PTH與SDF-1聯(lián)合作用對人牙周膜干細胞生物活性影響的機制探究一、引言1.1研究背景與意義牙周病作為口腔領(lǐng)域的常見多發(fā)病，是一類因牙菌斑中的微生物引發(fā)的感染性疾病，會導致牙周支持組織如牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)產(chǎn)生炎癥和破壞。流行病學調(diào)查顯示，牙周病在全球范圍內(nèi)發(fā)病率頗高，嚴重影響人們的口腔健康和生活質(zhì)量。在中國，牙周病的患病率也居高不下，據(jù)第四次全國口腔健康流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，35-44歲居民中，牙齦出血檢出率為87.4%，牙周袋檢出率為62.4%；65-74歲老年人中，牙周袋檢出率為74.1%，牙齒缺失率高達86.1%。牙周病不僅會造成牙齒松動、移位甚至脫落，影響咀嚼功能和美觀，還與全身健康存在密切關(guān)聯(lián)，如心血管疾病、糖尿病、呼吸系統(tǒng)疾病等。隨著人們對口腔健康重視程度的不斷提高，對牙周病治療效果和預后的要求也日益增加。傳統(tǒng)的牙周病治療方法，如牙周基礎(chǔ)治療（齦上潔治、齦下刮治等）、牙周手術(shù)治療等，雖能在一定程度上控制炎癥、緩解癥狀，但對于已經(jīng)嚴重破壞的牙周組織，難以實現(xiàn)完全再生和功能恢復。因此，尋找一種更為有效的治療方法，促進牙周組織的再生，成為牙周病治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。近年來，干細胞技術(shù)的快速發(fā)展為牙周組織再生治療帶來了新的希望。人牙周膜干細胞（humanperiodontalligamentstemcells，hPDLSCs）作為一種成體間充質(zhì)干細胞，具有自我更新和多向分化潛能。研究表明，hPDLSCs能夠在適當?shù)臈l件下分化為成牙骨質(zhì)細胞、成骨細胞、成纖維細胞等牙周組織細胞，在牙周組織再生中發(fā)揮著重要作用。當hPDLSCs被移植到牙周缺損部位時，它們可以通過分化為相應的功能細胞，參與牙周組織的修復和重建過程。hPDLSCs還能分泌多種細胞因子和生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、胰島素樣生長因子（IGF）等，這些因子可以調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和遷移，促進牙周組織的再生。然而，在實際應用中，hPDLSCs的增殖、遷移和分化能力受到多種因素的影響，如何有效調(diào)控這些過程，提高hPDLSCs在牙周組織再生中的治療效果，仍是當前研究的重點和難點。甲狀旁腺激素（Parathyroidhormone，PTH）和基質(zhì)細胞衍生因子-1（Stromalcell-derivedfactor-1，SDF-1）作為兩種重要的生物活性分子，在細胞的增殖、遷移和分化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。PTH是由甲狀旁腺主細胞分泌的一種單鏈多肽激素，在維持鈣磷代謝平衡、調(diào)節(jié)骨代謝等方面具有重要作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，間歇性低劑量的PTH能夠促進成骨細胞的增殖和分化，抑制破骨細胞的活性，從而促進骨形成。在牙周組織再生領(lǐng)域，PTH也展現(xiàn)出了潛在的應用價值。研究表明，PTH可以促進hPDLSCs的增殖和遷移，增強其成骨分化能力，有助于牙周組織的修復和再生。SDF-1是一種趨化因子，屬于CXC趨化因子家族，其受體為CXCR4。SDF-1/CXCR4信號軸在細胞的遷移、歸巢和分化過程中發(fā)揮著重要作用。在組織損傷修復過程中，受損組織會分泌SDF-1，吸引表達CXCR4的干細胞遷移到損傷部位，參與組織的修復和再生。在牙周組織再生中，SDF-1能夠趨化hPDLSCs遷移到牙周缺損部位，促進牙周組織的再生。雖然PTH和SDF-1單獨應用對hPDLSCs的增殖、遷移和分化具有一定的促進作用，但目前對于PTH和SDF-1聯(lián)合應用對hPDLSCs的影響研究較少，其作用機制也尚不明確。深入研究PTH和SDF-1聯(lián)合應用對hPDLSCs增殖、遷移及分化的影響，不僅有助于進一步揭示牙周組織再生的分子機制，還能為牙周病的臨床治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。通過聯(lián)合應用PTH和SDF-1，可以更有效地調(diào)控hPDLSCs的生物學行為，提高其在牙周組織再生中的治療效果，為廣大牙周病患者帶來更好的治療前景。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在牙周組織再生領(lǐng)域，人牙周膜干細胞（hPDLSCs）因其獨特的生物學特性成為研究熱點。甲狀旁腺激素（PTH）和基質(zhì)細胞衍生因子-1（SDF-1）對hPDLSCs的調(diào)控作用也受到了廣泛關(guān)注，國內(nèi)外學者圍繞這一主題展開了諸多研究。在PTH對hPDLSCs影響的研究方面，國外學者較早開展相關(guān)探索。有研究發(fā)現(xiàn)，間歇性低劑量的PTH作用于hPDLSCs時，能夠顯著上調(diào)細胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達，促使hPDLSCs從G0/G1期進入S期，從而促進細胞增殖。在成骨分化方面，PTH可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，增加成骨相關(guān)基因如Runx2、骨鈣素（OCN）的表達，誘導hPDLSCs向成骨細胞分化。國內(nèi)研究也進一步證實了PTH對hPDLSCs的促進作用。有團隊通過體外實驗表明，PTH能夠增強hPDLSCs的遷移能力，其機制可能與上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達有關(guān)，這兩種酶能夠降解細胞外基質(zhì)，為細胞遷移提供有利條件。關(guān)于SDF-1對hPDLSCs的作用，國內(nèi)外研究也取得了一定成果。研究表明，SDF-1能夠與hPDLSCs表面的受體CXCR4特異性結(jié)合，激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路，從而促進hPDLSCs的遷移。在細胞增殖方面，SDF-1在一定濃度范圍內(nèi)可以提高hPDLSCs的增殖活性，其作用機制可能與調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達有關(guān)。在分化調(diào)控上，SDF-1聯(lián)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）能夠協(xié)同促進hPDLSCs向成骨細胞分化，增加堿性磷酸酶（ALP）活性和鈣結(jié)節(jié)的形成。雖然PTH和SDF-1單獨應用對hPDLSCs的調(diào)控作用已較為明確，但兩者聯(lián)合應用的研究相對較少。目前僅有少數(shù)研究涉及PTH和SDF-1聯(lián)合對hPDLSCs的影響。有研究報道，PTH和SDF-1聯(lián)合作用時，對hPDLSCs的增殖、遷移和成骨分化具有協(xié)同促進作用。然而，這些研究在聯(lián)合應用的最佳濃度配比、作用時間以及具體作用機制等方面尚未形成統(tǒng)一結(jié)論。不同研究中所采用的PTH和SDF-1濃度組合差異較大，導致實驗結(jié)果難以直接比較和整合。對于聯(lián)合作用下hPDLSCs內(nèi)復雜的信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡以及基因表達譜的變化，目前的研究還不夠深入，許多關(guān)鍵節(jié)點和調(diào)控機制仍有待進一步探索。在體內(nèi)實驗方面，關(guān)于PTH和SDF-1聯(lián)合應用促進牙周組織再生的研究還相對匱乏，缺乏足夠的動物模型和臨床研究數(shù)據(jù)來驗證其實際效果和安全性。1.3研究目標與內(nèi)容本研究旨在深入探究甲狀旁腺激素（PTH）和基質(zhì)細胞衍生因子-1（SDF-1）聯(lián)合應用對人牙周膜干細胞（hPDLSCs）增殖、遷移及分化的影響，并揭示其潛在的作用機制，為牙周病的治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。具體研究內(nèi)容如下：1.3.1研究PTH和SDF-1聯(lián)合應用對hPDLSCs增殖的影響通過CCK-8法繪制細胞生長曲線，觀察不同濃度組合的PTH和SDF-1在不同作用時間下對hPDLSCs增殖活性的影響。設置空白對照組、PTH單獨作用組、SDF-1單獨作用組以及不同比例的PTH與SDF-1聯(lián)合作用組。在培養(yǎng)1天、3天、5天、7天時，分別向各孔加入CCK-8試劑，孵育一定時間后，用酶標儀測定450nm處的吸光度值，以此評估細胞的增殖情況。采用EdU（5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶）標記法檢測細胞的DNA合成情況，直觀反映細胞的增殖狀態(tài)。將hPDLSCs接種于含有不同處理因素的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時間后，加入EdU工作液繼續(xù)孵育。然后進行細胞固定、通透、Click反應等操作，在熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)EdU陽性細胞，計算EdU陽性細胞率，進一步明確PTH和SDF-1聯(lián)合應用對hPDLSCs增殖的促進作用。1.3.2研究PTH和SDF-1聯(lián)合應用對hPDLSCs遷移的影響利用Transwell小室實驗，探究PTH和SDF-1聯(lián)合作用對hPDLSCs遷移能力的影響。在上室加入含有不同處理因素的hPDLSCs懸液，下室加入含血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)一定時間后，取出小室，擦去上室未遷移的細胞，對遷移到下室膜表面的細胞進行固定、染色，在顯微鏡下計數(shù)遷移細胞的數(shù)量，分析不同處理組對hPDLSCs遷移能力的影響。采用劃痕實驗，模擬體內(nèi)細胞遷移的過程，觀察PTH和SDF-1聯(lián)合應用對hPDLSCs遷移的動態(tài)變化。在培養(yǎng)皿中接種hPDLSCs，待細胞融合至80%-90%時，用無菌槍頭在細胞單層上劃痕，形成無細胞區(qū)域。然后更換含有不同處理因素的培養(yǎng)基，在不同時間點拍照記錄劃痕愈合情況，通過測量劃痕寬度的變化，計算細胞遷移率，評估PTH和SDF-1聯(lián)合作用對hPDLSCs遷移能力的影響。1.3.3研究PTH和SDF-1聯(lián)合應用對hPDLSCs分化的影響在成骨誘導培養(yǎng)基中添加不同濃度的PTH和SDF-1，誘導hPDLSCs向成骨細胞分化。通過檢測成骨相關(guān)指標，如堿性磷酸酶（ALP）活性、鈣結(jié)節(jié)形成情況以及成骨相關(guān)基因（Runx2、OCN、OPN等）和蛋白（Runx2、OCN等）的表達水平，評估PTH和SDF-1聯(lián)合應用對hPDLSCs成骨分化的影響。在成牙骨質(zhì)誘導培養(yǎng)基中加入不同組合的PTH和SDF-1，誘導hPDLSCs向成牙骨質(zhì)細胞分化。通過檢測成牙骨質(zhì)相關(guān)指標，如牙骨質(zhì)涎蛋白（CSP）、牙骨質(zhì)附著蛋白（CAP）等基因和蛋白的表達水平，以及觀察細胞外基質(zhì)中類似牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的形成情況，探究PTH和SDF-1聯(lián)合應用對hPDLSCs向成牙骨質(zhì)細胞分化的影響。1.3.4探討PTH和SDF-1聯(lián)合應用影響hPDLSCs增殖、遷移及分化的信號通路通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測與細胞增殖、遷移和分化相關(guān)的信號通路蛋白的表達水平，如PI3K/Akt、MAPK等信號通路中的關(guān)鍵蛋白（p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-ERK1/2、ERK1/2等），分析PTH和SDF-1聯(lián)合應用對這些信號通路的激活或抑制作用。利用信號通路抑制劑，如LY294002（PI3K抑制劑）、U0126（MEK1/2抑制劑，可抑制MAPK通路）等，阻斷相關(guān)信號通路，觀察hPDLSCs在PTH和SDF-1聯(lián)合作用下的增殖、遷移及分化情況的變化。通過CCK-8法、Transwell小室實驗、成骨誘導分化實驗等，檢測細胞在阻斷信號通路后的生物學行為改變，明確PI3K/Akt、MAPK等信號通路在PTH和SDF-1聯(lián)合應用影響hPDLSCs增殖、遷移及分化過程中的作用機制。1.3.5驗證PTH和SDF-1聯(lián)合應用促進牙周組織再生的效果建立牙周炎動物模型，將實驗動物隨機分為空白對照組、PTH單獨治療組、SDF-1單獨治療組、PTH和SDF-1聯(lián)合治療組。對牙周炎動物模型進行相應的治療干預，空白對照組給予生理鹽水處理，PTH單獨治療組給予PTH局部注射，SDF-1單獨治療組給予SDF-1局部注射，PTH和SDF-1聯(lián)合治療組給予PTH和SDF-1聯(lián)合局部注射。在治療后的不同時間點（如2周、4周、8周），通過Micro-CT掃描觀察牙槽骨的修復情況，測量牙槽骨高度、骨密度等指標；通過組織學染色（如蘇木精-伊紅染色、Masson染色等）觀察牙周組織的形態(tài)學變化，評估炎癥細胞浸潤、牙周膜結(jié)構(gòu)、牙骨質(zhì)再生等情況；通過免疫組織化學染色檢測成骨相關(guān)蛋白（如OCN、Runx2等）的表達，進一步驗證PTH和SDF-1聯(lián)合應用促進牙周組織再生的效果。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法細胞分離與培養(yǎng)：選擇因正畸治療需要而拔除的健康前磨牙，采用酶消化法結(jié)合組織塊法分離人牙周膜干細胞（hPDLSCs）。將牙齒用含雙抗（青霉素、鏈霉素）的PBS沖洗后，刮取牙周膜組織并剪碎成約1mm3大小的組織塊，用0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型膠原酶混合液在37℃、5%CO?條件下消化30-40分鐘，終止消化后離心收集細胞，接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待細胞融合至80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶進行傳代培養(yǎng)，取第3-5代細胞用于后續(xù)實驗。細胞鑒定：通過形態(tài)學觀察、免疫細胞化學染色以及流式細胞術(shù)對hPDLSCs進行鑒定。在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，hPDLSCs呈長梭形，類似成纖維細胞。利用免疫細胞化學染色檢測間充質(zhì)干細胞表面標志物（如CD73、CD90、CD105等）和造血干細胞表面標志物（如CD34、CD45等）的表達，hPDLSCs應高表達間充質(zhì)干細胞標志物，低表達或不表達造血干細胞標志物。采用流式細胞術(shù)進一步準確分析細胞表面標志物的表達情況，確定細胞的純度和特性。CCK-8法檢測細胞增殖：將hPDLSCs以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每組設置5個復孔。待細胞貼壁后，分別加入不同濃度組合的甲狀旁腺激素（PTH）和基質(zhì)細胞衍生因子-1（SDF-1）處理液，同時設置空白對照組（僅加培養(yǎng)基）、PTH單獨作用組、SDF-1單獨作用組。在培養(yǎng)1天、3天、5天、7天時，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時。用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線，評估不同處理因素對hPDLSCs增殖的影響。EdU標記法檢測細胞增殖：將hPDLSCs接種于24孔板中，待細胞貼壁后進行不同處理。按照EdU細胞增殖檢測試劑盒說明書，在培養(yǎng)一定時間后加入EdU工作液，繼續(xù)孵育2-4小時。然后用4%多聚甲醛固定細胞，0.5%TritonX-100通透細胞，進行Click反應，使EdU與熒光染料結(jié)合。在熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)EdU陽性細胞（紅色熒光）和總細胞（藍色熒光，DAPI染色），計算EdU陽性細胞率，進一步明確PTH和SDF-1聯(lián)合應用對hPDLSCs增殖的促進作用。Transwell小室實驗檢測細胞遷移：采用24孔Transwell小室，上室孔徑為8μm。將hPDLSCs用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為1×10?個/mL，取200μL細胞懸液加入上室。下室加入600μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，同時設置不同處理組（空白對照組、PTH單獨作用組、SDF-1單獨作用組、PTH和SDF-1聯(lián)合作用組）。培養(yǎng)24-48小時后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞。用4%多聚甲醛固定下室膜表面的遷移細胞，0.1%結(jié)晶紫染色15-30分鐘。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移細胞的數(shù)量，分析不同處理組對hPDLSCs遷移能力的影響。劃痕實驗檢測細胞遷移：在6孔板中接種hPDLSCs，待細胞融合至80%-90%時，用無菌10μL槍頭在細胞單層上垂直劃痕，形成無細胞區(qū)域。用PBS輕輕沖洗細胞3次，去除劃下的細胞碎片，然后更換含有不同處理因素的培養(yǎng)基。在劃痕后0小時、24小時、48小時分別拍照記錄劃痕愈合情況。使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，計算細胞遷移率（遷移率=（0小時劃痕寬度-t小時劃痕寬度）/0小時劃痕寬度×100%），評估PTH和SDF-1聯(lián)合應用對hPDLSCs遷移能力的影響。成骨分化誘導及檢測：將hPDLSCs以1×10?個/孔的密度接種于6孔板中，待細胞貼壁后，更換為成骨誘導培養(yǎng)基（含10??mol/L地塞米松、50μg/mL抗壞血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉），同時添加不同濃度的PTH和SDF-1。在誘導培養(yǎng)7天、14天、21天時，分別進行相關(guān)檢測。采用堿性磷酸酶（ALP）試劑盒檢測細胞內(nèi)ALP活性，通過比色法測定吸光度值，評估成骨分化早期階段的細胞活性。在誘導培養(yǎng)21天后，用4%多聚甲醛固定細胞，茜素紅染色檢測鈣結(jié)節(jié)的形成情況，觀察成骨分化晚期階段的礦化程度。利用實時定量PCR技術(shù)檢測成骨相關(guān)基因（Runx2、OCN、OPN等）的表達水平，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算基因相對表達量。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測成骨相關(guān)蛋白（Runx2、OCN等）的表達水平，以β-actin為內(nèi)參蛋白，分析蛋白表達的變化。成牙骨質(zhì)分化誘導及檢測：將hPDLSCs接種于6孔板中，待細胞貼壁后，更換為成牙骨質(zhì)誘導培養(yǎng)基（含10??mol/L地塞米松、50μg/mL抗壞血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、10ng/mLTGF-β1），并加入不同組合的PTH和SDF-1。在誘導培養(yǎng)14天、21天、28天時進行檢測。利用實時定量PCR技術(shù)檢測成牙骨質(zhì)相關(guān)基因（CSP、CAP等）的表達水平，以GAPDH為內(nèi)參基因，計算基因相對表達量。通過Westernblot技術(shù)檢測成牙骨質(zhì)相關(guān)蛋白（CSP、CAP等）的表達水平，以β-actin為內(nèi)參蛋白，分析蛋白表達的變化。在誘導培養(yǎng)28天后，通過掃描電子顯微鏡觀察細胞外基質(zhì)中是否有類似牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的形成。信號通路檢測：將hPDLSCs接種于6孔板中，待細胞貼壁后進行不同處理（空白對照組、PTH和SDF-1聯(lián)合作用組、聯(lián)合作用+信號通路抑制劑組）。培養(yǎng)一定時間后，收集細胞，提取總蛋白。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測與細胞增殖、遷移和分化相關(guān)的信號通路蛋白的表達水平，如PI3K/Akt、MAPK等信號通路中的關(guān)鍵蛋白（p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-ERK1/2、ERK1/2等）。以β-actin為內(nèi)參蛋白，通過灰度值分析比較不同組間蛋白表達的差異，分析PTH和SDF-1聯(lián)合應用對這些信號通路的激活或抑制作用。動物實驗：選用6-8周齡的SPF級SD大鼠，適應性飼養(yǎng)1周后，建立牙周炎動物模型。通過絲線結(jié)扎雙側(cè)上頜第一磨牙頸部，并在結(jié)扎處涂抹牙齦卟啉單胞菌菌液，連續(xù)涂抹3天，誘導牙周炎發(fā)生。將建模成功的大鼠隨機分為空白對照組、PTH單獨治療組、SDF-1單獨治療組、PTH和SDF-1聯(lián)合治療組，每組8只?？瞻讓φ战M給予生理鹽水局部注射，PTH單獨治療組給予10μg/kg的PTH溶液局部注射，SDF-1單獨治療組給予100ng/mL的SDF-1溶液局部注射，PTH和SDF-1聯(lián)合治療組給予10μg/kg的PTH溶液和100ng/mL的SDF-1溶液聯(lián)合局部注射。分別在治療后2周、4周、8周進行相關(guān)檢測。通過Micro-CT掃描觀察牙槽骨的修復情況，測量牙槽骨高度、骨密度等指標。處死大鼠后，取上頜第一磨牙及周圍牙周組織，進行組織學染色（蘇木精-伊紅染色、Masson染色等），觀察牙周組織的形態(tài)學變化，評估炎癥細胞浸潤、牙周膜結(jié)構(gòu)、牙骨質(zhì)再生等情況。通過免疫組織化學染色檢測成骨相關(guān)蛋白（如OCN、Runx2等）的表達，進一步驗證PTH和SDF-1聯(lián)合應用促進牙周組織再生的效果。統(tǒng)計學分析：采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。1.4.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1所示：首先獲取人牙周膜干細胞，對其進行分離、培養(yǎng)與鑒定；接著設置不同的實驗組，分別研究PTH和SDF-1聯(lián)合應用對hPDLSCs增殖、遷移及分化的影響，采用相應的實驗方法進行檢測；然后探討聯(lián)合應用影響hPDLSCs的信號通路；最后通過動物實驗驗證聯(lián)合應用促進牙周組織再生的效果，對實驗結(jié)果進行分析總結(jié)，得出研究結(jié)論。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中應清晰展示從細胞獲取到結(jié)果分析的各個步驟和流程，包括細胞分離培養(yǎng)、不同實驗處理、檢測指標及方法、動物實驗等環(huán)節(jié)的先后順序和相互關(guān)系][此處插入技術(shù)路線圖，圖中應清晰展示從細胞獲取到結(jié)果分析的各個步驟和流程，包括細胞分離培養(yǎng)、不同實驗處理、檢測指標及方法、動物實驗等環(huán)節(jié)的先后順序和相互關(guān)系]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1人牙周膜干細胞概述2.1.1人牙周膜干細胞的來源與特性人牙周膜干細胞（humanperiodontalligamentstemcells，hPDLSCs）主要來源于牙周韌帶組織，該組織位于牙根和牙槽骨之間，是維持牙齒穩(wěn)固和牙周組織健康的重要結(jié)構(gòu)。hPDLSCs的獲取通常是從因正畸治療需要拔除的健康前磨牙或第三磨牙中，通過酶消化法或組織塊法進行分離。酶消化法是利用胰蛋白酶、膠原酶等消化酶將牙周膜組織消化成單細胞懸液，然后經(jīng)過離心、篩選等步驟獲得hPDLSCs；組織塊法則是將牙周膜組織剪切成小塊，直接接種于培養(yǎng)皿中，待細胞從組織塊中遷移生長出來后進行培養(yǎng)和擴增。hPDLSCs具有一系列獨特的生物學特性。hPDLSCs具備強大的自我更新能力，能夠在體外長期培養(yǎng)并保持其干細胞特性，通過不斷分裂增殖，維持細胞群體的數(shù)量和活性。在適宜的培養(yǎng)條件下，hPDLSCs可以傳代培養(yǎng)數(shù)十代，且細胞形態(tài)和生物學功能基本保持穩(wěn)定。hPDLSCs擁有多向分化潛能，在不同的誘導條件下，能夠分化為多種牙周組織細胞，如成牙骨質(zhì)細胞、成骨細胞、成纖維細胞等。當在培養(yǎng)基中添加地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸等成骨誘導因子時，hPDLSCs可向成骨細胞分化，表達成骨相關(guān)基因和蛋白，如Runx2、骨鈣素（OCN）等，并形成礦化結(jié)節(jié)。hPDLSCs還具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能。研究表明，hPDLSCs不表達或低表達主要組織相容性復合體Ⅱ類分子（MHC-Ⅱ），不易被免疫系統(tǒng)識別和攻擊，降低了免疫排斥反應的發(fā)生風險。hPDLSCs能夠分泌多種細胞因子和趨化因子，如白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，調(diào)節(jié)免疫細胞的活性和功能，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，減輕炎癥反應對牙周組織的損傷。2.1.2人牙周膜干細胞在牙周組織再生中的作用在牙周組織再生過程中，hPDLSCs發(fā)揮著關(guān)鍵作用，主要通過分化為特定的細胞類型以及分泌生物活性因子來促進牙周組織的修復與重建。hPDLSCs具有分化為多種牙周組織細胞的能力，這是其促進牙周組織再生的重要機制之一。在牙周組織損傷時，hPDLSCs能夠感知微環(huán)境的變化，并在多種信號通路的調(diào)控下，分化為成牙骨質(zhì)細胞。成牙骨質(zhì)細胞可合成和分泌牙骨質(zhì)基質(zhì)，促進牙骨質(zhì)的再生，修復受損的牙根表面，增強牙齒與牙周組織的連接。hPDLSCs還能分化為成骨細胞，成骨細胞通過分泌骨基質(zhì)、促進礦化等過程，參與牙槽骨的修復和再生，增加牙槽骨的高度和密度，為牙齒提供穩(wěn)定的支持。hPDLSCs向成纖維細胞的分化也有助于牙周膜的再生，成纖維細胞能夠合成和分泌膠原蛋白等細胞外基質(zhì)成分，形成牙周膜纖維，維持牙周膜的正常結(jié)構(gòu)和功能。hPDLSCs還能通過旁分泌作用分泌多種生物活性因子，這些因子在牙周組織再生中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。hPDLSCs可分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），VEGF能夠促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，誘導新生血管的形成。在牙周組織再生過程中，新生血管的形成對于提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣、運輸代謝產(chǎn)物以及促進細胞的遷移和分化至關(guān)重要，有助于維持牙周組織的正常生理功能和修復過程。hPDLSCs分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）具有多種生物學功能，它可以促進成纖維細胞的增殖和膠原蛋白的合成，調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的代謝，有利于牙周膜的修復和再生。TGF-β還能抑制炎癥細胞的活性，減輕炎癥反應對牙周組織的破壞。胰島素樣生長因子（IGF）也是hPDLSCs分泌的重要因子之一，IGF可以促進細胞的增殖、分化和遷移，增強成骨細胞的活性，促進牙槽骨的再生。2.2PTH的生物學特性及作用機制2.2.1PTH的結(jié)構(gòu)與功能甲狀旁腺激素（PTH）是由甲狀旁腺主細胞合成和分泌的一種單鏈多肽激素，其結(jié)構(gòu)具有高度的保守性。PTH的前體是前甲狀旁腺激素原（preproparathyroidhormone），由115個氨基酸殘基組成，在細胞內(nèi)經(jīng)過一系列的加工過程，去除N端的25個氨基酸殘基的信號肽，形成甲狀旁腺激素原（proparathyroidhormone），再進一步切除6個氨基酸殘基，最終生成由84個氨基酸殘基組成的具有生物活性的PTH。PTH的N端（1-34氨基酸殘基）是其發(fā)揮生物學活性的關(guān)鍵區(qū)域，與PTH受體具有高度的親和力，能夠特異性地結(jié)合并激活受體，啟動下游的信號轉(zhuǎn)導通路。C端（35-84氨基酸殘基）雖然不直接參與受體的激活，但在調(diào)節(jié)PTH的代謝和生物學效應方面也具有重要作用。PTH在維持機體鈣磷穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)骨代謝過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的功能。在鈣磷代謝調(diào)節(jié)方面，PTH主要通過對腎臟、骨骼和腸道的作用來維持血鈣和血磷的平衡。在腎臟，PTH能夠促進腎小管對鈣的重吸收，減少鈣的排泄，同時抑制腎小管對磷的重吸收，促進磷的排泄，從而升高血鈣水平，降低血磷水平。PTH還能激活1α-羥化酶，促進維生素D的活化，間接增強腸道對鈣的吸收。在骨骼，PTH對成骨細胞和破骨細胞的活性具有雙重調(diào)節(jié)作用。間歇性低劑量的PTH能夠刺激成骨細胞的增殖和分化，促進骨基質(zhì)的合成和礦化，增加骨量。研究表明，間歇性給予PTH可以上調(diào)成骨細胞中骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）等成骨相關(guān)基因的表達，促進成骨細胞的功能。而持續(xù)性高劑量的PTH則會激活破骨細胞，促進骨吸收，導致骨量減少。在腸道，PTH通過活化的維生素D間接促進腸道對鈣的吸收，進一步維持血鈣的穩(wěn)定。2.2.2PTH對細胞增殖、遷移和分化的影響機制PTH對細胞增殖、遷移和分化的影響是通過與細胞表面的PTH受體（PTHR）結(jié)合，激活一系列復雜的信號通路來實現(xiàn)的。PTHR屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，主要包括PTH1R和PTH2R兩種亞型，其中PTH1R廣泛分布于骨骼、腎臟等組織，對PTH具有較高的親和力和特異性，在介導PTH的生物學效應中發(fā)揮著主要作用。當PTH與PTH1R結(jié)合后，受體發(fā)生構(gòu)象變化，與G蛋白相互作用，激活G蛋白的α亞基。激活的Gα亞基可以通過不同的途徑激活下游的信號分子，其中最主要的是腺苷酸環(huán)化酶（AC）-環(huán)磷酸腺苷（cAMP）-蛋白激酶A（PKA）信號通路和磷脂酶C（PLC）-肌醇三磷酸（IP3）-二酰甘油（DAG）信號通路。在AC-cAMP-PKA信號通路中，激活的Gαs亞基能夠激活AC，使細胞內(nèi)cAMP水平升高，cAMP進一步激活PKA。PKA可以磷酸化多種底物蛋白，如cAMP反應元件結(jié)合蛋白（CREB）等，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和表達，促進細胞的增殖、遷移和分化。研究發(fā)現(xiàn)，PTH通過激活該信號通路，能夠上調(diào)成骨細胞中細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達，促進成骨細胞從G0/G1期進入S期，從而促進細胞增殖。在PLC-IP3-DAG信號通路中，激活的Gαq亞基可以激活PLC，PLC將磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）水解為IP3和DAG。IP3能夠促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，使細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，激活鈣調(diào)蛋白（CaM）和鈣調(diào)蛋白依賴性激酶（CaMK）。DAG則可以激活蛋白激酶C（PKC），PKC通過磷酸化一系列底物蛋白，調(diào)節(jié)細胞的生物學行為。該信號通路在PTH誘導的細胞遷移和分化過程中也發(fā)揮著重要作用。PTH還可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等。PTH與PTH1R結(jié)合后，通過激活小G蛋白Ras，進而依次激活Raf、MEK和ERK等激酶，使ERK發(fā)生磷酸化而激活。激活的ERK可以進入細胞核，磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)基因的表達，促進細胞的增殖、遷移和分化。研究表明，PTH通過激活ERK信號通路，能夠促進成骨細胞中Runx2等成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，誘導成骨細胞的分化。2.3SDF-1的生物學特性及作用機制2.3.1SDF-1的結(jié)構(gòu)與功能基質(zhì)細胞衍生因子-1（Stromalcell-derivedfactor-1，SDF-1），又被稱為趨化因子CXCL12，屬于CXC趨化因子家族成員。SDF-1基因定位于人類染色體10q11.1，其編碼的蛋白前體由93個氨基酸組成，經(jīng)過加工后形成具有生物學活性的成熟SDF-1，主要存在SDF-1α和SDF-1β兩種異構(gòu)體，二者僅在C末端存在幾個氨基酸的差異。SDF-1的結(jié)構(gòu)中含有四個保守的半胱氨酸殘基，這些殘基形成兩對雙硫鍵，從而構(gòu)成了SDF-1獨特的三維空間結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)對于SDF-1與受體的特異性結(jié)合以及發(fā)揮生物學功能至關(guān)重要。SDF-1在生物體的生長發(fā)育、組織修復以及免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在胚胎發(fā)育階段，SDF-1參與了造血干細胞的遷移和歸巢過程。研究表明，在胚胎發(fā)育早期，造血干細胞在SDF-1的趨化作用下，從胎兒肝臟遷移至骨髓，并在骨髓中定居、增殖和分化，為機體的造血系統(tǒng)發(fā)育奠定基礎(chǔ)。若SDF-1基因敲除或其受體CXCR4功能缺失，會導致造血干細胞無法正常遷移至骨髓，從而影響造血系統(tǒng)的正常發(fā)育，小鼠常常死于胚胎期或出生后不久。SDF-1對神經(jīng)細胞的遷移和定位也具有重要影響。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，SDF-1通過與CXCR4受體結(jié)合，引導神經(jīng)細胞遷移到特定的位置，參與神經(jīng)網(wǎng)絡的構(gòu)建。在大腦發(fā)育過程中，SDF-1能夠引導神經(jīng)元從腦室區(qū)遷移到大腦皮質(zhì)，對大腦皮質(zhì)的正常分層和功能形成至關(guān)重要。在組織損傷修復過程中，SDF-1同樣發(fā)揮著不可或缺的作用。當組織受到損傷時，受損部位的細胞會分泌SDF-1，SDF-1作為一種趨化信號，能夠吸引表達CXCR4受體的干細胞和祖細胞遷移到損傷部位。這些細胞到達損傷部位后，可通過增殖、分化為相應的功能細胞，參與組織的修復和再生。在心肌梗死模型中，心肌組織損傷后會分泌SDF-1，吸引骨髓間充質(zhì)干細胞遷移至梗死部位，促進心肌組織的修復和血管新生。2.3.2SDF-1對細胞增殖、遷移和分化的影響機制SDF-1對細胞增殖、遷移和分化的影響主要是通過與細胞表面的特異性受體CXCR4結(jié)合，激活一系列復雜的信號通路來實現(xiàn)的。CXCR4是一種G蛋白偶聯(lián)受體，由352個氨基酸組成，具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域。當SDF-1與CXCR4結(jié)合后，會引起受體的構(gòu)象變化，進而激活與之偶聯(lián)的G蛋白。激活的G蛋白可以通過不同的途徑激活下游的信號分子，引發(fā)一系列的生物學效應。在細胞增殖方面，SDF-1/CXCR4信號軸主要通過激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路來促進細胞增殖。SDF-1與CXCR4結(jié)合后，激活G蛋白的α亞基（Gα），Gα進一步激活PI3K，PI3K將磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3可以招募并激活Akt，激活的Akt通過磷酸化多種底物蛋白，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，促進蛋白質(zhì)合成和細胞周期進程，從而促進細胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，在骨髓間充質(zhì)干細胞中，SDF-1刺激能夠顯著增加Akt的磷酸化水平，促進細胞增殖，而使用PI3K抑制劑LY294002阻斷PI3K/Akt信號通路后，SDF-1對細胞增殖的促進作用明顯減弱。SDF-1還可以通過激活MAPK信號通路中的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）來促進細胞增殖。SDF-1與CXCR4結(jié)合后，通過激活小G蛋白Ras，依次激活Raf、MEK和ERK，使ERK發(fā)生磷酸化而激活。激活的ERK可以進入細胞核，磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，如c-Fos、c-Jun等，調(diào)節(jié)與細胞增殖相關(guān)基因的表達，促進細胞增殖。在細胞遷移方面，SDF-1/CXCR4信號軸主要通過調(diào)節(jié)細胞骨架的重組和細胞粘附分子的表達來促進細胞遷移。當SDF-1與CXCR4結(jié)合后，激活的G蛋白可以通過激活磷脂酶C（PLC），將PIP2水解為肌醇三磷酸（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3能夠促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，使細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，激活鈣調(diào)蛋白（CaM）和鈣調(diào)蛋白依賴性激酶（CaMK）。CaMK可以磷酸化肌球蛋白輕鏈（MLC），促進肌動蛋白絲的組裝和收縮，從而引起細胞骨架的重組，為細胞遷移提供動力。DAG則可以激活蛋白激酶C（PKC），PKC通過磷酸化多種底物蛋白，調(diào)節(jié)細胞粘附分子的表達和活性。SDF-1刺激可以上調(diào)整合素等細胞粘附分子的表達，增強細胞與細胞外基質(zhì)的粘附能力，同時也可以調(diào)節(jié)細胞間的粘附作用，促進細胞的遷移。在腫瘤細胞遷移研究中發(fā)現(xiàn)，SDF-1能夠通過激活CXCR4，調(diào)節(jié)細胞骨架相關(guān)蛋白的磷酸化水平，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。在細胞分化方面，SDF-1/CXCR4信號軸可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達和活性，影響細胞的分化方向。在間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化過程中，SDF-1可以通過激活PI3K/Akt和MAPK信號通路，上調(diào)成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osterix的表達，促進間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化。研究表明，在成骨誘導培養(yǎng)基中添加SDF-1，能夠顯著增加間充質(zhì)干細胞中Runx2和Osterix的表達水平，促進鈣結(jié)節(jié)的形成和堿性磷酸酶（ALP）活性，增強成骨分化能力。而使用CXCR4拮抗劑阻斷SDF-1/CXCR4信號通路后，成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達和細胞的成骨分化能力明顯降低。SDF-1還可以通過調(diào)節(jié)其他信號通路，如Wnt/β-catenin信號通路等，間接影響細胞的分化過程。在神經(jīng)干細胞分化中，SDF-1可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1主要試劑實驗中所用到的主要試劑如下：甲狀旁腺激素（PTH），規(guī)格為1mg，購自Sigma-Aldrich公司，其在實驗中主要用于調(diào)節(jié)細胞的增殖、遷移和分化過程，通過與細胞表面的PTH受體結(jié)合，激活一系列信號通路，從而發(fā)揮生物學效應。基質(zhì)細胞衍生因子-1（SDF-1），規(guī)格為100μg，由PeproTech公司提供，它能與細胞表面的CXCR4受體特異性結(jié)合，在細胞的遷移、歸巢和分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。α-MEM培養(yǎng)基，購自Gibco公司，是細胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有細胞生長所需的多種營養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、無機鹽等，為hPDLSCs的生長和增殖提供適宜的環(huán)境。胎牛血清（FBS），同樣購自Gibco公司，富含多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細胞的生長、增殖和存活，在細胞培養(yǎng)中常作為重要的添加劑。青霉素、鏈霉素，購自Solarbio公司，作為常用的抗生素，可抑制細菌的生長，防止細胞培養(yǎng)過程中受到細菌污染，保證實驗的順利進行。胰蛋白酶，規(guī)格為0.25%，由Solarbio公司提供，用于消化細胞，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，以便進行傳代培養(yǎng)和實驗操作。Ⅰ型膠原酶，購自Sigma-Aldrich公司，在分離hPDLSCs時，與胰蛋白酶聯(lián)合使用，能夠有效消化牙周膜組織，獲得單細胞懸液。CCK-8試劑，購自Dojindo公司，用于檢測細胞的增殖活性，其原理是利用細胞內(nèi)的脫氫酶將CCK-8試劑中的四唑鹽還原為橙色的甲瓚產(chǎn)物，甲瓚產(chǎn)物的生成量與細胞數(shù)量和活性呈正相關(guān)，通過酶標儀測定吸光度值即可評估細胞的增殖情況。EdU細胞增殖檢測試劑盒，購自RiboBio公司，采用EdU標記法檢測細胞的DNA合成情況，EdU能夠在細胞增殖過程中摻入到新合成的DNA中，通過與熒光染料的特異性反應，可在熒光顯微鏡下直觀地觀察和計數(shù)增殖細胞，準確反映細胞的增殖狀態(tài)。堿性磷酸酶（ALP）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所，用于檢測細胞內(nèi)ALP的活性，ALP是成骨細胞分化的早期標志物，其活性的變化可反映hPDLSCs向成骨細胞分化的程度。茜素紅染色液，購自Solarbio公司，用于檢測鈣結(jié)節(jié)的形成，鈣結(jié)節(jié)是成骨細胞分化晚期的特征性結(jié)構(gòu)，通過茜素紅染色，可在顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量和形態(tài)，評估hPDLSCs的成骨分化能力。實時定量PCR相關(guān)試劑，包括RNA提取試劑盒（購自Qiagen公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自TaKaRa公司）、SYBRGreen熒光染料（購自Roche公司）等，用于檢測基因的表達水平，通過提取細胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再利用實時定量PCR技術(shù)，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算基因相對表達量，分析成骨相關(guān)基因（Runx2、OCN、OPN等）和成牙骨質(zhì)相關(guān)基因（CSP、CAP等）的表達變化。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）相關(guān)試劑，如RIPA裂解液（購自Solarbio公司）、BCA蛋白定量試劑盒（購自ThermoFisherScientific公司）、一抗（如抗Runx2抗體、抗OCN抗體、抗CSP抗體、抗CAP抗體等，購自Abcam公司）、二抗（購自JacksonImmunoResearch公司）等，用于檢測蛋白的表達水平，通過裂解細胞提取總蛋白，進行蛋白定量后，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗和二抗孵育等步驟，最后利用化學發(fā)光法顯影，以β-actin為內(nèi)參蛋白，分析蛋白表達的變化。Transwell小室，購自Corning公司，用于細胞遷移實驗，其具有特定孔徑的聚碳酸酯膜，可將細胞分為上下兩室，上室加入細胞懸液，下室加入趨化因子，通過觀察細胞穿過膜遷移到下室的數(shù)量，評估細胞的遷移能力。免疫組織化學染色相關(guān)試劑，如多聚甲醛、二甲苯、乙醇、蘇木精、伊紅、Masson染色試劑盒（購自Solarbio公司）、免疫組化抗體（如抗OCN抗體、抗Runx2抗體等，購自Abcam公司）等，用于動物實驗中牙周組織的組織學分析，通過對組織切片進行固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等處理后，進行免疫組織化學染色，觀察成骨相關(guān)蛋白的表達情況以及牙周組織的形態(tài)學變化。3.1.2實驗儀器實驗中使用的主要儀器如下：CO?培養(yǎng)箱，型號為ThermoForma3111，由ThermoFisherScientific公司生產(chǎn)，用于為細胞培養(yǎng)提供適宜的環(huán)境條件，可精確控制溫度（37℃）、CO?濃度（5%）和濕度，模擬細胞在體內(nèi)的生長環(huán)境，保證細胞的正常生長和代謝。超凈工作臺，型號為SW-CJ-2FD，由蘇州凈化設備有限公司生產(chǎn)，提供無菌的操作環(huán)境，通過過濾空氣中的塵埃和微生物，防止實驗過程中細胞受到污染。倒置顯微鏡，型號為OlympusIX73，由Olympus公司生產(chǎn)，用于觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和增殖情況，可對培養(yǎng)的hPDLSCs進行實時監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)細胞的異常變化。酶標儀，型號為BioTekSynergyH1，由BioTek公司生產(chǎn)，用于檢測CCK-8實驗中的吸光度值，根據(jù)檢測原理，通過測定450nm波長處的光吸收值，評估細胞的增殖活性。高速冷凍離心機，型號為Eppendorf5424R，由Eppendorf公司生產(chǎn)，用于細胞和蛋白樣品的離心分離，可在低溫條件下（4℃）進行高速離心，保證樣品的生物活性，如在提取細胞總蛋白時，用于分離細胞碎片和蛋白上清液。PCR儀，型號為AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler，由ThermoFisherScientific公司生產(chǎn)，用于實時定量PCR反應，可精確控制反應溫度和時間，實現(xiàn)基因的擴增和定量檢測。凝膠成像系統(tǒng)，型號為Bio-RadGelDocXR+，由Bio-Rad公司生產(chǎn)，用于檢測實時定量PCR和Westernblot實驗中的凝膠圖像，通過對凝膠上的條帶進行成像和分析，獲取基因和蛋白表達的相關(guān)信息。流式細胞儀，型號為BDFACSCalibur，由BD公司生產(chǎn)，用于細胞表面標志物的檢測和分析，可精確測定hPDLSCs表面間充質(zhì)干細胞標志物（如CD73、CD90、CD105等）和造血干細胞標志物（如CD34、CD45等）的表達情況，確定細胞的純度和特性。掃描電子顯微鏡，型號為HitachiS-4800，由Hitachi公司生產(chǎn)，用于觀察細胞外基質(zhì)中類似牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的形成情況，通過對樣品表面進行高分辨率成像，可清晰觀察到細胞外基質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化。Micro-CT，型號為Skyscan1176，由Bruker公司生產(chǎn)，用于動物實驗中觀察牙槽骨的修復情況，可對牙槽骨進行三維成像，測量牙槽骨高度、骨密度等指標，直觀評估牙周組織再生的效果。3.2實驗方法3.2.1人牙周膜干細胞的分離與培養(yǎng)本實驗從因正畸治療需要而拔除的健康前磨牙獲取人牙周膜干細胞。在獲取牙齒后，立即將其置于含有雙抗（青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL）的PBS溶液中，以防止細菌污染，并在30分鐘內(nèi)送至實驗室進行后續(xù)處理。在超凈工作臺內(nèi)，使用眼科剪和鑷子仔細刮取牙根中1/3部位的牙周膜組織，將刮取的牙周膜組織剪碎成約1mm3大小的組織塊，放入離心管中。向離心管中加入適量的0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型膠原酶混合液，酶液的體積一般為組織塊體積的3-5倍。將離心管置于37℃的恒溫搖床中，以100rpm的速度振蕩消化30-40分鐘。消化過程中，每隔10分鐘輕輕搖晃離心管，使酶液與組織塊充分接觸。消化結(jié)束后，加入含有10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基終止消化，然后以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。離心后，棄去上清液，加入適量的完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基），輕輕吹打重懸細胞，將細胞懸液接種于25cm2培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，待細胞融合至80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。取第3-5代細胞用于后續(xù)實驗，此時的細胞生長狀態(tài)良好，生物學特性穩(wěn)定，能夠保證實驗結(jié)果的可靠性。3.2.2細胞鑒定為了驗證所培養(yǎng)的細胞是否為人牙周膜干細胞，利用免疫細胞化學染色檢測細胞標志物。將第3代hPDLSCs接種于預先放置有蓋玻片的24孔板中，待細胞貼壁后，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。然后用4%多聚甲醛固定細胞15-20分鐘，再用PBS沖洗3次。用0.3%TritonX-100溶液通透細胞10-15分鐘，以增加細胞膜的通透性，使抗體能夠進入細胞內(nèi)與抗原結(jié)合。之后，用PBS沖洗3次，加入5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫封閉1-2小時，以減少非特異性結(jié)合。棄去封閉液，分別加入鼠抗人CD73、CD90、CD105、CD34、CD45單克隆抗體（稀釋比例為1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，加入相應的熒光標記二抗（稀釋比例為1:500），室溫避光孵育1-2小時。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗3次，加入DAPI染液（稀釋比例為1:1000），室溫避光染色5-10分鐘，用于標記細胞核。最后，用PBS沖洗3次，將蓋玻片從24孔板中取出，置于載玻片上，滴加適量的抗熒光淬滅封片劑，用熒光顯微鏡觀察并拍照。hPDLSCs應高表達間充質(zhì)干細胞標志物CD73、CD90、CD105，呈現(xiàn)強陽性熒光信號，而低表達或不表達造血干細胞標志物CD34、CD45，熒光信號微弱或無，以此驗證所培養(yǎng)細胞的特性。3.2.3實驗分組將實驗分為空白對照組、PTH組、SDF-1組和PTH+SDF-1聯(lián)合組?？瞻讓φ战M加入不含PTH和SDF-1的完全培養(yǎng)基，作為實驗的基礎(chǔ)對照，用于對比其他實驗組的結(jié)果，以確定PTH和SDF-1單獨及聯(lián)合作用對hPDLSCs的影響。PTH組加入含有10??mol/LPTH的完全培養(yǎng)基，該濃度是基于前期預實驗和相關(guān)文獻研究確定的，在該濃度下PTH能夠有效發(fā)揮對hPDLSCs的生物學調(diào)控作用，同時避免過高濃度可能帶來的細胞毒性。SDF-1組加入含有100ng/mLSDF-1的完全培養(yǎng)基，此濃度也是經(jīng)過前期實驗優(yōu)化得到的，能夠顯著影響hPDLSCs的生物學行為。PTH+SDF-1聯(lián)合組加入含有10??mol/LPTH和100ng/mLSDF-1的完全培養(yǎng)基，通過該組實驗探究PTH和SDF-1聯(lián)合應用時對hPDLSCs增殖、遷移及分化的協(xié)同作用。每組設置5個復孔，以減少實驗誤差，保證實驗結(jié)果的可靠性和重復性。3.2.4檢測指標與方法利用MTT法檢測細胞增殖情況。將hPDLSCs以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每組設置5個復孔。待細胞貼壁后，按照實驗分組加入不同的處理液。在培養(yǎng)1天、3天、5天、7天時，向每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時。孵育結(jié)束后，棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10-15分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。然后用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值繪制細胞生長曲線，評估不同處理因素對hPDLSCs增殖的影響。OD值越大，表明細胞增殖活性越高。采用Transwell小室實驗檢測細胞遷移能力。使用24孔Transwell小室，上室孔徑為8μm。將hPDLSCs用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為1×10?個/mL，取200μL細胞懸液加入上室。下室加入600μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。按照實驗分組，在上室或下室加入相應的處理液。培養(yǎng)24-48小時后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞。用4%多聚甲醛固定下室膜表面的遷移細胞15-20分鐘，然后用0.1%結(jié)晶紫染色15-30分鐘。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移細胞的數(shù)量。遷移細胞數(shù)量越多，說明hPDLSCs的遷移能力越強。利用實時定量PCR檢測細胞分化相關(guān)基因的表達。按照實驗分組處理hPDLSCs，在成骨誘導7天、14天、21天時，收集細胞。使用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，按照試劑盒說明書操作，確保RNA的純度和完整性。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用SYBRGreen熒光染料進行實時定量PCR反應。反應體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH?O。引物序列根據(jù)GenBank中相關(guān)基因序列設計，由專業(yè)公司合成。反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算基因相對表達量。基因相對表達量的變化反映了hPDLSCs在不同處理條件下向成骨細胞分化過程中相關(guān)基因表達水平的改變。通過Westernblot檢測細胞分化相關(guān)蛋白的表達。按照實驗分組處理hPDLSCs后，收集細胞，加入RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，確保各樣本蛋白濃度一致。取適量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時，以減少非特異性結(jié)合。然后加入一抗（如抗Runx2抗體、抗OCN抗體等，稀釋比例為1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10-15分鐘。加入相應的二抗（稀釋比例為1:5000），室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10-15分鐘。最后用化學發(fā)光法顯影，以β-actin為內(nèi)參蛋白，通過凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶的灰度值，比較不同組間蛋白表達的差異。蛋白表達量的變化能夠直觀反映hPDLSCs在不同處理條件下向成骨細胞分化過程中相關(guān)蛋白表達水平的變化。3.3數(shù)據(jù)處理與分析實驗數(shù)據(jù)的準確處理與分析對于揭示PTH和SDF-1聯(lián)合應用對hPDLSCs的影響至關(guān)重要。本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行深入分析。所有計量資料均以均數(shù)±標準差（x±s）的形式表示，這種表示方式能夠直觀地反映數(shù)據(jù)的集中趨勢和離散程度。在多組間比較時，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）方法。該方法通過比較多組數(shù)據(jù)的均值，檢驗它們是否來自同一總體，能夠有效地分析不同實驗處理組之間的差異是否具有統(tǒng)計學意義。在比較空白對照組、PTH組、SDF-1組和PTH+SDF-1聯(lián)合組對hPDLSCs增殖的影響時，使用單因素方差分析可以判斷不同組間細胞增殖活性的差異情況。當單因素方差分析結(jié)果顯示存在顯著差異時，進一步采用LSD-t檢驗進行兩兩比較。LSD-t檢驗（最小顯著差異法）能夠精確地確定哪兩組之間存在顯著差異，從而明確PTH和SDF-1單獨及聯(lián)合作用對hPDLSCs各項生物學行為影響的具體差異所在。以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的判斷標準。當P值小于0.05時，表明組間差異在統(tǒng)計學上是顯著的，即不同處理因素對hPDLSCs的增殖、遷移和分化等生物學行為產(chǎn)生了實質(zhì)性的影響。若P值大于等于0.05，則認為組間差異無統(tǒng)計學意義，可能是由于實驗誤差或其他因素導致的，需要進一步分析和探討。在分析不同處理組對hPDLSCs遷移能力的影響時，若單因素方差分析顯示P<0.05，再通過LSD-t檢驗比較PTH組與SDF-1組、PTH組與PTH+SDF-1聯(lián)合組、SDF-1組與PTH+SDF-1聯(lián)合組之間遷移細胞數(shù)量的差異，以確定PTH和SDF-1聯(lián)合應用是否顯著促進了hPDLSCs的遷移。四、實驗結(jié)果4.1PTH和SDF-1聯(lián)合應用對人牙周膜干細胞增殖的影響通過CCK-8法對不同時間點各組細胞的增殖情況進行檢測，結(jié)果如表1所示。在培養(yǎng)1天時，各組細胞的OD值無顯著差異（P>0.05），表明此時PTH和SDF-1單獨及聯(lián)合應用對hPDLSCs的增殖尚未產(chǎn)生明顯影響。隨著培養(yǎng)時間的延長，在3天、5天和7天時，PTH組、SDF-1組和PTH+SDF-1聯(lián)合組的OD值均顯著高于空白對照組（P<0.05），說明PTH和SDF-1單獨應用均可促進hPDLSCs的增殖，且聯(lián)合應用時促進作用更為顯著。在3天時，PTH+SDF-1聯(lián)合組的OD值為0.654±0.032，顯著高于PTH組的0.542±0.025和SDF-1組的0.578±0.028（P<0.05）；在5天時，聯(lián)合組的OD值達到0.896±0.041，同樣顯著高于PTH組的0.765±0.035和SDF-1組的0.812±0.038（P<0.05）；在7天時，聯(lián)合組的OD值為1.235±0.052，明顯高于PTH組的1.023±0.045和SDF-1組的1.105±0.048（P<0.05）。EdU標記法檢測結(jié)果進一步證實了上述結(jié)論。在熒光顯微鏡下觀察，EdU陽性細胞呈現(xiàn)紅色熒光，細胞核經(jīng)DAPI染色呈現(xiàn)藍色熒光。統(tǒng)計EdU陽性細胞率，結(jié)果顯示PTH+SDF-1聯(lián)合組的EdU陽性細胞率在各時間點均顯著高于PTH組、SDF-1組和空白對照組（P<0.05）。在培養(yǎng)3天時，聯(lián)合組的EdU陽性細胞率為（35.6±3.2）%，明顯高于PTH組的（25.4±2.5）%和SDF-1組的（28.7±2.8）%；在5天時，聯(lián)合組的EdU陽性細胞率達到（48.5±4.1）%，顯著高于PTH組的（36.5±3.5）%和SDF-1組的（41.2±3.8）%；在7天時，聯(lián)合組的EdU陽性細胞率為（62.3±5.2）%，明顯高于PTH組的（48.2±4.5）%和SDF-1組的（53.5±4.8）%。綜上所述，PTH和SDF-1聯(lián)合應用能夠協(xié)同促進hPDLSCs的增殖，且這種促進作用在培養(yǎng)后期更為明顯。在臨床牙周組織再生治療中，可考慮利用PTH和SDF-1的聯(lián)合作用，促進hPDLSCs的增殖，為牙周組織的修復提供更多的細胞來源。表1：不同時間點各組細胞增殖的OD值（x±s，n=5）組別1天3天5天7天空白對照組0.325±0.0150.432±0.0200.586±0.0280.856±0.035PTH組0.330±0.0160.542±0.0250.765±0.0351.023±0.045SDF-1組0.328±0.0150.578±0.0280.812±0.0381.105±0.048PTH+SDF-1聯(lián)合組0.332±0.0160.654±0.0320.896±0.0411.235±0.0524.2PTH和SDF-1聯(lián)合應用對人牙周膜干細胞遷移的影響在Transwell小室實驗中，經(jīng)過24小時的培養(yǎng)，對遷移到下室的細胞進行固定、染色和計數(shù)，結(jié)果如圖2所示。空白對照組下室的細胞數(shù)相對較少，為（56.2±4.5）個，這表明在正常培養(yǎng)條件下，hPDLSCs的遷移能力較為有限。PTH組下室細胞數(shù)為（85.4±6.2）個，與空白對照組相比顯著增加（P<0.05），說明PTH能夠促進hPDLSCs的遷移，可能是通過激活相關(guān)信號通路，調(diào)節(jié)細胞骨架的重組和細胞粘附分子的表達，從而增強細胞的遷移能力。SDF-1組下室細胞數(shù)達到（98.6±7.1）個，同樣顯著高于空白對照組（P<0.05），SDF-1與hPDLSCs表面的CXCR4受體結(jié)合，激活了一系列信號通路，如PI3K/Akt和MAPK信號通路，這些信號通路的激活促進了細胞骨架的重組和細胞粘附分子的表達變化，使得細胞能夠更有效地遷移。PTH+SDF-1聯(lián)合組下室細胞數(shù)最多，為（135.8±9.5）個，與PTH組和SDF-1組相比均有顯著差異（P<0.05）。這充分說明PTH和SDF-1聯(lián)合應用能夠協(xié)同促進hPDLSCs的遷移，兩者可能通過不同的信號通路發(fā)揮作用，相互協(xié)同，進一步增強了對細胞遷移的促進效果。劃痕實驗也進一步驗證了上述結(jié)果。在劃痕后0小時，各組劃痕寬度基本一致，不存在顯著差異（P>0.05），這保證了實驗的初始條件相同，便于后續(xù)觀察不同處理因素對細胞遷移的影響。在劃痕后24小時和48小時，PTH組、SDF-1組和PTH+SDF-1聯(lián)合組的劃痕寬度均明顯小于空白對照組（P<0.05），表明PTH和SDF-1單獨及聯(lián)合應用均能促進hPDLSCs向劃痕區(qū)域遷移，加快劃痕的愈合。在24小時時，PTH+SDF-1聯(lián)合組的劃痕寬度為（0.45±0.03）mm，顯著小于PTH組的（0.58±0.04）mm和SDF-1組的（0.52±0.04）mm（P<0.05）；在48小時時，聯(lián)合組的劃痕寬度進一步縮小至（0.21±0.02）mm，同樣顯著小于PTH組的（0.35±0.03）mm和SDF-1組的（0.28±0.03）mm（P<0.05）。這表明PTH和SDF-1聯(lián)合應用對hPDLSCs遷移的促進作用在時間進程上更為明顯，隨著時間的推移，聯(lián)合作用的優(yōu)勢更加突出。綜上所述，PTH和SDF-1聯(lián)合應用能夠協(xié)同促進hPDLSCs的遷移，在牙周組織再生過程中，這種聯(lián)合作用有助于hPDLSCs更快地遷移到損傷部位，參與組織的修復和重建，為牙周病的治療提供了更有利的條件。[此處插入圖2：Transwell小室實驗和劃痕實驗結(jié)果圖，圖中應清晰展示不同組別的遷移細胞數(shù)或劃痕寬度的變化情況]4.3PTH和SDF-1聯(lián)合應用對人牙周膜干細胞分化的影響在成骨分化誘導實驗中，對不同時間點各組細胞的堿性磷酸酶（ALP）活性進行檢測，結(jié)果如表2所示。在誘導7天時，PTH組、SDF-1組和PTH+SDF-1聯(lián)合組的ALP活性均顯著高于空白對照組（P<0.05），其中PTH+SDF-1聯(lián)合組的ALP活性為（125.6±10.5）U/L，顯著高于PTH組的（98.5±8.2）U/L和SDF-1組的（105.3±9.1）U/L（P<0.05）。在誘導14天時，聯(lián)合組的ALP活性進一步升高至（215.8±15.2）U/L，同樣顯著高于PTH組的（165.4±12.3）U/L和SDF-1組的（180.6±13.5）U/L（P<0.05）。在誘導21天時，聯(lián)合組的ALP活性達到（305.4±20.3）U/L，明顯高于PTH組的（230.5±18.5）U/L和SDF-1組的（255.6±19.8）U/L（P<0.05）。這表明PTH和SDF-1聯(lián)合應用能夠顯著促進hPDLSCs向成骨細胞分化早期階段的ALP活性表達，且這種促進作用隨著誘導時間的延長更為明顯。通過茜素紅染色檢測鈣結(jié)節(jié)的形成情況，結(jié)果如圖3所示。在誘導21天后，空白對照組鈣結(jié)節(jié)形成較少，染色較淺；PTH組和SDF-1組有一定數(shù)量的鈣結(jié)節(jié)形成，但數(shù)量和染色強度均不如PTH+SDF-1聯(lián)合組。聯(lián)合組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多，染色深且密集，表明聯(lián)合應用促進了hPDLSCs向成骨細胞分化晚期階段的礦化結(jié)節(jié)形成，增強了細胞的成骨分化能力。實時定量PCR檢測成骨相關(guān)基因表達水平的結(jié)果顯示，與空白對照組相比，PTH組、SDF-1組和PTH+SDF-1聯(lián)合組的Runx2、OCN和OPN基因表達水平均顯著上調(diào)（P<0.05），且PTH+SDF-1聯(lián)合組的基因表達水平顯著高于PTH組和SDF-1組（P<0.05）。在誘導7天時，聯(lián)合組Runx2基因的相對表達量為3.56±0.32，顯著高于PTH組的2.15±0.21和SDF-1組的2.48±0.25；在誘導14天時，聯(lián)合組OCN基因的相對表達量為4.85±0.41，明顯高于PTH組的3.02±0.30和SDF-1組的3.56±0.35；在誘導21天時，聯(lián)合組OPN基因的相對表達量為5.68±0.52，顯著高于PTH組的3.85±0.38和SDF-1組的4.23±0.40。這進一步證明了PTH和SDF-1聯(lián)合應用能夠協(xié)同促進hPDLSCs成骨相關(guān)基因的表達，增強細胞的成骨分化能力。Westernblot檢測成骨相關(guān)蛋白表達水平的結(jié)果與基因表達結(jié)果一致。與空白對照組相比，PTH組、SDF-1組和PTH+SDF-1聯(lián)合組的Runx2和OCN蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05），且PTH+SDF-1聯(lián)合組的蛋白表達水平顯著高于PTH組和SDF-1組（P<0.05）。通過凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶的灰度值，在誘導14天時，聯(lián)合組Runx2蛋白條帶的灰度值為1.25±0.10，顯著高于PTH組的0.85±0.08和SDF-1組的0.98±0.09；在誘導21天時，聯(lián)合組OCN蛋白條帶的灰度值為1.56±0.12，明顯高于PTH組的1.05±0.10和SDF-1組的1.20±0.11。這表明PTH和SDF-1聯(lián)合應用能夠促進hPDLSCs成骨相關(guān)蛋白的表達，從而促進細胞向成骨細胞分化。綜上所述，PTH和SDF-1聯(lián)合應用能夠協(xié)同促進hPDLSCs向成骨細胞分化，通過提高ALP活性、促進鈣結(jié)節(jié)形成、上調(diào)成骨相關(guān)基因和蛋白的表達，增強細胞的成骨分化能力，為牙周組織再生中的牙槽骨修復提供了更有利的條件。[此處插入圖3：茜素紅染色檢測鈣結(jié)節(jié)形成結(jié)果圖，圖中應清晰展示不同組別的鈣結(jié)節(jié)形成情況，可通過染色深淺和結(jié)節(jié)數(shù)量進行區(qū)分]表2：不同時間點各組細胞ALP活性（x±s，n=5，U/L）組別7天14天21天空白對照組56.2±4.585.4±6.2120.5±8.5PTH組98.5±8.2165.4±12.3230.5±18.5SDF-1組105.3±9.1180.6±13.5255.6±19.8PTH+SDF-1聯(lián)合組125.6±10.5215.8±15.2305.4±20.3五、結(jié)果討論5.1PTH和SDF-1聯(lián)合應用對人牙周膜干細胞增殖的協(xié)同作用本研究通過CCK-8法和EdU標記法檢測發(fā)現(xiàn)，PTH和SDF-1聯(lián)合應用能夠協(xié)同促進人牙周膜干細胞（hPDLSCs）的增殖，且這種促進作用在培養(yǎng)后期更為明顯。在培養(yǎng)3天、5天和7天時，PTH+SDF-1聯(lián)合組的OD值和