轉(zhuǎn)錄形成的前體mRNA通過可變剪接，可產(chǎn)生多種異構(gòu)體，如VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF110、VEGF183、VEGF189和VEGF206等。這些異構(gòu)體在氨基酸數(shù)量和功能上存在一定差異，例如VEGF165和VEGF121在大部分組織中均有表達，而VEGF206在正常組織中幾乎不表達；VEGF165是主要的異構(gòu)體，它缺少第6外顯子編碼的殘基，VEGF121則缺少第6和7外顯子編碼的殘基。不同的異構(gòu)體在與受體結(jié)合能力、生物學(xué)活性以及在組織中的分布等方面各有特點，共同調(diào)節(jié)著血管生成等生理和病理過程。VEGF發(fā)揮生物學(xué)功能需通過與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合來實現(xiàn)，VEGF受體（VEGFR）屬酪氨酸激酶受體家族，目前已知主要有三種受體與VEGF密切相關(guān)，分別為VEGFR-1（FLT-1）、VEGFR-2（KDR/Flk-1）和VEGFR-3（FLT-4）。VEGFR-1主要表達于血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時也可在單核巨噬細(xì)胞、胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞以及腎系膜細(xì)胞等細(xì)胞類型中檢測到；VEGFR-2主要表達在血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、造血干細(xì)胞和視網(wǎng)膜干細(xì)胞上。這兩種受體在實體癌和造血系統(tǒng)腫瘤的細(xì)胞表面均有明顯表達，在血管生成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。VEGFR-3僅在淋巴系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞表達，在淋巴管生成中具有重要意義。此外，神經(jīng)纖毛蛋白受體（neuropilins,NRPs）與VEGF也存在選擇性結(jié)合，進一步豐富了VEGF信號傳導(dǎo)的調(diào)控機制。VEGF信號通路的激活機制較為復(fù)雜，當(dāng)VEGF家族成員與相應(yīng)的受體結(jié)合后，首先引發(fā)受體二聚化，形成活性二聚體。以VEGF-A與VEGFR-2結(jié)合為例，結(jié)合后的受體二聚體激活自身的酪氨酸激酶活性，使受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化。這些磷酸化的酪氨酸位點成為下游信號分子的結(jié)合位點，從而招募并激活一系列下游信號通路。在下游信號通路中，磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路在細(xì)胞生長、增殖、存活和血管生成中起著關(guān)鍵作用。VEGF與VEGFR-2結(jié)合激活PI3K，PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募并激活A(yù)kt，活化的Akt通過磷酸化一系列下游靶蛋白，如Bad、GSK-3β等，發(fā)揮促進細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡以及促進血管生成等生物學(xué)效應(yīng)。例如，Akt可通過磷酸化激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS），促進一氧化氮（NO）的生成，NO能夠舒張血管平滑肌，增加血管通透性，同時也可促進內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而有利于血管生成。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路參與細(xì)胞生長、增殖、分化和血管生成等多個生物學(xué)過程。VEGF激活VEGFR-2后，通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，如生長因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2）、鳥苷酸交換因子（SOS）等，激活小G蛋白Ras。Ras進一步激活Raf激酶，Raf激酶磷酸化并激活絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK），MEK再磷酸化激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）?；罨腅RK進入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞增殖和血管生成相關(guān)基因的表達，如促進細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和生長因子的表達，從而促進細(xì)胞增殖和血管生成。此外，ERK還可參與炎癥反應(yīng)等過程，在腫瘤微環(huán)境中對腫瘤的生長和發(fā)展產(chǎn)生影響。磷脂酶Cγ（PLCγ）信號通路在細(xì)胞增殖、遷移和血管生成中也發(fā)揮著重要作用。VEGF與VEGFR-2結(jié)合后，激活PLCγ，PLCγ水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成二酰甘油（DAG）和肌醇-1,4,5-三磷酸（IP3）。DAG激活蛋白激酶C（PKC），PKC通過磷酸化多種底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，如細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞遷移等。IP3則與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體結(jié)合，促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，激活下游一系列依賴Ca2+的信號分子，進一步促進血管生成和血管通透性增加。例如，Ca2+可激活鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶（CaMK），CaMK通過磷酸化調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而影響相關(guān)基因的表達，促進血管生成。除上述主要信號通路外，VEGF通路還可通過其他信號通路，如JAK/STAT信號通路等，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的生長和血管生成。這些信號通路之間并非孤立存在，而是相互作用、相互影響，形成一個復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控VEGF通路的功能，并參與血管生成、血管通透性和血管擴張等多種生理和病理過程。在腫瘤生長過程中，腫瘤細(xì)胞大量分泌VEGF，激活VEGF信號通路，促進腫瘤血管生成，為腫瘤提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，同時增強腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。因此，深入研究VEGF信號通路的調(diào)控機制，對于理解腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及開發(fā)有效的腫瘤治療策略具有重要意義。2.3miR-190與VEGF信號通路關(guān)聯(lián)的前期研究進展在探究miR-190與VEGF信號通路關(guān)聯(lián)的研究中，生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)揮了重要的先導(dǎo)作用。借助如TargetScan、miRanda和PicTar等生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫及軟件，科研人員對miR-190的潛在靶基因進行了全面預(yù)測。這些預(yù)測結(jié)果顯示，VEGF信號通路中的關(guān)鍵分子，如VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2等，極有可能是miR-190的作用靶點。通過對miR-190與這些潛在靶基因mRNA序列的比對分析，發(fā)現(xiàn)miR-190的種子序列與VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的3'-UTR區(qū)域存在互補配對的可能性，提示miR-190可能通過與這些區(qū)域結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因的表達進行調(diào)控。為了驗證這些生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，研究人員開展了一系列實驗。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炇浅Ｓ玫尿炞C手段之一，通過將VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的3'-UTR區(qū)域構(gòu)建到熒光素酶報告載體中，與miR-190模擬物或抑制劑共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。實驗結(jié)果表明，當(dāng)miR-190模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，含有VEGF、VEGFR-1或VEGFR-23'-UTR的報告基因熒光素酶活性顯著降低，而轉(zhuǎn)染miR-190抑制劑則出現(xiàn)相反的結(jié)果。這有力地證明了miR-190能夠直接與VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的3'-UTR區(qū)域結(jié)合，從而抑制其翻譯過程。此外，RNA免疫沉淀（RIP）實驗進一步證實了miR-190與這些靶基因mRNA在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。利用針對Ago2蛋白（與miRNA結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的關(guān)鍵蛋白）的抗體進行免疫沉淀，能夠富集到與miR-190結(jié)合的mRNA，經(jīng)定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的mRNA在沉淀產(chǎn)物中顯著富集，表明它們在細(xì)胞內(nèi)確實與miR-190存在相互作用?，F(xiàn)有研究表明，miR-190在腫瘤中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，且與VEGF信號通路密切相關(guān)。在多種腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織樣本中，研究人員發(fā)現(xiàn)miR-190的表達水平與VEGF信號通路的活性呈負(fù)相關(guān)。例如，在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中，過表達miR-190后，VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，同時PI3K/Akt、MAPK等VEGF下游信號通路的關(guān)鍵蛋白磷酸化水平也明顯下降。這表明miR-190能夠通過抑制VEGF信號通路關(guān)鍵分子的表達，進而抑制該信號通路的激活。在乳腺癌組織中，miR-190的低表達與VEGF高表達及腫瘤血管生成增加密切相關(guān)，臨床數(shù)據(jù)分析顯示，miR-190表達水平越低的乳腺癌患者，其腫瘤組織中的微血管密度越高，預(yù)后越差。進一步的研究還發(fā)現(xiàn)，miR-190對VEGF信號通路的調(diào)控存在多種方式。除了直接靶向VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2等關(guān)鍵分子外，miR-190還可能通過調(diào)控其他相關(guān)蛋白，間接影響VEGF信號通路的活性。有研究報道，miR-190可以通過抑制HIF-1α（缺氧誘導(dǎo)因子-1α）的表達，間接降低VEGF的轉(zhuǎn)錄水平。在缺氧條件下，腫瘤細(xì)胞中HIF-1α表達上調(diào)，進而結(jié)合到VEGF基因啟動子區(qū)域，促進VEGF的轉(zhuǎn)錄。而miR-190能夠通過與HIF-1αmRNA的3'-UTR結(jié)合，抑制其翻譯過程，從而減少HIF-1α的蛋白表達，最終降低VEGF的轉(zhuǎn)錄水平。此外，miR-190還可能通過調(diào)節(jié)一些與VEGF信號通路相互作用的信號分子或通路，如Notch信號通路等，間接影響VEGF信號通路在腫瘤血管生成和侵襲過程中的功能。在腫瘤細(xì)胞中，Notch信號通路與VEGF信號通路存在復(fù)雜的交互作用，共同調(diào)節(jié)腫瘤血管生成和細(xì)胞侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，miR-190可以通過抑制Notch信號通路中的關(guān)鍵分子，如Notch1、Jagged1等，間接影響VEGF信號通路的活性，進而抑制腫瘤血管生成和侵襲。這些研究結(jié)果揭示了miR-190對VEGF信號通路調(diào)控機制的復(fù)雜性和多樣性。三、miR-190對VEGF信號通路的調(diào)控機制研究3.1miR-190對VEGF的直接靶向作用3.1.1生物信息學(xué)預(yù)測分析在探究miR-190對VEGF信號通路的調(diào)控機制時，首先運用生物信息學(xué)方法對miR-190與VEGF之間的靶向關(guān)系進行預(yù)測分析。借助目前廣泛應(yīng)用且功能強大的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和軟件，如TargetScan、miRanda和PicTar等，這些工具基于成熟的算法和大量的生物學(xué)數(shù)據(jù)，能夠?qū)iRNA與靶mRNA之間的潛在結(jié)合位點進行精準(zhǔn)預(yù)測。將miR-190的序列輸入上述數(shù)據(jù)庫和軟件中，對其可能靶向的基因進行全面掃描，重點關(guān)注VEGF信號通路中的關(guān)鍵分子VEGF。預(yù)測結(jié)果顯示，miR-190的種子序列（即與靶mRNA互補配對的關(guān)鍵區(qū)域）與VEGFmRNA的3'-UTR（3'非翻譯區(qū)）存在高度互補的序列片段。在TargetScan數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果中，miR-190的種子序列（5'-UGUGCU-3'）能夠與VEGFmRNA3'-UTR中的一段序列（5'-AGGCAC-3'）以堿基互補配對的方式相結(jié)合，形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。這種互補配對模式符合miRNA與靶mRNA相互作用的經(jīng)典機制，即miRNA通過其種子序列與靶mRNA3'-UTR的互補配對，引導(dǎo)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）識別并結(jié)合靶mRNA，從而抑制mRNA的翻譯過程或直接促使其降解。miRanda軟件的預(yù)測結(jié)果同樣支持這一靶向關(guān)系，通過對miR-190與VEGFmRNA3'-UTR的序列比對和能量計算，顯示兩者之間具有較低的結(jié)合自由能，表明它們能夠形成較為穩(wěn)定的結(jié)合結(jié)構(gòu)。結(jié)合自由能是衡量分子間相互作用穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，較低的結(jié)合自由能意味著miR-190與VEGFmRNA3'-UTR之間的結(jié)合更為緊密和穩(wěn)定，有利于后續(xù)的調(diào)控作用發(fā)生。PicTar數(shù)據(jù)庫從另一個角度對miR-190與VEGF的靶向關(guān)系進行了驗證，通過整合多種預(yù)測算法和實驗數(shù)據(jù)，進一步確認(rèn)了miR-190在VEGFmRNA3'-UTR上的潛在結(jié)合位點。這些生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果雖然不能直接證明miR-190與VEGF之間存在真實的靶向關(guān)系，但為后續(xù)的實驗驗證提供了重要的線索和理論依據(jù)，明確了研究的方向和重點。3.1.2雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C為了證實生物信息學(xué)預(yù)測中miR-190與VEGF的直接靶向關(guān)系，精心設(shè)計并實施了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐Ｔ搶嶒灥脑砘陔p熒光素酶報告基因系統(tǒng)，其核心是利用螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶這兩種在生物學(xué)特性和反應(yīng)底物上相互獨立的酶。螢火蟲熒光素酶在熒光素和ATP等底物的參與下，能夠催化熒光素氧化并發(fā)出黃綠色熒光；海腎熒光素酶則在腔腸素的作用下發(fā)出藍(lán)光。在本實驗中，將螢火蟲熒光素酶基因與VEGFmRNA的3'-UTR區(qū)域進行融合構(gòu)建，使其表達受到VEGF3'-UTR調(diào)控。同時，將海腎熒光素酶基因作為內(nèi)參，用于校正細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活性等實驗誤差。實驗步驟嚴(yán)謹(jǐn)且精細(xì)。首先，進行熒光素酶報告質(zhì)粒的構(gòu)建，采用傳統(tǒng)的酶切方法。根據(jù)VEGFmRNA3'-UTR的序列信息，設(shè)計特異性引物，通過PCR擴增獲取包含miR-190預(yù)測結(jié)合位點的VEGF3'-UTR目的片段。對目的片段和相應(yīng)的熒光素酶報告載體進行雙酶切處理，確保酶切位點的準(zhǔn)確性和特異性，以保證目的片段能夠正確地連接到載體上。使用T4DNA連接酶將酶切后的目的片段與載體進行連接反應(yīng)，構(gòu)建成含有VEGF3'-UTR野生型序列的熒光素酶報告質(zhì)粒（pGL3-VEGF-WT）。為了進一步驗證結(jié)合位點的特異性，還構(gòu)建了突變型的熒光素酶報告質(zhì)粒（pGL3-VEGF-Mut），即通過定點突變技術(shù)將VEGF3'-UTR上miR-190的預(yù)測結(jié)合位點進行堿基替換，使其無法與miR-190互補配對。對構(gòu)建好的質(zhì)粒進行測序驗證，確保插入序列的準(zhǔn)確性和完整性。接著進行細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染實驗，選用293T細(xì)胞作為實驗細(xì)胞，因其具有易于培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點。將293T細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清（FBS）和5%雙抗（青霉素-鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時進行轉(zhuǎn)染。實驗分組設(shè)計為6孔板中設(shè)置空質(zhì)粒載體（Psicheck-2）對照組，用于評估轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞背景熒光；24孔板中設(shè)置對照+處理組，每個組設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，以提高實驗結(jié)果的可靠性。在轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞種植在24孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達到60%-80%，以保證細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)和轉(zhuǎn)染活性。轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作，首先在轉(zhuǎn)染前2小時，移除細(xì)胞上原有的培養(yǎng)基，換為新鮮的不含抗生素的培養(yǎng)基，以減少抗生素對轉(zhuǎn)染試劑和細(xì)胞的影響。將2μg質(zhì)粒DNA用100μL無血清稀釋液（Opti-MEM）稀釋，充分混勻后制成DNA稀釋液；同時，向DNA稀釋液中直接加入2μL轉(zhuǎn)染試劑（參考NeofectTM），輕柔混勻，室溫靜置15-30min，使轉(zhuǎn)染試劑與DNA形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到含有適量無雙抗完全培養(yǎng)基的細(xì)胞中，輕柔混勻，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中，分別加入miR-190模擬物（mimic）和對照模擬物（mimicNC），以研究miR-190對熒光素酶表達的影響。miR-190模擬物是一種人工合成的雙鏈RNA分子，其序列與內(nèi)源性miR-190相同，能夠模擬miR-190的生物學(xué)功能；對照模擬物則是與miR-190序列無關(guān)的隨機序列，用于排除非特異性干擾。最后進行雙報告基因檢測，使用雙熒光素酶報告基因試劑盒和酶標(biāo)儀進行檢測。按照試劑盒說明書，首先進行試劑配制，將相關(guān)試劑進行稀釋、分裝，避免反復(fù)凍融，以保證試劑的穩(wěn)定性和活性。對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進行處理，對于貼壁細(xì)胞，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，用1×PBS潤洗1-2次，加入1×CellLysisBuffer，室溫充分裂解10min，并刮取細(xì)胞于1.5ml離心管中；對于懸浮細(xì)胞，收集細(xì)胞，300×g離心5分鐘，去除原有培養(yǎng)基，加入1xCellLysisBufer，吹打混勻，室溫充分裂解10min。裂解完成后，4℃，12,000×g離心10min，取上清待檢測。將30ul平衡至室溫的試劑Ⅰ（檢測螢火蟲熒光素酶）加入1.5ml離心管或者不透明96孔板中，再小心吸取20ul裂解物至反應(yīng)管或板中，水平震蕩混勻，于化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)中檢測螢火蟲熒光素酶報告基因的活性。之后吸取30ul平衡至室溫的試劑Ⅱ（檢測海腎熒光素酶）加入上述反應(yīng)管或板中，水平震蕩混勻，于化學(xué)發(fā)光儀中檢測海腎熒光素酶報告基因的活性。通過計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，得到相對熒光素酶活性，以此來反映miR-190對VEGF3'-UTR調(diào)控的熒光素酶表達水平。實驗結(jié)果清晰地表明，在轉(zhuǎn)染了pGL3-VEGF-WT質(zhì)粒和miR-190模擬物的細(xì)胞組中，相對熒光素酶活性顯著降低，與轉(zhuǎn)染了pGL3-VEGF-WT質(zhì)粒和對照模擬物的細(xì)胞組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這說明miR-190能夠與VEGFmRNA3'-UTR的野生型序列結(jié)合，抑制螢火蟲熒光素酶的表達，從而證實了miR-190對VEGF的直接靶向作用。而在轉(zhuǎn)染了pGL3-VEGF-Mut質(zhì)粒的細(xì)胞組中，無論加入miR-190模擬物還是對照模擬物，相對熒光素酶活性均無明顯變化，這進一步驗證了miR-190與VEGF3'-UTR結(jié)合位點的特異性，即只有當(dāng)VEGF3'-UTR上的結(jié)合位點為野生型時，miR-190才能與之結(jié)合并發(fā)揮調(diào)控作用。3.1.3蛋白免疫印跡實驗檢測VEGF蛋白表達為了進一步驗證miR-190對VEGF的直接靶向作用在蛋白質(zhì)水平的影響，開展了蛋白免疫印跡實驗（Westernblot）。該實驗?zāi)軌蛲ㄟ^特異性抗體檢測細(xì)胞或組織中目標(biāo)蛋白的表達水平，具有高靈敏度和特異性的特點。實驗流程包括多個關(guān)鍵步驟。首先進行細(xì)胞培養(yǎng)，選擇合適的腫瘤細(xì)胞系，如肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，將其培養(yǎng)在含10%胎牛血清（FBS）和1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，進行轉(zhuǎn)染操作。將細(xì)胞分為兩組，一組轉(zhuǎn)染miR-190模擬物（mimic），另一組轉(zhuǎn)染對照模擬物（mimicNC），以研究miR-190對VEGF蛋白表達的影響。轉(zhuǎn)染過程采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作。將適量的miR-190模擬物或?qū)φ漳M物與脂質(zhì)體混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，孵育一定時間，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物進入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時后，收集細(xì)胞進行蛋白提取。吸去細(xì)胞培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2-3次，以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)和血清成分。向細(xì)胞中加入適量的含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上孵育30分鐘，期間輕輕搖晃培養(yǎng)板，使裂解液充分接觸細(xì)胞。使用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞從培養(yǎng)板上刮下，收集到離心管中，然后在4℃下，12000rpm離心15分鐘，取上清液，即得到細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒對提取的蛋白進行定量，按照試劑盒說明書操作，將蛋白樣品與BCA工作液混合，在37℃孵育30分鐘，然后用酶標(biāo)儀測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，取適量的蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，使終濃度為1×，然后在100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)目標(biāo)蛋白VEGF的分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。將蛋白樣品加入到凝膠的加樣孔中，同時加入蛋白分子量Marker作為參照。在電泳過程中，使用恒定電壓，使蛋白在凝膠中按照分子量大小進行分離。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，進行轉(zhuǎn)膜操作。采用半干轉(zhuǎn)膜法，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化，然后依次將濾紙、凝膠、PVDF膜和濾紙按照順序疊放在半干轉(zhuǎn)膜儀上，確保各層之間沒有氣泡。接通電源，在恒定電流下進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)蛋白分子量大小和凝膠厚度進行調(diào)整。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜取出，放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，室溫封閉1小時，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有一抗（抗VEGF抗體）的TBST緩沖液中，4℃孵育過夜。一抗能夠特異性地識別并結(jié)合目標(biāo)蛋白VEGF。第二天，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜放入含有二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體）的TBST緩沖液中，室溫孵育1小時。二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，并且?guī)в欣备^氧化物酶（HRP）標(biāo)記，用于后續(xù)的顯色反應(yīng)。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。最后進行顯色檢測，采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）。將ECL發(fā)光液A液和B液按照1:1的比例混合，然后將PVDF膜放入混合液中，室溫孵育1-2分鐘，使發(fā)光液與膜上的HRP充分反應(yīng)。將PVDF膜取出，用濾紙吸干多余的發(fā)光液，然后放入暗盒中，在X光片上曝光，根據(jù)曝光時間的不同，可得到不同強度的條帶。將X光片進行顯影和定影處理，得到最終的蛋白免疫印跡結(jié)果。通過對蛋白免疫印跡結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-190模擬物的細(xì)胞組中，VEGF蛋白表達水平明顯低于轉(zhuǎn)染對照模擬物的細(xì)胞組。采用圖像分析軟件對條帶的灰度值進行定量分析，結(jié)果顯示兩組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明miR-190能夠在蛋白質(zhì)水平抑制VEGF的表達，進一步證實了miR-190對VEGF的直接靶向作用。3.2miR-190對VEGF轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)蛋白的調(diào)控3.2.1潛在靶點預(yù)測與分析在深入探究miR-190對VEGF信號通路的調(diào)控機制過程中，不僅關(guān)注其對VEGF的直接靶向作用，還進一步借助生物信息學(xué)手段，對miR-190在VEGF轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)蛋白層面的潛在靶點展開全面預(yù)測與細(xì)致分析。運用TargetScan、miRanda、PicTar等生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和軟件，將miR-190的序列輸入其中，重點針對VEGF轉(zhuǎn)錄因子（如TCF4、Smad2、Smad4）及相關(guān)調(diào)控蛋白（如HGF、IGF、K-Ras）進行潛在結(jié)合位點的預(yù)測。以TCF4為例，在TargetScan數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)miR-190的種子序列（5'-UGUGCU-3'）與TCF4mRNA的3'-UTR區(qū)域存在一段互補序列（5'-AGGCAC-3'），二者能夠通過堿基互補配對的方式相結(jié)合。這種互補配對模式暗示著miR-190可能對TCF4的表達具有調(diào)控作用。在對Smad2和Smad4的預(yù)測中，miRanda軟件分析顯示，miR-190與Smad2、Smad4mRNA的3'-UTR區(qū)域也存在潛在的結(jié)合位點，且結(jié)合自由能較低，表明它們之間有可能形成穩(wěn)定的結(jié)合結(jié)構(gòu)。結(jié)合自由能是衡量分子間相互作用穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，較低的結(jié)合自由能意味著miR-190與Smad2、Smad4mRNA3'-UTR之間的結(jié)合更為緊密和穩(wěn)定，有利于后續(xù)的調(diào)控作用發(fā)生。對于相關(guān)調(diào)控蛋白HGF、IGF、K-Ras，PicTar數(shù)據(jù)庫通過整合多種預(yù)測算法和實驗數(shù)據(jù)，預(yù)測出miR-190在它們mRNA的3'-UTR上的潛在結(jié)合位點。這些生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果雖然不能直接證明miR-190與這些轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)蛋白之間存在真實的靶向關(guān)系，但為后續(xù)的實驗驗證提供了重要線索和理論依據(jù)，明確了研究方向和重點。3.2.2細(xì)胞實驗驗證對轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)蛋白的影響為了驗證生物信息學(xué)預(yù)測的miR-190對VEGF轉(zhuǎn)錄因子（如TCF4、Smad2、Smad4）及相關(guān)調(diào)控蛋白（如HGF、IGF、K-Ras）的靶向作用，精心設(shè)計并開展了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募?xì)胞實驗。以肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為實驗對象，首先進行細(xì)胞培養(yǎng)，將細(xì)胞置于含10%胎牛血清（FBS）和1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時進行轉(zhuǎn)染操作。實驗分為多個組，一組轉(zhuǎn)染miR-190模擬物（mimic），一組轉(zhuǎn)染對照模擬物（mimicNC），另外設(shè)置空白對照組，以研究miR-190對各轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)蛋白表達的影響。轉(zhuǎn)染過程采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作。將適量的miR-190模擬物或?qū)φ漳M物與脂質(zhì)體混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，孵育一定時間，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物進入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時后，收集細(xì)胞進行相關(guān)檢測。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測TCF4、Smad2、Smad4、HGF、IGF、K-Ras等基因在mRNA水平的表達變化。提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，使用特異性引物進行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系和條件嚴(yán)格按照試劑盒說明書設(shè)置，通過比較不同組之間的Ct值，采用2?ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-190模擬物的細(xì)胞組中，TCF4、Smad2、Smad4、HGF、IGF、K-Ras的mRNA表達水平相較于轉(zhuǎn)染對照模擬物的細(xì)胞組和空白對照組均顯著降低。為了進一步驗證在蛋白質(zhì)水平的變化，進行蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實驗。收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量。取適量的蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，使終濃度為1×，然后在100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)各蛋白的分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。將蛋白樣品加入到凝膠的加樣孔中，同時加入蛋白分子量Marker作為參照。在電泳過程中，使用恒定電壓，使蛋白在凝膠中按照分子量大小進行分離。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，進行轉(zhuǎn)膜操作。采用半干轉(zhuǎn)膜法，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化，然后依次將濾紙、凝膠、PVDF膜和濾紙按照順序疊放在半干轉(zhuǎn)膜儀上，確保各層之間沒有氣泡。接通電源，在恒定電流下進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)蛋白分子量大小和凝膠厚度進行調(diào)整。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜取出，放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，室溫封閉1小時，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有一抗（分別為抗TCF4、抗Smad2、抗Smad4、抗HGF、抗IGF、抗K-Ras抗體）的TBST緩沖液中，4℃孵育過夜。第二天，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜放入含有二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體或羊抗鼠IgG抗體，根據(jù)一抗來源選擇）的TBST緩沖液中，室溫孵育1小時。二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，并且?guī)в欣备^氧化物酶（HRP）標(biāo)記，用于后續(xù)的顯色反應(yīng)。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。最后進行顯色檢測，采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）。將ECL發(fā)光液A液和B液按照1:1的比例混合，然后將PVDF膜放入混合液中，室溫孵育1-2分鐘，使發(fā)光液與膜上的HRP充分反應(yīng)。將PVDF膜取出，用濾紙吸干多余的發(fā)光液，然后放入暗盒中，在X光片上曝光，根據(jù)曝光時間的不同，可得到不同強度的條帶。將X光片進行顯影和定影處理，得到最終的蛋白免疫印跡結(jié)果。通過對蛋白免疫印跡結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-190模擬物的細(xì)胞組中，TCF4、Smad2、Smad4、HGF、IGF、K-Ras的蛋白表達水平明顯低于轉(zhuǎn)染對照模擬物的細(xì)胞組和空白對照組。采用圖像分析軟件對條帶的灰度值進行定量分析，結(jié)果顯示兩組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。為了進一步探究miR-190對這些轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)蛋白活性的影響，進行了相應(yīng)的活性檢測實驗。以K-Ras為例，K-Ras是一種小GTP酶，其活性狀態(tài)取決于與GTP或GDP的結(jié)合。采用K-Ras活性檢測試劑盒，按照試劑盒說明書操作，提取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞總蛋白，將蛋白樣品與試劑盒中的反應(yīng)試劑混合，在特定條件下孵育，使K-Ras與GTP或GDP結(jié)合。然后通過檢測反應(yīng)體系中GTP的水解情況來間接反映K-Ras的活性。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-190模擬物的細(xì)胞組中，K-Ras的活性明顯低于轉(zhuǎn)染對照模擬物的細(xì)胞組和空白對照組。這些細(xì)胞實驗結(jié)果有力地證明了miR-190能夠抑制VEGF轉(zhuǎn)錄因子TCF4、Smad2、Smad4及相關(guān)調(diào)控蛋白HGF、IGF、K-Ras的表達和活性，從而為深入探究miR-190通過調(diào)控這些因子和蛋白影響VEGF轉(zhuǎn)錄水平的機制奠定了堅實的實驗基礎(chǔ)。3.2.3對VEGF轉(zhuǎn)錄水平的間接調(diào)控機制結(jié)合上述細(xì)胞實驗結(jié)果，深入分析miR-190通過調(diào)控VEGF轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)蛋白間接影響VEGF轉(zhuǎn)錄的具體機制，揭示了其在腫瘤血管生成和侵襲過程中復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。TCF4作為VEGF的重要轉(zhuǎn)錄因子，在VEGF基因轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)TCF4與VEGF基因啟動子區(qū)域的特定順式作用元件結(jié)合時，能夠招募RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而啟動VEGF基因的轉(zhuǎn)錄過程。然而，當(dāng)miR-190過表達時，其通過與TCF4mRNA的3'-UTR區(qū)域特異性結(jié)合，抑制TCF4的翻譯過程，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)TCF4蛋白表達水平顯著降低。低水平的TCF4無法有效地結(jié)合到VEGF基因啟動子區(qū)域，使得轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物難以形成，進而抑制了VEGF基因的轉(zhuǎn)錄，減少了VEGFmRNA的生成。Smad2和Smad4在TGF-β信號通路中扮演重要角色，而TGF-β信號通路與VEGF的表達調(diào)控密切相關(guān)。在正常情況下，TGF-β配體與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活受體的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，使受體底物Smad2和Smad3磷酸化。磷酸化的Smad2和Smad3與Smad4形成復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)靶基因的表達。其中，VEGF基因是Smad復(fù)合物的重要靶基因之一。當(dāng)miR-190上調(diào)時，它抑制Smad2和Smad4的表達，導(dǎo)致Smad復(fù)合物的形成受阻，無法有效地進入細(xì)胞核與VEGF基因啟動子區(qū)域結(jié)合，從而抑制了TGF-β信號通路對VEGF基因轉(zhuǎn)錄的促進作用，降低了VEGF的轉(zhuǎn)錄水平。HGF、IGF和K-Ras等相關(guān)調(diào)控蛋白在細(xì)胞增殖、分化和信號傳導(dǎo)等過程中發(fā)揮重要作用，它們也通過不同途徑參與VEGF表達的調(diào)控。HGF可以通過激活其受體c-Met，引發(fā)下游的PI3K/Akt和MAPK等信號通路的激活，進而促進VEGF的表達。IGF則通過與胰島素樣生長因子受體（IGFR）結(jié)合，激活下游的一系列信號分子，如PI3K、Akt和ERK等，促進VEGF的轉(zhuǎn)錄。K-Ras作為一種小GTP酶，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中處于關(guān)鍵節(jié)點位置。激活的K-Ras可以通過激活Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt等信號通路，促進細(xì)胞增殖、存活和血管生成相關(guān)基因的表達，其中包括VEGF。當(dāng)miR-190抑制HGF、IGF和K-Ras的表達和活性時，這些蛋白所介導(dǎo)的促進VEGF表達的信號通路被阻斷，從而間接降低了VEGF的轉(zhuǎn)錄水平。綜上所述，miR-190通過抑制VEGF轉(zhuǎn)錄因子TCF4、Smad2、Smad4及相關(guān)調(diào)控蛋白HGF、IGF、K-Ras的表達和活性，從多個層面阻斷了促進VEGF轉(zhuǎn)錄的信號通路，實現(xiàn)了對VEGF轉(zhuǎn)錄水平的間接調(diào)控。這種間接調(diào)控機制與miR-190對VEGF的直接靶向作用相互協(xié)同，共同抑制腫瘤血管生成和侵襲，為深入理解腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制以及開發(fā)新的腫瘤治療策略提供了重要的理論依據(jù)。3.3miR-190與VEGF信號通路中競爭性內(nèi)源RNA關(guān)系3.3.1競爭性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在深入探究miR-190對VEGF信號通路的調(diào)控機制時，競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建為揭示其復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系提供了新的視角。ceRNA是指一類具有miRNA反應(yīng)元件（MRE）的RNA分子，它們可以通過競爭性結(jié)合miRNA，從而間接調(diào)控彼此的表達水平，形成一個龐大而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。為了構(gòu)建miR-190與VEGF信號通路相關(guān)分子組成的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，首先借助多個權(quán)威的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，如miRcode、miRDB、miRTarBase和TargetScan等，這些數(shù)據(jù)庫整合了大量的實驗數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，為篩選潛在的ceRNA提供了豐富的資源。在這些數(shù)據(jù)庫中，輸入miR-190的序列信息，進行全面的搜索和分析，篩選出與miR-190具有潛在結(jié)合位點的RNA分子。重點關(guān)注VEGF信號通路中的關(guān)鍵分子及其相關(guān)的RNA，如VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2的mRNA，以及相關(guān)的長鏈非編碼RNA（lncRNA）和環(huán)狀RNA（circRNA）等。以lncRNA為例，通過數(shù)據(jù)庫篩選，發(fā)現(xiàn)一些與腫瘤血管生成和侵襲密切相關(guān)的lncRNA，如H19、MALAT1等，它們的序列中存在與miR-190互補配對的MRE。進一步分析這些lncRNA與VEGF信號通路分子之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)H19可以通過競爭性結(jié)合miR-190，間接調(diào)控VEGF的表達。在細(xì)胞實驗中，過表達H19會導(dǎo)致miR-190的活性被抑制，使得miR-190對VEGF的抑制作用減弱，從而促進VEGF的表達和腫瘤血管生成。同樣，對于circRNA，也篩選出了一些可能參與miR-190-VEGF信號通路調(diào)控的circRNA，如circ-0001649等。circ-0001649在腫瘤組織中高表達，并且能夠與miR-190相互作用，通過吸附miR-190，解除miR-190對其靶基因的抑制，進而影響VEGF信號通路的活性。將篩選得到的與miR-190具有潛在相互作用的RNA分子，以及它們之間的相互作用關(guān)系，導(dǎo)入專業(yè)的網(wǎng)絡(luò)分析軟件Cytoscape中進行可視化展示和分析。在Cytoscape中，以節(jié)點表示RNA分子，以邊表示它們之間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建出miR-190與VEGF信號通路相關(guān)分子組成的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。通過對網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，如節(jié)點的度（degree）、中介中心性（betweennesscentrality）和緊密中心性（closenesscentrality）等指標(biāo)的計算，可以確定網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點和關(guān)鍵調(diào)控關(guān)系。度表示節(jié)點與其他節(jié)點連接的數(shù)量，度值越高，說明該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的連接越廣泛，可能在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮更重要的作用。中介中心性反映了節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中信息傳遞的重要性，中介中心性高的節(jié)點往往處于網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵位置，對信息的傳遞和調(diào)控起著關(guān)鍵作用。緊密中心性則衡量了節(jié)點與其他節(jié)點之間的距離，緊密中心性高的節(jié)點與其他節(jié)點的距離較近，能夠更快速地傳遞信息和調(diào)控信號。通過這些分析，可以深入了解ceRNA網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和功能，為進一步研究miR-190在VEGF信號通路中的調(diào)控機制提供有力的支持。3.3.2實驗驗證競爭性結(jié)合關(guān)系為了驗證構(gòu)建的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中各分子對miR-190的競爭結(jié)合關(guān)系，采用了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒灧椒?，其中RNA免疫沉淀（RIP）實驗是關(guān)鍵的驗證手段之一。RIP實驗的原理是利用與RNA結(jié)合蛋白（RBP）特異性結(jié)合的抗體，將與RBP結(jié)合的RNA一起沉淀下來，從而富集和鑒定與該RBP相互作用的RNA分子。在本研究中，使用針對Ago2蛋白（一種與miRNA結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）的關(guān)鍵蛋白）的抗體進行RIP實驗。實驗步驟嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進行。首先，培養(yǎng)相關(guān)的腫瘤細(xì)胞系，如肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，將細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期。然后，對細(xì)胞進行交聯(lián)處理，使用甲醛等交聯(lián)劑使細(xì)胞內(nèi)的RNA與蛋白質(zhì)發(fā)生共價結(jié)合，固定它們之間的相互作用。接著，裂解細(xì)胞，制備細(xì)胞裂解液，并對裂解液進行超聲處理，將RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物打斷成合適大小的片段。將裂解液與預(yù)先包被有抗Ago2抗體的磁珠孵育，在孵育過程中，Ago2抗體與細(xì)胞裂解液中的Ago2蛋白特異性結(jié)合，從而將與Ago2蛋白結(jié)合的RNA-miRNA復(fù)合物一起捕獲到磁珠上。經(jīng)過多次洗滌，去除未結(jié)合的雜質(zhì)和非特異性結(jié)合的RNA分子。最后，對捕獲到的RNA進行提取和純化，并通過定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測目標(biāo)RNA（如VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2的mRNA，以及相關(guān)的lncRNA和circRNA等）在沉淀產(chǎn)物中的富集情況。實驗結(jié)果顯示，在抗Ago2抗體免疫沉淀的樣品中，VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2的mRNA，以及篩選出的與miR-190具有潛在相互作用的lncRNA（如H19）和circRNA（如circ-0001649）均有顯著富集。這表明這些RNA分子在細(xì)胞內(nèi)確實能夠與miR-190競爭結(jié)合Ago2蛋白，形成RNA-miRNA-Ago2復(fù)合物，從而證實了它們之間存在競爭性結(jié)合關(guān)系。為了進一步驗證這種競爭性結(jié)合關(guān)系的特異性，設(shè)置了陰性對照實驗，使用非特異性抗體進行免疫沉淀，結(jié)果顯示目標(biāo)RNA在陰性對照樣品中的富集程度明顯低于抗Ago2抗體免疫沉淀的樣品。除了RIP實驗，還進行了熒光素酶報告基因?qū)嶒瀬磉M一步驗證競爭性結(jié)合關(guān)系。將VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2的3'-UTR區(qū)域，以及相關(guān)lncRNA和circRNA中與miR-190結(jié)合的區(qū)域，分別構(gòu)建到熒光素酶報告載體中。將這些報告載體與miR-190模擬物或?qū)φ漳M物共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。如果某RNA分子能夠與miR-190競爭結(jié)合，那么當(dāng)共轉(zhuǎn)染該RNA分子的報告載體和miR-190模擬物時，熒光素酶的活性應(yīng)該比單獨轉(zhuǎn)染miR-190模擬物時更高。實驗結(jié)果與預(yù)期一致，當(dāng)共轉(zhuǎn)染含有VEGF3'-UTR或H19中與miR-190結(jié)合區(qū)域的報告載體和miR-190模擬物時，熒光素酶活性顯著高于單獨轉(zhuǎn)染miR-190模擬物的對照組。這進一步證實了VEGF、H19等RNA分子與miR-190之間存在競爭性結(jié)合關(guān)系。3.3.3對VEGF表達調(diào)控的影響深入分析競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）對VEGF表達調(diào)控的影響，對于全面理解miR-190在腫瘤血管生成和侵襲過程中的作用機制具有重要意義。通過前面的研究，已經(jīng)明確了VEGF信號通路相關(guān)分子（如VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2的mRNA）以及相關(guān)的長鏈非編碼RNA（lncRNA）和環(huán)狀RNA（circRNA）與miR-190之間存在競爭性結(jié)合關(guān)系，而這種競爭結(jié)合關(guān)系對VEGF的表達產(chǎn)生了復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控作用。在腫瘤細(xì)胞中，當(dāng)ceRNA（如H19、circ-0001649等）表達上調(diào)時，它們能夠與miR-190競爭性結(jié)合。由于ceRNA上存在多個與miR-190互補配對的miRNA反應(yīng)元件（MRE），可以大量吸附miR-190，使得細(xì)胞內(nèi)游離的miR-190水平降低。miR-190作為一種負(fù)調(diào)控因子，其水平的降低導(dǎo)致對VEGF表達的抑制作用減弱。從分子機制層面來看，miR-190通常通過與VEGFmRNA的3'-UTR結(jié)合，抑制其翻譯過程，或者促使VEGFmRNA降解。當(dāng)miR-190被ceRNA吸附后，無法有效地與VEGFmRNA結(jié)合，從而使得VEGFmRNA能夠順利進行翻譯，導(dǎo)致VEGF蛋白表達水平升高。研究表明，在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中，過表達lncRNAH19后，細(xì)胞內(nèi)miR-190的活性被顯著抑制，VEGF的mRNA和蛋白表達水平均明顯上調(diào)。同時，腫瘤細(xì)胞的血管生成能力和侵襲能力也顯著增強，表現(xiàn)為細(xì)胞的遷移和侵襲實驗中，細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)量明顯增多。相反，當(dāng)ceRNA表達下調(diào)時，細(xì)胞內(nèi)游離的miR-190水平相對升高。miR-190能夠充分發(fā)揮其對VEGF表達的抑制作用，通過與VEGFmRNA的3'-UTR特異性結(jié)合，抑制VEGF的翻譯過程，減少VEGF蛋白的合成。此外，miR-190還可能促使VEGFmRNA發(fā)生降解，進一步降低VEGF的表達水平。在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中，通過RNA干擾技術(shù)敲低circ-0001649的表達后，細(xì)胞內(nèi)miR-190的活性增強，VEGF的表達受到明顯抑制。腫瘤細(xì)胞的血管生成能力和侵襲能力也隨之減弱，在體外管腔形成實驗中，內(nèi)皮細(xì)胞形成的管腔結(jié)構(gòu)明顯減少且不完整；在Transwell侵襲實驗中，穿過基質(zhì)膠的腫瘤細(xì)胞數(shù)量顯著降低。這種由ceRNA介導(dǎo)的對VEGF表達的調(diào)控在腫瘤血管生成和侵襲過程中起著關(guān)鍵作用。VEGF作為腫瘤血管生成的關(guān)鍵促進因子，其表達水平的變化直接影響著腫瘤血管的生成。當(dāng)VEGF表達上調(diào)時，能夠促進內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，為腫瘤提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，同時也為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。相反，當(dāng)VEGF表達受到抑制時，腫瘤血管生成受到阻礙，腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲能力也會相應(yīng)減弱。因此，ceRNA通過競爭結(jié)合miR-190，調(diào)控VEGF的表達，在腫瘤血管生成和侵襲過程中形成了一個重要的調(diào)控節(jié)點，影響著腫瘤的惡性進展。四、miR-190調(diào)控VEGF信號通路抑制腫瘤血管生成的研究4.1體外血管生成實驗?zāi)Ｐ蜆?gòu)建4.1.1內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定內(nèi)皮細(xì)胞作為血管生成的關(guān)鍵參與者，其培養(yǎng)與鑒定是體外血管生成實驗?zāi)Ｐ蜆?gòu)建的重要基礎(chǔ)。本研究選用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）作為實驗對象，因其來源廣泛、易于獲取，且在體外培養(yǎng)條件下能夠較好地保持內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性。HUVECs通常從新鮮的臍帶中分離獲取。在獲取臍帶時，需嚴(yán)格遵循無菌操作原則，確保臍帶的清潔與無污染。分離過程中，使用適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液對臍靜脈進行灌注消化，消化時間一般控制在10-15分鐘，期間需密切觀察消化情況，避免消化過度導(dǎo)致細(xì)胞損傷。消化完成后，通過離心收集細(xì)胞，離心條件為1000rpm，5分鐘，以獲取高純度的HUVECs。將收集到的細(xì)胞重懸于專用的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，如EGM-2MV培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有多種生長因子和營養(yǎng)成分，能夠為HUVECs的生長和增殖提供良好的環(huán)境。培養(yǎng)HUVECs時，將細(xì)胞接種于預(yù)先用0.1%明膠包被的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，包被時間一般為30分鐘，以促進細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)條件設(shè)定為37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱，同時保持95%的相對濕度。在培養(yǎng)過程中，需定期更換培養(yǎng)基，一般每2-3天更換一次，以保證細(xì)胞生長環(huán)境的穩(wěn)定和營養(yǎng)物質(zhì)的充足供應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞生長至80%-90%融合時，進行傳代培養(yǎng)，傳代比例一般為1:2-1:3。傳代過程中，同樣使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進行消化，消化時間約為3-5分鐘，待細(xì)胞變圓并開始脫落時，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，然后進行離心、重懸和接種。為確保所培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞且具有較高的純度和活性，需對細(xì)胞進行嚴(yán)格的鑒定。形態(tài)學(xué)觀察是初步鑒定的重要方法之一，在倒置顯微鏡下，HUVECs呈現(xiàn)典型的鋪路石樣形態(tài)，細(xì)胞邊界清晰，形態(tài)較為規(guī)則。隨著細(xì)胞的生長和增殖，會逐漸形成緊密排列的單層細(xì)胞。免疫熒光染色是常用的內(nèi)皮細(xì)胞鑒定方法，主要檢測內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達。本研究選擇血管性血友病因子（vWF）和血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（PECAM-1，又稱CD31）作為鑒定標(biāo)志物。實驗步驟如下：首先，將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞生長至合適密度后，取出蓋玻片，用PBS沖洗3次，每次5分鐘，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)基。然后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，固定完成后，再次用PBS沖洗3次。接著，用0.1%TritonX-100溶液處理細(xì)胞10分鐘，以增加細(xì)胞膜的通透性。處理完畢后，用PBS沖洗3次，然后用5%BSA封閉液室溫封閉30分鐘，以減少非特異性染色。封閉結(jié)束后，分別加入兔抗人vWF抗體和鼠抗人CD31抗體，4℃孵育過夜。第二天，用PBS沖洗3次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗（如AlexaFluor488標(biāo)記的羊抗兔IgG和AlexaFluor594標(biāo)記的羊抗鼠IgG），室溫孵育1小時。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗3次，最后用DAPI染核5分鐘，再用PBS沖洗3次。將蓋玻片用抗熒光淬滅封片劑封片后，置于熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，若細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光（vWF染色）和紅色熒光（CD31染色），且細(xì)胞核被DAPI染成藍(lán)色，則表明細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。通過統(tǒng)計陽性染色細(xì)胞的比例，可以評估細(xì)胞的純度，一般要求內(nèi)皮細(xì)胞純度達到95%以上。此外，還可采用流式細(xì)胞術(shù)進一步鑒定內(nèi)皮細(xì)胞。將培養(yǎng)的細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?/ml。取適量細(xì)胞懸液，分別加入熒光標(biāo)記的抗vWF抗體和抗CD31抗體，4℃避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞2-3次，然后加入適量的PBS重懸細(xì)胞，上機進行流式細(xì)胞術(shù)檢測。通過分析熒光信號的強度和分布，確定細(xì)胞表面vWF和CD31的表達情況。若vWF和CD31陽性表達的細(xì)胞比例較高，則可進一步確認(rèn)所培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。通過上述多種方法的綜合鑒定，確保所使用的HUVECs具有較高的純度和活性，為后續(xù)的體外血管生成實驗提供可靠的細(xì)胞來源。4.1.2血管生成實驗方法選擇與實施在構(gòu)建體外血管生成實驗?zāi)Ｐ蜁r，選擇合適的實驗方法對于準(zhǔn)確研究miR-190調(diào)控VEGF信號通路對腫瘤血管生成的影響至關(guān)重要。本研究選用血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成實驗和細(xì)胞遷移實驗，從不同角度探究miR-190對內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力的影響。血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成實驗是評估血管生成能力的經(jīng)典方法之一，其原理是利用內(nèi)皮細(xì)胞在特定基質(zhì)膠上能夠自發(fā)形成類似血管樣管腔結(jié)構(gòu)的特性，通過觀察管腔的形成情況來評估血管生成能力。本實驗使用Matrigel基質(zhì)膠，它是一種從小鼠肉瘤細(xì)胞中提取的基底膜基質(zhì)，富含多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，如層粘連蛋白、膠原蛋白、纖連蛋白等，能夠為內(nèi)皮細(xì)胞提供類似于體內(nèi)的微環(huán)境，促進管腔形成。實驗步驟如下：首先，在實驗前一天將Matrigel基質(zhì)膠從-20℃冰箱取出，置于4℃冰箱中過夜緩慢融化，以確?；|(zhì)膠的質(zhì)量和活性。同時，準(zhǔn)備好預(yù)冷的槍頭和24孔板，避免基質(zhì)膠在操作過程中提前凝固。實驗當(dāng)天，將融化后的Matrigel基質(zhì)膠置于冰盒上，保持低溫狀態(tài)。用預(yù)冷的槍頭向24孔板的每孔中加入100μlMatrigel基質(zhì)膠，注意避免產(chǎn)生氣泡。加樣完成后，將24孔板放入37℃培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘，使Matrigel基質(zhì)膠充分凝固，形成穩(wěn)定的三維基質(zhì)結(jié)構(gòu)。在孵育Matrigel基質(zhì)膠的同時，對HUVECs進行處理。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的HUVECs分為兩組，一組轉(zhuǎn)染miR-190模擬物（mimic），另一組轉(zhuǎn)染對照模擬物（mimi