Nestin對多發(fā)性骨髓瘤細胞生物學(xué)行為的調(diào)控機制與臨床意義探究一、引言1.1研究背景多發(fā)性骨髓瘤（MultipleMyeloma，MM）作為一種惡性漿細胞增生性疾病，在血液系統(tǒng)腫瘤中占據(jù)著顯著的地位，其發(fā)病率僅次于白血病，位居第二。近年來，隨著全球人口老齡化進程的加速，MM的發(fā)病率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢。在中國，每10萬人中就有約1.6個多發(fā)性骨髓瘤患者，且這一數(shù)字還在持續(xù)攀升。由于MM起病較為隱匿，早期癥狀不典型，容易被誤診或漏診，導(dǎo)致很多患者確診時已處于疾病中晚期。目前，針對MM的治療手段雖取得了一定進展，如自體干細胞移植以及沙利度胺、來那度胺和硼替佐米等藥物的應(yīng)用，在一定程度上改變了骨髓瘤的治療格局并延長了患者的總生存期，但MM仍然是一種不可治愈的惡性血液腫瘤，患者終將面臨復(fù)發(fā)困境。臨床上患者復(fù)發(fā)的次數(shù)越多，治療難度也隨之增加，患者無進展生存和復(fù)發(fā)后的生存時間也就越短。數(shù)據(jù)顯示，MM患者的5年生存率僅有40%左右，這表明當(dāng)前的治療方案仍存在很大的局限性，遠遠無法滿足臨床需求。深入探究MM的發(fā)病機制，尋找更為有效的治療靶點迫在眉睫。近期研究表明，Nestin在MM的發(fā)病過程中扮演著重要角色。Nestin作為一種祖細胞標記物，屬于中間絲蛋白家族，最初發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)干細胞和神經(jīng)前體細胞中，在胚胎發(fā)育過程中高度表達，成年后在大多數(shù)組織中表達沉默，但在一些腫瘤組織中卻異常高表達。在MM中，Nestin的表達水平與疾病的進程密切相關(guān)，其可能參與了MM細胞的增殖、遷移、凋亡等生物學(xué)過程，對MM的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后產(chǎn)生影響。因此，研究Nestin在MM中的生物學(xué)作用及其作用機制，對于揭示MM的發(fā)病機制、開發(fā)新型治療靶點以及改善患者的預(yù)后具有重要意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究Nestin在多發(fā)性骨髓瘤細胞株中的表達模式，系統(tǒng)分析其對多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖、遷移、凋亡等生物學(xué)行為的調(diào)控作用機制，從而為揭示多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機制提供全新的視角，為開發(fā)新型治療靶點奠定堅實的理論基礎(chǔ)。多發(fā)性骨髓瘤嚴重威脅人類健康，發(fā)病率呈上升趨勢，然而現(xiàn)有治療手段存在局限性，復(fù)發(fā)率高且難以治愈，患者生存情況不佳。深入研究Nestin在多發(fā)性骨髓瘤中的作用具有重大的理論和現(xiàn)實意義。在理論層面，有助于更深入地理解多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機制，Nestin在胚胎發(fā)育后大多組織中表達沉默卻在多發(fā)性骨髓瘤組織中異常高表達，研究其如何參與細胞增殖、遷移和凋亡等過程，能夠揭示多發(fā)性骨髓瘤細胞異常生物學(xué)行為背后的分子機制，補充和完善腫瘤發(fā)病理論體系。在臨床實踐方面，若能明確Nestin在多發(fā)性骨髓瘤中的關(guān)鍵作用，就有可能將其作為一個新的治療靶點。通過開發(fā)針對Nestin的靶向治療藥物，為多發(fā)性骨髓瘤患者提供更精準、有效的治療方案，有望提高患者的緩解率、延長生存期并改善生活質(zhì)量。此外，Nestin還可能作為一個潛在的診斷和預(yù)后評估標志物，幫助醫(yī)生更早期、準確地診斷疾病，以及預(yù)測患者的疾病進展和預(yù)后情況，從而實現(xiàn)個性化醫(yī)療，對提升多發(fā)性骨髓瘤的整體診療水平意義深遠。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在多發(fā)性骨髓瘤的研究領(lǐng)域，國外起步相對較早，積累了較為豐富的成果。早在20世紀中期，國外學(xué)者就開始對多發(fā)性骨髓瘤的臨床特征、病理表現(xiàn)進行系統(tǒng)觀察和總結(jié)，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的興起，國外在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機制的研究上取得了眾多突破，發(fā)現(xiàn)了一系列與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因和信號通路，如NRAS和KRAS的激活、FGFR3和TP53突變等，這些發(fā)現(xiàn)為理解多發(fā)性骨髓瘤的生物學(xué)行為提供了重要線索。在治療方面，國外率先開展了自體干細胞移植以及沙利度胺、來那度胺和硼替佐米等藥物的臨床試驗，并將其廣泛應(yīng)用于臨床，顯著改善了患者的生存情況。國內(nèi)對于多發(fā)性骨髓瘤的研究雖然起步稍晚，但近年來發(fā)展迅速。國內(nèi)學(xué)者在多發(fā)性骨髓瘤的流行病學(xué)研究方面做出了重要貢獻，明確了中國人群中多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病率、發(fā)病年齡特點以及地域分布差異等，為疾病的防控提供了數(shù)據(jù)支持。在發(fā)病機制研究上，國內(nèi)團隊也積極探索，與國際研究接軌，在基因異常、細胞因子網(wǎng)絡(luò)等方面取得了一定成果。在治療領(lǐng)域，國內(nèi)不僅快速跟進國際先進的治療方法，還結(jié)合中國患者的特點進行優(yōu)化和創(chuàng)新，提高了治療的有效性和安全性。例如，在中藥輔助治療多發(fā)性骨髓瘤方面進行了諸多探索，取得了一些有益的經(jīng)驗。Nestin作為一個研究熱點，國內(nèi)外均開展了廣泛的研究。國外在Nestin的基礎(chǔ)生物學(xué)研究方面較為深入，詳細闡述了Nestin在胚胎發(fā)育過程中的時空表達模式，明確了其在神經(jīng)干細胞和神經(jīng)前體細胞中的重要作用，即參與細胞的增殖、分化和遷移，維持細胞的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等。在腫瘤研究領(lǐng)域，國外較早發(fā)現(xiàn)Nestin在多種實體腫瘤如乳腺癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等中異常高表達，且與腫瘤的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移能力及不良預(yù)后密切相關(guān)。在多發(fā)性骨髓瘤的研究中，國外研究團隊率先證實了Nestin在多發(fā)性骨髓瘤患者成熟CD138+CD38+漿細胞中的表達，通過一系列實驗表明Nestin表達水平與疾病進程呈正相關(guān)，高表達Nestin的患者對傳統(tǒng)治療藥物反應(yīng)較差，生存期更短。國內(nèi)對于Nestin的研究多集中在腫瘤領(lǐng)域。在實體腫瘤方面，研究發(fā)現(xiàn)Nestin可通過多種信號通路促進腫瘤細胞的增殖和遷移，如在肝癌細胞中，Nestin通過激活PI3K/AKT信號通路，促進細胞的增殖和存活。在多發(fā)性骨髓瘤的研究中，國內(nèi)團隊也開展了相關(guān)工作，通過細胞實驗和臨床樣本檢測，進一步驗證了Nestin在多發(fā)性骨髓瘤細胞中的表達情況及其與疾病生物學(xué)行為的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)抑制Nestin表達可顯著降低多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖和侵襲能力，誘導(dǎo)細胞凋亡，為深入研究Nestin在多發(fā)性骨髓瘤中的作用機制提供了更多證據(jù)。雖然國內(nèi)外在Nestin和多發(fā)性骨髓瘤的研究上取得了一定進展，但仍存在許多未知領(lǐng)域。對于Nestin在多發(fā)性骨髓瘤細胞中具體的作用機制尚未完全明確，其上下游調(diào)控因子以及參與的信號通路還需進一步深入研究。在治療靶點的開發(fā)上，雖然Nestin具有潛在的應(yīng)用價值，但如何將基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為臨床有效的治療手段，仍面臨諸多挑戰(zhàn)。二、多發(fā)性骨髓瘤及Nestin相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1多發(fā)性骨髓瘤概述2.1.1疾病定義與特征多發(fā)性骨髓瘤是一種較為常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其特征為骨髓中漿細胞的異?？寺⌒栽錾@些異常增生的漿細胞會在骨髓中大量聚集，破壞骨髓的正常造血微環(huán)境，影響正常血細胞的生成。與此同時，這些異常漿細胞還會分泌大量單克隆免疫球蛋白或其片段（如輕鏈或重鏈），導(dǎo)致患者體內(nèi)出現(xiàn)單克隆免疫球蛋白血癥，這也是多發(fā)性骨髓瘤的一個重要病理特征。在臨床上，多發(fā)性骨髓瘤患者的癥狀表現(xiàn)十分多樣。骨骼系統(tǒng)受累是多發(fā)性骨髓瘤的常見表現(xiàn)之一，約70%-80%的患者會出現(xiàn)骨痛癥狀，疼痛部位多集中在腰骶部、胸部和肋骨等部位，疼痛程度輕重不一，部分患者還可能出現(xiàn)骨質(zhì)疏松、病理性骨折等情況，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。這主要是由于骨髓瘤細胞與骨髓微環(huán)境中的細胞相互作用，激活破骨細胞，抑制成骨細胞活性，打破了骨吸收與骨形成的平衡，導(dǎo)致骨質(zhì)破壞。貧血也是多發(fā)性骨髓瘤患者常見的癥狀之一，患者常表現(xiàn)為面色蒼白、頭暈、乏力等，隨著病情進展，貧血程度會逐漸加重。這是因為骨髓瘤細胞浸潤骨髓，抑制了正常造血干細胞的增殖和分化，導(dǎo)致紅細胞生成減少。此外，多發(fā)性骨髓瘤患者還容易出現(xiàn)腎功能損害，表現(xiàn)為蛋白尿、血尿、腎功能不全等，其發(fā)生機制與輕鏈蛋白對腎小管的損傷、高鈣血癥、高尿酸血癥等因素有關(guān)。感染也是多發(fā)性骨髓瘤患者面臨的一個重要問題，由于患者體內(nèi)免疫球蛋白異常，正常免疫功能受到抑制，機體抵抗力下降，容易受到各種病原體的侵襲，如細菌、病毒、真菌等，感染部位常見于呼吸道、泌尿系統(tǒng)等。多發(fā)性骨髓瘤在血液系統(tǒng)腫瘤中占據(jù)著重要地位，其發(fā)病率僅次于白血病，是第二大常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。隨著全球人口老齡化的加劇，多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，給社會和家庭帶來了沉重的負擔(dān)。2.1.2發(fā)病機制與治療現(xiàn)狀多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機制較為復(fù)雜，涉及多個基因、信號通路以及骨髓微環(huán)境等多種因素的相互作用。目前研究認為，多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生是一個多步驟、多階段的過程，遺傳因素、環(huán)境因素、化學(xué)物質(zhì)、病毒感染、慢性炎癥以及抗原刺激等都可能參與其中。有學(xué)者提出人類8型皰疹病毒可能與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生有關(guān)，但具體機制尚未完全明確。細胞因子在多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病過程中也起著關(guān)鍵作用。其中，白介素六（IL-6）被認為是促進B細胞分化成漿細胞的重要調(diào)節(jié)因子。在進展性多發(fā)性骨髓瘤患者中，骨髓中的IL-6水平會出現(xiàn)異常升高的情況，這提示以IL-6為中心的細胞因子失調(diào)，可能是導(dǎo)致骨髓瘤細胞增生的重要原因之一。IL-6通過與其受體結(jié)合，激活下游的信號通路，如JAK-STAT、PI3K-AKT等，促進骨髓瘤細胞的增殖、存活和耐藥。此外，骨髓瘤細胞與骨髓微環(huán)境中的細胞，如骨髓基質(zhì)細胞、成骨細胞、破骨細胞等相互作用，形成了一個復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，也對多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展起著重要的調(diào)控作用。在這個微環(huán)境中，細胞之間通過分泌細胞因子、黏附分子等進行信號傳遞，促進骨髓瘤細胞的生長、遷移和耐藥。近年來，針對多發(fā)性骨髓瘤的治療取得了顯著進展。傳統(tǒng)的治療方法包括化療、放療等，化療藥物如馬法蘭、環(huán)磷酰胺等，通過抑制細胞的DNA合成或干擾細胞的代謝過程，來殺死骨髓瘤細胞。然而，這些傳統(tǒng)化療藥物的副作用較大，且容易產(chǎn)生耐藥性，限制了其治療效果。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，靶向治療和免疫治療等新型治療方法應(yīng)運而生，為多發(fā)性骨髓瘤患者帶來了新的希望。靶向治療藥物如硼替佐米、來那度胺等，能夠特異性地作用于骨髓瘤細胞表面的靶點或相關(guān)信號通路，抑制骨髓瘤細胞的增殖和存活。硼替佐米是一種蛋白酶體抑制劑，通過抑制蛋白酶體的活性，阻斷細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解途徑，導(dǎo)致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)堆積，引發(fā)細胞凋亡。來那度胺則是一種免疫調(diào)節(jié)劑，能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，增強免疫細胞對骨髓瘤細胞的殺傷作用，同時還能抑制骨髓瘤細胞的增殖和血管生成。免疫治療藥物如達雷妥尤單抗等，通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)，識別和殺傷骨髓瘤細胞。達雷妥尤單抗是一種抗CD38的單克隆抗體，能夠特異性地結(jié)合骨髓瘤細胞表面的CD38抗原，通過抗體依賴的細胞毒性作用（ADCC）、補體依賴的細胞毒性作用（CDC）等機制，殺傷骨髓瘤細胞。對于適合造血干細胞移植的患者，造血干細胞移植也是一種重要的治療手段，包括自體造血干細胞移植和異體造血干細胞移植。自體造血干細胞移植是先采集患者自身的造血干細胞，在進行預(yù)處理后，再將干細胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，以重建患者的造血和免疫功能。異體造血干細胞移植則是使用供者的造血干細胞進行移植，由于存在移植物抗宿主?。℅VHD）等風(fēng)險，其應(yīng)用相對受限，但對于一些高?；颊撸赡芫哂懈玫闹委熜Ч?。盡管目前的治療手段在一定程度上改善了多發(fā)性骨髓瘤患者的生存情況，但多發(fā)性骨髓瘤仍然是一種難以治愈的疾病。大部分患者在經(jīng)過治療后會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和耐藥的情況，復(fù)發(fā)后的治療選擇相對有限，患者的生存時間和生活質(zhì)量受到嚴重影響。此外，一些治療方法還存在著嚴重的副作用，如化療藥物的骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)等，靶向治療藥物的神經(jīng)毒性、血液學(xué)毒性等，這些都給患者帶來了極大的痛苦。因此，深入研究多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機制，尋找更為有效的治療靶點和治療方法，仍然是當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要研究方向。2.2Nestin蛋白特性2.2.1Nestin的結(jié)構(gòu)與分布Nestin作為一種獨特的細胞骨架蛋白，屬于Ⅵ類中間絲蛋白，由1621個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為177400。其結(jié)構(gòu)包含一個僅8個氨基酸的短N端、一個長度超過1400個氨基酸的罕見長C端，以及連接兩者的中央桿即α螺旋桿。α螺旋桿區(qū)域由4個線圈和3個連接器（L1、L12和L2）相互連接構(gòu)成。這種特殊的結(jié)構(gòu)使得Nestin在發(fā)揮功能時具有獨特的性質(zhì)，短N端的存在決定了Nestin需要與其他中間絲蛋白，如波形蛋白相互協(xié)作，共同組裝形成高階結(jié)構(gòu)，以維持細胞的正常形態(tài)和功能。在胚胎發(fā)育階段，Nestin呈現(xiàn)出廣泛且特異性的表達分布。它最初被發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)上皮干細胞中，在神經(jīng)胚形成時期，Nestin便開始在神經(jīng)板皮層細胞中表達，隨著神經(jīng)細胞遷移活動的推進，其表達量逐漸下降。除神經(jīng)系統(tǒng)外，Nestin在胚胎期的心肌細胞、骨骼肌母細胞、血管內(nèi)皮細胞、晶狀體上皮細胞以及皮膚毛囊的先驅(qū)細胞等多種細胞類型中均有表達。在心肌和骨骼肌發(fā)育過程中，Nestin在胚胎期的骨骼肌母細胞和心肌細胞中最先呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，出生后表達量則明顯降低。這表明Nestin在胚胎發(fā)育過程中，參與了多種組織和器官的形成與發(fā)育，對維持細胞的增殖、分化和遷移等生物學(xué)過程起著關(guān)鍵作用。在成年個體中，Nestin在大多數(shù)正常組織中表達沉默，僅在少數(shù)具有干細胞特性或再生能力的細胞中低水平表達，如神經(jīng)干細胞、間充質(zhì)干細胞、胰島細胞以及毛囊中的部分細胞等。然而，在腫瘤組織中，Nestin的表達情況則發(fā)生了顯著變化。研究發(fā)現(xiàn)，Nestin在多種惡性腫瘤中異常高表達，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌以及多發(fā)性骨髓瘤等。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，Nestin不僅在腫瘤細胞中高表達，還在腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞表面大量表達，這與腫瘤的血管生成、細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在多發(fā)性骨髓瘤中，Nestin在骨髓瘤細胞中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且其表達水平與疾病的進程緊密相關(guān)，高表達Nestin的患者往往病情進展更為迅速，預(yù)后較差。Nestin在腫瘤組織中的異常表達，暗示著其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色，可能參與了腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲以及腫瘤血管生成等多個關(guān)鍵生物學(xué)過程。2.2.2Nestin在腫瘤中的一般功能Nestin在多種腫瘤中發(fā)揮著促進腫瘤細胞增殖的關(guān)鍵作用。以肺癌細胞為例，通過實驗手段上調(diào)肺癌細胞中Nestin的表達水平，能夠顯著增強細胞的增殖能力，使細胞的分裂速度加快，細胞數(shù)量迅速增多。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，Nestin可以通過激活相關(guān)信號通路來實現(xiàn)對細胞增殖的調(diào)控。在肝癌細胞中，Nestin能夠激活PI3K/AKT信號通路，該信號通路中的關(guān)鍵蛋白AKT被激活后，會進一步磷酸化下游的多種底物，如mTOR等，從而促進細胞的蛋白質(zhì)合成、DNA復(fù)制等過程，最終促進肝癌細胞的增殖和存活。這表明Nestin在腫瘤細胞增殖過程中，通過特定的信號通路傳導(dǎo)，影響細胞內(nèi)的關(guān)鍵生物學(xué)過程，為腫瘤細胞的快速增殖提供了必要條件。腫瘤細胞的遷移和侵襲能力是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)，Nestin在這一過程中也發(fā)揮著重要作用。在乳腺癌的研究中，當(dāng)抑制乳腺癌細胞中Nestin的表達時，細胞的遷移和侵襲能力明顯下降，在體外細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗中，實驗組細胞的遷移距離和穿過小室膜的細胞數(shù)量均顯著少于對照組。深入研究發(fā)現(xiàn)，Nestin可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞中一些與遷移和侵襲相關(guān)的分子表達，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等。MMPs能夠降解細胞外基質(zhì)，為腫瘤細胞的遷移和侵襲開辟道路。Nestin通過調(diào)控相關(guān)信號通路，促進MMPs的表達和活性，從而增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，使得腫瘤細胞更容易突破周圍組織的屏障，向遠處轉(zhuǎn)移。腫瘤的血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，Nestin在其中也扮演著重要角色。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，Nestin在腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞表面高度表達，它可以通過多種方式促進血管生成。一方面，Nestin可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成相關(guān)因子的表達和分泌。VEGF是一種重要的促血管生成因子，能夠刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成。Nestin通過激活相關(guān)信號通路，促進腫瘤細胞分泌VEGF，進而促進腫瘤血管的生成。另一方面，Nestin還可以直接參與血管內(nèi)皮細胞的生物學(xué)過程，影響內(nèi)皮細胞的形態(tài)和功能，促進血管的形成和穩(wěn)定。研究表明，Nestin能夠增強血管內(nèi)皮細胞的遷移和增殖能力，使其更容易形成血管樣結(jié)構(gòu)，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供充足的血液供應(yīng)。在腫瘤的耐藥性方面，Nestin也與腫瘤細胞對化療藥物的抵抗密切相關(guān)。在肺癌的化療研究中發(fā)現(xiàn)，高表達Nestin的肺癌細胞對順鉑等化療藥物的耐藥性明顯增強。進一步的機制研究表明，Nestin可以通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原平衡來影響腫瘤細胞的耐藥性。Nestin可以通過競爭性結(jié)合keap1，抑制了Keap1對Nrf2的泛素化-蛋白酶體降解，促進了Nrf2的核轉(zhuǎn)位。Nrf2是調(diào)控細胞氧化還原平衡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其激活后會導(dǎo)致腫瘤細胞抗氧化能力增強，從而降低化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用。此外，Nestin還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞膜上的藥物轉(zhuǎn)運蛋白表達，影響化療藥物的攝取和外排，進一步增強腫瘤細胞的耐藥性。這表明Nestin在腫瘤耐藥過程中，通過多種途徑影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，給腫瘤的治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。三、Nestin在多發(fā)性骨髓瘤細胞中的表達模式研究3.1實驗設(shè)計與方法3.1.1實驗材料準備本實驗選用了多種多發(fā)性骨髓瘤細胞株，包括U266、RPMI8226和LP1等。這些細胞株均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），具有明確的來源和生物學(xué)特性，能夠代表多發(fā)性骨髓瘤細胞的不同特征，為研究Nestin在多發(fā)性骨髓瘤細胞中的表達模式提供了豐富的實驗材料。在實驗試劑方面，準備了一系列關(guān)鍵試劑。RIPA裂解液（強）用于提取細胞中的總蛋白，其能夠有效裂解細胞，使蛋白質(zhì)充分釋放出來。蛋白酶抑制劑cocktail則用于抑制蛋白酶的活性，防止蛋白在提取過程中被降解，確保提取的蛋白保持完整的結(jié)構(gòu)和功能。BCA蛋白濃度測定試劑盒用于準確測定提取蛋白的濃度，為后續(xù)實驗的標準化操作提供了保障。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒包含了配制聚丙烯酰胺凝膠所需的各種試劑，方便快捷地用于蛋白質(zhì)的分離。PVDF膜（0.45μm）作為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜的載體，具有良好的蛋白質(zhì)吸附性能和化學(xué)穩(wěn)定性，能夠有效地將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，以便進行后續(xù)的免疫檢測。此外，還準備了針對Nestin的一抗，該抗體能夠特異性地識別Nestin蛋白，為檢測Nestin的表達提供了關(guān)鍵工具。HRP標記的二抗則用于與一抗結(jié)合，通過酶催化底物顯色的方式，實現(xiàn)對Nestin蛋白的檢測。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒能夠在HRP的催化下產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，通過曝光顯影，使檢測結(jié)果可視化。實驗儀器的選擇也至關(guān)重要。高速冷凍離心機用于細胞和蛋白樣品的離心分離，能夠在低溫條件下快速、高效地分離細胞碎片和蛋白質(zhì)，保證樣品的活性和純度。電泳儀和垂直電泳槽用于進行SDS-PAGE電泳，通過電場作用將蛋白質(zhì)按照分子量大小進行分離，為后續(xù)的轉(zhuǎn)膜和檢測奠定基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)膜儀用于將電泳分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，確保蛋白質(zhì)在膜上的固定和定位，以便進行免疫檢測?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)則用于檢測ECL化學(xué)發(fā)光信號，通過高靈敏度的成像技術(shù)，將微弱的發(fā)光信號轉(zhuǎn)化為清晰的圖像，實現(xiàn)對Nestin蛋白表達的定量分析。在定量PCR實驗中，準備了RNAisoPlus試劑用于提取細胞中的總RNA，其能夠高效地裂解細胞，保護RNA的完整性，為后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增提供高質(zhì)量的模板。PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser用于去除基因組DNA污染并進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進行PCR擴增。SYBRPremixExTaqII用于PCR擴增反應(yīng)，其包含了PCR反應(yīng)所需的各種成分，如DNA聚合酶、dNTPs、緩沖液等，能夠在熒光信號的監(jiān)測下，實現(xiàn)對目的基因的定量擴增。Nestin特異性引物根據(jù)Nestin基因序列設(shè)計合成，具有高度的特異性和擴增效率，能夠準確地擴增Nestin基因片段。內(nèi)參基因GAPDH引物作為參照，用于校正樣品間的差異，確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。實時熒光定量PCR儀用于進行定量PCR反應(yīng)，通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，精確地測定目的基因的表達水平。3.1.2Westernblotting檢測流程在進行Westernblotting檢測時，首先進行細胞總蛋白的提取。對于培養(yǎng)的多發(fā)性骨髓瘤細胞，吸除培養(yǎng)液后，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌細胞三次，每次平放輕輕搖動1min，以徹底洗去培養(yǎng)液。這一步驟十分關(guān)鍵，因為培養(yǎng)液中的成分可能會干擾后續(xù)的蛋白提取和檢測過程。將PBS棄凈后，把培養(yǎng)瓶置于冰上，加入適量的RIPA裂解液（強），并添加蛋白酶抑制劑cocktail，以抑制蛋白降解。在冰上裂解30min，期間為使細胞充分裂解，需經(jīng)常來回搖動培養(yǎng)瓶，也可放置在4℃搖床裂解。裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)，動作要迅速，以減少蛋白降解的可能性。然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5mL離心管中，整個操作盡量在冰上進行。在EP管中將細胞震碎，10s/次，共3次，以進一步促進細胞裂解。接著于4℃下12000rpm離心20-30min，離心機需提前預(yù)冷至4℃，以保證蛋白的活性。離心后的上清即為細胞總蛋白，將其分裝轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中，放于－20℃保存?zhèn)溆谩５鞍诐舛葴y定采用BCA法。按照BCA蛋白濃度測定試劑盒的說明書進行操作，首先配制不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標準品溶液，作為標準曲線的參考。將標準品溶液和待測蛋白樣品分別加入到96孔板中，再加入適量的BCA工作液，充分混勻。將96孔板置于37℃孵育30min，使反應(yīng)充分進行。使用酶標儀在562nm波長處測定各孔的吸光度值。以BSA標準品的濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線計算出待測蛋白樣品的濃度，確保每個蛋白樣品的上樣量一致，為后續(xù)實驗的準確性提供保障。進行SDS-PAGE電泳時，先根據(jù)實驗需求配制合適濃度的SDS-PAGE凝膠。按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒的說明，依次加入各種試劑，如丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris-HCl緩沖液、SDS、TEMED和過硫酸銨等，充分混勻后，迅速將凝膠溶液注入到垂直電泳槽的玻璃板中，插入梳子，待凝膠聚合完全。在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，如5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。樣品處理時，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合均勻后，100℃或沸水浴加熱3-5min，或者95℃加熱10min，以充分變性蛋白，使其伸展為線性結(jié)構(gòu)，便于在電泳過程中按照分子量大小進行分離。蛋白樣品冷卻到室溫后，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)。同時，加入預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標準，用于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小。電泳時，推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，如設(shè)置電壓為80-100V，當(dāng)溴酚藍進入下層膠時，提高電壓至120V左右進行恒壓電泳。也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V，然后設(shè)定定時時間為90-120分鐘，以避免發(fā)生電泳過頭的情況。當(dāng)溴酚藍到達膠的底端處附近，或根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標準的電泳情況，預(yù)計目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后，即可停止電泳。轉(zhuǎn)膜過程中，推薦選用PVDF膜。在使用前，需將PVDF膜經(jīng)甲醇浸潤和活化，以提高其蛋白質(zhì)吸附性能。轉(zhuǎn)膜溶液使用10X轉(zhuǎn)膜緩沖液，在稀釋時添加20%的甲醇，以提高轉(zhuǎn)膜效率。轉(zhuǎn)膜推薦使用bio-rad的預(yù)裁轉(zhuǎn)印濾紙，其吸水性強，不掉屑，能夠保證轉(zhuǎn)膜過程的順利進行。采用濕式轉(zhuǎn)膜方式時，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，轉(zhuǎn)膜時間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過夜，具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時，通常會有非常嚴重的發(fā)熱現(xiàn)象，為了保證蛋白的活性和轉(zhuǎn)膜效果，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜的效果可參考所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標準，其中分子量最大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，進行封閉和抗體孵育。將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜放入含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液中，在搖床上室溫封閉1-2h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點，減少背景信號。封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次5min，以去除未結(jié)合的封閉液。然后將膜放入含有Nestin一抗的TBST緩沖液中，4℃孵育過夜，使一抗與膜上的Nestin蛋白特異性結(jié)合。次日，取出膜，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。接著將膜放入含有HRP標記的二抗的TBST緩沖液中，室溫孵育1-2h，使二抗與一抗結(jié)合。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的二抗。最后進行化學(xué)發(fā)光檢測。按照ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒的說明書，將A液和B液等體積混合，制成ECL工作液。將混合好的ECL工作液均勻地滴加到PVDF膜上，確保膜表面完全覆蓋。在暗室中，將膜與X光片接觸，曝光適當(dāng)時間，根據(jù)信號強度調(diào)整曝光時間。曝光結(jié)束后，將X光片放入顯影液和定影液中進行顯影和定影處理，使蛋白條帶清晰顯現(xiàn)。通過圖像分析軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析，以β-actin作為內(nèi)參，計算Nestin蛋白的相對表達量。3.1.3定量PCR檢測流程在定量PCR檢測中，RNA提取是關(guān)鍵的第一步。向每107個多發(fā)性骨髓瘤細胞中加入1-2ml的RNAisoPlus，用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無明顯沉淀，確保細胞充分裂解，釋放出RNA。室溫靜置5分鐘，使RNA充分溶解。然后在12000g、4℃條件下離心5分鐘，小心吸取上清液，移入新的離心管中，切勿吸取沉淀，因為沉淀中可能含有細胞碎片和雜質(zhì)，會影響RNA的純度。向上述步驟的勻漿裂解液中加入氯仿，氯仿的體積為RNAisoPlus的1/5，蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩15秒，使溶液充分乳化，無分相現(xiàn)象。由于氯仿沸點低，易揮發(fā)，振蕩時應(yīng)小心離心管蓋突然彈開。待溶液充分乳化后，再室溫靜止5分鐘。接著在12000g、4℃條件下離心15分鐘，此時勻漿液分為三層，即無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中，切忌吸出白色中間層，因為中間層主要是蛋白質(zhì)，會污染RNA樣品。向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15-30℃下靜止10分鐘，使RNA沉淀析出。然后在12000g、4℃條件下離心10分鐘，一般在離心后，試管底部會出現(xiàn)沉淀。小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇1ml，切勿觸及沉淀，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，以去除RNA沉淀中的雜質(zhì)和鹽分。在12000g、4℃條件下離心5分鐘后小心棄去乙醇，為了更好地控制RNA中的鹽離子含量，應(yīng)盡量除凈乙醇。室溫干燥沉淀2-5分鐘，注意不可以離心或加熱干燥，否則RNA將會很難溶解。最后加入適量的RNase-free水溶解沉淀，必要時可用移液槍輕輕吹打沉淀，至RNA沉淀完全溶解。RNA質(zhì)量檢測是確保實驗結(jié)果準確性的重要環(huán)節(jié)。使用微量核酸分光光度計測量RNA濃度，同時檢測OD260/OD280和OD260/OD230的比值，以評估RNA的純度。一般來說，高質(zhì)量的RNA其OD260/OD280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，OD260/OD230比值應(yīng)大于2.0。如果比值不在正常范圍內(nèi)，可能提示RNA存在蛋白質(zhì)、多糖或酚類等雜質(zhì)污染，需要進一步純化處理。去除基因組DNA和進行cDNA合成是定量PCR的關(guān)鍵步驟。將提取的RNA加入到gDNA吸附柱中，室溫10000g離心1min，收集濾液即為去除基因組DNA的RNA。把去除基因組DNA的RNA在65℃條件下熱變性5分鐘，立即置于冰上冷卻，以破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)，提高反轉(zhuǎn)錄效率。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系按照PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser的說明書進行配制，反應(yīng)條件為37℃，15min；98℃，5min；4℃，hold。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆?。cDNA的實時熒光定量PCR反應(yīng)在96孔板中進行。每個樣本分別設(shè)置3個目的基因（Nestin）和3個內(nèi)參基因（GAPDH）的平行實驗，以減少實驗誤差。PCR反應(yīng)體系為20μL，根據(jù)SYBRPremixExTaqII的說明書進行配制，其中包括滅菌蒸餾水、SYBRPremixExTaqII、ForwardPrimer（20pM）、ReversePrimer（20pM）、50XRQX和模板cDNA。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min；95℃變性10s、60℃退火34s（采集熒光信號），共進行45個循環(huán)；72℃延伸30s。循環(huán)結(jié)束后，從60℃升高到98℃獲取熔解曲線，通過熔解曲線分析可以判斷擴增產(chǎn)物的特異性，確保擴增的是目的基因片段。實驗結(jié)果的分析采用2-△△Ct法。首先計算每個樣本中目的基因（Nestin）和內(nèi)參基因（GAPDH）的Ct值，Ct值是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。然后計算△Ct值，即目的基因Ct值減去內(nèi)參基因Ct值。再計算△△Ct值，即實驗組△Ct值減去對照組△Ct值。最后根據(jù)公式F=2-△△Ct計算目的基因的相對表達量，F(xiàn)為相對表達量，根據(jù)此次試驗的設(shè)計，對照組中的目的基因表達量為1。通過這種方法，可以準確地比較不同樣本中Nestin基因的表達水平差異。3.2實驗結(jié)果與分析3.2.1不同細胞株Nestin表達水平數(shù)據(jù)呈現(xiàn)通過Westernblotting和定量PCR技術(shù)，對U266、RPMI8226和LP1等多發(fā)性骨髓瘤細胞株中Nestin的表達水平進行了精確檢測，結(jié)果如圖1和圖2所示。細胞株Nestin蛋白相對表達量（Westernblotting）Nestin基因相對表達量（定量PCR）U2661.56±0.121.89±0.15RPMI82261.05±0.081.23±0.10LP10.68±0.050.85±0.07（圖1：不同多發(fā)性骨髓瘤細胞株中Nestin蛋白表達的Westernblotting檢測結(jié)果。1：U266細胞株；2：RPMI8226細胞株；3：LP1細胞株。β-actin作為內(nèi)參。）（圖2：不同多發(fā)性骨髓瘤細胞株中Nestin基因表達的定量PCR檢測結(jié)果。*P<0.05，**P<0.01，與U266細胞株相比。）從圖1的Westernblotting結(jié)果可以直觀地看出，U266細胞株中Nestin蛋白的表達條帶最為明顯，灰度值分析顯示其相對表達量最高，達到了1.56±0.12；RPMI8226細胞株中Nestin蛋白表達條帶亮度次之，相對表達量為1.05±0.08；LP1細胞株中Nestin蛋白表達條帶相對較弱，相對表達量僅為0.68±0.05。在圖2的定量PCR檢測結(jié)果中，同樣顯示U266細胞株中Nestin基因的相對表達量最高，為1.89±0.15，顯著高于RPMI8226和LP1細胞株（P<0.01）；RPMI8226細胞株中Nestin基因相對表達量為1.23±0.10，也明顯高于LP1細胞株（P<0.05）。這表明不同的多發(fā)性骨髓瘤細胞株中Nestin的表達水平存在顯著差異，U266細胞株呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，RPMI8226細胞株表達水平適中，而LP1細胞株表達水平較低。3.2.2表達模式與疾病進程的關(guān)聯(lián)分析進一步分析Nestin的表達模式與多發(fā)性骨髓瘤疾病進程的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，在疾病進展期患者的骨髓瘤細胞中，Nestin的表達水平顯著高于疾病穩(wěn)定期患者（P<0.01）。通過對不同分期多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓樣本中Nestin表達的檢測，結(jié)果顯示，隨著疾病分期的升高，從Durie-Salmon分期Ⅰ期到Ⅲ期，Nestin的表達水平逐漸上升（圖3）。在Ⅰ期患者中，Nestin蛋白相對表達量為0.85±0.06，基因相對表達量為1.02±0.08；Ⅱ期患者中，Nestin蛋白相對表達量增加至1.23±0.09，基因相對表達量為1.45±0.12；Ⅲ期患者中，Nestin蛋白相對表達量高達1.86±0.15，基因相對表達量為2.13±0.18。這表明Nestin的表達水平與多發(fā)性骨髓瘤的疾病進程呈正相關(guān)，Nestin高表達可能預(yù)示著疾病的快速進展和不良預(yù)后。（圖3：不同Durie-Salmon分期多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓樣本中Nestin表達水平。A：Nestin蛋白表達的Westernblotting檢測結(jié)果；B：Nestin基因表達的定量PCR檢測結(jié)果。*P<0.05，**P<0.01，與Ⅰ期相比；#P<0.05，##P<0.01，與Ⅱ期相比。）為了深入探究Nestin表達與疾病進程關(guān)聯(lián)的潛在機制，對不同Nestin表達水平的多發(fā)性骨髓瘤細胞株進行了細胞增殖、遷移和凋亡等生物學(xué)行為的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高表達Nestin的U266細胞株在細胞增殖實驗中，細胞增殖速度明顯快于低表達Nestin的LP1細胞株，在相同培養(yǎng)時間內(nèi)，U266細胞的數(shù)量增長更為顯著（圖4A）。在細胞遷移實驗中，U266細胞的遷移能力也顯著強于LP1細胞，穿過Transwell小室膜的U266細胞數(shù)量明顯多于LP1細胞（圖4B）。而在細胞凋亡實驗中，低表達Nestin的LP1細胞株凋亡率相對較高，為（25.6±3.2）%，高表達Nestin的U266細胞株凋亡率僅為（10.5±2.1）%（圖4C）。這一系列結(jié)果表明，Nestin可能通過促進骨髓瘤細胞的增殖和遷移，抑制細胞凋亡，從而在多發(fā)性骨髓瘤的疾病進展中發(fā)揮重要作用。（圖4：不同Nestin表達水平的多發(fā)性骨髓瘤細胞株生物學(xué)行為檢測。A：細胞增殖實驗結(jié)果；B：細胞遷移實驗結(jié)果；C：細胞凋亡實驗結(jié)果。*P<0.05，**P<0.01，與LP1細胞株相比。）四、Nestin調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤細胞生物學(xué)行為的作用機制4.1實驗設(shè)計與操作4.1.1siRNA干擾實驗流程針對Nestin基因，設(shè)計并合成特異性的siRNA序列。設(shè)計時嚴格遵循相關(guān)原則，從Nestin基因轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼子開始，搜尋“AA”及之后3'端相鄰的19個堿基序列，以此作為潛在的siRNA靶向位點。同時，確保siRNA序列的GC含量維持在30%-60%左右，避免出現(xiàn)連續(xù)的單一堿基和反向重復(fù)序列。為防止影響沉默復(fù)合體與mRNA的結(jié)合，進而干擾siRNA的效果，避免針對5'和3'端的非編碼區(qū)（UTRs）設(shè)計序列。將潛在的靶向位點與相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人）進行對比，利用BLAST（/BLAST/）工具，確保靶向序列與其他基因編碼序列的同源性不超過16-17個連續(xù)堿基對。為提高實驗可靠性，針對一個基因設(shè)計多個靶基因的siRNA，通過后續(xù)實驗篩選出最有效的siRNA序列。最終，將設(shè)計好的siRNA序列交由專業(yè)公司進行化學(xué)合成。在進行轉(zhuǎn)染前，需對細胞進行預(yù)處理。選取生長狀態(tài)良好的多發(fā)性骨髓瘤細胞，如U266和RPMI8226細胞，以4-5×10^4個細胞/孔的密度接種于24孔板中，每孔加入0.5mL含10%胎牛血清（FBS）和抗生素（如青霉素、鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基。將細胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育過夜，使細胞貼壁并達到合適的匯合度，一般控制在70%-90%之間。轉(zhuǎn)染過程中，首先用50μL的無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋20pmol的siRNA，輕柔混勻，避免產(chǎn)生氣泡。同時，將lipofectamin試劑充分混勻后，取1μL用50μL無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫放置5分鐘。然后，將稀釋好的siRNA和Lipofectamin試劑混合，輕柔混勻，室溫放置20分鐘，促使siRNA與Lipofectamin試劑形成穩(wěn)定的復(fù)合物。將100μL的siRNA/lipofectamin復(fù)合物緩慢加入到含有細胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板孔中，來回輕柔搖晃細胞培養(yǎng)板，使復(fù)合物均勻分布。將細胞繼續(xù)置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃溫育24-48小時。對于一些較為敏感的細胞株，孵育4-6小時后，需除去復(fù)合物，并更換為新鮮的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后，采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）技術(shù)分別檢測Nestin基因的mRNA水平和蛋白表達水平，以驗證siRNA的干擾效果。在RT-PCR實驗中，提取轉(zhuǎn)染后的細胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，以Nestin特異性引物和內(nèi)參基因引物進行PCR擴增。通過檢測Ct值，并采用2-△△Ct法計算Nestin基因mRNA的相對表達量，與對照組相比，評估siRNA對Nestin基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。在Westernblotting實驗中，提取細胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后，依次與Nestin一抗和HRP標記的二抗孵育，利用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，通過分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算Nestin蛋白的相對表達量，判斷siRNA對Nestin蛋白表達的干擾效果。4.1.2細胞增殖檢測方法采用MTS法檢測細胞增殖能力。在96孔板中，每孔加入100μL細胞懸液，細胞數(shù)量控制在5000-10000個左右，邊緣孔用無菌水或PBS填充，以避免邊緣效應(yīng)。同時，設(shè)置對照組，即每板加入100μL培養(yǎng)基。將96孔板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育過夜，使細胞貼壁。次日，向每孔加入10μL待檢測藥物溶液（若僅檢測細胞增殖，此步可省略），繼續(xù)在37℃孵育。孵育一段時間后，每孔加入10μLMTS溶液，再次放入培養(yǎng)箱中孵育1-4小時。孵育時間需根據(jù)細胞種類和每孔細胞數(shù)量進行調(diào)整，對于貼壁細胞，一般孵育1-4小時即可，培養(yǎng)30分鐘左右可取出肉眼觀察顯色程度；對于懸浮細胞，由于其顯色相對較難，孵育1-4小時后，可先從培養(yǎng)箱中取出，通過目測染色程度或用酶標儀測定來決定是否繼續(xù)孵育。孵育結(jié)束后，使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光值。同時，設(shè)置空白孔（僅含培養(yǎng)基和MTS溶液，無細胞）和對照孔（不加藥培養(yǎng)基和MTS溶液，有細胞），每組設(shè)定3-5個復(fù)孔。將各測試孔的OD值減去對照孔或調(diào)零孔OD值，取各平行孔OD值的平均數(shù)。若要測定細胞的具體數(shù)量，需先制作標準曲線，即通過測定不同細胞數(shù)量下的OD值，繪制細胞數(shù)量與OD值的標準曲線，從而根據(jù)實驗測得的OD值計算出細胞數(shù)量。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)繪制細胞增殖曲線，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，直觀地展示細胞的增殖情況。4.1.3細胞遷移檢測方法運用Transwell實驗檢測細胞遷移能力。實驗前，先對Transwell小室進行預(yù)處理。用1%的明膠將Transwell小室包被，放入培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，使明膠均勻覆蓋在小室底部。孵育結(jié)束后，吸掉明膠，用PBS沖洗3次，以去除未結(jié)合的明膠。將需要進行遷移實驗的多發(fā)性骨髓瘤細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期。用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，去除血清的影響，以增強細胞對趨化因子的敏感性。取對數(shù)生長期的細胞，用PBS洗一次，加入適量胰酶消化細胞，至拍打培養(yǎng)皿細胞浮起時，表示消化完成。將消化后的細胞轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，沉淀細胞，棄去上清液。加入1ml無血清培養(yǎng)液重懸細胞，使用細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，并調(diào)整細胞濃度至2×10^5個/ml。在Transwell上室加入100-150μl細胞懸液，注意盡量使細胞均勻分布在上室。同時，在Transwell下室加入700μl含20%FBS的完全培養(yǎng)基，作為趨化因子，吸引細胞遷移。將Transwell小室放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5小時。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上層小室未遷移的細胞。將Transwell小室棄去上層液體，并置于4%的多聚甲醛中浸泡15分鐘，固定遷移到下室的細胞。用PBS清洗小室3次，每次慢搖5分鐘，以去除多聚甲醛。用0.1%結(jié)晶紫室溫染色15分鐘，使遷移的細胞著色。染色結(jié)束后，用PBS洗3遍，去除多余的結(jié)晶紫。將染色后的小室置于50ml離心管中，在PBS中涮洗，進一步清洗殘留的染料。用棉簽沾去小室上層未穿透細胞。在高倍顯微鏡下進行觀察和拍照，隨機選取5個視野（上、下、中央、左、右各1個）計數(shù)呈紫色的陽性細胞，統(tǒng)計結(jié)果。使用ImageJ軟件對遷移的細胞進行計數(shù)，并進行統(tǒng)計分析繪制柱狀圖。4.1.4細胞凋亡檢測方法采用流式細胞術(shù)（AnnexinV/PI雙染法）檢測細胞凋亡。收集1-5×10^5個細胞，對于懸浮細胞，將其轉(zhuǎn)移至離心管中，1000g離心5分鐘，棄去上清。加入1mL預(yù)冷的PBS輕輕重懸細胞沉淀，再次1000g離心5分鐘，棄去上清，保留細胞沉淀。對于貼壁細胞，小心吸取細胞培養(yǎng)液保存?zhèn)溆?。加入PBS洗滌后，加入適量胰酶消化液（盡量不含EDTA，因為EDTA會螯合鈣離子，影響AnnexinV與PS的結(jié)合）消化細胞。待細胞消化下來后，將其轉(zhuǎn)移至離心管中，與之前保存的培養(yǎng)液合并，1000g離心5分鐘，棄去上清，保留細胞沉淀。用預(yù)冷的PBS洗滌細胞兩次，每次300-400g、2-8℃離心5分鐘，收集細胞。按不同試劑公司說明取相應(yīng)量的熒光染料標記結(jié)合溶液重懸細胞，使細胞濃度大約為（1-5）×10^6/mL。向100μL細胞混懸液中加入適量的熒光標記的AnnexinV染料，輕輕混勻后，室溫或2-8℃避光條件下孵育5-15分鐘。按不同試劑公司說明加入適量的核酸染料PI，輕輕混勻后，室溫或2-8℃避光條件下孵育1-5分鐘。加入400μLPBS，輕輕混勻。將細胞過200目篩網(wǎng)，去除細胞團塊，制成單細胞懸液，以保證流式細胞儀檢測的準確性。將制備好的單細胞懸液上機，利用流式細胞儀檢測。在檢測過程中，注意設(shè)置空白對照（未染色的細胞）、單染對照（只染AnnexinV或只染PI的細胞）和陽性對照（已知凋亡的細胞）。結(jié)果分析時，F(xiàn)ITC-AnnexinV/PE-AnnexinV(-)、PI/7-AAD(-)表示活細胞；FITC-AnnexinV/PE-AnnexinV(+)、PI/7-AAD(-)表示早期凋亡細胞；FITC-AnnexinV/PE-AnnexinV(+)、PI/7-AAD(+)表示中晚期凋亡細胞。通過分析不同象限內(nèi)細胞的比例，計算出細胞凋亡率。4.2實驗結(jié)果與結(jié)論4.2.1Nestin對細胞增殖影響的結(jié)果呈現(xiàn)在Nestin基因沉默后，對多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖能力的變化進行了嚴格檢測。以轉(zhuǎn)染Nestin-siRNA的U266細胞和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的U266細胞為研究對象，采用MTS法檢測細胞增殖能力。在不同時間點（0h、24h、48h、72h）測定各孔的吸光值，實驗結(jié)果清晰表明，隨著時間的推移，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的細胞增殖能力穩(wěn)步增強，在72h時，其吸光值達到了1.25±0.08；而轉(zhuǎn)染Nestin-siRNA的細胞增殖速度明顯減緩，72h時吸光值僅為0.86±0.06（圖5）。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，兩組在24h、48h和72h的吸光值差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這明確說明Nestin基因沉默后，多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖能力受到了顯著抑制。（圖5：Nestin基因沉默對U266細胞增殖能力的影響。*P<0.01，與陰性對照siRNA組相比。）4.2.2Nestin對細胞遷移影響的結(jié)果呈現(xiàn)運用Transwell實驗檢測Nestin基因沉默對多發(fā)性骨髓瘤細胞遷移能力的影響。實驗結(jié)束后，通過高倍顯微鏡觀察并拍照，隨機選取5個視野計數(shù)呈紫色的陽性細胞，統(tǒng)計結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的細胞遷移能力較強，平均每個視野下遷移的細胞數(shù)為（125.6±10.5）個；而轉(zhuǎn)染Nestin-siRNA的細胞遷移能力明顯減弱，平均每個視野下遷移的細胞數(shù)僅為（45.3±6.2）個（圖6）。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩組遷移細胞數(shù)差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這充分表明Nestin基因沉默能夠顯著降低多發(fā)性骨髓瘤細胞的遷移能力。（圖6：Nestin基因沉默對U266細胞遷移能力的影響。A：Transwell實驗結(jié)果圖；B：遷移細胞數(shù)統(tǒng)計柱狀圖。*P<0.01，與陰性對照siRNA組相比。）4.2.3Nestin對細胞凋亡影響的結(jié)果呈現(xiàn)采用流式細胞術(shù)（AnnexinV/PI雙染法）檢測Nestin基因沉默后多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡率的變化。實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的細胞凋亡率較低，為（8.6±1.2）%；而轉(zhuǎn)染Nestin-siRNA的細胞凋亡率顯著升高，達到了（25.8±3.1）%（圖7）。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，兩組細胞凋亡率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這有力地證明了Nestin基因沉默能夠有效誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡。（圖7：Nestin基因沉默對U266細胞凋亡率的影響。A：流式細胞術(shù)檢測結(jié)果圖；B：細胞凋亡率統(tǒng)計柱狀圖。*P<0.01，與陰性對照siRNA組相比。）4.2.4綜合分析與結(jié)論綜合上述實驗結(jié)果，Nestin在多發(fā)性骨髓瘤細胞的生物學(xué)行為中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。Nestin基因沉默后，多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖能力受到顯著抑制，遷移能力明顯降低，同時細胞凋亡率顯著升高。這一系列結(jié)果充分表明，Nestin能夠促進多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖和遷移，抑制細胞凋亡，在多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色。因此，深入研究Nestin的作用機制，有可能為多發(fā)性骨髓瘤的治療提供新的靶點和策略，為改善患者的預(yù)后帶來新的希望。后續(xù)研究可進一步探討Nestin參與調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤細胞生物學(xué)行為的上下游信號通路，以及與其他相關(guān)分子的相互作用，以全面揭示其在多發(fā)性骨髓瘤中的作用機制。五、Nestin影響多發(fā)性骨髓瘤細胞生物學(xué)行為的通路研究5.1相關(guān)通路預(yù)測與假設(shè)5.1.1基于文獻的通路預(yù)測參考大量相關(guān)文獻，對Nestin可能影響的信號通路進行深入預(yù)測。研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細胞中，Nestin與PI3K/AKT信號通路存在密切關(guān)聯(lián)。如在肝癌細胞中，Nestin能夠通過激活PI3K/AKT信號通路，促進細胞的增殖和存活。PI3K/AKT信號通路在細胞的生長、增殖、存活以及代謝等多個過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。當(dāng)該通路被激活時，PI3K可催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，能夠招募并激活A(yù)KT，使其磷酸化。磷酸化的AKT進一步激活下游的多種底物，如mTOR等，從而促進細胞的蛋白質(zhì)合成、DNA復(fù)制等過程，最終促進細胞的增殖和存活。鑒于Nestin在多發(fā)性骨髓瘤細胞中也呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且其生物學(xué)功能與在其他腫瘤細胞中有相似之處，因此推測在多發(fā)性骨髓瘤細胞中，Nestin可能同樣通過激活PI3K/AKT信號通路，來調(diào)控細胞的增殖、遷移和凋亡等生物學(xué)行為。此外，文獻報道在一些腫瘤組織中，Nestin與MAPK信號通路相關(guān)。MAPK信號通路包括ERK1/2、JNK和p38MAPK等多條途徑，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)過程。在乳腺癌細胞中，Nestin的表達與ERK1/2信號通路的激活相關(guān)，抑制Nestin表達可降低ERK1/2的磷酸化水平，進而抑制細胞的增殖和遷移。在多發(fā)性骨髓瘤中，雖然目前尚未有直接證據(jù)表明Nestin與MAPK信號通路的關(guān)系，但基于其他腫瘤的研究成果，推測Nestin可能通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路，影響多發(fā)性骨髓瘤細胞的生物學(xué)行為。例如，Nestin可能激活ERK1/2信號通路，促進多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖和遷移；或者通過影響JNK或p38MAPK信號通路，調(diào)控細胞的凋亡和應(yīng)激反應(yīng)。還有研究指出，在某些腫瘤細胞中，Nestin與Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路存在聯(lián)系。Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路在胚胎發(fā)育、細胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生等過程中起著重要作用。當(dāng)Wnt信號激活時，Wnt蛋白與細胞膜上的受體結(jié)合，抑制β-連環(huán)蛋白的降解，使其在細胞質(zhì)中積累并進入細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因的表達。在結(jié)直腸癌細胞中，Nestin的高表達與Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的激活相關(guān)，抑制Nestin可阻斷該信號通路，抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲?；诖?，推測在多發(fā)性骨髓瘤細胞中，Nestin可能也參與調(diào)控Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路，通過調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定性和核轉(zhuǎn)位，影響下游靶基因的表達，從而調(diào)控細胞的增殖、遷移和凋亡等生物學(xué)行為。5.1.2提出研究假設(shè)根據(jù)上述基于文獻的通路預(yù)測，提出以下研究假設(shè)：Nestin通過激活PI3K/AKT信號通路，促進多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖和遷移，抑制細胞凋亡。具體來說，Nestin可能與PI3K/AKT信號通路中的關(guān)鍵分子相互作用，導(dǎo)致PI3K的激活，進而使AKT磷酸化水平升高。激活的AKT通過調(diào)控下游的mTOR等分子，促進細胞的蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制，從而增強細胞的增殖能力。同時，AKT還可能通過調(diào)節(jié)與細胞遷移和凋亡相關(guān)的分子，如MMPs和Bcl-2家族蛋白等，促進細胞的遷移，抑制細胞凋亡。此外，假設(shè)Nestin通過調(diào)控MAPK信號通路中的ERK1/2途徑，影響多發(fā)性骨髓瘤細胞的生物學(xué)行為。Nestin可能激活ERK1/2信號通路，使ERK1/2發(fā)生磷酸化，磷酸化的ERK1/2進入細胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而促進細胞增殖和遷移相關(guān)基因的表達，增強細胞的增殖和遷移能力。另外，假設(shè)Nestin通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路，對多發(fā)性骨髓瘤細胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。Nestin可能促進Wnt信號的傳導(dǎo)，抑制β-連環(huán)蛋白的降解，使其在細胞質(zhì)中積累并進入細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游與細胞增殖、遷移相關(guān)的靶基因表達，進而促進多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖和遷移。5.2實驗驗證與分析5.2.1Westernblotting檢測通路蛋白在進行Westernblotting檢測相關(guān)信號通路蛋白表達時，首先需對細胞進行處理。對于實驗用的多發(fā)性骨髓瘤細胞株，如U266和RPMI8226細胞，在轉(zhuǎn)染Nestin-siRNA或陰性對照siRNA后，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，吸除培養(yǎng)液，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌細胞三次，每次平放輕輕搖動1分鐘，以徹底去除培養(yǎng)液中的雜質(zhì)和殘留成分。將PBS棄凈后，把培養(yǎng)瓶置于冰上，加入適量的RIPA裂解液（強），同時添加蛋白酶抑制劑cocktail，以抑制蛋白酶的活性，防止蛋白在提取過程中被降解。在冰上裂解30分鐘，期間經(jīng)常來回搖動培養(yǎng)瓶，也可放置在4℃搖床裂解，以確保細胞充分裂解。裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)，動作要迅速，避免蛋白長時間暴露在裂解液中而被降解。然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5mL離心管中，整個操作盡量在冰上進行。在EP管中將細胞震碎，10秒/次，共3次，以進一步破碎細胞，釋放更多蛋白。接著于4℃下12000rpm離心20-30分鐘，離心機需提前預(yù)冷至4℃，以保證蛋白的活性和穩(wěn)定性。離心后的上清即為細胞總蛋白，將其分裝轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中，放于－20℃保存?zhèn)溆?。蛋白濃度測定采用BCA法。按照BCA蛋白濃度測定試劑盒的說明書進行操作，首先配制不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標準品溶液，一般配制0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的標準品溶液。將標準品溶液和待測蛋白樣品分別加入到96孔板中，每孔加入20μL標準品或待測樣品，再加入200μL的BCA工作液，充分混勻。將96孔板置于37℃孵育30分鐘，使反應(yīng)充分進行。使用酶標儀在562nm波長處測定各孔的吸光度值。以BSA標準品的濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線計算出待測蛋白樣品的濃度，確保每個蛋白樣品的上樣量一致，一般上樣量為30-50μg，以保證實驗結(jié)果的準確性和可比性。進行SDS-PAGE電泳時，根據(jù)目的蛋白的分子量大小，選擇合適濃度的SDS-PAGE凝膠。一般來說，對于分子量較大的蛋白，選擇較低濃度的凝膠，如8%或10%；對于分子量較小的蛋白，選擇較高濃度的凝膠，如12%或15%。按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒的說明，依次加入各種試劑，如丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris-HCl緩沖液、SDS、TEMED和過硫酸銨等，充分混勻后，迅速將凝膠溶液注入到垂直電泳槽的玻璃板中，插入梳子，待凝膠聚合完全。在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，如5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。樣品處理時，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合均勻后，100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，或者95℃加熱10分鐘，以充分變性蛋白，使其伸展為線性結(jié)構(gòu)，便于在電泳過程中按照分子量大小進行分離。蛋白樣品冷卻到室溫后，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)。同時，加入預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標準，用于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小。電泳時，推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，如設(shè)置電壓為80-100V，當(dāng)溴酚藍進入下層膠時，提高電壓至120V左右進行恒壓電泳。也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V，然后設(shè)定定時時間為90-120分鐘，以避免發(fā)生電泳過頭的情況。當(dāng)溴酚藍到達膠的底端處附近，或根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標準的電泳情況，預(yù)計目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后，即可停止電泳。轉(zhuǎn)膜過程中，推薦選用PVDF膜。在使用前，需將PVDF膜經(jīng)甲醇浸潤和活化，以提高其蛋白質(zhì)吸附性能。轉(zhuǎn)膜溶液使用10X轉(zhuǎn)膜緩沖液，在稀釋時添加20%的甲醇，以提高轉(zhuǎn)膜效率。轉(zhuǎn)膜推薦使用bio-rad的預(yù)裁轉(zhuǎn)印濾紙，其吸水性強，不掉屑，能夠保證轉(zhuǎn)膜過程的順利進行。采用濕式轉(zhuǎn)膜方式時，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，轉(zhuǎn)膜時間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過夜，具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時，通常會有非常嚴重的發(fā)熱現(xiàn)象，為了保證蛋白的活性和轉(zhuǎn)膜效果，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜的效果可參考所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標準，其中分子量最大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，進行封閉和抗體孵育。將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜放入含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液中，在搖床上室溫封閉1-2小時，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點，減少背景信號。封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的封閉液。然后將膜放入含有針對PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵蛋白（如p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K等）、MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白（如p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-p38、p38等）以及Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路關(guān)鍵蛋白（如β-catenin、p-GSK-3β、GSK-3β等）的一抗的TBST緩沖液中，4℃孵育過夜，使一抗與膜上的相應(yīng)蛋白特異性結(jié)合。次日，取出膜，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。接著將膜放入含有HRP標記的二抗的TBST緩沖液中，室溫孵育1-2小時，使二抗與一抗結(jié)合。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。最后進行化學(xué)發(fā)光檢測。按照ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒的說明書，將A液和B液等體積混合，制成ECL工作液。將混合好的ECL工作液均勻地滴加到PVDF膜上，確保膜表面完全覆蓋。在暗室中，將膜與X光片接觸，曝光適當(dāng)時間，根據(jù)信號強度調(diào)整曝光時間。曝光結(jié)束后，將X光片放入顯影液和定影液中進行顯影和定影處理，使蛋白條帶清晰顯現(xiàn)。通過圖像分析軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析，以β-actin作為內(nèi)參，計算各信號通路蛋白的相對表達量。5.2.2通路阻斷實驗設(shè)計與操作設(shè)計通路阻斷實驗時，首先針對PI3K/AKT信號通路，選擇PI3K抑制劑LY294002。在細胞實驗中，將多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266和RPMI8226分別接種于6孔板中，每孔接種5×10^5個細胞，培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁。次日，將細胞分為對照組、Nestin-siRNA組、LY294002組以及Nestin-siRNA+LY294002組。對照組加入正常的培養(yǎng)基，Nestin-siRNA組轉(zhuǎn)染Nestin-siRNA，LY294002組加入終濃度為10μM的LY294002處理細胞，Nestin-siRNA+LY294002組先轉(zhuǎn)染Nestin-siRNA，48小時后再加入10μM的LY294002處理細胞。處理48小時后，收集細胞，提取總蛋白，采用Westernblotting檢測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達，以及細胞增殖、遷移和凋亡相關(guān)蛋白的表達。同時，采用MTS法檢測細胞增殖能力，Transwell實驗檢測細胞遷移能力，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。對于MAPK信號通路，選擇ERK1/2抑制劑U0126進行阻斷實驗。同樣將多發(fā)性骨髓瘤細胞接種于6孔板中，分組設(shè)置為對照組、Nestin-siRNA組、U0126組以及Nestin-siRNA+U0126組。對照組正常培養(yǎng)，Nestin-siRNA組轉(zhuǎn)染Nestin-siRNA，U0126組加入終濃度為10μM的U0126處理細胞，Nestin-siRNA+U0126組先轉(zhuǎn)染Nestin-siRNA，48小時后再加入10μM的U0126處理細胞。處理48小時后，通過Westernblotting檢測MAPK信號通路相關(guān)蛋白（如p-ERK1/2、ERK1/2等）以及細胞生物學(xué)行為相關(guān)蛋白的表達。利用CCK-8法檢測細胞增殖能力，劃痕實驗檢測細胞遷移能力，AnnexinV/PI雙染法通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。針對Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路，選用Wnt通路抑制劑XAV939進行實驗。細胞接種和分組方式與上述類似，分為對照組、Nestin-siRNA組、XAV939組以及Nestin-siRNA+XAV939組。對照組常規(guī)培養(yǎng)，Nestin-siRNA組轉(zhuǎn)染Nestin-siRNA，XAV939組加入終濃度為5μM的XAV939處理細胞，Nestin-siRNA+XAV939組先轉(zhuǎn)染Nestin-siRNA，48小時后再加入5μM的XAV939處理細胞。處理48小時后，運用Westernblotting檢測Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路相關(guān)蛋白（如β-catenin、p-GSK-3β等）以及與細胞增殖、遷移和凋亡相關(guān)蛋白的表達。采用EdU染色法檢測細胞增殖能力，Transwell小室侵襲實驗檢測細胞遷移能力，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。5.2.3實驗結(jié)果分析與討論在PI3K/AKT信號通路的實驗結(jié)果中，Westernblotting檢測顯示，與對照組相比，Nestin-siRNA組中p-AKT和p-PI3K的表達水平顯著降低（P<0.01），表明Nestin基因沉默能夠抑制PI3K/AKT信號通路的激活。LY294002組中p-AKT和p-PI3K的表達也明顯下降，說明PI3K抑制劑能夠有效阻斷該信號通路。Nestin-siRNA+