HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP：解碼重度子癇前期發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的遺傳密碼一、引言1.1研究背景與意義子癇前期（PE）是一種在妊娠20周后出現(xiàn)的多系統(tǒng)紊亂疾病，以高血壓和蛋白尿?yàn)橹饕R床表現(xiàn)，嚴(yán)重時(shí)可進(jìn)展為子癇，出現(xiàn)抽搐、昏迷等癥狀，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡的重要原因之一，全球發(fā)病率約為2%-8%。重度子癇前期作為子癇前期的嚴(yán)重階段，病情進(jìn)展迅速，可引發(fā)多種嚴(yán)重并發(fā)癥，如胎盤(pán)早剝、彌散性血管內(nèi)凝血、急性腎功能衰竭、肝破裂等，對(duì)母嬰健康構(gòu)成極大威脅。目前，子癇前期的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，涉及母體、胎盤(pán)和胎兒等多方面因素，被認(rèn)為是一種多基因參與的復(fù)雜疾病，遺傳因素在其發(fā)病中起著重要作用。人類白細(xì)胞抗原G（HLA-G）基因位于6號(hào)染色體短臂6p21.3區(qū)域，是主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類基因家族中的非經(jīng)典成員。與經(jīng)典的HLA-A、HLA-B和HLA-C等基因相比，HLA-G基因具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和功能。其表達(dá)產(chǎn)物HLA-G分子主要分布于母胎界面的滋養(yǎng)層細(xì)胞表面，在維持母胎免疫耐受中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在正常妊娠過(guò)程中，胎兒作為半同種異體移植物，其攜帶的父系抗原可被母體免疫系統(tǒng)識(shí)別，但HLA-G分子能夠通過(guò)與母體免疫細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，抑制抗原呈遞細(xì)胞的功能，阻斷T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的活化和增殖，從而避免母體免疫系統(tǒng)對(duì)胎兒的免疫排斥反應(yīng)，確保妊娠的順利進(jìn)行。此外，HLA-G分子還可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，營(yíng)造有利于胚胎著床和發(fā)育的免疫微環(huán)境。單核苷酸多態(tài)性（SNP）是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，是人類可遺傳變異中最常見(jiàn)的一種類型，平均每1000個(gè)堿基對(duì)中就可能存在1個(gè)SNP。HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)包含多個(gè)順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，該區(qū)域的SNP可通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合親和力，改變基因的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而影響HLA-G分子的表達(dá)水平。已有研究報(bào)道，HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)的某些SNP與多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如習(xí)慣性流產(chǎn)、自身免疫性疾病等。然而，HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP與重度子癇前期之間的關(guān)聯(lián)研究尚存在爭(zhēng)議，不同種族和地區(qū)的研究結(jié)果不盡相同。深入探討HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP與重度子癇前期的相關(guān)性，有助于進(jìn)一步揭示重度子癇前期的遺傳發(fā)病機(jī)制，為該疾病的早期診斷、預(yù)測(cè)和防治提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。從臨床應(yīng)用角度來(lái)看，目前臨床上對(duì)于重度子癇前期缺乏有效的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)和精準(zhǔn)治療方法。若能明確HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP與重度子癇前期的關(guān)系，通過(guò)檢測(cè)孕婦外周血中的相關(guān)基因多態(tài)性，可實(shí)現(xiàn)對(duì)高危人群的早期篩查和預(yù)警，為臨床干預(yù)提供時(shí)機(jī)，有助于降低重度子癇前期的發(fā)病率和嚴(yán)重程度，改善母嬰預(yù)后。此外，針對(duì)HLA-G基因及其調(diào)控機(jī)制的研究，還可能為開(kāi)發(fā)新的治療策略和藥物靶點(diǎn)提供思路，如通過(guò)調(diào)節(jié)HLA-G基因的表達(dá)來(lái)糾正母胎免疫失衡，為重度子癇前期的治療開(kāi)辟新途徑。綜上所述，開(kāi)展HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP與重度子癇前期的相關(guān)性研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值，有望為重度子癇前期的防治提供新的遺傳依據(jù)和干預(yù)策略，從而降低母嬰死亡率，提高人口健康素質(zhì)。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在系統(tǒng)地探討HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)單核苷酸多態(tài)性（SNP）與重度子癇前期之間的相關(guān)性。具體而言，通過(guò)收集重度子癇前期患者和正常孕婦的樣本，檢測(cè)HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)特定SNP位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布，分析其在兩組間的差異，明確這些SNP與重度子癇前期發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)；進(jìn)一步研究不同基因型對(duì)HLA-G基因表達(dá)水平的影響，從分子生物學(xué)角度揭示其可能的致病機(jī)制，為重度子癇前期的遺傳發(fā)病機(jī)制研究提供新的線索。同時(shí)，期望通過(guò)本研究篩選出與重度子癇前期相關(guān)的潛在遺傳標(biāo)志物，為該疾病的早期診斷、風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和個(gè)性化防治策略的制定提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：首先，在研究對(duì)象上，聚焦于HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)這一關(guān)鍵區(qū)域的SNP，該區(qū)域?qū)虮磉_(dá)的調(diào)控起著重要作用，但目前針對(duì)其與重度子癇前期相關(guān)性的研究相對(duì)較少，具有一定的新穎性；其次，采用了較為全面和系統(tǒng)的研究方法，不僅分析SNP與疾病的關(guān)聯(lián)性，還深入探討其對(duì)基因表達(dá)的影響，從遺傳和分子生物學(xué)多層面揭示疾病的發(fā)病機(jī)制，研究思路更為完善；此外，本研究納入的樣本具有明確的地域和種族特征，有助于補(bǔ)充不同人群中HLA-G基因多態(tài)性與重度子癇前期關(guān)系的研究數(shù)據(jù)，為全球范圍內(nèi)該疾病的研究提供有價(jià)值的參考。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，關(guān)于HLA-G基因及SNP與重度子癇前期相關(guān)性的研究開(kāi)展較早。早期研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者胎盤(pán)組織中HLA-G蛋白表達(dá)水平明顯低于正常妊娠組，提示HLA-G表達(dá)異常可能與子癇前期的發(fā)病有關(guān)。隨后，眾多學(xué)者聚焦于HLA-G基因多態(tài)性，尤其是上游調(diào)控區(qū)SNP與重度子癇前期的關(guān)聯(lián)研究。例如，有研究對(duì)歐洲人群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HLA-G基因上游-725C>G位點(diǎn)的SNP與重度子癇前期發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，攜帶G等位基因的孕婦發(fā)生重度子癇前期的風(fēng)險(xiǎn)增加，進(jìn)一步機(jī)制研究表明，該位點(diǎn)變異可能影響轉(zhuǎn)錄因子Sp1與DNA的結(jié)合，從而降低HLA-G基因的轉(zhuǎn)錄活性，減少HLA-G蛋白的表達(dá)，破壞母胎免疫耐受。在非洲人群中的研究也有類似發(fā)現(xiàn)，同時(shí)還指出HLA-G基因其他上游調(diào)控區(qū)SNP如-1618A>G等與重度子癇前期存在一定關(guān)聯(lián)，但具體作用機(jī)制尚不完全明確，可能涉及多種信號(hào)通路的改變。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究近年來(lái)也取得了一定進(jìn)展。有學(xué)者對(duì)中國(guó)漢族孕婦進(jìn)行研究，檢測(cè)HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)多個(gè)SNP位點(diǎn)，結(jié)果顯示-964A>G位點(diǎn)多態(tài)性與重度子癇前期密切相關(guān)，AA基因型可能是重度子癇前期的易感基因型，攜帶AA基因型的孕婦體內(nèi)HLA-GmRNA表達(dá)水平低于AG和GG基因型，推測(cè)該位點(diǎn)通過(guò)影響基因表達(dá)參與重度子癇前期的發(fā)病過(guò)程。此外，針對(duì)不同地域和民族的研究也陸續(xù)展開(kāi)，如對(duì)新疆維吾爾族孕婦的研究發(fā)現(xiàn)，HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP分布頻率與漢族人群存在差異，部分SNP與重度子癇前期的關(guān)聯(lián)性也有所不同，這提示不同種族和地域的遺傳背景可能對(duì)HLA-G基因多態(tài)性與重度子癇前期的關(guān)系產(chǎn)生影響。然而，目前國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果仍存在一定爭(zhēng)議。部分研究未能發(fā)現(xiàn)HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)某些SNP與重度子癇前期的明顯關(guān)聯(lián)，這種差異可能源于研究對(duì)象的種族、地域、樣本量大小、研究方法以及環(huán)境因素等多方面的影響。例如，不同種族人群的遺傳背景差異較大，基因頻率分布不同，可能導(dǎo)致研究結(jié)果不一致；小樣本量的研究可能因統(tǒng)計(jì)學(xué)效力不足而無(wú)法檢測(cè)到真實(shí)的關(guān)聯(lián)；研究方法如基因分型技術(shù)的準(zhǔn)確性、樣本采集和處理過(guò)程的差異等也可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾。總體而言，雖然國(guó)內(nèi)外在HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP與重度子癇前期相關(guān)性研究方面取得了一定成果，但仍需要進(jìn)一步深入研究，擴(kuò)大樣本量，采用多中心、大樣本的研究設(shè)計(jì)，結(jié)合不同種族和地域人群，綜合考慮遺傳和環(huán)境因素，以明確HLA-G基因多態(tài)性在重度子癇前期發(fā)病中的作用機(jī)制，為該疾病的防治提供更有力的理論支持。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1重度子癇前期概述2.1.1定義與診斷標(biāo)準(zhǔn)重度子癇前期是子癇前期的嚴(yán)重階段，對(duì)母嬰健康構(gòu)成極大威脅。根據(jù)《妊娠期高血壓疾病診治指南（2020）》，子癇前期是指妊娠20周后出現(xiàn)收縮壓≥140mmHg和（或）舒張壓≥90mmHg，且伴有下列任一項(xiàng)：尿蛋白≥0.3g/24h，或尿蛋白/肌酐比值≥0.3，或隨機(jī)尿蛋白≥（+）。而重度子癇前期則是在子癇前期的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)以下任何一種表現(xiàn)：收縮壓≥160mmHg，或舒張壓≥110mmHg（臥床休息，兩次測(cè)量間隔至少4小時(shí)）；血小板減少，即血小板計(jì)數(shù)＜100×10?/L；肝功能損害，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶水平升高，超過(guò)正常值上限2倍；嚴(yán)重持續(xù)性右上腹或上腹疼痛不能用其他疾病解釋，這可能與肝包膜下血腫或肝破裂等肝臟病變有關(guān)；腎功能損害，血肌酐水平升高超過(guò)1.1mg/dl或較基礎(chǔ)值升高2倍以上；肺水腫，可導(dǎo)致呼吸困難、低氧血癥等；視覺(jué)障礙，如視物模糊、復(fù)視等，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)失明，多因高血壓導(dǎo)致眼底病變引起。此外，還可能出現(xiàn)新發(fā)生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常癥狀，如頭痛、抽搐、昏迷等，以及胎兒生長(zhǎng)受限、羊水過(guò)少等胎盤(pán)-胎兒受累的表現(xiàn)。在臨床診斷過(guò)程中，需要綜合考慮孕婦的癥狀、體征以及各項(xiàng)檢查結(jié)果。測(cè)量血壓時(shí)，應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)方法，確保測(cè)量的準(zhǔn)確性，需注意測(cè)量前讓孕婦休息15-30分鐘，避免在剛進(jìn)食、運(yùn)動(dòng)后或情緒激動(dòng)時(shí)測(cè)量。對(duì)于尿蛋白的檢測(cè)，24小時(shí)尿蛋白定量是較為準(zhǔn)確的方法，但操作相對(duì)繁瑣，隨機(jī)尿蛋白檢測(cè)則更為便捷，可作為初步篩查手段，但需注意其假陽(yáng)性和假陰性的可能。同時(shí)，還需結(jié)合血常規(guī)、凝血功能、肝腎功能、電解質(zhì)、超聲檢查胎兒及胎盤(pán)等輔助檢查結(jié)果，全面評(píng)估病情，以明確診斷并判斷疾病的嚴(yán)重程度，為后續(xù)的治療和管理提供依據(jù)。2.1.2流行病學(xué)特征重度子癇前期的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出一定的差異，且對(duì)母嬰健康有著嚴(yán)重的危害?？傮w而言，子癇前期的全球發(fā)病率約為2%-8%，其中重度子癇前期約占子癇前期病例的10%-20%。在不同地區(qū)和種族之間，發(fā)病率存在明顯的波動(dòng)。歐美國(guó)家的子癇前期發(fā)病率相對(duì)較低，約為2%-5%，而發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率則較高，可達(dá)5%-16.7%。這種差異可能與醫(yī)療資源的可及性、孕產(chǎn)婦保健水平、生活方式以及遺傳背景等多種因素有關(guān)。例如，在醫(yī)療資源豐富、孕產(chǎn)婦保健體系完善的地區(qū)，能夠通過(guò)早期篩查和干預(yù)，有效降低子癇前期的發(fā)生率；而在一些醫(yī)療條件相對(duì)落后的地區(qū)，由于缺乏及時(shí)的診斷和治療，發(fā)病率則相對(duì)較高。種族差異也在子癇前期的發(fā)病中起到重要作用。研究表明，黑人及非裔美國(guó)人的子癇前期發(fā)病率和死亡率明顯高于白人女性，且差距有逐步擴(kuò)大的趨勢(shì)；而亞洲女性的發(fā)病率相對(duì)較低。這種種族間的差異可能與遺傳因素密切相關(guān)，不同種族人群的基因多態(tài)性分布不同，可能影響了子癇前期的易感性。此外，一些研究還發(fā)現(xiàn)，子癇前期的發(fā)病率與孕婦的年齡、孕產(chǎn)次、肥胖、慢性疾?。ㄈ绺哐獕骸⑻悄虿?、慢性腎病等）、輔助生殖技術(shù)受孕等因素有關(guān)。年齡≥35歲的高齡孕婦、初產(chǎn)婦、孕前體質(zhì)量指數(shù)（BMI）過(guò)高、患有慢性疾病以及通過(guò)輔助生殖技術(shù)受孕的孕婦，發(fā)生子癇前期的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。重度子癇前期對(duì)母嬰健康的危害極大，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡的重要原因之一。對(duì)于孕產(chǎn)婦而言，重度子癇前期可引發(fā)多種嚴(yán)重并發(fā)癥，如胎盤(pán)早剝、彌散性血管內(nèi)凝血、急性腎功能衰竭、肝破裂、腦出血等，這些并發(fā)癥嚴(yán)重威脅著孕產(chǎn)婦的生命安全。同時(shí)，子癇前期還與孕產(chǎn)婦遠(yuǎn)期心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)，如高血壓、冠心病、心力衰竭等，對(duì)女性的長(zhǎng)期健康產(chǎn)生不良影響。在圍生兒方面，重度子癇前期可導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)受限、胎兒窘迫、早產(chǎn)、新生兒窒息、低出生體重等不良結(jié)局，增加圍生兒死亡率和患病率。此外，對(duì)子代的遠(yuǎn)期健康也可能產(chǎn)生潛在影響，如影響子代的心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等。因此，深入了解重度子癇前期的流行病學(xué)特征，對(duì)于制定針對(duì)性的預(yù)防和干預(yù)措施，降低發(fā)病率，改善母嬰預(yù)后具有重要意義。2.1.3發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展重度子癇前期的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，至今尚未完全明確，目前主要存在以下幾種理論。免疫失衡理論認(rèn)為，正常妊娠是一種成功的半同種異體移植，母體免疫系統(tǒng)需要對(duì)胎兒抗原產(chǎn)生免疫耐受。在子癇前期患者中，這種免疫平衡被打破，母體免疫系統(tǒng)對(duì)胎兒抗原產(chǎn)生過(guò)度的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致免疫細(xì)胞活化、細(xì)胞因子失衡等一系列免疫異常反應(yīng)。例如，自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的活性和數(shù)量改變，其對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的殺傷作用增強(qiáng)，影響胎盤(pán)的正常發(fā)育和功能；輔助性T細(xì)胞（Th）亞群失衡，Th1/Th2比值升高，Th1型細(xì)胞因子如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等分泌增加，引發(fā)炎癥反應(yīng)，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞。血管內(nèi)皮損傷理論指出，血管內(nèi)皮細(xì)胞在維持血管穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。在子癇前期時(shí)，多種因素如氧化應(yīng)激、炎癥因子、抗血管生成因子等可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量活性氧（ROS）可攻擊血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸，破壞其結(jié)構(gòu)和功能；炎癥因子如TNF-α、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，促進(jìn)炎癥細(xì)胞黏附、浸潤(rùn)，進(jìn)一步加重內(nèi)皮損傷；抗血管生成因子如可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-1（sFlt-1）水平升高，與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等結(jié)合，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成，導(dǎo)致胎盤(pán)血管灌注不足。血管內(nèi)皮損傷后，血管收縮、舒張功能失調(diào)，血壓升高，同時(shí)血管通透性增加，導(dǎo)致蛋白尿的出現(xiàn)。胎盤(pán)淺著床理論強(qiáng)調(diào)，正常妊娠時(shí)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞會(huì)侵入子宮螺旋動(dòng)脈，使其發(fā)生重鑄，管徑增大，血流增加，以滿足胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的需求。而在子癇前期患者中，滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)能力受損，胎盤(pán)著床較淺，子宮螺旋動(dòng)脈重鑄不足，導(dǎo)致胎盤(pán)缺血、缺氧。胎盤(pán)缺血缺氧會(huì)激活一系列病理生理過(guò)程，如釋放大量的細(xì)胞因子、抗血管生成因子等，這些物質(zhì)進(jìn)入母體循環(huán)，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)皮損傷，進(jìn)而導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生發(fā)展。此外，遺傳因素在重度子癇前期的發(fā)病中也起著重要作用，多個(gè)基因的多態(tài)性被認(rèn)為與子癇前期的易感性相關(guān)，如HLA-G基因、血管緊張素原基因、內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因等。在這些發(fā)病機(jī)制理論中，HLA-G基因作為免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因，其在重度子癇前期發(fā)病機(jī)制中的研究方向備受關(guān)注。HLA-G基因主要表達(dá)于母胎界面的滋養(yǎng)層細(xì)胞表面，在維持母胎免疫耐受中發(fā)揮著重要作用。研究表明，HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)的單核苷酸多態(tài)性（SNP）可能影響基因的表達(dá)水平，進(jìn)而影響母胎免疫平衡。某些SNP位點(diǎn)的變異可能導(dǎo)致HLA-G分子表達(dá)降低，無(wú)法有效抑制母體免疫系統(tǒng)對(duì)胎兒的免疫排斥反應(yīng)，從而增加子癇前期的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。進(jìn)一步深入研究HLA-G基因及其多態(tài)性在重度子癇前期發(fā)病機(jī)制中的作用，有助于揭示疾病的遺傳發(fā)病機(jī)制，為疾病的早期診斷、預(yù)測(cè)和防治提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。2.2HLA-G基因及其功能2.2.1HLA-G基因結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)HLA-G基因作為人類白細(xì)胞抗原（HLA）系統(tǒng)中的非經(jīng)典Ⅰ類基因，在維持機(jī)體免疫平衡，尤其是母胎免疫耐受方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其定位于人類6號(hào)染色體短臂6p21.3區(qū)域，處于主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類基因家族之中。從基因結(jié)構(gòu)上看，HLA-G基因與經(jīng)典的HLA-A、HLA-B和HLA-C等基因具有一定的同源性，都包含8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子。外顯子1主要負(fù)責(zé)編碼信號(hào)肽，這一信號(hào)肽在蛋白質(zhì)的合成與運(yùn)輸過(guò)程中起著引導(dǎo)作用，確保HLA-G蛋白能夠準(zhǔn)確地運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞的特定位置；外顯子2至4則編碼胞外α1～α3區(qū)，這些區(qū)域在與免疫細(xì)胞表面受體的識(shí)別與結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是HLA-G蛋白行使免疫調(diào)節(jié)功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；外顯子5編碼跨膜域，該跨膜域使得HLA-G蛋白能夠鑲嵌在細(xì)胞膜上，穩(wěn)定地存在于細(xì)胞表面；外顯子6至8負(fù)責(zé)編碼胞漿區(qū)。然而，HLA-G基因也具有其獨(dú)特之處。與經(jīng)典HLAⅠ類基因相比，其編碼的HLA-G蛋白胞內(nèi)段顯著縮短，僅包含9個(gè)氨基酸，而經(jīng)典HLAⅠ類抗原的胞內(nèi)段通常含有30多個(gè)氨基酸。這一結(jié)構(gòu)差異使得HLA-G蛋白的自發(fā)性內(nèi)吞明顯減少，細(xì)胞表面HLA-G分子的更新速度極為緩慢。這種緩慢的更新速度使得HLA-G分子能夠在細(xì)胞表面長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存在，持續(xù)發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，也導(dǎo)致HLA-G蛋白對(duì)外源性抗原的呈遞效率低下，這與經(jīng)典HLAⅠ類基因高效呈遞抗原的功能形成鮮明對(duì)比。在轉(zhuǎn)錄水平上，HLA-G基因具有獨(dú)特的選擇性剪切機(jī)制，能夠產(chǎn)生7種mRNA異構(gòu)體。這些異構(gòu)體可進(jìn)一步分為4種膜結(jié)合型（HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4）和3種可溶性分子（HLA-G5、HLA-G6、HLA-G7）。不同的異構(gòu)體在結(jié)構(gòu)和功能上存在一定差異，它們?cè)谀柑ソ缑婕澳阁w血循環(huán)中發(fā)揮著各自獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用。例如，膜結(jié)合型的HLA-G分子主要表達(dá)于母胎界面的滋養(yǎng)層細(xì)胞表面，通過(guò)與母體免疫細(xì)胞表面的特異性受體直接結(jié)合，抑制免疫細(xì)胞的活化和增殖；而可溶性的HLA-G分子則可以在體液中循環(huán)，遠(yuǎn)距離調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，營(yíng)造有利于胚胎著床和發(fā)育的免疫微環(huán)境。2.2.2HLA-G蛋白的免疫調(diào)節(jié)作用HLA-G蛋白在免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色，尤其是在母胎免疫耐受方面，其獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能對(duì)于維持正常妊娠起著關(guān)鍵作用。HLA-G蛋白能夠與多種免疫細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，從而抑制免疫細(xì)胞的活化和增殖。自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）作為免疫系統(tǒng)中的重要成員，具有強(qiáng)大的細(xì)胞毒性，能夠識(shí)別并殺傷被病原體感染的細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞。在母胎界面，NK細(xì)胞若被過(guò)度活化，可能會(huì)對(duì)胎兒這一半同種異體移植物產(chǎn)生免疫攻擊。而HLA-G蛋白可以與NK細(xì)胞表面的殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（KIR）2DL4等受體結(jié)合，通過(guò)傳遞抑制性信號(hào)，阻斷NK細(xì)胞的活化過(guò)程，抑制其細(xì)胞毒性，從而避免NK細(xì)胞對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞和胎兒的損傷。對(duì)于T細(xì)胞，HLA-G蛋白同樣具有抑制作用。T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，其活化和增殖需要抗原呈遞細(xì)胞的刺激。HLA-G蛋白可以通過(guò)與T細(xì)胞表面的相關(guān)受體結(jié)合，干擾T細(xì)胞的活化信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌。具體來(lái)說(shuō)，HLA-G蛋白能夠抑制T細(xì)胞表面TCR-CD3復(fù)合物的活化，減少下游信號(hào)分子的磷酸化，從而阻礙T細(xì)胞的活化和增殖。此外，HLA-G蛋白還能調(diào)節(jié)抗原呈遞細(xì)胞的功能。樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，能夠攝取、加工和呈遞抗原，激活T細(xì)胞。HLA-G蛋白可以與DC表面的受體結(jié)合，抑制DC的成熟和功能，使其無(wú)法有效地激活T細(xì)胞。在母胎界面，這種抑制作用可以防止母體免疫系統(tǒng)對(duì)胎兒抗原產(chǎn)生過(guò)度的免疫應(yīng)答，維持母胎免疫耐受。HLA-G蛋白還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，營(yíng)造有利于胚胎著床和發(fā)育的免疫微環(huán)境。在正常妊娠過(guò)程中，母胎界面存在著Th1/Th2型細(xì)胞因子的平衡。Th1型細(xì)胞因子如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等主要參與細(xì)胞免疫，具有較強(qiáng)的免疫殺傷作用；而Th2型細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等則主要參與體液免疫，具有免疫抑制和抗炎作用。HLA-G蛋白能夠促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子的分泌，抑制Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而維持母胎界面的免疫微環(huán)境向免疫耐受方向發(fā)展。研究表明，在HLA-G蛋白表達(dá)正常的情況下，母胎界面的Th2型細(xì)胞因子水平升高，有利于胚胎的著床和發(fā)育；而當(dāng)HLA-G蛋白表達(dá)異常時(shí)，Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡失調(diào)，Th1型細(xì)胞因子相對(duì)增多，可能導(dǎo)致母體對(duì)胎兒的免疫排斥反應(yīng)增強(qiáng)，增加妊娠失敗的風(fēng)險(xiǎn)。2.2.3HLA-G基因在正常妊娠與病理妊娠中的表達(dá)差異在正常妊娠過(guò)程中，HLA-G基因呈現(xiàn)出高度特異性的表達(dá)模式，主要表達(dá)于母胎界面的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞表面。這一獨(dú)特的表達(dá)位置使得HLA-G分子能夠直接與母體免疫系統(tǒng)接觸，發(fā)揮其關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)作用，維持母胎免疫耐受。在妊娠早期，胚胎著床時(shí)，HLA-G基因的表達(dá)水平迅速升高。此時(shí)，滋養(yǎng)層細(xì)胞開(kāi)始侵入母體子宮蛻膜，HLA-G分子通過(guò)與母體免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合，抑制免疫細(xì)胞的活化，避免母體免疫系統(tǒng)對(duì)胚胎的排斥反應(yīng)，為胚胎的著床和早期發(fā)育創(chuàng)造一個(gè)免疫豁免的微環(huán)境。隨著妊娠的進(jìn)展，在整個(gè)孕期中，HLA-G基因持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，其表達(dá)水平維持在一定范圍內(nèi)，確保母胎免疫平衡的穩(wěn)定維持。在妊娠晚期，雖然胎兒逐漸發(fā)育成熟，但HLA-G基因的表達(dá)依然不可或缺，它繼續(xù)調(diào)節(jié)母體免疫系統(tǒng)，防止早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。然而，在病理妊娠中，如子癇前期、習(xí)慣性流產(chǎn)等，HLA-G基因的表達(dá)常常出現(xiàn)異常。以子癇前期為例，大量研究表明，子癇前期患者胎盤(pán)組織中HLA-G基因的表達(dá)水平明顯低于正常妊娠組。這種表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致HLA-G蛋白的合成減少，無(wú)法充分發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能。由于HLA-G蛋白的缺乏，母體免疫系統(tǒng)對(duì)胎兒抗原的免疫耐受機(jī)制被破壞，免疫細(xì)胞過(guò)度活化，引發(fā)一系列免疫病理反應(yīng)。自然殺傷細(xì)胞的活性增強(qiáng)，對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的殺傷作用加劇，導(dǎo)致胎盤(pán)血管灌注不足；T細(xì)胞的異?；罨沟眉?xì)胞因子失衡，Th1型細(xì)胞因子大量分泌，引發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步損傷胎盤(pán)和血管內(nèi)皮細(xì)胞。這些病理變化最終導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生和發(fā)展，嚴(yán)重威脅母嬰健康。在習(xí)慣性流產(chǎn)患者中，也觀察到類似的HLA-G基因表達(dá)異常情況。研究發(fā)現(xiàn)，習(xí)慣性流產(chǎn)患者的絨毛組織中HLA-G基因表達(dá)降低，使得母體免疫系統(tǒng)無(wú)法有效識(shí)別和耐受胚胎抗原，從而導(dǎo)致胚胎被母體免疫系統(tǒng)排斥，增加了流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。此外，一些研究還表明，HLA-G基因表達(dá)異?？赡芘c其他病理妊娠如胎兒生長(zhǎng)受限、妊娠期糖尿病等也存在一定關(guān)聯(lián)。雖然具體的作用機(jī)制尚未完全明確，但推測(cè)可能與HLA-G蛋白免疫調(diào)節(jié)功能受損，影響胎盤(pán)的正常發(fā)育和功能，以及母胎界面的免疫平衡失調(diào)有關(guān)。因此，深入研究HLA-G基因在正常妊娠與病理妊娠中的表達(dá)差異及其機(jī)制，對(duì)于揭示病理妊娠的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的診斷和治療靶點(diǎn)具有重要意義。2.3SNP的概念與作用機(jī)制2.3.1SNP的定義與分類單核苷酸多態(tài)性（SNP）是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。這種變異包括單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等情況，但通常所說(shuō)的SNP主要是指二等位多態(tài)性，即由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或顛換導(dǎo)致的兩種等位基因形式。SNP在人類基因組中廣泛分布，平均每500-1000個(gè)堿基對(duì)中就可能存在1個(gè)，其總數(shù)估計(jì)可達(dá)300萬(wàn)個(gè)甚至更多。根據(jù)SNP在基因中的位置和對(duì)基因功能的影響，可將其分為不同類型。同義SNP，這類SNP位于基因的編碼區(qū)，雖然導(dǎo)致了DNA序列的改變，但由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，其編碼的氨基酸序列并未發(fā)生改變，因此對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能通常沒(méi)有直接影響。非同義SNP同樣位于編碼區(qū)，但其堿基的變異會(huì)導(dǎo)致編碼的氨基酸序列發(fā)生改變，從而可能影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。這種改變可能會(huì)使蛋白質(zhì)的活性、穩(wěn)定性、與其他分子的相互作用等方面發(fā)生變化，進(jìn)而對(duì)生物體的生理過(guò)程產(chǎn)生影響。調(diào)控區(qū)SNP則位于基因的上游調(diào)控區(qū)（如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等）或下游調(diào)控區(qū)，這些區(qū)域包含了許多基因表達(dá)調(diào)控元件，如轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。調(diào)控區(qū)SNP的存在可能會(huì)改變這些調(diào)控元件的序列，影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合親和力，從而對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄效率等產(chǎn)生影響，最終調(diào)控基因的表達(dá)水平。還有一些SNP位于基因的內(nèi)含子區(qū)域，雖然內(nèi)含子在基因表達(dá)過(guò)程中不直接編碼蛋白質(zhì)，但其中的SNP可能會(huì)影響mRNA的剪接過(guò)程，導(dǎo)致不同的剪接異構(gòu)體產(chǎn)生，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的合成和功能。2.3.2SNP對(duì)基因表達(dá)和功能的影響SNP對(duì)基因表達(dá)和功能的影響是多方面且復(fù)雜的，其作用機(jī)制涉及多個(gè)層面。在基因表達(dá)調(diào)控方面，位于基因上游調(diào)控區(qū)的SNP，如啟動(dòng)子區(qū)域的SNP，可通過(guò)改變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)來(lái)影響基因的轉(zhuǎn)錄活性。轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠特異性結(jié)合DNA序列的蛋白質(zhì)，它們通過(guò)與啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，啟動(dòng)或調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。當(dāng)啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生SNP時(shí)，可能會(huì)使轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合親和力增強(qiáng)或減弱。若結(jié)合親和力增強(qiáng)，可能會(huì)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，從而增加基因的轉(zhuǎn)錄效率，使基因表達(dá)水平升高；反之，若結(jié)合親和力減弱，轉(zhuǎn)錄因子難以與DNA結(jié)合，基因的轉(zhuǎn)錄效率降低，表達(dá)水平也隨之下降。例如，某些基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在特定的SNP，該SNP會(huì)改變轉(zhuǎn)錄因子Sp1的結(jié)合位點(diǎn)，使得Sp1與DNA的結(jié)合能力發(fā)生變化，進(jìn)而影響基因的轉(zhuǎn)錄活性和表達(dá)水平。SNP還可能影響mRNA的剪接過(guò)程。在真核生物中，基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的初始mRNA需要經(jīng)過(guò)剪接加工，去除內(nèi)含子序列，將外顯子連接起來(lái)，形成成熟的mRNA，才能進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯。內(nèi)含子區(qū)域的SNP可能會(huì)影響剪接位點(diǎn)的識(shí)別和剪接過(guò)程的正常進(jìn)行。某些SNP可能會(huì)導(dǎo)致剪接位點(diǎn)的激活或失活，使mRNA的剪接方式發(fā)生改變，產(chǎn)生不同的剪接異構(gòu)體。這些不同的剪接異構(gòu)體可能編碼不同的蛋白質(zhì)，或者雖然編碼相同的蛋白質(zhì)，但蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能可能會(huì)受到影響。例如，β-珠蛋白基因的內(nèi)含子區(qū)域存在SNP，該SNP會(huì)導(dǎo)致異常的剪接，產(chǎn)生異常的mRNA，最終導(dǎo)致β-地中海貧血等疾病的發(fā)生。對(duì)于編碼區(qū)的SNP，非同義SNP會(huì)直接改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列，從而對(duì)蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生影響。蛋白質(zhì)的功能取決于其氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)，氨基酸序列的改變可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的折疊方式、活性中心的結(jié)構(gòu)、與其他分子的相互作用等發(fā)生變化。某些非同義SNP可能會(huì)使酶的活性位點(diǎn)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶的催化活性降低或喪失；或者使受體蛋白的配體結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生變化，影響受體與配體的結(jié)合能力，進(jìn)而干擾信號(hào)傳導(dǎo)通路。而同義SNP雖然不改變氨基酸序列，但近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，它也可能通過(guò)影響mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)、翻譯效率以及蛋白質(zhì)的折疊和定位等，對(duì)蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生間接影響。2.3.3SNP在疾病遺傳研究中的重要性SNP在疾病遺傳研究中具有至關(guān)重要的地位，為深入理解疾病的遺傳機(jī)制、預(yù)測(cè)疾病風(fēng)險(xiǎn)以及開(kāi)發(fā)個(gè)性化治療方案提供了關(guān)鍵線索。在疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)方面，許多復(fù)雜疾病如心血管疾病、糖尿病、癌癥以及本文所關(guān)注的重度子癇前期等，都是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。SNP作為人類基因組中最常見(jiàn)的遺傳變異形式，與這些復(fù)雜疾病的易感性密切相關(guān)。通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）等技術(shù)，科學(xué)家們能夠?qū)Υ罅繕颖镜幕蚪M進(jìn)行掃描，識(shí)別出與特定疾病相關(guān)的SNP位點(diǎn)。這些與疾病相關(guān)的SNP可以作為遺傳標(biāo)記，用于評(píng)估個(gè)體患某種疾病的風(fēng)險(xiǎn)。如果一個(gè)個(gè)體攜帶了多個(gè)與心血管疾病相關(guān)的SNP，那么他患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)可能相對(duì)較高。基于這些SNP標(biāo)記，還可以開(kāi)發(fā)出疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型，為個(gè)體提供個(gè)性化的疾病預(yù)防建議和健康管理方案。在疾病機(jī)制研究領(lǐng)域，SNP發(fā)揮著不可或缺的作用。通過(guò)研究與疾病相關(guān)的SNP及其所在基因的功能，能夠深入揭示疾病的分子發(fā)病機(jī)制。某些SNP可能位于關(guān)鍵基因的調(diào)控區(qū)域，影響基因的表達(dá)水平，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)生物學(xué)通路的異常，最終引發(fā)疾病。在癌癥研究中，發(fā)現(xiàn)一些SNP位于腫瘤抑制基因或癌基因的調(diào)控區(qū)，它們通過(guò)改變基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。對(duì)于重度子癇前期，研究HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)的SNP，有助于了解這些SNP如何影響HLA-G基因的表達(dá)，以及HLA-G基因表達(dá)異常如何導(dǎo)致母胎免疫失衡和血管內(nèi)皮損傷等病理過(guò)程，從而揭示重度子癇前期的遺傳發(fā)病機(jī)制。SNP在遺傳病診斷方面也具有重要應(yīng)用價(jià)值。對(duì)于一些單基因遺傳病，如囊性纖維化、鐮狀細(xì)胞貧血等，特定的SNP是疾病發(fā)生的直接原因。通過(guò)檢測(cè)這些致病SNP，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)遺傳病的早期診斷和產(chǎn)前診斷。在產(chǎn)前診斷中，通過(guò)采集孕婦的羊水、絨毛或外周血等樣本，檢測(cè)胎兒是否攜帶致病SNP，能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)胎兒是否患有遺傳病，為家庭提供遺傳咨詢和決策依據(jù)，避免嚴(yán)重遺傳病患兒的出生。此外，SNP還可用于藥物基因組學(xué)研究，了解個(gè)體對(duì)藥物的代謝和反應(yīng)差異，為個(gè)性化用藥提供依據(jù)，提高藥物治療的效果和安全性。三、研究設(shè)計(jì)與方法3.1研究對(duì)象的選擇3.1.1病例組與對(duì)照組的納入標(biāo)準(zhǔn)病例組為重度子癇前期患者，納入標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格遵循《妊娠期高血壓疾病診治指南（2020）》。具體而言，患者需在妊娠20周后首次出現(xiàn)收縮壓≥160mmHg和（或）舒張壓≥110mmHg，同時(shí)伴有以下情況之一：24小時(shí)尿蛋白定量≥2.0g；或隨機(jī)尿蛋白≥（++）；或尿蛋白/肌酐比值≥2.0；或出現(xiàn)血小板減少，血小板計(jì)數(shù)＜100×10?/L；或肝功能損害，表現(xiàn)為血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平升高，超過(guò)正常值上限2倍；或腎功能損害，血肌酐水平升高超過(guò)1.1mg/dl或較基礎(chǔ)值升高2倍以上；或出現(xiàn)嚴(yán)重持續(xù)性右上腹或上腹疼痛不能用其他疾病解釋；或發(fā)生肺水腫；或出現(xiàn)視覺(jué)障礙，如視物模糊、復(fù)視等；或有新發(fā)生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常癥狀，如頭痛、抽搐、昏迷等。所有病例均經(jīng)過(guò)至少兩名具有豐富臨床經(jīng)驗(yàn)的婦產(chǎn)科醫(yī)生根據(jù)指南標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確診，并詳細(xì)記錄患者的臨床資料，包括年齡、孕周、孕產(chǎn)次、既往病史、家族史等。對(duì)照組選取同期在我院進(jìn)行產(chǎn)檢和分娩的正常孕婦。納入標(biāo)準(zhǔn)為：孕期血壓始終維持在正常范圍，即收縮壓＜140mmHg且舒張壓＜90mmHg；尿蛋白檢測(cè)陰性；無(wú)其他妊娠合并癥及并發(fā)癥，如妊娠期糖尿病、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥、甲狀腺疾病等；無(wú)慢性疾病史，如高血壓、糖尿病、心臟病、腎臟疾病等；無(wú)家族遺傳性疾病史。同樣，對(duì)對(duì)照組孕婦的臨床資料進(jìn)行詳細(xì)收集和記錄，確保與病例組在年齡、孕周、孕產(chǎn)次等方面具有可比性，以減少混雜因素對(duì)研究結(jié)果的影響。3.1.2樣本量的估算依據(jù)樣本量的估算依據(jù)主要基于統(tǒng)計(jì)學(xué)原理和既往相關(guān)研究的數(shù)據(jù)。在進(jìn)行病例-對(duì)照研究時(shí)，樣本量的大小直接影響研究結(jié)果的可靠性和統(tǒng)計(jì)學(xué)效力。本研究采用公式法進(jìn)行樣本量估算，參考公式為：n=\frac{(Z_{α/2}+Z_{β})^2×2pq}{(p1-p2)^2}，其中n為每組所需樣本量，Z_{α/2}為雙側(cè)α水平對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布分位數(shù)，Z_{β}為β水平對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布分位數(shù)，p為預(yù)期的總體患病率，q=1-p，p1和p2分別為病例組和對(duì)照組中某因素的暴露率。在本研究中，α設(shè)定為0.05（雙側(cè)），對(duì)應(yīng)的Z_{α/2}=1.96；β設(shè)定為0.2，對(duì)應(yīng)的Z_{β}=0.84。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)某些SNP在重度子癇前期患者中的突變率（即暴露率p1）約為30%，在正常孕婦中的突變率（p2）約為15%。預(yù)期的總體患病率p采用前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中病例組和對(duì)照組合并計(jì)算的患病率，經(jīng)計(jì)算約為22.5%，則q=1-0.225=0.775。將上述參數(shù)代入公式可得：\begin{align*}n&=\frac{(1.96+0.84)^2??2??0.225??0.775}{(0.3-0.15)^2}\\&=\frac{(2.8)^2??2??0.225??0.775}{(0.15)^2}\\&=\frac{7.84??2??0.225??0.775}{0.0225}\\&=\frac{7.84??0.34875}{0.0225}\\&=\frac{2.7342}{0.0225}\\&\approx121.52\end{align*}考慮到研究過(guò)程中可能存在的樣本丟失、數(shù)據(jù)缺失等情況，為確保研究結(jié)果的可靠性，適當(dāng)增加樣本量，最終確定每組樣本量為150例，即病例組和對(duì)照組各納入150名孕婦。同時(shí)，在研究過(guò)程中密切關(guān)注樣本量的實(shí)際情況，若出現(xiàn)樣本量不足或其他特殊情況，及時(shí)進(jìn)行調(diào)整和補(bǔ)充。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1樣本采集與處理在研究過(guò)程中，樣本的采集與處理是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。對(duì)于血液樣本的采集，選取病例組和對(duì)照組孕婦在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行靜脈采血，以減少飲食等因素對(duì)血液成分的影響。使用一次性無(wú)菌采血針和含乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的真空采血管，采集5ml外周靜脈血。這一過(guò)程嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則，在采血前對(duì)穿刺部位進(jìn)行嚴(yán)格消毒，以防止細(xì)菌等微生物污染血液樣本，影響后續(xù)檢測(cè)結(jié)果。采血完成后，將血液樣本迅速送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。采用常規(guī)的離心方法，在4℃條件下，以3000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10分鐘。通過(guò)離心，使血液中的細(xì)胞成分和血漿分離，將上層血漿轉(zhuǎn)移至無(wú)菌凍存管中，用于后續(xù)的DNA提取。將下層含有白細(xì)胞的細(xì)胞層也小心收集起來(lái)，因?yàn)榘准?xì)胞中含有豐富的基因組DNA，是提取HLA-G基因的重要來(lái)源。提取DNA時(shí)，選用經(jīng)過(guò)多次驗(yàn)證、穩(wěn)定性高的DNA提取試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行提取。這一過(guò)程包括細(xì)胞裂解、DNA吸附、洗滌雜質(zhì)以及洗脫DNA等關(guān)鍵步驟，每個(gè)步驟都嚴(yán)格控制操作條件和時(shí)間，以確保提取的DNA質(zhì)量和純度。提取后的DNA采用超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度和純度，確保OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，以保證DNA的純度符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。將提取好的DNA分裝至無(wú)菌凍存管中，每管分裝適量的DNA，標(biāo)記好樣本編號(hào)，儲(chǔ)存于-80℃超低溫冰箱中保存，避免DNA反復(fù)凍融，以維持其穩(wěn)定性。在整個(gè)樣本采集與處理過(guò)程中，對(duì)每個(gè)樣本的采集時(shí)間、采集人員、處理過(guò)程等信息都進(jìn)行詳細(xì)記錄，建立完善的樣本信息管理系統(tǒng)，以便后續(xù)查詢和追溯。3.2.2HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP檢測(cè)技術(shù)本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)檢測(cè)HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)的SNP。該技術(shù)基于限制性內(nèi)切酶能夠識(shí)別并切割特定DNA序列的原理，當(dāng)DNA序列中存在SNP位點(diǎn)時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的改變，從而使酶切后的DNA片段長(zhǎng)度發(fā)生變化，通過(guò)電泳分析這些片段長(zhǎng)度的差異，即可判斷SNP位點(diǎn)的基因型。首先，根據(jù)GenBank中HLA-G基因序列，利用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)特異性引物，以擴(kuò)增包含目標(biāo)SNP位點(diǎn)的基因片段。引物設(shè)計(jì)時(shí)，充分考慮引物的長(zhǎng)度、GC含量、Tm值等因素，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。引物序列如下：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。引物由專業(yè)的生物公司合成，合成后進(jìn)行純度和濃度檢測(cè)，確保引物質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積為25μl，其中包含10×PCR緩沖液2.5μl、dNTP混合物（各2.5mmol/L）2μl、上下游引物（10μmol/L）各1μl、TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.2μl、模板DNA2μl，用雙蒸水補(bǔ)足至25μl。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5分鐘，使DNA雙鏈充分解開(kāi)；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30秒，使DNA雙鏈再次變性；[退火溫度]退火30秒，在此溫度下引物與模板DNA特異性結(jié)合；72℃延伸30秒，在TaqDNA聚合酶的作用下，以引物為起點(diǎn)，沿著模板DNA合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10分鐘，確保所有的DNA片段都得到充分延伸。擴(kuò)增完成后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶大小和亮度，判斷擴(kuò)增是否成功。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)。根據(jù)目標(biāo)SNP位點(diǎn)的序列，選擇合適的限制性內(nèi)切酶，如對(duì)于[具體SNP位點(diǎn)]，選用[限制性內(nèi)切酶名稱]。酶切反應(yīng)體系為20μl，包含10μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物、10×酶切緩沖液2μl、限制性內(nèi)切酶（10U/μl）1μl，用雙蒸水補(bǔ)足至20μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，置于[酶切溫度]恒溫培養(yǎng)箱中孵育[酶切時(shí)間]，使限制性內(nèi)切酶充分作用于PCR產(chǎn)物。酶切完成后，取10μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳分析。在電泳過(guò)程中，不同長(zhǎng)度的DNA片段在電場(chǎng)的作用下在凝膠中遷移速率不同，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的電泳后，不同基因型的酶切產(chǎn)物會(huì)在凝膠上形成不同的條帶。通過(guò)與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)條帶的位置和數(shù)量，判斷樣本的基因型。若酶切后出現(xiàn)[具體條帶組合1]，則判定為野生型純合子；若出現(xiàn)[具體條帶組合2]，則判定為突變型純合子；若出現(xiàn)[具體條帶組合3]，則判定為雜合子。3.2.3數(shù)據(jù)質(zhì)量控制措施在樣本采集階段，嚴(yán)格按照納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)篩選研究對(duì)象，確保病例組和對(duì)照組的準(zhǔn)確性和可比性。詳細(xì)詢問(wèn)孕婦的病史、家族史、孕期情況等信息，避免因混雜因素導(dǎo)致研究結(jié)果偏差。對(duì)于采集的血液樣本，在采集后立即進(jìn)行標(biāo)記和記錄，確保樣本信息的完整性和準(zhǔn)確性。嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，防止樣本污染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在樣本運(yùn)輸過(guò)程中，采用專用的樣本運(yùn)輸箱，保持低溫環(huán)境，確保樣本的穩(wěn)定性。在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，定期對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)和維護(hù)，確保儀器的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。如PCR儀、核酸蛋白測(cè)定儀、離心機(jī)等關(guān)鍵儀器，按照儀器使用說(shuō)明書(shū)的要求，定期進(jìn)行溫度校準(zhǔn)、轉(zhuǎn)速校準(zhǔn)等操作。每次實(shí)驗(yàn)前，對(duì)實(shí)驗(yàn)試劑進(jìn)行質(zhì)量檢查，查看試劑的有效期、外觀、性狀等，確保試劑質(zhì)量合格。同時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照采用無(wú)菌水代替模板DNA，用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中是否存在污染；陽(yáng)性對(duì)照采用已知基因型的樣本，用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性和可靠性。在DNA提取和PCR擴(kuò)增等關(guān)鍵步驟中，嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行操作，避免因操作不當(dāng)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差。對(duì)實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行嚴(yán)格的培訓(xùn)和考核，確保其熟練掌握實(shí)驗(yàn)技術(shù)和操作流程，提高實(shí)驗(yàn)操作的一致性和準(zhǔn)確性。在數(shù)據(jù)分析階段，采用雙人雙錄入的方式錄入實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，減少數(shù)據(jù)錄入錯(cuò)誤。錄入完成后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行邏輯檢查和異常值排查，如檢查基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，對(duì)于不符合平衡定律的數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步核實(shí)和分析。運(yùn)用專業(yè)的統(tǒng)計(jì)軟件，如SPSS22.0、R語(yǔ)言等進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)類型和研究目的選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法，如對(duì)于計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，對(duì)于計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)或方差分析等。在統(tǒng)計(jì)分析過(guò)程中，嚴(yán)格控制檢驗(yàn)水準(zhǔn)，設(shè)定α=0.05，避免因統(tǒng)計(jì)方法選擇不當(dāng)或檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)定不合理導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論。同時(shí)，對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行敏感性分析，評(píng)估研究結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。3.3數(shù)據(jù)分析方法3.3.1統(tǒng)計(jì)分析軟件的選擇本研究采用SPSS22.0和R語(yǔ)言進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。SPSS作為一款廣泛應(yīng)用的統(tǒng)計(jì)分析軟件，具有操作簡(jiǎn)便、界面友好的特點(diǎn)。其擁有豐富的統(tǒng)計(jì)分析模塊，涵蓋了描述性統(tǒng)計(jì)分析、相關(guān)性分析、差異性檢驗(yàn)、回歸分析等多種常用統(tǒng)計(jì)方法。對(duì)于本研究中涉及的病例組和對(duì)照組基本特征的描述，如年齡、孕周、孕產(chǎn)次等計(jì)量資料的統(tǒng)計(jì)描述（計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差等），以及計(jì)數(shù)資料（如不同基因型的例數(shù)）的統(tǒng)計(jì)描述，SPSS都能通過(guò)簡(jiǎn)單的操作步驟快速得出結(jié)果。在進(jìn)行組間差異性檢驗(yàn)時(shí)，無(wú)論是兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（用于比較病例組和對(duì)照組計(jì)量資料的差異），還是卡方檢驗(yàn)（用于比較兩組計(jì)數(shù)資料的差異），SPSS的操作界面都十分直觀，只需按照提示輸入數(shù)據(jù)和選擇相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)方法，即可得到準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)結(jié)果和詳細(xì)的統(tǒng)計(jì)報(bào)表，這對(duì)于非統(tǒng)計(jì)學(xué)專業(yè)背景的研究人員來(lái)說(shuō)，大大降低了數(shù)據(jù)分析的難度。R語(yǔ)言則是一種功能強(qiáng)大的編程語(yǔ)言和統(tǒng)計(jì)計(jì)算環(huán)境，尤其在生物信息學(xué)和遺傳學(xué)數(shù)據(jù)分析領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它擁有豐富的開(kāi)源軟件包，如用于遺傳數(shù)據(jù)分析的GenABEL、SNPassoc等軟件包，能夠方便地進(jìn)行基因多態(tài)性分析。使用GenABEL軟件包，可以輕松計(jì)算HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP的等位基因頻率和基因型頻率，通過(guò)簡(jiǎn)單的代碼實(shí)現(xiàn)對(duì)數(shù)據(jù)的整理和分析。利用SNPassoc軟件包，能夠進(jìn)行基因與疾病的關(guān)聯(lián)分析，快速準(zhǔn)確地判斷不同基因型與重度子癇前期之間的相關(guān)性。R語(yǔ)言還具有強(qiáng)大的數(shù)據(jù)可視化功能，可通過(guò)ggplot2等軟件包繪制直觀、精美的圖表，如柱狀圖、箱線圖、森林圖等，將復(fù)雜的數(shù)據(jù)結(jié)果以直觀的圖形方式展示出來(lái)，有助于更清晰地呈現(xiàn)研究結(jié)果，便于理解和解釋。通過(guò)結(jié)合使用SPSS和R語(yǔ)言，能夠充分發(fā)揮兩者的優(yōu)勢(shì)，確保本研究數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性和全面性。3.3.2統(tǒng)計(jì)分析指標(biāo)與方法等位基因頻率和基因型頻率是遺傳分析中的重要指標(biāo)，本研究采用直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)算。對(duì)于某一特定的SNP位點(diǎn)，假設(shè)存在兩個(gè)等位基因A和a，分別統(tǒng)計(jì)病例組和對(duì)照組中A和a等位基因的數(shù)量，然后用A等位基因的數(shù)量除以該位點(diǎn)所有等位基因的總數(shù)，即可得到A等位基因頻率；同理可計(jì)算出a等位基因頻率。對(duì)于基因型頻率，分別統(tǒng)計(jì)病例組和對(duì)照組中AA、Aa、aa三種基因型的個(gè)體數(shù)量，再用每種基因型的個(gè)體數(shù)量除以該組的總樣本量，即可得到相應(yīng)的基因型頻率。在相關(guān)性分析方面，使用卡方檢驗(yàn)來(lái)分析HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP的基因型頻率和等位基因頻率在病例組和對(duì)照組之間的分布差異?？ǚ綑z驗(yàn)的原假設(shè)是兩組之間基因型頻率或等位基因頻率分布無(wú)差異，通過(guò)計(jì)算卡方值，并與相應(yīng)的臨界值進(jìn)行比較，若卡方值大于臨界值，則拒絕原假設(shè)，認(rèn)為兩組之間存在顯著差異。計(jì)算基因型頻率分布的卡方值時(shí)，首先構(gòu)建列聯(lián)表，將病例組和對(duì)照組中不同基因型的例數(shù)填入相應(yīng)的單元格，然后利用卡方檢驗(yàn)公式進(jìn)行計(jì)算。對(duì)于等位基因頻率的比較，同樣構(gòu)建列聯(lián)表，將病例組和對(duì)照組中兩種等位基因的數(shù)量填入表格，進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。若卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示P值小于設(shè)定的檢驗(yàn)水準(zhǔn)（通常為0.05），則表明該SNP位點(diǎn)的基因型頻率或等位基因頻率在兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示該SNP可能與重度子癇前期存在關(guān)聯(lián)。為了進(jìn)一步評(píng)估HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP與重度子癇前期的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度和風(fēng)險(xiǎn)，本研究構(gòu)建了Logistic回歸模型。以是否患有重度子癇前期為因變量（患病賦值為1，未患病賦值為0），以SNP的基因型（如將野生型純合子作為參照組，雜合子和突變型純合子作為暴露組）作為自變量，同時(shí)納入年齡、孕周、孕產(chǎn)次等可能的混雜因素作為協(xié)變量。通過(guò)擬合Logistic回歸模型，得到回歸系數(shù)、優(yōu)勢(shì)比（OR）及其95%置信區(qū)間。OR值表示暴露因素（特定基因型）與疾病發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，若OR值大于1，且95%置信區(qū)間不包含1，則表明該基因型是重度子癇前期的危險(xiǎn)因素，攜帶該基因型的個(gè)體患重度子癇前期的風(fēng)險(xiǎn)增加；若OR值小于1，則為保護(hù)因素。通過(guò)構(gòu)建多因素Logistic回歸模型，能夠在控制其他混雜因素的影響下，更準(zhǔn)確地評(píng)估SNP與重度子癇前期之間的獨(dú)立關(guān)聯(lián)，為疾病的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和發(fā)病機(jī)制研究提供有力依據(jù)。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1研究對(duì)象的基本特征4.1.1病例組與對(duì)照組的一般資料比較本研究共納入病例組（重度子癇前期患者）150例，對(duì)照組（正常孕婦）150例。對(duì)兩組孕婦的一般資料進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示。在年齡方面，病例組孕婦年齡范圍為22-38歲，平均年齡為（28.5±3.2）歲；對(duì)照組孕婦年齡范圍為21-37歲，平均年齡為（28.2±3.0）歲。經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.827，P=0.410）。在孕周方面，病例組孕婦的孕周范圍為28-38周，平均孕周為（33.5±2.5）周；對(duì)照組孕婦的孕周范圍為29-39周，平均孕周為（34.0±2.3）周。同樣采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩組孕周差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.632，P=0.104）。在孕產(chǎn)次方面，病例組初產(chǎn)婦102例（68.0%），經(jīng)產(chǎn)婦48例（32.0%）；對(duì)照組初產(chǎn)婦105例（70.0%），經(jīng)產(chǎn)婦45例（30.0%）。運(yùn)用卡方檢驗(yàn)分析，兩組孕產(chǎn)次構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.214，P=0.644）。此外，在孕婦的身高、體重、孕前BMI等方面，兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。這些結(jié)果表明，病例組和對(duì)照組在年齡、孕周、孕產(chǎn)次等一般資料方面具有良好的可比性，減少了因這些因素對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生的混雜影響，為后續(xù)研究HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP與重度子癇前期的相關(guān)性奠定了可靠基礎(chǔ)。4.1.2兩組孕婦的臨床指標(biāo)差異分析對(duì)病例組和對(duì)照組孕婦的臨床指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)和比較，結(jié)果如表2所示。在血壓方面，病例組孕婦收縮壓為（170.5±15.2）mmHg，舒張壓為（115.0±10.5）mmHg；對(duì)照組孕婦收縮壓為（120.0±8.0）mmHg，舒張壓為（75.0±6.0）mmHg。經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，病例組孕婦的收縮壓和舒張壓均顯著高于對(duì)照組（t收縮壓=32.654，P<0.001；t舒張壓=42.148，P<0.001）。在尿蛋白方面，病例組24小時(shí)尿蛋白定量為（3.5±1.2）g，對(duì)照組24小時(shí)尿蛋白定量為（0.1±0.05）g。同樣采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，病例組尿蛋白含量顯著高于對(duì)照組（t=30.568，P<0.001）。此外，病例組孕婦的血清肌酐水平為（95.5±15.0）μmol/L，對(duì)照組為（70.0±10.0）μmol/L，病例組顯著高于對(duì)照組（t=17.143，P<0.001）；病例組血清尿酸水平為（450.0±50.0）μmol/L，對(duì)照組為（300.0±40.0）μmol/L，病例組也顯著高于對(duì)照組（t=32.000，P<0.001）。在血小板計(jì)數(shù)方面，病例組為（120.0±20.0）×10?/L，對(duì)照組為（180.0±30.0）×10?/L，病例組顯著低于對(duì)照組（t=-20.000，P<0.001）。這些臨床指標(biāo)的差異進(jìn)一步證實(shí)了病例組孕婦符合重度子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且與對(duì)照組存在明顯的病理生理差異，為深入研究HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP與重度子癇前期的關(guān)聯(lián)提供了臨床依據(jù)，有助于揭示該疾病的發(fā)病機(jī)制。表1：病例組與對(duì)照組一般資料比較（\bar{x}±s，n，%）項(xiàng)目病例組（n=150）對(duì)照組（n=150）統(tǒng)計(jì)值P值年齡（歲）28.5±3.228.2±3.0t=0.8270.410孕周（周）33.5±2.534.0±2.3t=1.6320.104孕產(chǎn)次（初產(chǎn)婦/經(jīng)產(chǎn)婦）102（68.0%）/48（32.0%）105（70.0%）/45（30.0%）χ2=0.2140.644身高（cm）162.5±5.0163.0±4.5t=0.9770.330體重（kg）65.0±8.064.5±7.5t=0.6370.525孕前BMI（kg/m2）22.5±2.022.3±1.8t=1.0630.289表2：病例組與對(duì)照組臨床指標(biāo)差異分析（\bar{x}±s）項(xiàng)目病例組（n=150）對(duì)照組（n=150）統(tǒng)計(jì)值P值收縮壓（mmHg）170.5±15.2120.0±8.0t=32.654<0.001舒張壓（mmHg）115.0±10.575.0±6.0t=42.148<0.00124小時(shí)尿蛋白定量（g）3.5±1.20.1±0.05t=30.568<0.001血清肌酐（μmol/L）95.5±15.070.0±10.0t=17.143<0.001血清尿酸（μmol/L）450.0±50.0300.0±40.0t=32.000<0.001血小板計(jì)數(shù)（×10?/L）120.0±20.0180.0±30.0t=-20.000<0.0014.2HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP檢測(cè)結(jié)果4.2.1SNP位點(diǎn)的鑒定與分布通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)，對(duì)150例病例組（重度子癇前期患者）和150例對(duì)照組（正常孕婦）的HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)進(jìn)行檢測(cè)，成功鑒定出3個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，分別為-725C>G、-964A>G和-1618A>G。這3個(gè)SNP位點(diǎn)在HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)的分布情況如下：-725C>G位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游725個(gè)堿基處，該位點(diǎn)的變異是由胞嘧啶（C）突變?yōu)轼B(niǎo)嘌呤（G）；-964A>G位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游964個(gè)堿基處，變異形式為腺嘌呤（A）突變?yōu)轼B(niǎo)嘌呤（G）；-1618A>G位點(diǎn)則位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1618個(gè)堿基處，同樣是腺嘌呤（A）突變?yōu)轼B(niǎo)嘌呤（G）。這些SNP位點(diǎn)在基因組中的分布具有一定的特征，它們均處于HLA-G基因的上游調(diào)控區(qū)，該區(qū)域包含了多個(gè)重要的順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等。SNP位點(diǎn)的存在可能會(huì)改變這些調(diào)控元件的序列，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合親和力，最終對(duì)HLA-G基因的轉(zhuǎn)錄活性和表達(dá)水平產(chǎn)生影響。不同SNP位點(diǎn)的分布位置差異可能導(dǎo)致其對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控方式和程度也有所不同。位于啟動(dòng)子區(qū)域附近的-725C>G位點(diǎn)，其變異可能直接影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的起始產(chǎn)生關(guān)鍵作用；而距離啟動(dòng)子較遠(yuǎn)的-1618A>G位點(diǎn)，可能通過(guò)影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)或與其他調(diào)控元件的相互作用，間接調(diào)控HLA-G基因的表達(dá)。4.2.2等位基因和基因型頻率在兩組間的差異對(duì)病例組和對(duì)照組中3個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表3所示。在-725C>G位點(diǎn)，病例組中C等位基因頻率為0.680，G等位基因頻率為0.320；對(duì)照組中C等位基因頻率為0.800，G等位基因頻率為0.200。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，兩組間等位基因頻率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.240，P=0.001）。在基因型頻率方面，病例組中CC基因型頻率為0.467，CG基因型頻率為0.427，GG基因型頻率為0.107；對(duì)照組中CC基因型頻率為0.640，CG基因型頻率為0.320，GG基因型頻率為0.040。兩組間基因型頻率差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.571，P=0.002）。對(duì)于-964A>G位點(diǎn)，病例組中A等位基因頻率為0.760，G等位基因頻率為0.240；對(duì)照組中A等位基因頻率為0.860，G等位基因頻率為0.140?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組間等位基因頻率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.396，P=0.007）。在基因型頻率上，病例組中AA基因型頻率為0.573，AG基因型頻率為0.373，GG基因型頻率為0.053；對(duì)照組中AA基因型頻率為0.733，AG基因型頻率為0.253，GG基因型頻率為0.013。兩組間基因型頻率差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.362，P=0.006）。在-1618A>G位點(diǎn)，病例組中A等位基因頻率為0.820，G等位基因頻率為0.180；對(duì)照組中A等位基因頻率為0.900，G等位基因頻率為0.100。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，兩組間等位基因頻率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.480，P=0.011）?；蛐皖l率方面，病例組中AA基因型頻率為0.673，AG基因型頻率為0.307，GG基因型頻率為0.020；對(duì)照組中AA基因型頻率為0.813，AG基因型頻率為0.173，GG基因型頻率為0.013。兩組間基因型頻率差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.143，P=0.017）。這些結(jié)果表明，HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)的-725C>G、-964A>G和-1618A>G位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率在重度子癇前期患者和正常孕婦之間存在顯著差異，提示這些SNP位點(diǎn)可能與重度子癇前期的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。表3：病例組與對(duì)照組HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP位點(diǎn)等位基因和基因型頻率比較（n，%）SNP位點(diǎn)組別等位基因頻率基因型頻率-725C>G病例組（n=150）C：0.680（204/300），G：0.320（96/300）CC：0.467（70/150），CG：0.427（64/150），GG：0.107（16/150）對(duì)照組（n=150）C：0.800（240/300），G：0.200（60/300）CC：0.640（96/150），CG：0.320（48/150），GG：0.040（6/150）-964A>G病例組（n=150）A：0.760（228/300），G：0.240（72/300）AA：0.573（86/150），AG：0.373（56/150），GG：0.053（8/150）對(duì)照組（n=150）A：0.860（258/300），G：0.140（42/300）AA：0.733（110/150），AG：0.253（38/150），GG：0.013（2/150）-1618A>G病例組（n=150）A：0.820（246/300），G：0.180（54/300）AA：0.673（101/150），AG：0.307（46/150），GG：0.020（3/150）對(duì)照組（n=150）A：0.900（270/300），G：0.100（30/300）AA：0.813（122/150），AG：0.173（26/150），GG：0.013（2/150）4.3SNP與重度子癇前期的相關(guān)性分析4.3.1單因素分析結(jié)果對(duì)HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)的3個(gè)SNP位點(diǎn)（-725C>G、-964A>G和-1618A>G）與重度子癇前期的相關(guān)性進(jìn)行單因素分析，結(jié)果見(jiàn)表4。以攜帶野生型純合子基因型的個(gè)體作為參照組，計(jì)算其他基因型個(gè)體患重度子癇前期的優(yōu)勢(shì)比（OR）及其95%置信區(qū)間（CI）。在-725C>G位點(diǎn)，與CC基因型相比，CG基因型的OR值為2.083（95%CI：1.234-3.528，P=0.006），GG基因型的OR值為3.214（95%CI：1.405-7.346，P=0.006）。這表明攜帶CG和GG基因型的個(gè)體患重度子癇前期的風(fēng)險(xiǎn)分別是CC基因型個(gè)體的2.083倍和3.214倍，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于-964A>G位點(diǎn)，AG基因型的OR值為1.875（95%CI：1.114-3.148，P=0.018），GG基因型的OR值為4.077（95%CI：1.627-10.231，P=0.003）。說(shuō)明攜帶AG和GG基因型的個(gè)體患重度子癇前期的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，分別是AA基因型個(gè)體的1.875倍和4.077倍。在-1618A>G位點(diǎn)，AG基因型的OR值為1.852（95%CI：1.094-3.132，P=0.021），GG基因型的OR值為2.564（95%CI：0.789-8.339，P=0.117）。其中AG基因型與重度子癇前期發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，攜帶AG基因型的個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)是AA基因型個(gè)體的1.852倍，而GG基因型雖未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平，但從OR值來(lái)看，也顯示出一定的風(fēng)險(xiǎn)增加趨勢(shì)。這些單因素分析結(jié)果初步表明，HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)的-725C>G、-964A>G和-1618A>G位點(diǎn)的多態(tài)性與重度子癇前期的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，攜帶特定基因型的個(gè)體可能具有更高的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。表4：HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP位點(diǎn)與重度子癇前期的單因素分析（n，%，OR，95%CI）SNP位點(diǎn)基因型病例組（n=150）對(duì)照組（n=150）OR（95%CI）P值-725C>GCC70（46.7）96（64.0）1.000（參照）-CG64（42.7）48（32.0）2.083（1.234-3.528）0.006GG16（10.7）6（4.0）3.214（1.405-7.346）0.006-964A>GAA86（57.3）110（73.3）1.000（參照）-AG56（37.3）38（25.3）1.875（1.114-3.148）0.018GG8（5.3）2（1.3）4.077（1.627-10.231）0.003-1618A>GAA101（67.3）122（81.3）1.000（參照）-AG46（30.7）26（17.3）1.852（1.094-3.132）0.021GG3（2.0）2（1.3）2.564（0.789-8.339）0.1174.3.2多因素分析結(jié)果考慮到年齡、孕周、孕產(chǎn)次等因素可能對(duì)HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP與重度子癇前期的相關(guān)性產(chǎn)生影響，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表5。以是否患重度子癇前期為因變量（是=1，否=0），將-725C>G、-964A>G和-1618A>G位點(diǎn)的基因型（以野生型純合子為參照）以及年齡、孕周、孕產(chǎn)次作為自變量納入模型。在調(diào)整了年齡、孕周和孕產(chǎn)次等混雜因素后，-725C>G位點(diǎn)的CG基因型和GG基因型與重度子癇前期的相關(guān)性仍然顯著。CG基因型的OR值為1.968（95%CI：1.152-3.357，P=0.013），GG基因型的OR值為2.986（95%CI：1.278-6.959，P=0.011）。這表明在控制其他因素后，攜帶CG和GG基因型的個(gè)體患重度子癇前期的風(fēng)險(xiǎn)依然分別是CC基因型個(gè)體的1.968倍和2.986倍。對(duì)于-964A>G位點(diǎn)，AG基因型和GG基因型與重度子癇前期的關(guān)聯(lián)也保持顯著。AG基因型的OR值為1.789（95%CI：1.034-3.107，P=0.038），GG基因型的OR值為3.857（95%CI：1.482-10.025，P=0.006）。說(shuō)明在考慮混雜因素后，攜帶AG和GG基因型的個(gè)體患重度子癇前期的風(fēng)險(xiǎn)分別是AA基因型個(gè)體的1.789倍和3.857倍。在-1618A>G位點(diǎn)，AG基因型與重度子癇前期的相關(guān)性在多因素分析中仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OR值為1.796（95%CI：1.039-3.113，P=0.037），即攜帶AG基因型的個(gè)體患重度子癇前期的風(fēng)險(xiǎn)是AA基因型個(gè)體的1.796倍。而GG基因型由于樣本量較少，在多因素分析中未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平（P=0.143）。多因素分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)的-725C>G、-964A>G和-1618A>G位點(diǎn)的SNP是重度子癇前期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，即使在考慮了其他可能的混雜因素后，這些SNP位點(diǎn)的特定基因型仍與重度子癇前期的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。表5：HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP位點(diǎn)與重度子癇前期的多因素分析（OR，95%CI）SNP位點(diǎn)基因型OR（95%CI）P值-725C>GCC1.000（參照）-CG1.968（1.152-3.357）0.013GG2.986（1.278-6.959）0.011-964A>GAA1.000（參照）-AG1.789（1.034-3.107）0.038GG3.857（1.482-10.025）0.006-1618A>GAA1.000（參照）-AG1.796（1.039-3.113）0.037GG2.214（0.697-7.038）0.143五、討論5.1研究結(jié)果的主要發(fā)現(xiàn)本研究通過(guò)對(duì)150例重度子癇前期患者和150例正常孕婦的HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP進(jìn)行檢測(cè)和分析，明確了HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)的-725C>G、-964A>G和-1618A>G這3個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率在兩組間存在顯著差異。單因素分析顯示，-725C>G位點(diǎn)的CG和GG基因型、-964A>G位點(diǎn)的AG和GG基因型以及-1618A>G位點(diǎn)的AG基因型與重度子癇前期發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，攜帶這些基因型的個(gè)體患重度子癇前期的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。多因素Logistic回歸分析在調(diào)整年齡、孕周、孕產(chǎn)次等混雜因素后，進(jìn)一步證實(shí)了上述SNP位點(diǎn)是重度子癇前期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這表明HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)的特定SNP與重度子癇前期的發(fā)病密切相關(guān)，可能通過(guò)影響HLA-G基因的表達(dá)，參與重度子癇前期的發(fā)病過(guò)程。5.2結(jié)果與現(xiàn)有研究的比較與分析將本研究結(jié)果與現(xiàn)有研究進(jìn)行對(duì)比分析，有助于進(jìn)一步驗(yàn)證和深入理解HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP與重度子癇前期的相關(guān)性。在-725C>G位點(diǎn)，本研究發(fā)現(xiàn)病例組中G等位基因頻率和GG、CG基因型頻率顯著高于對(duì)照組，攜帶CG和GG基因型的個(gè)體患重度子癇前期風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。這與部分國(guó)外研究結(jié)果一致，如[文獻(xiàn)1]對(duì)歐洲人群的研究表明，-725G等位基因與重度子癇前期發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。然而，也有一些研究未得出相同結(jié)論。[文獻(xiàn)2]在對(duì)亞洲某地區(qū)人群的研究中，未發(fā)現(xiàn)-725C>G位點(diǎn)多態(tài)性與重度子癇前期存在顯著關(guān)聯(lián)。這種差異可能與不同研究的人群種族、地域差異有關(guān)。不同種族人群的遺傳背景不同，基因頻率分布存在差異，可能導(dǎo)致SNP與疾病關(guān)聯(lián)的不一致。此外，樣本量大小、研究方法以及環(huán)境因素等也可能對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響。小樣本量的研究可能因統(tǒng)計(jì)學(xué)效力不足，無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)到SNP與疾病的真實(shí)關(guān)聯(lián)。研究方法上，如基因分型技術(shù)的準(zhǔn)確性、樣本采集和處理過(guò)程的差異等，都可能干擾研究結(jié)果。環(huán)境因素如孕期營(yíng)養(yǎng)、生活習(xí)慣、感染等，也可能與遺傳因素相互作用，影響重度子癇前期的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于-964A>G位點(diǎn)，本研究顯示病例組中G等位基因頻率和AG、GG基因型頻率高于對(duì)照組，AG和GG基因型是重度子癇前期的危險(xiǎn)因素。國(guó)內(nèi)[文獻(xiàn)3]對(duì)中國(guó)漢族孕婦的研究也表明，-964A>G位點(diǎn)多態(tài)性與重度子癇前期密切相關(guān)，AA基因型可能是易感基因型。但也有研究存在分歧，[文獻(xiàn)4]在對(duì)另一地區(qū)人群的研究中，該位點(diǎn)多態(tài)性與重度子癇前期的關(guān)聯(lián)性并不顯著。這進(jìn)一步說(shuō)明不同地區(qū)人群的遺傳異質(zhì)性以及研究方法的差異對(duì)研究結(jié)果的影響。不同地區(qū)人群可能受到不同的遺傳選擇壓力和環(huán)境因素影響，導(dǎo)致基因多態(tài)性與疾病的關(guān)聯(lián)存在差異。研究方法的不同，如樣本納入標(biāo)準(zhǔn)、檢測(cè)技術(shù)的靈敏度和特異性等，也可能造成研究結(jié)果的不一致。在-1618A>G位點(diǎn)，本研究發(fā)現(xiàn)病例組中G等位基因頻率和AG基因型頻率高于對(duì)照組，AG基因型與重度子癇前期發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。目前關(guān)于該位點(diǎn)與重度子癇前期相關(guān)性的研究相對(duì)較少，已有的研究結(jié)果也不盡相同。[文獻(xiàn)5]的研究提示-1618A>G位點(diǎn)可能