ICS11.220

CCSB41

DB36

江西省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB36/T1747—2023

新型鵝星狀病毒病診斷技術(shù)規(guī)程

Diagnostictechnicalregulationsfornovelgooseastrovirusdisease

2023-02-10發(fā)布2023-08-01實施

江西省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB36/T1747—2023

目??次

前?言.............................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語和定義.........................................................................1

4臨床診斷...........................................................................1

5實驗室診斷.........................................................................2

6綜合判定...........................................................................6

附錄A（資料性附錄）病毒分離所需儀器設(shè)備和試劑耗材...................................7

附錄B（資料性附錄）樣品的采集、處理、運輸及保存.....................................8

附錄C（資料性附錄）RT-PCR所需儀器設(shè)備和試劑耗材....................................9

附錄D（資料性附錄）熒光RT-PCR所需儀器設(shè)備和試劑耗材...............................10

附錄E（資料性附錄）RT-LAMP方法所需儀器設(shè)備和試劑耗材..............................11

附錄F（資料性附錄）新型鵝星狀病毒RT-PCR引物、熒光RT-PCR的引物和探針、RT-LAMP引物12

參?考?文?獻.......................................................................14

1I

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前?言

本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》規(guī)定起草。

本文件由江西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。

本文件起草單位：江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。

本文件主要起草人：李海琴、張帆帆、康昭風(fēng)、譚美芳、楊群、曾艷兵、韋啟鵬、黃江南、方紹培、

譚佳、吳誠誠、季華員。

II

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新型鵝星狀病毒病診斷技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了新型鵝星狀病毒病的術(shù)語定義、臨床診斷、實驗室診斷和綜合判定技術(shù)要求。

本文件適用于新型鵝星狀病毒病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，凡是注日期的引用

文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）

適用于本文件。

GB19489實驗室生物安全通用要求

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

新型鵝星狀病毒novelgooseastrovirus,NGoAstV

屬于星狀病毒科（Astroviridae）禽星狀病毒屬（Avastrovirus），星狀病毒（Astroviruses,AstV）是

一種呈球形的RNA病毒，直徑為25nm～35nm，病毒表面無囊膜，有5個～6個突起，用透射電子顯微鏡

觀察呈五角星狀或六角星狀。

3.2

新型鵝星狀病毒病novelgooseastrovirusdisease,NGoAstVD

指由新型鵝星狀病毒引起的以雛鵝尿酸鹽沉積在關(guān)節(jié)和（或）內(nèi)臟為主要病理特征的傳染病。。

3.3

雞肝癌細胞系chickenhepatomacellline,LMH

LMH細胞系是利用患肝細胞癌的雞肝細胞致突變培育而成，是一種可以持續(xù)傳代的雞肝癌細胞系。

4臨床診斷

4.1流行病學(xué)

病鵝、隱性帶毒鵝、帶毒種蛋是主要傳染源，自然感染的潛伏期是3d，該病既可垂直傳播、也可

1

DB36/T1747—2023

水平傳播。各品種鵝均易感，5日齡～20日齡雛鵝最易感，最早可在3日齡發(fā)病。死亡率30%～40%，

最高可超過50%。

4.2臨床癥狀

患鵝精神沉郁，食欲減退，飲水量增加，消瘦，四肢癱瘓，排白色稀便，發(fā)病高峰期約在7日齡～

14日齡。

4.3病理變化

4.3.1剖檢病變

剖檢病理變化主要表現(xiàn)為腎臟呈花斑腎，輸尿管尿酸鹽沉積，有的關(guān)節(jié)腔尿酸鹽沉積嚴重，有的心

臟、肝臟表面有白色尿酸鹽沉積。

4.3.2組織學(xué)病變

患鵝腎小管上皮細胞脫落壞死，管腔內(nèi)充滿粉紅色的尿酸鹽沉積，腎間質(zhì)出血，腎小球腫脹；有的

心臟組織中心肌纖維排列紊亂、腫脹，有的肝臟可見少量炎性細胞或肝細胞空泡變性。

4.4臨床診斷結(jié)果判定

符合4.1流行病學(xué)特征、病鵝出現(xiàn)4.2臨床癥狀和4.3病理變化，可判定為新型鵝星狀病毒病疑似病例，

應(yīng)進行實驗室確診。

5實驗室診斷

實驗室生物安全要求按照GB19489執(zhí)行。

5.1病毒分離

試驗設(shè)備和試劑耗材準(zhǔn)備見附錄A，樣品準(zhǔn)備見附錄B。

5.1.1細胞分離

5.1.1.1細胞的準(zhǔn)備

細胞的準(zhǔn)備工作包括以下內(nèi)容：

a)在37℃水浴中提前預(yù)熱消化液（0.25%胰酶）和DMEM/F12細胞培養(yǎng)液，將生長良好的LMH

細胞用無菌PBS洗滌2次，棄去PBS；

b)加入0.25%胰酶消化為單個細胞，加入細胞培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹散細胞，再加入細胞培養(yǎng)液，

用吸管輕輕吹打使細胞分散均勻后，按每孔1mL加入到細胞培養(yǎng)瓶；

c)在37℃含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h～36h，密度達到80%時，用于細胞分離。

5.1.1.2病毒的分離培養(yǎng)

病毒的分離培養(yǎng)工作包括以下內(nèi)容：

a)將上述細胞培養(yǎng)液棄掉，用無菌PBS洗滌3次后，將處理好的樣品接種到單層細胞上，每孔

0.2mL～0.4mL；

2

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b)放入細胞培養(yǎng)箱1h～2h，每隔15min輕輕搖動一次，吸附后棄掉液體，用無菌PBS洗滌3

次，加入細胞維持液，每孔1mL；

c)于37℃含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5d，每天觀察細胞狀態(tài)；

d)待細胞液變黃，將細胞培養(yǎng)瓶反復(fù)凍融3次，細胞液經(jīng)5000rpm離心10min后取上清用于檢

測或置于-80℃保存。

5.1.2鵝胚分離

5.1.2.1種蛋準(zhǔn)備

將種鵝蛋（新型鵝星狀病毒陰性）置于孵化器中37℃下孵育10d～11d，用于病毒分離。

5.1.2.2鵝胚接種

將待檢樣品以0.2mL/胚的劑量經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種10日齡～11日齡鵝胚，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培

養(yǎng)，每天照蛋2次，連續(xù)觀察6d，并記錄死胚情況。

5.1.2.3尿囊液收集

棄掉接種后24h內(nèi)死亡的鵝胚，若接種2d～6d內(nèi)鵝胚出現(xiàn)死亡，則收集死亡鵝胚的尿囊液；若接

種6d內(nèi)鵝胚不出現(xiàn)死亡，則收集6d活胚的尿囊液。

5.2病毒的鑒定

5.2.1RT-PCR技術(shù)

試驗設(shè)備和試劑耗材準(zhǔn)備見附錄C。

5.2.1.1病毒RNA的提取

提取待檢組織樣品總RNA，提取的RNA立即用于反轉(zhuǎn)錄，否則置于-80℃冰箱凍存。

5.2.1.2病毒cDNA的合成

采用50μL體系，于無菌無酶EP管中依次加入RNA模板5μL、Buffer緩沖液10μL，隨機引物2μL、

dNTPs(2.5mMeach)4μL、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μL)1μL，RNA酶抑制劑(40U/μL)2μL，補充無菌水

至總體積共50μL，置于PCR儀中進行cDNA合成，以25℃5min、50℃45min、85℃2min、4℃5min

的程序進行一個循環(huán)，cDNA合成后進行PCR擴增或于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5.2.1.3PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

配置PCR反應(yīng)液，在樣品制備區(qū)加樣。采用25μL反應(yīng)體系，見表1所示。

表1PCR反應(yīng)體系

試劑體積（μL）

2×PCRMix12.5

上游引物（10μmol/L）1.0

下游引物（10μmol/L）1.0

模板cDNA2.0

無RNA酶去離子水8.5

總體積25.0

3

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瞬時離心，置PCR擴增儀內(nèi)進行擴增，反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性3min；然后進入擴增循環(huán)：95℃30

s，55℃30s，72℃45s，35個循環(huán)；最后72℃延伸8min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

5.2.1.4PCR產(chǎn)物檢測

將制備好的1.0%瓊脂糖凝膠放入電泳槽（帶加樣孔的一端在陰極），倒入電泳液（1×TAE）浸過膠

面。DNAMarker、陰性對照產(chǎn)物、PCR產(chǎn)物和陽性對照產(chǎn)物各取7μL加入膠孔內(nèi)，在110V電壓下電泳

20min～40min；在凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察、拍照，并記錄結(jié)果。

5.2.1.5RT-PCR結(jié)果判定

5.2.1.5.1試驗成立的條件

陰性對照樣品無條帶，陽性對照樣品出現(xiàn)489bp大小的條帶，試驗條件成立。必要時，對擴增片段

進行序列測定。

5.2.1.5.2試驗結(jié)果的判定

在試驗成立的前提下，待檢樣品出現(xiàn)489bp大小的條帶，判定待檢樣品為新型鵝星狀病毒PCR陽

性。否則為陰性，必要時，對擴增片段進行序列測定。

5.2.2熒光RT-PCR技術(shù)

試驗設(shè)備和試劑耗材準(zhǔn)備見附錄D。

5.2.2.1病毒RNA的提取

同5.2.1.1。

5.2.2.2病毒cDNA的合成

同5.2.1.2。

5.2.2.3熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

將試劑盒中預(yù)混液、引物和探針取出，置于冰上直至融化，將下列試劑依次加入到無RNA酶的熒

光定量PCR管中。采用20μL反應(yīng)體系，見表2所示。

表2熒光定量PCR反應(yīng)體系

試劑體積（μL）

2×熒光定量PCR預(yù)混液10.0

上游引物(10μmol/L)0.4

下游引物(10μmol/L)0.4

探針(10μmol/L)0.4

cDNA1.0

無RNA酶去離子水7.8

總體積20.0

將上述成分分別加入熒光定量PCR管中，輕輕混合均勻，瞬時離心，打開熒光定量PCR儀和聯(lián)機計

算機，將上述熒光定量PCR管置于熒光定量PCR儀內(nèi)，設(shè)置反應(yīng)程序為94℃30s，94℃5s，60℃30s，

45個循環(huán)；4℃終止反應(yīng)。

4

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5.2.2.4熒光定量PCR結(jié)果判定

5.2.2.5.1試驗成立的條件

閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增的最高點為準(zhǔn)。陰

性對照的檢測結(jié)果應(yīng)無特異性擴增，陽性對照Ct值應(yīng)＜28，則試驗結(jié)果成立。

5.2.2.5.2試驗結(jié)果的判定

判定結(jié)果按照以下要求：

a)Ct值＜30，而且出現(xiàn)明顯的擴增線，表明樣品中存在新型鵝星狀病毒，判為陽性；

b)無Ct值，并且無擴增曲線，或者Ct值＞35，表明樣品中無新型鵝星狀病毒，判為陰性；

c)30≤Ct值≤35的樣品，判為可疑，必須重做，重做結(jié)果Ct值＜30者判為陽性，否則判為陰性。

5.2.3RT-LAMP方法

試驗設(shè)備和試劑耗材準(zhǔn)備見附錄E。

5.2.3.1病毒RNA的提取

同5.2.1.1。

5.2.3.2病毒cDNA的合成

同5.2.1.2。

5.2.3.3LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

配置LAMP反應(yīng)液，在樣品制備區(qū)加樣。采用25μL反應(yīng)體系，見表3所示。

表3LAMP反應(yīng)體系

試劑體積（μL）

2×buffer12.5

酶混合物(EM)1.0

內(nèi)引物-NGoAstV-FIP1.0

內(nèi)引物-NGoAstV-BIP1.0

外引物-NGoAstV-F30.5

外引物-NGoAstV-B30.5

環(huán)引物-NGoAstV-LB1.0

環(huán)引物-NGoAstV-LF1.0

cDNA2.0

無RNA酶去離子水4.5

總體積25.0

將上述成分分別加入無菌的PCR管中，輕輕混合均勻、離心后置于PCR擴增儀內(nèi)進行擴增，反應(yīng)

程序64℃反應(yīng)60min，然后85℃反應(yīng)2min進行酶滅活處理。

5.2.3.4LAMP結(jié)果判定

5.2.3.5.1試驗成立條件

5

DB36/T1747—2023

反應(yīng)結(jié)束后，取TE染料加入產(chǎn)物中，混勻后在紫外線下觀察。在陽性對照出現(xiàn)黃綠色熒光，同時

陰性對照不出現(xiàn)黃綠色熒光的情況下，試驗成立。

5.2.3.5.2結(jié)果判定

在紫外線下被檢樣品出現(xiàn)黃綠色熒光，判為陽性；在紫外線下被檢樣品未出現(xiàn)黃綠色熒光，判為陰

性。

6綜合判定

符合臨床診斷規(guī)定的疑似病例經(jīng)5.2.1、5.2.2、5.2.3中的任一方法檢測，結(jié)果為陽性者，可判定為新

型鵝星狀病毒病。

6

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BAA

附錄A

（資料性附錄）

病毒分離所需儀器設(shè)備和試劑耗材

A.1細胞分離

A.1.1儀器和設(shè)備

生物安全柜、可調(diào)微量移液器（2μL-20μL、20μL-200μL、100μL-1000μL）、高壓蒸汽滅菌鍋、

無菌離心管（1.5mL、15mL、50mL）、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、漩渦振蕩器、細胞培養(yǎng)箱、細

胞培養(yǎng)瓶（25㎝2、75㎝2、175㎝2）。

A.1.2試劑

磷酸鹽緩沖液（PBS）、DMEM/F12細胞培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、胰酶、青霉素-鏈霉素溶液。

A.1.3分離病毒用細胞

雞肝癌細胞系（LMH），LMH培養(yǎng)特性見參考文獻[1]。

A.1.4培養(yǎng)液配制

A.1.4.1細胞培養(yǎng)液

在DMEM/F12培養(yǎng)液中加入10%FBS、1%青霉素-鏈霉素溶液（1萬U/mL），用于LMH細胞培養(yǎng)。

A.1.4.2細胞維持液

在DMEM/F12培養(yǎng)液中加入2%FBS、1%青霉素-鏈霉素溶液（1萬U/mL），用于病毒感染后的LMH

細胞維持。

A.2鵝胚分離

A.2.1儀器設(shè)備與試劑耗材

可調(diào)微量移液器（2μL-20μL、20μL-200μL、100μL-1000μL）、高壓蒸汽滅菌鍋、無菌注射器（1

mL、5mL）、無菌剪刀、無菌鑷子、無菌離心管（1.5mL、15mL、50mL）、無RNA酶的帶濾芯槍頭、

75%酒精、碘伏、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、孵化箱。

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CB

附錄B

（資料性附錄）

樣品的采集、處理、運輸及保存

B.1儀器設(shè)備與耗材

臺式高速冷凍離心機、高壓蒸汽滅菌鍋、高壓滅菌的剪刀、高壓滅菌的鑷子、旋渦振蕩器、可調(diào)微

量移液器（2μL-20μL、20μL-200μL、100μL-1000μL）、無菌注射器（1mL、5mL）、無RNA酶的

1.5mL離心管、無RNA酶的帶濾芯槍頭、0.22μm微孔濾器、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、一次性口罩、

一次性手套和一次性帽子。

B.2樣品采集

可采標(biāo)NY/T541。采集和樣品前處理過程中應(yīng)戴一次性手套、口罩、帽子，采集過程中樣品不得

交叉污染。樣品采集過程包括以下要求：

1)組織樣品：采集死亡鵝或發(fā)病鵝的心、肝、肺、腎、脾等組織，采集病料時，用無菌的剪刀剪

取組織樣品，將樣品裝入一次性無菌50mL離心管或一次性潔凈塑料自封袋，密封、編號，

待檢；

2)細胞培養(yǎng)上清液：直接將細胞培養(yǎng)上清液加入到滅菌的1.5mL離心管中，加蓋、編號，待檢。

3)鵝胚尿囊液：直接將鵝胚尿囊液加入到滅菌的1.5mL離心管中，加蓋、編號，待檢；

4)肛拭子樣品：取泄殖腔棉拭子時，將棉拭子深入泄殖腔轉(zhuǎn)3圈并沾取少量糞便，將棉拭子頭一

并放入盛有1mLPBS的無菌離心管中，蓋上管蓋并編號，10000rpm離心5min后取上清備

用。

B.3樣品處理

B.3.1組織樣品

在生物安全柜內(nèi)用滅菌剪刀剪碎后按照1:5加入無菌PBS（pH7.4、0.01mol·L?1）進行研磨，反復(fù)凍

融3次后，在4℃下10000rpm離心15min，上清液經(jīng)0.22μm濾器過濾后-80℃冰箱保存。

B.3.2細胞上清液和鵝胚尿囊液

將細胞培養(yǎng)液和鵝胚尿囊液在4℃下10000rpm離心15min，將上清液轉(zhuǎn)入滅菌的1.5mL離心管中，

依據(jù)原樣品地編號。

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DC

附錄C

（資料性附錄）

RT-PCR所需儀器設(shè)備和試劑耗材

C.1儀器設(shè)備與耗材

PCR基因擴增儀、核酸電泳儀、核酸電泳槽、凝膠成像分析系統(tǒng)、臺式高速冷凍離心機、可調(diào)微量

移液器（0.1μL-2.5μL、2μL-20μL、20μL-200μL、100μL-1000μL）、無RNA酶的1.5mL離心管、無

RNA酶的PCR管、無RNA酶的帶濾芯槍頭。

C.2試劑

商品化RNA提取試劑盒、無RNA酶去離子水、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（包括Buffer緩沖液、M-MLV反轉(zhuǎn)錄

酶、RNA酶抑制劑）、2×PCRMix、dNTPs(2.5nmol/Leach)、DNAMarker、電泳級瓊脂糖、Tis-乙酸電

泳緩沖液TAE(50×TAE，1×TAE）、1%瓊脂糖、陽性對照（新型鵝星狀病毒）、陰性對照（陰性尿囊液

或正常細胞）。

C.3引物

C.3.1隨機反轉(zhuǎn)錄引物

Random9反轉(zhuǎn)錄引物。

C.3.2RT-PCR引物

針對鵝星狀病毒的RT-PCR檢測引物，參照附錄F。

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ED

附錄D

（資料性附錄）

熒光RT-PCR所需儀器設(shè)備和試劑耗材

D.1儀器設(shè)備與耗材

臺式高速冷凍離心機、實時熒光定量PCR儀、渦旋振蕩器、可調(diào)微量移液器（0.1μL-2.5μL、2μL-20

μL、20μL-200μL、100μL-1000μL）、無RNA酶的1.5mL離心管、無RNA酶的熒光定量PCR管、無RNA

酶的帶濾芯槍頭。

D.2試劑

商品化RNA提取試劑盒、無RNA酶去離子水、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（包括Buffer緩沖液、M-MLV反轉(zhuǎn)錄

酶、RNA酶抑制劑）、實時熒光定量PCR試劑盒、dNTPs(2.5nmol/Leach)、陽性對照（新型鵝星狀病毒）、

陰性對照（陰性尿囊液或正常細胞）。

D.3引物

D.3.1特異反轉(zhuǎn)錄引物

Random9反轉(zhuǎn)錄引物。

D.3.2熒光定量RT-PCR引物和探針

針對鵝星狀病毒的熒光PCR引物和探針，參照附錄F。

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FE

附錄E

（資料性附錄）

RT-LAMP方法所需儀器設(shè)備和試劑耗材

E.1儀器設(shè)備與耗材

高速冷凍離心機、水浴鍋、紫外分析儀、可調(diào)微量移液器（0.1μL-2.5μL、2μL-20μL、20μL-200μL、

100μL-1000μL）、無RNA酶的1.5mL離心管、無RNA酶的PCR管、無RNA酶的帶濾芯槍頭。

E.2試劑

商品化RNA提取試劑盒、無RNA酶去離子水、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（包括Buffer緩沖液、M-MLV反轉(zhuǎn)錄

酶、RNA酶抑制劑）、商品化LAMP擴增試劑盒、TE可視染料、陽性對照（新型鵝星狀病毒）、陰

性對照（陰性尿囊液或正常細胞）。

E.3引物

E.3.1隨機反轉(zhuǎn)錄引物

Random9反轉(zhuǎn)錄引物。

E.3.2RT-PCR引物

針對鵝星狀病毒的RT-LAMP檢測引物，參照附錄F。

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GF

附錄F

（資料性附錄）

新型鵝星狀病毒RT-PCR引物、熒光RT-PCR的引物和探針、RT-LAMP引物

F.1新型鵝星狀病毒RT-PCR檢測引物

見表F.1。

表F.1鵝星狀病毒RT-PCR檢測用引物和探針

引物名稱引物序列（5ˊ→3ˊ，上下兩行分別為上下游引物序列）產(chǎn)物大?。╞p）基因用途

NGoAstV-FATTCTTGGCTCGGTTGTC

489ORF2RT-PCR

NGoAstV-RCCTGTGTTGC