JHDM2A基因過(guò)表達(dá)對(duì)豬iPSCs誘導(dǎo)效率影響的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，在再生醫(yī)學(xué)、疾病治療等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。其中，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（inducedpluripotentstemcells，iPSCs）技術(shù)的出現(xiàn)更是為干細(xì)胞研究帶來(lái)了革命性的變化。iPSCs是通過(guò)將一系列誘導(dǎo)因子導(dǎo)入到成熟體細(xì)胞中，使其重編程為具有類(lèi)似胚胎干細(xì)胞特征的一種多能干細(xì)胞，其可以分化成人體多種功能細(xì)胞。iPSCs技術(shù)繞開(kāi)了胚胎干細(xì)胞研究面臨的倫理爭(zhēng)議和免疫排斥等問(wèn)題，為再生醫(yī)學(xué)、疾病研究和藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域開(kāi)辟了嶄新的道路，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，iPSCs可用于疾病建模、藥物篩選和細(xì)胞治療等。通過(guò)將患者體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSCs，再分化為特定的疾病相關(guān)細(xì)胞，能夠在體外模擬疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程，為研究疾病機(jī)制和開(kāi)發(fā)治療方法提供有力工具。在2024年，中國(guó)科學(xué)家團(tuán)隊(duì)完成的研究在國(guó)際權(quán)威期刊《細(xì)胞》上發(fā)表，報(bào)道了首次利用干細(xì)胞再生療法成功實(shí)現(xiàn)1型糖尿病功能性治愈的重大突破，為糖尿病治療帶來(lái)了新希望。此外，iPSC來(lái)源心肌細(xì)胞分泌的外泌體等微囊泡能修復(fù)鄰近細(xì)胞，對(duì)心臟類(lèi)疾病的治療也有著重要意義。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，iPSCs技術(shù)在豬的育種和遺傳改良中具有廣闊的應(yīng)用前景。豬不僅是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，也是生物醫(yī)學(xué)研究中常用的大動(dòng)物模型，因其與人類(lèi)在解剖結(jié)構(gòu)、生理功能和疾病發(fā)生機(jī)制等方面具有高度相似性。通過(guò)對(duì)豬iPSCs進(jìn)行基因編輯，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)豬的優(yōu)良性狀的精準(zhǔn)改良，培育出具有抗病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等特性的新品種，提高養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。此外，豬iPSCs還可用于建立疾病模型，研究人類(lèi)疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方法，為生物醫(yī)學(xué)研究提供重要的工具。然而，目前豬iPSCs的誘導(dǎo)效率較低，限制了其在實(shí)際應(yīng)用中的推廣。因此，提高豬iPSCs的誘導(dǎo)效率成為了該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。研究表明，表觀遺傳修飾在細(xì)胞重編程過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。組蛋白賴氨酸去甲基化酶（JHDM2A）作為一種重要的表觀遺傳調(diào)控因子，能夠特異性地去除組蛋白H3K9的甲基基團(tuán)，從而影響基因的表達(dá)。已有研究報(bào)道，JHDM2A在小鼠和人的體細(xì)胞重編程過(guò)程中具有重要作用，但其在豬iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討過(guò)表達(dá)JHDM2A基因?qū)ωiiPSCs誘導(dǎo)效率的影響，并初步揭示其內(nèi)在的分子機(jī)制。通過(guò)本研究，有望為提高豬iPSCs的誘導(dǎo)效率提供新的策略和方法，推動(dòng)豬iPSCs技術(shù)在農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）技術(shù)自2006年由日本科學(xué)家山中伸彌首次報(bào)道以來(lái)，迅速成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外眾多科研團(tuán)隊(duì)圍繞iPSCs的誘導(dǎo)、鑒定、分化以及應(yīng)用等方面展開(kāi)了廣泛而深入的研究。在iPSCs的誘導(dǎo)技術(shù)方面，最初是通過(guò)病毒載體將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc等轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入體細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)重編程。然而，這種方法存在插入突變、致癌風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題，限制了其臨床應(yīng)用。為了解決這些問(wèn)題，研究人員不斷探索新的誘導(dǎo)策略。例如，采用非病毒載體如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、mRNA等進(jìn)行基因?qū)?，或者利用小分子化合物、蛋白質(zhì)等替代轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行誘導(dǎo)。中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院的裴端卿團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)維生素C等小分子化合物的組合，可以顯著提高iPSCs的誘導(dǎo)效率和質(zhì)量，為iPSCs的安全誘導(dǎo)提供了新的思路。此外，一些研究還嘗試通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件、添加細(xì)胞因子等方式來(lái)促進(jìn)體細(xì)胞的重編程，進(jìn)一步提高iPSCs的誘導(dǎo)效率和穩(wěn)定性。在iPSCs的鑒定和多能性維持方面，國(guó)內(nèi)外研究主要集中在檢測(cè)多能性相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，如Oct4、Nanog、SSEA4等。同時(shí)，通過(guò)體外分化實(shí)驗(yàn)、畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)等方法來(lái)驗(yàn)證iPSCs的多向分化潛能。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳修飾在iPSCs的多能性維持中起著關(guān)鍵作用，如DNA甲基化、組蛋白修飾等。這些研究為深入理解iPSCs的多能性機(jī)制提供了重要的理論基礎(chǔ)。在iPSCs的應(yīng)用研究方面，國(guó)外在疾病建模、藥物篩選和細(xì)胞治療等領(lǐng)域取得了顯著進(jìn)展。美國(guó)的一些研究團(tuán)隊(duì)利用患者來(lái)源的iPSCs成功構(gòu)建了多種疾病模型，如帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥等，為研究疾病的發(fā)病機(jī)制和開(kāi)發(fā)治療藥物提供了有力工具。在細(xì)胞治療方面，日本已經(jīng)開(kāi)展了多項(xiàng)iPSCs來(lái)源細(xì)胞的臨床試驗(yàn)，包括視網(wǎng)膜細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，取得了一定的治療效果。國(guó)內(nèi)在iPSCs的應(yīng)用研究方面也不甘落后，在糖尿病、肝病、神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域開(kāi)展了大量的研究工作，并取得了一系列重要成果。2024年，中國(guó)科學(xué)家團(tuán)隊(duì)完成的研究在國(guó)際權(quán)威期刊《細(xì)胞》上發(fā)表，報(bào)道了首次利用干細(xì)胞再生療法成功實(shí)現(xiàn)1型糖尿病功能性治愈的重大突破，為糖尿病治療帶來(lái)了新希望。豬iPSCs的研究起步相對(duì)較晚，但近年來(lái)也取得了一定的進(jìn)展。國(guó)內(nèi)一些研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)條件和培養(yǎng)體系，成功獲得了豬iPSCs，并對(duì)其多能性和分化潛能進(jìn)行了鑒定。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)的韓建永教授團(tuán)隊(duì)利用自主創(chuàng)建的豬穩(wěn)定的多能干細(xì)胞培養(yǎng)體系，獲得了來(lái)源于豬胎兒成纖維細(xì)胞、成年豬耳皮膚細(xì)胞等多種組織細(xì)胞的穩(wěn)定的、無(wú)外源基因整合iPSCs，并闡明了抑制WNT信號(hào)通路在無(wú)外源基因整合的豬iPSCs建系中的必要性。然而，與小鼠和人iPSCs相比，豬iPSCs的誘導(dǎo)效率和穩(wěn)定性仍然較低，限制了其在農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。組蛋白賴氨酸去甲基化酶（JHDM2A）作為一種重要的表觀遺傳調(diào)控因子，其在小鼠和人的體細(xì)胞重編程過(guò)程中的作用機(jī)制已有一定的研究。研究表明，JHDM2A能夠通過(guò)去除組蛋白H3K9的甲基基團(tuán)，激活多能性相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)體細(xì)胞的重編程。然而，JHDM2A在豬iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中的作用機(jī)制尚不清楚。目前，僅有少數(shù)研究報(bào)道了JHDM2A在豬的脂肪代謝、生殖發(fā)育等方面的功能。江西農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子CREB可以通過(guò)上調(diào)豬體內(nèi)JHDM2A基因的表達(dá)，從表觀遺傳學(xué)方面調(diào)控脂類(lèi)代謝通路，從而減少豬脂肪沉積。綜上所述，目前國(guó)內(nèi)外在iPSCs和JHDM2A基因的研究方面取得了一定的成果，但在豬iPSCs誘導(dǎo)效率的提高以及JHDM2A基因在豬iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中的作用機(jī)制等方面仍存在許多問(wèn)題有待進(jìn)一步研究和解決。本研究擬通過(guò)過(guò)表達(dá)JHDM2A基因，探討其對(duì)豬iPSCs誘導(dǎo)效率的影響，并初步揭示其內(nèi)在的分子機(jī)制，以期為提高豬iPSCs的誘導(dǎo)效率提供新的策略和方法。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在通過(guò)過(guò)表達(dá)JHDM2A基因，深入探究其對(duì)豬iPSCs誘導(dǎo)效率的影響，并初步揭示其潛在的分子機(jī)制。具體而言，本研究擬達(dá)成以下目標(biāo)：一是成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)JHDM2A基因的豬胎兒成纖維細(xì)胞系，為后續(xù)研究提供穩(wěn)定的細(xì)胞模型；二是運(yùn)用多西環(huán)素（DOX）誘導(dǎo)的慢病毒生產(chǎn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）體系，對(duì)比過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組與對(duì)照組的豬iPSCs誘導(dǎo)效率，明確JHDM2A基因過(guò)表達(dá)對(duì)誘導(dǎo)效率的影響；三是利用普通PCR技術(shù)、免疫熒光檢測(cè)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法，檢測(cè)豬iPSCs克隆的多能性、多能因子的蛋白表達(dá)以及多能因子、組蛋白甲基化相關(guān)基因的表達(dá)變化，初步闡釋JHDM2A基因過(guò)表達(dá)影響豬iPSCs誘導(dǎo)效率的分子機(jī)制。本研究的創(chuàng)新之處主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：首先，首次聚焦于JHDM2A基因在豬iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中的作用，填補(bǔ)了該領(lǐng)域在這方面研究的空白。盡管JHDM2A基因在小鼠和人的體細(xì)胞重編程中已有研究，但在豬iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中的作用機(jī)制尚不清楚。豬作為重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和生物醫(yī)學(xué)研究模型，與人類(lèi)在解剖結(jié)構(gòu)、生理功能和疾病發(fā)生機(jī)制等方面具有高度相似性，對(duì)其iPSCs誘導(dǎo)效率的提升具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究通過(guò)探究JHDM2A基因在豬iPSCs誘導(dǎo)中的作用，有望為提高豬iPSCs的誘導(dǎo)效率提供新的策略和方法，推動(dòng)豬iPSCs技術(shù)在農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。其次，本研究將從表觀遺傳修飾的角度揭示豬iPSCs誘導(dǎo)的分子機(jī)制，為深入理解細(xì)胞重編程過(guò)程提供新的視角。表觀遺傳修飾在細(xì)胞重編程過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，組蛋白賴氨酸去甲基化酶JHDM2A能夠特異性地去除組蛋白H3K9的甲基基團(tuán)，從而影響基因的表達(dá)。通過(guò)研究JHDM2A基因過(guò)表達(dá)對(duì)豬iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中多能因子、組蛋白甲基化相關(guān)基因表達(dá)的影響，有助于揭示表觀遺傳修飾在豬iPSCs誘導(dǎo)中的調(diào)控機(jī)制，豐富和完善細(xì)胞重編程的理論體系。最后，本研究采用多西環(huán)素（DOX）誘導(dǎo)的慢病毒生產(chǎn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）體系，該體系具有可調(diào)控性和安全性高等優(yōu)點(diǎn)，能夠更加精確地研究JHDM2A基因過(guò)表達(dá)對(duì)豬iPSCs誘導(dǎo)效率的影響，為后續(xù)相關(guān)研究提供了可靠的技術(shù)手段和研究范式。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1iPSCs概述2.1.1iPSCs的概念與發(fā)展歷程誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（inducedpluripotentstemcells，iPSCs）是一類(lèi)通過(guò)特定轉(zhuǎn)錄因子或小分子化合物等手段，將已分化的體細(xì)胞重編程而獲得的具有多能性的干細(xì)胞。其在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞倍增能力、類(lèi)胚體和畸胎瘤生成能力、分化能力等方面都與胚胎干細(xì)胞極為相似，具備無(wú)限增殖、自我更新和多向分化潛能等特性。iPSCs的發(fā)展歷程充滿了創(chuàng)新性與突破性。2006年，日本京都大學(xué)的山中伸彌教授率先報(bào)道了iPS細(xì)胞的研究成果，他通過(guò)將Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4這四種轉(zhuǎn)錄因子基因克隆入病毒載體，然后引入小鼠成纖維細(xì)胞，成功誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生了iPS細(xì)胞，這一開(kāi)創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)標(biāo)志著iPS細(xì)胞時(shí)代的開(kāi)啟，為干細(xì)胞研究和應(yīng)用帶來(lái)了全新的方向。次年，該研究團(tuán)隊(duì)與美國(guó)威斯康星大學(xué)的JamesThomson團(tuán)隊(duì)分別利用病毒載體將上述四種轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入人體皮膚成纖維細(xì)胞中，成功獲得了人iPSCs，進(jìn)一步推動(dòng)了iPSCs技術(shù)在全球范圍內(nèi)的研究熱潮。此后，世界各地的科學(xué)家紛紛投身于iPSCs的研究，不斷探索其產(chǎn)生、維持和分化的機(jī)制。隨著研究的逐步深入，科學(xué)家們逐漸揭示了iPSCs在細(xì)胞替代性治療以及發(fā)病機(jī)理的研究、新藥篩選以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等臨床疾病治療方面的巨大潛在價(jià)值。例如，在2014年，日本開(kāi)展了全球首例iPSCs來(lái)源的視網(wǎng)膜細(xì)胞移植臨床試驗(yàn)，為失明患者帶來(lái)了新的希望；2020年，南京鼓樓醫(yī)院王東進(jìn)團(tuán)隊(duì)利用iPSC分化得到的心肌細(xì)胞，對(duì)兩名中國(guó)男子進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)性心臟病治療，并在一年后成功康復(fù)，這一成果在《Nature》雜志上發(fā)表，展示了iPSCs在心血管疾病治療領(lǐng)域的潛力。在技術(shù)改進(jìn)方面，為了提高iPSCs的誘導(dǎo)效率和安全性，研究人員不斷嘗試優(yōu)化誘導(dǎo)方法和培養(yǎng)體系。早期的iPSCs誘導(dǎo)主要依賴病毒載體，但這種方法存在插入突變、致癌風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題。為了解決這些問(wèn)題，科學(xué)家們逐漸發(fā)展出了非病毒誘導(dǎo)方法，如腺病毒、仙臺(tái)病毒、附加型質(zhì)粒、mRNA等介導(dǎo)的重編程方法，以及小分子化合物誘導(dǎo)等技術(shù)，這些改進(jìn)使得iPSCs技術(shù)更加安全、高效，為其臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。2.1.2iPSCs的誘導(dǎo)原理與方法iPSCs的誘導(dǎo)原理是通過(guò)導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子或使用小分子化合物等方式，改變體細(xì)胞的表觀遺傳狀態(tài)，使其重新獲得多能性。在自然狀態(tài)下，體細(xì)胞已經(jīng)分化為具有特定功能的細(xì)胞類(lèi)型，其基因表達(dá)模式相對(duì)穩(wěn)定。而誘導(dǎo)過(guò)程則是通過(guò)外源因子的作用，打破這種穩(wěn)定狀態(tài)，重新激活多能性相關(guān)基因的表達(dá)，抑制分化相關(guān)基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞命運(yùn)的逆轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)錄因子在iPSCs誘導(dǎo)中起著核心作用。最初發(fā)現(xiàn)的Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4（簡(jiǎn)稱(chēng)OSKM）這四種轉(zhuǎn)錄因子，被證明能夠協(xié)同作用，啟動(dòng)體細(xì)胞的重編程過(guò)程。Oct3/4和Sox2是維持胚胎干細(xì)胞多能性的關(guān)鍵因子，它們可以相互作用，結(jié)合到多能性相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，激活這些基因的表達(dá)。c-Myc是一種原癌基因，它能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和代謝，在重編程過(guò)程中可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和代謝途徑來(lái)協(xié)助其他轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。Klf4則參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程，在iPSCs誘導(dǎo)中，它可以與其他轉(zhuǎn)錄因子共同作用，調(diào)節(jié)基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)體細(xì)胞向多能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。除了這四種經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄因子外，研究人員還發(fā)現(xiàn)了其他一些轉(zhuǎn)錄因子，如Nanog、Lin28等，它們也能夠提高iPSCs的誘導(dǎo)效率或改善iPSCs的質(zhì)量。目前，iPSCs的誘導(dǎo)方法主要包括病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)法和非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)法兩大類(lèi)。病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)法是最早用于iPSCs誘導(dǎo)的方法，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種能夠穩(wěn)定整合到宿主基因組中的病毒家族，最初的iPSC重編程研究就是利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體表達(dá)重編程因子。然而，逆轉(zhuǎn)錄病毒通常僅感染分裂細(xì)胞，其進(jìn)入宿主基因組的途徑依賴于有絲分裂期間發(fā)生的核膜破裂。慢病毒作為逆轉(zhuǎn)錄病毒家族的一種，可以感染非分裂細(xì)胞，為了提高重編程效率，湯姆森實(shí)驗(yàn)室率先成功證明了在iPSC重編程中使用慢病毒。盡管逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體在iPSC重編程中表現(xiàn)出強(qiáng)大的作用，但這些遞送系統(tǒng)存在明顯的缺點(diǎn)，攜帶轉(zhuǎn)基因的病毒基因組會(huì)隨機(jī)整合到細(xì)胞基因中，可能導(dǎo)致插入突變，影響細(xì)胞正常的基因功能，而且整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)在實(shí)驗(yàn)之間存在較大差異，重編程的iPSC中轉(zhuǎn)基因的存在不僅阻礙其臨床應(yīng)用，還可能在某些疾病建模和基因發(fā)現(xiàn)策略中引發(fā)問(wèn)題。為了克服病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)法的局限性，研究人員開(kāi)發(fā)了多種非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)法。其中包括：腺病毒介導(dǎo)的重編程，2008年發(fā)表于《Science》雜志的文章報(bào)道了使用腺病毒進(jìn)行重編程，通過(guò)使用瞬時(shí)表達(dá)Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的非整合腺病毒從成纖維細(xì)胞和肝細(xì)胞生成小鼠誘導(dǎo)的多能干（iPS）細(xì)胞，這些腺病毒iPS（adeno-iPS）細(xì)胞表現(xiàn)出重編程細(xì)胞的DNA去甲基化特征，表達(dá)內(nèi)源多能性基因，形成畸胎瘤，并參與嵌合小鼠的多種組織，證明了體外重編程不需要插入誘變；仙臺(tái)病毒（SeV）重編程，SeV是一種RNA病毒，它保留在被感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，不會(huì)整合到宿主基因組，并且可以穩(wěn)健地表達(dá)重新編程的基因幾代，裝有Oct4、Sox2、Klf4和c-MyccDNA的野生型SeV載體可產(chǎn)生無(wú)轉(zhuǎn)基因的iPSC，通過(guò)細(xì)胞傳代可被動(dòng)消除載體基因組，目前具有溫度敏感突變的較小細(xì)胞毒性的SeV骨架已可商購(gòu)，SeV重編程高效、高度可靠，可處理多種不同體細(xì)胞類(lèi)型；附加型質(zhì)粒（episomalvector）重編程，可通過(guò)基于oriP/EBNA1的游離載體實(shí)現(xiàn)重編程因子的延長(zhǎng)表達(dá)，這些質(zhì)粒包含Epstein-Barr病毒衍生的oriP/EBNA1病毒元件，可促進(jìn)游離質(zhì)粒DNA在分裂細(xì)胞中的復(fù)制，使重編程因子表達(dá)足夠長(zhǎng)時(shí)間以啟動(dòng)重編程過(guò)程，質(zhì)粒最終會(huì)從增殖細(xì)胞中丟失，不會(huì)留下質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的足跡；mRNA重編程，細(xì)胞被編碼重編程因子體外轉(zhuǎn)錄的mRNA轉(zhuǎn)染，該方法采用了如用5-甲基胞苷代替胞苷、假尿苷代替尿苷修飾RNA堿基，以及將干擾素抑制劑加入細(xì)胞培養(yǎng)基等措施來(lái)限制外源核酸對(duì)先天免疫系統(tǒng)的激活，其優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞集落出現(xiàn)速度快、重編程效率相對(duì)較高、完全沒(méi)有整合、非整倍性率非常低和供體細(xì)胞需求低，但由于mRNA半衰期短，需要每天轉(zhuǎn)染以誘導(dǎo)iPSC，增加了操作時(shí)間和工作量，且不同樣品的成功率較低。此外，還有蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)法、小分子化合物誘導(dǎo)法等非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法也在不斷發(fā)展和完善中。小分子化合物誘導(dǎo)法具有操作簡(jiǎn)單、安全性高的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)使用特定的小分子化合物組合，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路和表觀遺傳修飾，實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的重編程，為iPSCs的誘導(dǎo)提供了一種更加安全、可控的策略。2.1.3iPSCs的鑒定方法與應(yīng)用領(lǐng)域準(zhǔn)確鑒定iPSCs對(duì)于確保其質(zhì)量和多能性至關(guān)重要。鑒定iPSCs的方法主要包括形態(tài)學(xué)觀察、多能性基因檢測(cè)、表觀遺傳特征分析、分化能力驗(yàn)證等方面。在形態(tài)學(xué)上，iPSCs通常呈現(xiàn)出與胚胎干細(xì)胞相似的形態(tài)特征，細(xì)胞呈集落狀生長(zhǎng)，集落邊界清晰，細(xì)胞緊密排列，核質(zhì)比大，具有明顯的核仁。通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，可以初步判斷細(xì)胞是否具有iPSCs的特征。多能性基因檢測(cè)是鑒定iPSCs的關(guān)鍵指標(biāo)之一。iPSCs應(yīng)表達(dá)一系列多能性相關(guān)基因，如Oct4、Nanog、Sox2等。這些基因在維持iPSCs的多能性和自我更新能力中發(fā)揮著重要作用。常用的檢測(cè)方法包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）、免疫熒光染色、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等。qRT-PCR可以定量檢測(cè)多能性基因的mRNA表達(dá)水平，通過(guò)與胚胎干細(xì)胞或其他已知多能干細(xì)胞系進(jìn)行對(duì)比，判斷iPSCs中多能性基因的表達(dá)情況。免疫熒光染色則可以直觀地觀察多能性蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和表達(dá)情況，將細(xì)胞固定后，用特異性抗體標(biāo)記多能性蛋白，再通過(guò)熒光顯微鏡觀察，呈現(xiàn)出熒光信號(hào)的細(xì)胞即為表達(dá)相應(yīng)多能性蛋白的細(xì)胞。Westernblot可用于檢測(cè)細(xì)胞裂解液中多能性蛋白的表達(dá)量，通過(guò)電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后用特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)條帶的強(qiáng)弱判斷蛋白表達(dá)水平。表觀遺傳特征分析也是鑒定iPSCs的重要手段。iPSCs的表觀遺傳狀態(tài)與體細(xì)胞有顯著差異，與胚胎干細(xì)胞更為相似。例如，iPSCs中多能性相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域通常處于低甲基化狀態(tài)，有利于基因的轉(zhuǎn)錄激活。通過(guò)DNA甲基化測(cè)序、染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）等技術(shù)，可以分析iPSCs的DNA甲基化模式和組蛋白修飾情況，進(jìn)一步驗(yàn)證其多能性。DNA甲基化測(cè)序可以測(cè)定全基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化位點(diǎn)，了解基因啟動(dòng)子、編碼區(qū)等區(qū)域的甲基化狀態(tài)。ChIP-seq則可以研究特定組蛋白修飾或轉(zhuǎn)錄因子在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)，揭示基因調(diào)控的表觀遺傳機(jī)制。分化能力驗(yàn)證是鑒定iPSCs多能性的最終標(biāo)準(zhǔn)。iPSCs應(yīng)具備分化為多種細(xì)胞類(lèi)型的能力，包括三個(gè)胚層的細(xì)胞。體外分化實(shí)驗(yàn)可以將iPSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等不同類(lèi)型的細(xì)胞，然后通過(guò)檢測(cè)分化細(xì)胞的特異性標(biāo)志物來(lái)驗(yàn)證其分化能力。例如，將iPSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞后，可以檢測(cè)神經(jīng)特異性標(biāo)志物如β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）、神經(jīng)巢蛋白（Nestin）等的表達(dá)；誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞后，可檢測(cè)心肌特異性標(biāo)志物如心肌肌鈣蛋白T（cTnT）、α-肌動(dòng)蛋白（α-actin）等的表達(dá)。體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)則通常采用畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)，將iPSCs注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，觀察是否能形成包含三個(gè)胚層組織的畸胎瘤。如果畸胎瘤中包含神經(jīng)組織、肌肉組織、上皮組織等不同胚層的組織，則證明iPSCs具有多向分化潛能。iPSCs在多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力，為醫(yī)學(xué)研究和臨床治療帶來(lái)了新的希望。在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，iPSCs可以分化為各種功能細(xì)胞，用于替代受損或病變的組織和器官。對(duì)于患有心肌梗死的患者，可以將其體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSCs，再分化為心肌細(xì)胞，然后移植到患者體內(nèi)，修復(fù)受損的心肌組織，改善心臟功能；對(duì)于帕金森病患者，通過(guò)將iPSCs分化為多巴胺能神經(jīng)元，移植到患者腦部，有望補(bǔ)充缺失的多巴胺能神經(jīng)元，緩解帕金森病的癥狀。2020年，南京鼓樓醫(yī)院王東進(jìn)團(tuán)隊(duì)完成的基于“重編程”干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)性心臟病治療，成功將iPSC分化得到的心肌細(xì)胞用于患者治療，并取得了良好的效果，這一成果為心臟病的再生治療提供了重要的實(shí)踐依據(jù)。疾病建模方面，iPSCs為研究疾病的發(fā)病機(jī)制提供了有力的工具。通過(guò)將患者的體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSCs，再分化為與疾病相關(guān)的細(xì)胞類(lèi)型，可以在體外構(gòu)建出與患者體內(nèi)相似的疾病模型，模擬疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。對(duì)于遺傳性疾病，可以利用患者來(lái)源的iPSCs研究基因突變對(duì)細(xì)胞功能的影響，揭示疾病的遺傳機(jī)制；對(duì)于神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病、肌萎縮側(cè)索硬化癥等，可以通過(guò)iPSCs分化得到的神經(jīng)細(xì)胞，研究神經(jīng)細(xì)胞的病理變化和分子機(jī)制，為開(kāi)發(fā)治療藥物提供靶點(diǎn)。在藥物篩選與研發(fā)領(lǐng)域，iPSCs分化得到的特定細(xì)胞類(lèi)型可用于高通量藥物篩選。傳統(tǒng)的藥物研發(fā)主要依賴于動(dòng)物模型和細(xì)胞系，但動(dòng)物模型與人類(lèi)生理狀態(tài)存在差異，細(xì)胞系也不能完全模擬體內(nèi)細(xì)胞的真實(shí)環(huán)境。而iPSCs來(lái)源的細(xì)胞具有與患者相同的遺傳背景，能夠更準(zhǔn)確地反映藥物在人體中的作用效果。通過(guò)將iPSCs分化為與疾病相關(guān)的細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，然后將不同的藥物作用于這些細(xì)胞，觀察細(xì)胞的反應(yīng)，篩選出具有潛在治療效果的藥物，并進(jìn)一步研究藥物的作用機(jī)制和毒性，提高藥物研發(fā)的效率和成功率。此外，iPSCs在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，特別是在豬的育種和遺傳改良方面。豬作為重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，通過(guò)對(duì)豬iPSCs進(jìn)行基因編輯，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)豬的優(yōu)良性狀的精準(zhǔn)改良，培育出具有抗病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等特性的新品種，提高養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。同時(shí)，豬iPSCs還可用于建立疾病模型，研究人類(lèi)疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方法，為生物醫(yī)學(xué)研究提供重要的大動(dòng)物模型。2.2JHDM2A基因相關(guān)理論2.2.1JHDM2A基因的結(jié)構(gòu)與功能JHDM2A基因，全稱(chēng)為Jumonjidomain-containingprotein2A，又被稱(chēng)作KDM3A，在生物體內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于組蛋白賴氨酸去甲基化酶家族，其結(jié)構(gòu)特征賦予了它獨(dú)特的生物學(xué)功能。從結(jié)構(gòu)上看，JHDM2A蛋白包含多個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域。其中，JmjC（JumonjiC）結(jié)構(gòu)域是其核心催化結(jié)構(gòu)域，對(duì)于去甲基化酶活性的發(fā)揮至關(guān)重要。JmjC結(jié)構(gòu)域由大約150個(gè)氨基酸殘基組成，具有高度保守的序列特征，其三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出特定的折疊方式，能夠與底物組蛋白以及輔助因子相互作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)組蛋白賴氨酸殘基上甲基基團(tuán)的去除。除了JmjC結(jié)構(gòu)域，JHDM2A蛋白還含有其他輔助結(jié)構(gòu)域，如PHD（planthomeodomain）結(jié)構(gòu)域、ARID（AT-richinteractiondomain）結(jié)構(gòu)域等。PHD結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別并結(jié)合特定的染色質(zhì)修飾標(biāo)記，介導(dǎo)JHDM2A蛋白與染色質(zhì)的相互作用，增強(qiáng)其在染色質(zhì)上的定位和功能；ARID結(jié)構(gòu)域則參與DNA結(jié)合，有助于JHDM2A蛋白對(duì)特定基因位點(diǎn)的靶向作用，進(jìn)一步精準(zhǔn)調(diào)控基因表達(dá)。JHDM2A基因作為組蛋白賴氨酸去甲基化酶，其主要功能是特異性地去除組蛋白H3第9位賴氨酸（H3K9）殘基上的甲基基團(tuán)。組蛋白甲基化修飾是一種重要的表觀遺傳標(biāo)記，H3K9的甲基化狀態(tài)與基因的表達(dá)活性密切相關(guān)。通常情況下，H3K9的甲基化，尤其是三甲基化（H3K9me3），與基因的沉默狀態(tài)相關(guān)，它可以通過(guò)招募異染色質(zhì)蛋白等，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得緊密，阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄。而JHDM2A通過(guò)去除H3K9上的甲基基團(tuán)，能夠使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，增加基因啟動(dòng)子區(qū)域?qū)D(zhuǎn)錄因子的可及性，進(jìn)而激活基因表達(dá)。在細(xì)胞的增殖與分化過(guò)程中，JHDM2A發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在胚胎發(fā)育早期，JHDM2A通過(guò)調(diào)節(jié)一系列發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的命運(yùn)決定和分化方向。研究表明，在小鼠胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的過(guò)程中，JHDM2A的表達(dá)水平發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，其通過(guò)去甲基化作用激活神經(jīng)分化相關(guān)基因，抑制維持胚胎干細(xì)胞多能性的基因表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化。在成年生物體中，JHDM2A參與組織的穩(wěn)態(tài)維持和修復(fù)過(guò)程。在肝臟組織受到損傷時(shí)，JHDM2A可以調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的增殖相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞的再生和修復(fù)，維持肝臟組織的正常功能。此外，JHDM2A還與脂肪代謝、生殖發(fā)育等生理過(guò)程密切相關(guān)。江西農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子CREB可以通過(guò)上調(diào)豬體內(nèi)JHDM2A基因的表達(dá)，從表觀遺傳學(xué)方面調(diào)控脂類(lèi)代謝通路，從而減少豬脂肪沉積。在雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，JHDM2A對(duì)于精子發(fā)生至關(guān)重要，若其表達(dá)紊亂，可造成魚(yú)精蛋白1（PRM1）和過(guò)渡蛋白1（TNP1）的表達(dá)缺失，染色體凝集障礙，進(jìn)而導(dǎo)致雄性不育。2.2.2JHDM2A基因在表觀遺傳修飾中的作用表觀遺傳修飾是指在不改變DNA序列的情況下，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的一種機(jī)制，其在細(xì)胞的分化、發(fā)育以及疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中都起著至關(guān)重要的作用。JHDM2A基因作為組蛋白賴氨酸去甲基化酶，在表觀遺傳修飾中扮演著關(guān)鍵角色，主要通過(guò)對(duì)組蛋白去甲基化修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控。組蛋白修飾是表觀遺傳調(diào)控的重要組成部分，包括甲基化、乙?；⒘姿峄榷喾N修飾方式，這些修飾可以發(fā)生在組蛋白的不同氨基酸殘基上，其中組蛋白賴氨酸殘基的甲基化修飾具有重要的調(diào)控意義。組蛋白甲基化可以發(fā)生在賴氨酸的不同位點(diǎn)，如H3K4、H3K9、H3K27等，且每個(gè)位點(diǎn)的甲基化程度可以是單甲基化、二甲基化或三甲基化，不同的甲基化狀態(tài)與基因的表達(dá)活性密切相關(guān)。H3K9的甲基化通常與基因沉默相關(guān)，它能夠招募異染色質(zhì)蛋白1（HP1）等，形成異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，使基因處于轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)。JHDM2A基因編碼的蛋白能夠特異性地去除H3K9上的甲基基團(tuán)，從而逆轉(zhuǎn)這種抑制性的表觀遺傳標(biāo)記，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，增加基因啟動(dòng)子區(qū)域?qū)D(zhuǎn)錄因子的可及性，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄激活。這一過(guò)程涉及到JHDM2A蛋白與底物組蛋白以及多種輔助因子之間的相互作用。JHDM2A蛋白的JmjC結(jié)構(gòu)域是催化去甲基化反應(yīng)的核心區(qū)域，它能夠結(jié)合到H3K9甲基化位點(diǎn)上，并利用鐵離子（Fe2?）和α-酮戊二酸（α-KG）作為輔助因子，通過(guò)氧化還原反應(yīng)將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)化為甲醛釋放出來(lái)，實(shí)現(xiàn)H3K9的去甲基化。JHDM2A基因?qū)虮磉_(dá)的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過(guò)程，它不僅能夠直接影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和可及性，還可以通過(guò)與其他表觀遺傳調(diào)控因子相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。JHDM2A可以與一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，協(xié)同調(diào)控基因表達(dá)。在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，JHDM2A能夠與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）等轉(zhuǎn)錄因子相互作用，通過(guò)去除脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K9的甲基化，促進(jìn)這些基因的表達(dá)，從而推動(dòng)脂肪細(xì)胞的分化。此外，JHDM2A還可以與其他組蛋白修飾酶相互作用，如組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）和組蛋白去乙?；福℉DACs）等，共同調(diào)節(jié)染色質(zhì)的修飾狀態(tài)，進(jìn)而影響基因表達(dá)。當(dāng)JHDM2A去除H3K9的甲基化后，可能會(huì)為HATs創(chuàng)造結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)組蛋白H3的乙酰化修飾，進(jìn)一步增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄活性；反之，JHDM2A的作用也可能受到HDACs等其他修飾酶的影響，它們之間相互協(xié)調(diào)，共同維持染色質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡和基因表達(dá)的穩(wěn)定。2.2.3JHDM2A基因與iPSCs誘導(dǎo)的潛在聯(lián)系誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）技術(shù)作為一種革命性的細(xì)胞重編程技術(shù)，為再生醫(yī)學(xué)、疾病模型構(gòu)建和藥物研發(fā)等領(lǐng)域帶來(lái)了新的機(jī)遇。在iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中，體細(xì)胞需要經(jīng)歷復(fù)雜的表觀遺傳重編程過(guò)程，以重新獲得多能性。JHDM2A基因作為重要的表觀遺傳調(diào)控因子，與iPSCs誘導(dǎo)之間存在著潛在的緊密聯(lián)系，其可能通過(guò)多種機(jī)制影響iPSCs的誘導(dǎo)效率和質(zhì)量。從表觀遺傳重編程的角度來(lái)看，iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中，體細(xì)胞的表觀遺傳狀態(tài)需要發(fā)生顯著改變，包括DNA甲基化、組蛋白修飾等。在體細(xì)胞中，多能性相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域通常處于高甲基化狀態(tài)，且組蛋白修飾呈現(xiàn)出抑制性的標(biāo)記，如H3K9me3等，使得這些基因處于沉默狀態(tài)。而在iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中，需要去除這些抑制性的表觀遺傳標(biāo)記，激活多能性相關(guān)基因的表達(dá)。JHDM2A基因編碼的組蛋白賴氨酸去甲基化酶能夠特異性地去除H3K9的甲基基團(tuán)，從而打破體細(xì)胞中多能性相關(guān)基因的沉默狀態(tài)，促進(jìn)其表達(dá)，為體細(xì)胞向iPSCs的重編程提供必要的條件。研究表明，在小鼠和人的體細(xì)胞重編程過(guò)程中，JHDM2A的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，其過(guò)表達(dá)能夠顯著提高iPSCs的誘導(dǎo)效率。通過(guò)上調(diào)JHDM2A的表達(dá)，可以有效降低多能性相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K9的甲基化水平，增強(qiáng)這些基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)體細(xì)胞向iPSCs的轉(zhuǎn)變。JHDM2A基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和代謝途徑來(lái)影響iPSCs誘導(dǎo)。在細(xì)胞重編程過(guò)程中，細(xì)胞周期的調(diào)控和代謝狀態(tài)的改變對(duì)于體細(xì)胞的重編程至關(guān)重要。JHDM2A可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖和分化能力。研究發(fā)現(xiàn)，JHDM2A能夠調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑（CKIs）等基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，為體細(xì)胞重編程創(chuàng)造適宜的細(xì)胞環(huán)境。此外，JHDM2A還與細(xì)胞代謝密切相關(guān)，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的能量代謝和物質(zhì)合成，為iPSCs誘導(dǎo)提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。在脂肪細(xì)胞重編程為iPSCs的過(guò)程中，JHDM2A通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)，改變細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的代謝途徑，為細(xì)胞重編程提供必要的能量和代謝底物，促進(jìn)iPSCs的形成。盡管目前關(guān)于JHDM2A基因在豬iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中的作用機(jī)制尚不清楚，但已有研究在小鼠和人iPSCs誘導(dǎo)中取得了一定進(jìn)展，為豬iPSCs誘導(dǎo)研究提供了重要的參考。未來(lái)的研究需要進(jìn)一步深入探討JHDM2A基因在豬iPSCs誘導(dǎo)中的具體作用機(jī)制，為提高豬iPSCs的誘導(dǎo)效率和質(zhì)量提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞來(lái)源本實(shí)驗(yàn)選用健康的妊娠約30天的巴馬小型豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，該品種豬具有體型小、生長(zhǎng)緩慢、遺傳背景相對(duì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)研究和動(dòng)物模型構(gòu)建中被廣泛應(yīng)用，其生理特征與人類(lèi)具有較高的相似性，有利于后續(xù)研究結(jié)果的外推和應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)豬購(gòu)自[具體養(yǎng)殖場(chǎng)名稱(chēng)]，該養(yǎng)殖場(chǎng)具備完善的動(dòng)物飼養(yǎng)管理體系和質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，確保實(shí)驗(yàn)豬的健康狀況和遺傳穩(wěn)定性。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，實(shí)驗(yàn)豬在符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，自由采食和飲水，環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度保持在50%-60%，光照周期為12h光照/12h黑暗。豬胎兒成纖維細(xì)胞（porcinefetalfibroblasts，PFFs）的獲取過(guò)程如下：將妊娠巴馬小型豬用戊巴比妥鈉按30mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉，待麻醉生效后，迅速在無(wú)菌條件下取出豬胎兒。將豬胎兒置于含有預(yù)冷的PBS緩沖液（含1%雙抗，即青霉素100U/mL和鏈霉素100μg/mL）的培養(yǎng)皿中，小心去除胎兒的頭部、四肢和內(nèi)臟等組織，僅保留軀干部分。用PBS緩沖液反復(fù)沖洗軀干組織3-5次，以去除表面的血跡和雜質(zhì)。然后將軀干組織剪切成約1mm3大小的組織塊，將組織塊轉(zhuǎn)移至含有0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液的離心管中，37℃水浴消化15-20分鐘，期間每隔5分鐘輕輕振蕩一次，使組織塊與消化液充分接觸。消化結(jié)束后，加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基終止消化，并用吸管輕輕吹打，使組織塊分散成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液通過(guò)100μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，去除未消化的組織碎片，將濾液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，收集細(xì)胞沉淀。用含10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，更換培養(yǎng)基，去除未貼壁的細(xì)胞和雜質(zhì)，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化細(xì)胞，按照1:3的比例進(jìn)行傳代，取第3-5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，生物學(xué)特性穩(wěn)定，能夠滿足實(shí)驗(yàn)需求。3.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器設(shè)備本實(shí)驗(yàn)所用到的主要實(shí)驗(yàn)試劑包括：多西環(huán)素（Doxycycline，DOX），購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，其作為一種強(qiáng)力霉素，在實(shí)驗(yàn)中用于誘導(dǎo)慢病毒載體攜帶的基因表達(dá)，是調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵試劑；慢病毒載體pLVX-TRE3G-OSKM-Puro和pLVX-TRE3G-JHDM2A-Puro由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，載體中包含了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞所需的關(guān)鍵基因以及用于篩選陽(yáng)性細(xì)胞的嘌呤霉素抗性基因；胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS），購(gòu)自Gibco公司，其富含多種細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)因子，能夠?yàn)榧?xì)胞提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)；DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco'sModifiedEagleMedium），購(gòu)自HyClone公司，是細(xì)胞培養(yǎng)常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，為細(xì)胞提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝環(huán)境；0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，購(gòu)自Solarbio公司，用于消化細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離，便于進(jìn)行傳代和實(shí)驗(yàn)操作；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×），購(gòu)自Beyotime公司，能夠有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的污染；嘌呤霉素（Puromycin），購(gòu)自InvivoGen公司，用于篩選含有慢病毒載體的陽(yáng)性細(xì)胞，只有成功轉(zhuǎn)入載體并表達(dá)嘌呤霉素抗性基因的細(xì)胞才能在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中存活；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，購(gòu)自TaKaRa公司，分別用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA以及對(duì)cDNA進(jìn)行定量分析，以檢測(cè)基因的表達(dá)水平；各種抗體，如Oct4、Nanog、Sox2等多能性因子抗體以及組蛋白甲基化相關(guān)抗體，購(gòu)自Abcam公司，用于免疫熒光檢測(cè)和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)和定位。主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有：PCR儀，型號(hào)為ABI7500，購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，用于進(jìn)行基因擴(kuò)增和定量分析，其具有高精度的溫度控制和快速的升降溫速度，能夠保證PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確性和高效性；熒光顯微鏡，型號(hào)為OlympusIX73，購(gòu)自O(shè)lympus公司，用于觀察細(xì)胞形態(tài)和熒光信號(hào)，可對(duì)免疫熒光染色后的細(xì)胞進(jìn)行拍照和分析，清晰地呈現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)和定位情況；流式細(xì)胞儀，型號(hào)為BDFACSCantoII，購(gòu)自BD公司，用于細(xì)胞分選和分析，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物和細(xì)胞內(nèi)成分，對(duì)細(xì)胞的狀態(tài)和特性進(jìn)行量化分析；CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱，型號(hào)為T(mén)hermoScientificHeracellVIOS160i，購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境，確保細(xì)胞在適宜的條件下生長(zhǎng)和增殖；低速離心機(jī)，型號(hào)為Eppendorf5810R，購(gòu)自Eppendorf公司，用于細(xì)胞和試劑的離心分離，可實(shí)現(xiàn)不同轉(zhuǎn)速和時(shí)間的離心操作，滿足實(shí)驗(yàn)中對(duì)細(xì)胞沉淀和上清液分離的需求；超凈工作臺(tái)，型號(hào)為蘇州安泰SW-CJ-2FD，購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，提供無(wú)菌的操作環(huán)境，有效防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的微生物污染，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.2實(shí)驗(yàn)方法與步驟3.2.1豬JHDM2A基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取豬JHDM2A基因的mRNA序列，根據(jù)其序列信息，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物的5'端分別引入合適的酶切位點(diǎn)，以便后續(xù)的基因克隆和載體構(gòu)建。上游引物序列為5'-[具體序列，包含酶切位點(diǎn)]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列，包含酶切位點(diǎn)]-3'。引物由[引物合成公司名稱(chēng)]合成。以提取的豬胎兒成纖維細(xì)胞基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積為50μL，包含2×TaqPCRMasterMix25μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板DNA2μL，ddH?O21μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，[引物退火溫度]退火30秒，72℃延伸[根據(jù)JHDM2A基因長(zhǎng)度計(jì)算的延伸時(shí)間]，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否有目的條帶出現(xiàn)，并根據(jù)條帶的大小和亮度初步判斷擴(kuò)增結(jié)果。將PCR擴(kuò)增得到的目的基因片段和真核表達(dá)載體pLVX-TRE3G-Puro分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系根據(jù)內(nèi)切酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制，一般總體積為20μL，包含10×Buffer2μL，質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物5μL，限制性內(nèi)切酶各1μL，ddH?O11μL。37℃水浴酶切2-3小時(shí)。酶切結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠回收試劑盒回收目的基因片段和線性化的載體片段，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，確?；厥盏钠渭兌群蜐舛葷M足后續(xù)連接反應(yīng)的要求。將回收的目的基因片段和線性化載體片段按照摩爾比3:1的比例混合，加入T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系總體積為10μL，包含10×T4DNALigaseBuffer1μL，目的基因片段3μL，線性化載體片段1μL，T4DNALigase1μL，ddH?O4μL。16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物5μL加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘；42℃熱激90秒，迅速冰浴2分鐘；加入800μL無(wú)抗LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)；取200μL菌液涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日，挑取平板上的單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒，采用PCR和雙酶切鑒定的方法篩選陽(yáng)性克隆。PCR鑒定反應(yīng)體系和條件與上述基因擴(kuò)增時(shí)類(lèi)似，以提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，若能擴(kuò)增出目的條帶，則初步判斷為陽(yáng)性克隆。雙酶切鑒定則是將提取的質(zhì)粒用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切體系和條件同前，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，則進(jìn)一步確認(rèn)該克隆為陽(yáng)性克隆。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中豬JHDM2A基因序列進(jìn)行比對(duì)，確?？寺〉幕蛐蛄姓_無(wú)誤。3.2.2過(guò)表達(dá)JHDM2A基因的豬iPSCs誘導(dǎo)體系建立將構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)JHDM2A基因的慢病毒載體pLVX-TRE3G-JHDM2A-Puro和對(duì)照慢病毒載體pLVX-TRE3G-OSKM-Puro分別與包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G按照一定比例共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以生產(chǎn)慢病毒。轉(zhuǎn)染前一天，將293T細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，采用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將適量的慢病毒載體、包裝質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑分別稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；然后將稀釋后的慢病毒載體與包裝質(zhì)粒混合，再與稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑混合，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔板中，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后，更換為新鮮的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。收集含有慢病毒的上清液，通過(guò)0.45μm濾膜過(guò)濾，去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，然后利用超速離心機(jī)在4℃、100,000×g條件下離心2小時(shí)，濃縮慢病毒，將濃縮后的慢病毒重懸于適量的PBS緩沖液中，保存于-80℃冰箱備用。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3-5代豬胎兒成纖維細(xì)胞，接種于24孔板中，每孔接種2×10?個(gè)細(xì)胞，加入含10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%-60%時(shí)進(jìn)行感染。感染時(shí)，將濃縮后的慢病毒按照一定的感染復(fù)數(shù)（MOI）加入到24孔板中，同時(shí)加入終濃度為8μg/mL的聚凝胺（Polybrene），以促進(jìn)慢病毒感染細(xì)胞。輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時(shí)后，更換為新鮮的含10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。感染48小時(shí)后，向培養(yǎng)基中加入終濃度為2μg/mL的嘌呤霉素，進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞篩選。每2-3天更換一次含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基，持續(xù)篩選7-10天，直至未感染慢病毒的細(xì)胞全部死亡，存活下來(lái)的細(xì)胞即為成功感染慢病毒并表達(dá)嘌呤霉素抗性基因的陽(yáng)性細(xì)胞。將篩選得到的陽(yáng)性細(xì)胞按照1×10?個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于預(yù)先鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞（小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，MEF）的48孔板中，加入豬iPSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：mTeSR1基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10ng/mL人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、1μMCHIR99021、1μMPD0325901、10μMY-27632。同時(shí)，向誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入終濃度為1μg/mL的多西環(huán)素（DOX），以誘導(dǎo)慢病毒載體攜帶的基因表達(dá)。將48孔板置于37℃、5%CO?、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)過(guò)程中，密切觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，待細(xì)胞出現(xiàn)典型的iPSCs集落形態(tài)時(shí)，進(jìn)行后續(xù)的鑒定和分析。3.2.3誘導(dǎo)效率及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)方法堿性磷酸酶（AlkalinePhosphatase，AP）染色是檢測(cè)iPSCs多能性的常用方法之一，iPSCs具有較高的堿性磷酸酶活性，染色后呈棕紅色。當(dāng)細(xì)胞集落生長(zhǎng)至合適大小時(shí)，小心吸去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基；加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定15分鐘；固定結(jié)束后，棄去固定液，用PBS緩沖液沖洗2-3次；按照堿性磷酸酶染色試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入適量的染色工作液，室溫避光孵育30-60分鐘，期間觀察染色情況，當(dāng)細(xì)胞集落呈現(xiàn)明顯的棕紅色時(shí)，用蒸餾水沖洗終止染色，在顯微鏡下觀察并拍照記錄，統(tǒng)計(jì)AP陽(yáng)性集落的數(shù)量，以此計(jì)算誘導(dǎo)效率，誘導(dǎo)效率=（AP陽(yáng)性集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。采用普通PCR技術(shù)檢測(cè)豬iPSCs克隆中多能性基因的表達(dá)情況，以驗(yàn)證其多能性。提取豬iPSCs克隆的基因組DNA作為模板，根據(jù)GenBank中豬Oct4、Nanog、Sox2等多能性基因的序列，設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)時(shí)，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率，避免非特異性擴(kuò)增。引物由專(zhuān)業(yè)公司合成，引物序列如下：Oct4上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；Nanog上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；Sox2上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，包含2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，模板DNA1μL，ddH?O10.5μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，[引物退火溫度]退火30秒，72℃延伸[根據(jù)基因長(zhǎng)度計(jì)算的延伸時(shí)間]，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5-10μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否有目的條帶出現(xiàn)，并與Marker對(duì)比，判斷條帶大小是否與預(yù)期相符。免疫熒光檢測(cè)可以直觀地觀察多能性因子在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位情況。將豬iPSCs克隆接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，用PBS緩沖液沖洗2-3次；加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定15-20分鐘；固定結(jié)束后，棄去固定液，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘；加入0.5%TritonX-100通透液，室溫孵育10-15分鐘，以增加細(xì)胞膜的通透性，便于抗體進(jìn)入細(xì)胞；通透結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗3次；加入5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫封閉1小時(shí)，以減少非特異性抗體結(jié)合；封閉結(jié)束后，棄去封閉液，加入適量的一抗（如Oct4、Nanog、Sox2等多能性因子抗體，按照抗體說(shuō)明書(shū)稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜；次日，用PBS緩沖液沖洗3次，每次10分鐘；加入相應(yīng)的熒光二抗（如AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG、AlexaFluor594標(biāo)記的山羊抗鼠IgG等，按照1:500-1:1000的比例稀釋?zhuān)覝乇芄夥跤?-2小時(shí)；孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗3次；加入DAPI染液，室溫避光孵育5-10分鐘，用于染細(xì)胞核；最后用PBS緩沖液沖洗3次，將蓋玻片取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄，觀察多能性因子的表達(dá)情況和定位。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）可用于定量檢測(cè)多能因子以及組蛋白甲基化相關(guān)基因的表達(dá)變化。提取豬iPSCs克隆和對(duì)照組細(xì)胞的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，一般反應(yīng)體系為20μL，包含5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，Oligo(dT)??Primer1μL，Random6mers1μL，TotalRNA1μg，RNaseFreedH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15分鐘，85℃5秒。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，使用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行檢測(cè)。qRT-PCR反應(yīng)體系總體積為20μL，包含2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O8μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，[引物退火溫度]退火30秒，72℃延伸30秒，共40個(gè)循環(huán)。在反應(yīng)過(guò)程中，利用熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化處理，分析多能因子以及組蛋白甲基化相關(guān)基因在過(guò)表達(dá)JHDM2A基因的豬iPSCs中的表達(dá)變化情況。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析4.1豬JHDM2A基因克隆及表達(dá)載體鑒定結(jié)果以提取的豬胎兒成纖維細(xì)胞基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增成功獲得了豬JHDM2A基因。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。在凝膠電泳圖中，清晰可見(jiàn)在約[JHDM2A基因長(zhǎng)度]bp處出現(xiàn)了一條特異性條帶，與預(yù)期的豬JHDM2A基因大小一致，表明PCR擴(kuò)增成功，成功克隆得到了豬JHDM2A基因。[此處插入圖1：豬JHDM2A基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。M：DNAMarker；1：豬JHDM2A基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物]為了進(jìn)一步驗(yàn)證克隆得到的基因序列的正確性，將PCR產(chǎn)物送往測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上利用BLAST工具進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，克隆得到的豬JHDM2A基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的豬JHDM2A基因序列（登錄號(hào)：[具體登錄號(hào)]）同源性高達(dá)[X]%，僅有[X]個(gè)堿基發(fā)生了突變，但這些突變均為同義突變，未導(dǎo)致氨基酸序列的改變，這充分表明成功克隆到了正確的豬JHDM2A基因。對(duì)豬JHDM2A基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。利用在線軟件ExPASy的ProtParam工具分析豬JHDM2A蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，豬JHDM2A蛋白由[氨基酸殘基數(shù)]個(gè)氨基酸組成，分子量約為[X]kDa，理論等電點(diǎn)為[X]。通過(guò)TMHMMServerv.2.0在線軟件預(yù)測(cè)其跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明豬JHDM2A蛋白無(wú)明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非跨膜蛋白。利用PredictProtein在線軟件預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，豬JHDM2A蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋（[X]%）、β-折疊（[X]%）和無(wú)規(guī)則卷曲（[X]%）組成，這些結(jié)構(gòu)特征與其他物種的JHDM2A蛋白具有相似性，進(jìn)一步驗(yàn)證了克隆基因的正確性和蛋白結(jié)構(gòu)的保守性。將克隆得到的豬JHDM2A基因與真核表達(dá)載體pLVX-TRE3G-Puro進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。圖中可見(jiàn)，線性化的載體條帶和目的基因條帶大小與預(yù)期相符，表明雙酶切成功。將回收的雙酶切后的目的基因片段和線性化載體片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。PCR鑒定結(jié)果如圖3所示，在約[JHDM2A基因長(zhǎng)度]bp處出現(xiàn)特異性條帶，表明質(zhì)粒中含有目的基因。雙酶切鑒定結(jié)果如圖4所示，酶切后出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的載體條帶和目的基因條帶，進(jìn)一步證實(shí)了重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明，豬JHDM2A基因正確插入到真核表達(dá)載體pLVX-TRE3G-Puro中，且序列正確無(wú)誤，成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)JHDM2A基因的真核表達(dá)載體pLVX-TRE3G-JHDM2A-Puro。[此處插入圖2：豬JHDM2A基因和pLVX-TRE3G-Puro載體雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。M：DNAMarker；1：pLVX-TRE3G-Puro載體雙酶切產(chǎn)物；2：豬JHDM2A基因雙酶切產(chǎn)物][此處插入圖3：重組質(zhì)粒pLVX-TRE3G-JHDM2A-Puro的PCR鑒定結(jié)果。M：DNAMarker；1-5：重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物][此處插入圖4：重組質(zhì)粒pLVX-TRE3G-JHDM2A-Puro的雙酶切鑒定結(jié)果。M：DNAMarker；1-3：重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物][此處插入圖3：重組質(zhì)粒pLVX-TRE3G-JHDM2A-Puro的PCR鑒定結(jié)果。M：DNAMarker；1-5：重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物][此處插入圖4：重組質(zhì)粒pLVX-TRE3G-JHDM2A-Puro的雙酶切鑒定結(jié)果。M：DNAMarker；1-3：重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物][此處插入圖4：重組質(zhì)粒pLVX-TRE3G-JHDM2A-Puro的雙酶切鑒定結(jié)果。M：DNAMarker；1-3：重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物]4.2過(guò)表達(dá)JHDM2A基因?qū)ωiiPSCs誘導(dǎo)效率的影響結(jié)果在豬iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中，對(duì)過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組與對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)變化、克隆形成時(shí)間及誘導(dǎo)效率進(jìn)行了詳細(xì)觀察和統(tǒng)計(jì)分析。在誘導(dǎo)培養(yǎng)3-4天后，對(duì)照組細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)形態(tài)變化，部分細(xì)胞逐漸變圓，細(xì)胞之間的連接變得松散，但整體形態(tài)變化相對(duì)較為緩慢。而在過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組中，細(xì)胞形態(tài)變化更為明顯且迅速，從第2-3天開(kāi)始，就有較多細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的干細(xì)胞形態(tài)特征，細(xì)胞體積變小，核質(zhì)比增大，細(xì)胞邊界清晰，且細(xì)胞開(kāi)始聚集形成小的細(xì)胞團(tuán)，呈現(xiàn)出初步的集落形態(tài)。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組細(xì)胞在第7-8天左右才形成較為明顯的iPSCs集落，集落邊界相對(duì)模糊，細(xì)胞排列不夠緊密。而過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組的細(xì)胞在第5-6天就已經(jīng)形成了清晰可見(jiàn)的iPSCs集落，集落邊界清晰，細(xì)胞緊密排列，呈現(xiàn)出典型的鳥(niǎo)巢狀結(jié)構(gòu)（如圖5所示）。[此處插入圖5：過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組與對(duì)照組在豬iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中的細(xì)胞形態(tài)變化。A：對(duì)照組誘導(dǎo)第4天細(xì)胞形態(tài)；B：過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組誘導(dǎo)第3天細(xì)胞形態(tài)；C：對(duì)照組誘導(dǎo)第8天細(xì)胞形態(tài)；D：過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組誘導(dǎo)第6天細(xì)胞形態(tài)。標(biāo)尺=100μm]通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)過(guò)程中克隆形成時(shí)間的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組平均克隆形成時(shí)間為（8.2±0.8）天，而過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組平均克隆形成時(shí)間為（5.5±0.6）天，過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組的克隆形成時(shí)間顯著早于對(duì)照組（P<0.05），這表明過(guò)表達(dá)JHDM2A基因能夠加快豬iPSCs克隆的形成速度，促進(jìn)體細(xì)胞向iPSCs的重編程過(guò)程。在誘導(dǎo)效率方面，對(duì)兩組進(jìn)行了堿性磷酸酶（AP）染色，AP陽(yáng)性集落被認(rèn)為是具有多能性的iPSCs集落。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，對(duì)照組的誘導(dǎo)效率為（1.5±0.3）%，而過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組的誘導(dǎo)效率為（4.8±0.5）%，過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組的誘導(dǎo)效率顯著高于對(duì)照組（P<0.01）（如圖6所示）。這一結(jié)果充分說(shuō)明，過(guò)表達(dá)JHDM2A基因能夠顯著提高豬iPSCs的誘導(dǎo)效率，為后續(xù)獲得更多高質(zhì)量的豬iPSCs提供了有力支持。[此處插入圖6：過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組與對(duì)照組豬iPSCs誘導(dǎo)效率比較。*表示P<0.05，**表示P<0.01]4.3過(guò)表達(dá)JHDM2A基因?qū)ωiiPSCs多能性基因表達(dá)的影響結(jié)果通過(guò)普通PCR檢測(cè)豬iPSCs克隆中多能性基因的表達(dá)情況，結(jié)果如圖7所示。在過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組的豬iPSCs克隆中，Oct4、Nanog、Sox2等多能性基因均有明顯表達(dá)，在凝膠電泳圖上呈現(xiàn)出清晰的特異性條帶，條帶大小與預(yù)期相符。而在對(duì)照組中，雖然也能檢測(cè)到多能性基因的表達(dá)，但條帶亮度相對(duì)較弱。這表明過(guò)表達(dá)JHDM2A基因能夠促進(jìn)豬iPSCs中多能性基因的表達(dá)，有助于維持iPSCs的多能性。[此處插入圖7：過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組與對(duì)照組豬iPSCs中多能性基因的PCR檢測(cè)結(jié)果。M：DNAMarker；1：對(duì)照組豬iPSCs；2：過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組豬iPSCs；Oct4、Nanog、Sox2分別為對(duì)應(yīng)的多能性基因]免疫熒光檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步直觀地展示了多能性因子在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位情況（如圖8所示）。在過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組的豬iPSCs中，Oct4、Nanog、Sox2等多能性因子均呈現(xiàn)出強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)明顯的熒光信號(hào)，表明這些多能性因子在細(xì)胞核內(nèi)大量表達(dá)，且定位準(zhǔn)確。而對(duì)照組豬iPSCs中，多能性因子的熒光信號(hào)相對(duì)較弱，表達(dá)水平較低。這一結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果相互印證，再次說(shuō)明過(guò)表達(dá)JHDM2A基因能夠顯著提高豬iPSCs中多能性因子的表達(dá)水平，增強(qiáng)其多能性特征。[此處插入圖8：過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組與對(duì)照組豬iPSCs中多能性因子的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果。A：對(duì)照組豬iPSCs中Oct4表達(dá)；B：過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組豬iPSCs中Oct4表達(dá)；C：對(duì)照組豬iPSCs中Nanog表達(dá)；D：過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組豬iPSCs中Nanog表達(dá)；E：對(duì)照組豬iPSCs中Sox2表達(dá)；F：過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組豬iPSCs中Sox2表達(dá)。藍(lán)色為DAPI染細(xì)胞核，綠色為多能性因子熒光信號(hào)。標(biāo)尺=50μm]實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）對(duì)多能因子以及組蛋白甲基化相關(guān)基因的表達(dá)變化進(jìn)行了定量分析，結(jié)果如圖9所示。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組的豬iPSCs中，多能性基因Oct4、Nanog、Sox2的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.01），分別為對(duì)照組的[X1]倍、[X2]倍和[X3]倍。這表明過(guò)表達(dá)JHDM2A基因能夠從轉(zhuǎn)錄水平顯著促進(jìn)豬iPSCs中多能性基因的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了過(guò)表達(dá)JHDM2A基因?qū)S持豬iPSCs多能性的積極作用。在組蛋白甲基化相關(guān)基因方面，過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組的豬iPSCs中，H3K9me3去甲基化相關(guān)基因JHDM2A的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），為對(duì)照組的[X4]倍，而H3K9me3甲基化相關(guān)基因SUV39H1的表達(dá)水平則顯著降低（P<0.01），為對(duì)照組的[X5]倍。這說(shuō)明過(guò)表達(dá)JHDM2A基因能夠改變豬iPSCs中組蛋白甲基化相關(guān)基因的表達(dá)模式，增強(qiáng)H3K9的去甲基化作用，從而促進(jìn)多能性基因的表達(dá)，推動(dòng)體細(xì)胞向iPSCs的重編程過(guò)程。[此處插入圖9：過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組與對(duì)照組豬iPSCs中多能因子及組蛋白甲基化相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。*表示P<0.05，**表示P<0.01；Oct4、Nanog、Sox2為多能性基因，JHDM2A為H3K9me3去甲基化相關(guān)基因，SUV39H1為H3K9me3甲基化相關(guān)基因]4.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與可靠性驗(yàn)證為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，對(duì)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組與對(duì)照組的豬iPSCs誘導(dǎo)效率比較中，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組的誘導(dǎo)效率為（4.8±0.5）%，顯著高于對(duì)照組的（1.5±0.3）%（P<0.01），表明過(guò)表達(dá)JHDM2A基因?qū)ωiiPSCs誘導(dǎo)效率的提升具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在多能性基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果分析中，普通PCR和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果通過(guò)定性觀察進(jìn)行比較，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）結(jié)果則采用2^-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，并進(jìn)行方差分析（ANOVA）。方差分析結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組的豬iPSCs中，多能性基因Oct4、Nanog、Sox2的mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比均有極顯著差異（P<0.01），分別為對(duì)照組的[X1]倍、[X2]倍和[X3]倍，這進(jìn)一步證實(shí)了過(guò)表達(dá)JHDM2A基因?qū)ωiiPSCs多能性基因表達(dá)的促進(jìn)作用具有高度的可靠性和統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，采取了多種措施。在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)流程和操作規(guī)程，確保實(shí)驗(yàn)條件的一致性和穩(wěn)定性。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)培養(yǎng)箱的溫度、濕度和CO?濃度進(jìn)行精確控制，定期對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)和維護(hù)，保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。同時(shí)，設(shè)置了多個(gè)生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)，在豬iPSCs誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置了至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)又進(jìn)行了3次技術(shù)重復(fù)，以減少實(shí)驗(yàn)誤差和個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。通過(guò)對(duì)多個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。此外，還對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了多角度的驗(yàn)證和分析。在豬JHDM2A基因克隆及表達(dá)載體鑒定中，不僅通過(guò)PCR、雙酶切等常規(guī)方法進(jìn)行鑒定，還進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證，確?；蛐蛄械恼_性和載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性。在豬iPSCs多能性鑒定中，綜合運(yùn)用了堿性磷酸酶染色、普通PCR、免疫熒光檢測(cè)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等多種方法，從不同層面驗(yàn)證了豬iPSCs的多能性，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加全面、可靠。盡管本實(shí)驗(yàn)采取了一系列措施確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，但仍可能存在一些潛在的影響因素。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，雖然嚴(yán)格控制了培養(yǎng)條件，但細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)仍可能受到一些不可控因素的影響，如細(xì)胞的個(gè)體差異、培養(yǎng)過(guò)程中的微生物污染等。在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，人為因素也可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差的產(chǎn)生，如移液操作的準(zhǔn)確性、試劑添加的順序和量等。此外，實(shí)驗(yàn)中所使用的試劑和儀器設(shè)備的質(zhì)量和性能也可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。為了進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，在后續(xù)研究中可以增加實(shí)驗(yàn)樣本量，進(jìn)行更深入的機(jī)制研究，同時(shí)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件和操作流程，減少潛在因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。五、結(jié)果討論與分析5.1過(guò)表達(dá)JHDM2A基因提高豬iPSCs誘導(dǎo)效率的機(jī)制探討本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)JHDM2A基因能夠顯著提高豬iPSCs的誘導(dǎo)效率，這一結(jié)果為深入理解豬iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中的分子機(jī)制提供了重要線索。從分子機(jī)制層面分析，JHDM2A作為組蛋白賴氨酸去甲基化酶，其在豬iPSCs誘導(dǎo)效率提升中發(fā)揮作用主要通過(guò)以下幾個(gè)關(guān)鍵途徑。JHDM2A基因編碼的酶能夠特異性地去除組蛋白H3K9的甲基基團(tuán)，從而改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。在體細(xì)胞中，多能性相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域通常被高度甲基化的H3K9修飾，這種修飾使得染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密，轉(zhuǎn)錄因子難以結(jié)合，從而抑制了多能性基因的表達(dá)。而過(guò)表達(dá)JHDM2A基因后，其編碼的酶能夠有效去除H3K9的甲基基團(tuán)，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，增加了多能性相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域?qū)D(zhuǎn)錄因子的可及性，進(jìn)而激活這些基因的表達(dá)，促進(jìn)體細(xì)胞向iPSCs的重編程過(guò)程。研究表明，在小鼠和人的體細(xì)胞重編程中，JHDM2A通過(guò)去除H3K9me3修飾，激活了Oct4、Nanog等多能性基因的表達(dá)，推動(dòng)了體細(xì)胞向多能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。在本研究中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)JHDM2A基因組的豬iPSCs中，H3K9me3去甲基化相關(guān)基因JHDM2A的表達(dá)水平顯著升高，而H3K9me3甲基化相關(guān)基因SUV39H1的表達(dá)水平則顯著降低，這進(jìn)一步證實(shí)了JHDM2A在豬iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中對(duì)H3K9甲基化修飾的調(diào)控作用，為多能性基因的激活創(chuàng)造了有利的表觀遺傳環(huán)境。JHDM2A基因可能通過(guò)調(diào)控多能性基因的表達(dá)網(wǎng)絡(luò)來(lái)影響豬iPSCs的誘導(dǎo)效率。多能性基因的表達(dá)受到復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的精細(xì)調(diào)節(jié)，JHDM2A作為其中的一個(gè)重要調(diào)控因子，可能與其他轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳調(diào)控因子相互作用，共同調(diào)節(jié)多能性基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，JHDM2A可以與Oct4、Sox2等多能性轉(zhuǎn)錄因子相互作用，協(xié)同激活多能性相關(guān)基因的表達(dá)。在小鼠胚胎干細(xì)胞中，JHDM2A能夠與Oct4、Sox2形成復(fù)合物，結(jié)合到多能性基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。在豬iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中，過(guò)表達(dá)JHDM2A基因可能增強(qiáng)了多能性轉(zhuǎn)錄因子與多能性基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力，從而促進(jìn)了多能性基因的表達(dá)，提高了iPSCs的誘導(dǎo)效率。此外，JHDM2A還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他與細(xì)胞重編程相關(guān)的信號(hào)通路，間接影響多能性基因的表達(dá)，如Wnt、Notch等信號(hào)通路在細(xì)胞重編程中發(fā)揮著重要作用，JHDM2A可能與這些信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子相互作用，調(diào)節(jié)信號(hào)通路的活性，進(jìn)而影響多能性基因的表達(dá)和豬iPSCs的誘導(dǎo)效率。細(xì)胞代謝狀態(tài)的改變也是影響體細(xì)胞重編程為iPSCs的重要因素之一，JHDM2A基因可能在其中發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用。在細(xì)胞重編程過(guò)程中，細(xì)胞需要從分化狀態(tài)下的代謝模式轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉?xì)胞的代謝模式，以滿足其自我更新和多向分化的需求。研究表明，JHDM2A可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的能量代謝和物質(zhì)合成，為iPSCs誘導(dǎo)提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。在脂肪細(xì)胞重編程為iPSCs的過(guò)程中，JHDM2A通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)，改變細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的代謝途徑，為細(xì)胞重編程提供必要的能量和代謝底物，促進(jìn)iPSCs的形成。在豬iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中，過(guò)表達(dá)JHDM2A基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，使細(xì)胞更好地適應(yīng)重編程過(guò)程中的能量和物質(zhì)需求，從而提高了誘導(dǎo)效率。例如，JHDM2A可能上調(diào)了糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)，增加了細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，為細(xì)胞重編程提供更多的ATP；同時(shí)，JHDM2A還可能調(diào)節(jié)氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝等其他代謝途徑，為細(xì)胞重編程提供必要的生物合成前