綿羊細管冷凍精液操作規(guī)程2018-05-30實施2018-05-30實施新疆維吾爾自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I標(biāo)準(zhǔn)下載本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》的要求編制。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站提出。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆維吾爾自治區(qū)畜牧廳歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站、新疆天山畜牧生物工程股份有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：耿娟、衛(wèi)新璞、譚世新、王玉欽、楊楠、王愛芳、孫巖、鄧強、熱孜亞·買買提、程黎明、賈旭升、田曉陽、王永力、陳蕾。標(biāo)準(zhǔn)下載1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了綿羊細管冷凍精液(以下簡稱細管凍精)制作前的準(zhǔn)備、采精、精液品質(zhì)外觀檢查、件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。采集精液所用玻璃器具(集精杯、溫度計)、假陰道充氣活塞、鑷子等都必須用洗滌液熱水清洗后用75%酒精棉球擦洗消毒，再用蒸餾水沖洗3遍后置于烘箱中加熱至12(1)將羊用集精杯插入假陰道一段；(2)用0.9%氯化鈉溶液沖洗假陰道內(nèi)壁2次；(3)假陰道夾層注入50℃~60℃溫水，水量控制在150mL～180mL。添加假陰道內(nèi)壁的水溫應(yīng)根據(jù)季節(jié)的變化調(diào)整溫度，內(nèi)胎溫度保持在38℃~40℃用于采精。(4)通過假陰道夾層開關(guān)出口處吹氣，使內(nèi)胎形成三角形；(5)凡士林涂抹假陰道內(nèi)壁整體面積的2/3處待用。待采。采精用的臺羊一般選擇發(fā)情旺盛的健康母羊(也可采用臺羊)。24.1種公羊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)4.1.1用于制作細管凍精的種公羊，其體型、外貌特征和生產(chǎn)性能均應(yīng)符合該品種標(biāo)準(zhǔn)特、一級以上的種羊。4.1.2主力公羊要進行后裔測定，對優(yōu)秀個體延長使用年限，充分發(fā)揮其利用率。4.1.3用于細管凍精制作的種公羊應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行隔離、檢疫程序，不允許有已發(fā)布的一類疫病、二類疫病中任何一種疫病。4.2采精方法將臺羊固定在采精架上，采精員蹲在臺羊右側(cè)后方，右手握假陰道，氣卡塞向下，靠在臺羊臀部，假陰道和地面約呈45°,當(dāng)公羊爬跨、伸出陰莖時，迅速向前用左手托著公羊包皮，右手持假陰道與臺羊成40°~45°,假陰道入口斜向下方，左右手配合將公羊陰莖自然地引入假陰道口內(nèi)(切勿用手捉拿陰莖),公羊射精動作很快，發(fā)現(xiàn)抬頭、挺腰、前沖，表示射精完畢。隨著公羊從臺羊身上滑下時，緩慢地把假陰道脫出，并立即將假陰道入口斜向上方，打開活塞放氣，使精液盡快、充分地流入集精管內(nèi)，然后小心地取下集精管并記錄公羊號，放于30℃恒溫水槽待檢。4.3采精頻率配種季節(jié)，成年種公羊每周采精4次～6次，也可一天采精2次(間隔時間為10min～15min)休息一天，其他時間可減少采精次數(shù)，每周采精2次～4次。5精液品質(zhì)外觀檢查5.1精液品質(zhì)外觀目測法新鮮精液色澤呈乳白色或稍帶淺黃色為正常精液。原精液的氣味應(yīng)表現(xiàn)出無味或略帶腥味。采用刻度滴管測量射精總量。5.2精子密度5.2.1肉眼觀測法在載玻片上滴一滴原精，在400倍～600倍顯微鏡下觀察評定密度：顯微鏡視野內(nèi)精子密集，精子間幾乎無空隙者評為“密”,每毫升約30億～60億精子；精子間隙大約為一個精子距離者評為“中”,每毫升約20億～30億精子；間隙超過一個精子距離評為“稀”,每毫升約10億～20億精子；視野內(nèi)只能看到少數(shù)精子或無精子者評為“無”。5.2.2密度測定儀測定采用密度測定儀測定精子密度。標(biāo)準(zhǔn)下載35.3精液活力顯微鏡檢查方法評定精子活力的顯微鏡載物臺溫度為37℃~38℃為宜，也可利用自制保溫箱38℃~40℃檢查活力。5.3.2活力檢查方法在載玻片上滴一滴精液，然后用蓋玻片均勻蓋著整個液面，做成壓片檢查標(biāo)本，在200倍～400倍顯微鏡下觀察活力。懸滴檢查法在蓋玻片上滴一滴精液，然后再凹玻片上的凹窩中作成懸滴狀檢查標(biāo)本，置于顯微鏡下放大400倍進行觀察。5.4精子活力評定方法5.4.1蓋玻片和載玻片要事先洗凈擦干，檢查活力時應(yīng)預(yù)熱。5.4.2評定精液活力時水浴鍋的溫度須保持在32℃~38.5℃溫度下檢查活力為宜。有條件的單位可用帶有恒溫裝置的顯微鏡或在顯微鏡的載物臺上裝一個恒溫器觀察活力。5.4.3每個滴片要觀察三個以上視野，不同層面的精子運動狀況，所呈現(xiàn)的前進運動精子數(shù)所占的百分率并給予評定。5.4.4采用0～10的十級評分法評分，也可采用百分制進行評定。5.5精液品質(zhì)種公羊的新鮮精液應(yīng)符合下列質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方可凍精，對其中任何一項不符合標(biāo)準(zhǔn)的，不得用于制作冷凍精液。a)原精液精子活力：即呈直線前進運動精子活力≥65%;b)原精液精子密度≥10×10?個/mL;c)原精液精子畸形率≤15%。6精液稀釋保護液與配制配制凍精用的稀釋保護液，必須使用雙重蒸餾水、新鮮的卵黃和化學(xué)分析純試劑等，所用器具保證清潔、干燥、無菌。6.1配制要求6.1.1所有稀釋溶液(除卵黃外)都必須經(jīng)過濾后并在水浴中煮沸消毒，冷卻至35℃~38℃,再加卵黃和抗菌素，甘油單獨水浴蒸煮消毒30min～45min。6.1.2配制好的稀釋液應(yīng)做好標(biāo)記，并將三角瓶口蓋用濾膜封好后放入4℃的冰箱冷藏。6.1.3稀釋保護劑必須現(xiàn)用現(xiàn)配。6.2配方成分Tirs檸檬酸鈉果糖抗菌素甘油蛋黃雙蒸水4稀釋后的精液在30℃~35℃范圍采用逐漸降溫法，在1h～2h內(nèi)使稀釋后的精液溫度降至4℃,并著裝要求進行無菌操作，嚴(yán)格禁止異味存在(酒味、煙味)。5標(biāo)準(zhǔn)下載8.2.1將液氮閥、增壓閥打開進行增壓，待液氮壓力(不能超過0.3MPa)平穩(wěn)后開始冷凍操作。8.2.2開啟冷凍程序，將冷凍儀預(yù)冷至4℃,按照9.2.1每一劑量細管凍精中總精子數(shù)≥5000萬，每一劑量細管凍精中直線前進運動精子數(shù)≥1500萬。9.2.2解凍后的精子活力≥35%以上。9.2.3解凍后的精子畸形率≤20%。9.2.4解凍后的每一細管精液中菌落數(shù)≤800個。恒溫水浴鍋溫度和相差顯微鏡恒溫板溫度均調(diào)整至37℃~38.5℃為宜。布擦干水漬，雙手搓動數(shù)下使其均勻，用細管剪刀6細管凍精應(yīng)封口良好，以25支包裝單位裝入特制的塑料拇指管內(nèi)，再以50支～200支為一個單位裝消毒紗布袋中置于液氮中貯存。11.2.1細管凍精外包裝上應(yīng)標(biāo)記有凍精制作時間、解凍后活力、制作單位、凍精數(shù)量、品種代碼及種公羊號等。11.2.2細管凍精壁上應(yīng)有鮮明的標(biāo)記：注明場名、精液制作日期、品種代號、公羊號(具體操作方法參見附錄A)。貯存凍精的低溫容器應(yīng)符合GB/T5458的規(guī)定；專人負責(zé)及時補充液氮，細管凍精應(yīng)浸在液氮中；每只公羊的凍精應(yīng)單獨貯存；貯存細管凍精的容器每年至少清洗、消毒1次并更換新鮮液氮；取放時，細管凍精離開液氮的時間不得超過10s。凍精運輸過程中應(yīng)有專人負責(zé)，貯存容器不得橫倒、碰撞和強烈振動，保證細管凍精始終浸在液氮7(資料性附錄)綿羊公羊品種代號A.1導(dǎo)言本附錄給出了最簡稱的綿羊公羊品種代號。A.2原則和方法以綿羊品種英譯漢的漢語名稱第一和第二個字的漢語拼音的第一字母組合；同一品種毛色不同的，在該品種代號前加該毛色的漢語拼音的第一字母；涉及國家為多字的，以該國的第一字和品種第一字的漢語拼音第一字母組合；如仍不能區(qū)分則再加上區(qū)分性狀的第一字的漢語拼音的第一字母；如品種代號按照上述規(guī)則簡寫后仍有重號，則品種分布較為廣泛性的取漢語名稱第一和第二個字的漢語拼音的第一字母組合；其它取第一、第二和第三個字的漢語拼音的第一字母組合；示例1:陶賽特羊的品種代號以“陶”和“塞”兩個漢語拼音第一字母組合為TS;示例2:中國美利奴羊(軍墾型)的品種代號以“中”、“美”和“軍”三個漢語拼音第一字母組A.3不同品種公羊代號不同品種公羊代號見表A.3公羊品種公羊品種阿勒泰羊羅布羊白頭