152022-07-15發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC1城師范學(xué)院、巴林左旗林業(yè)和草原局、內(nèi)蒙古伊禾綠錦農(nóng)業(yè)發(fā)展有I青貯飼料中乳酸菌菌種的分離與保藏技術(shù)規(guī)程GB/T4789.28食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和SN/T1538.1培養(yǎng)基制備指南第1部分：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制應(yīng)使分離和保藏的菌種不染雜菌，使退化和死亡降到最低應(yīng)保證菌種分離和保藏的安全性，不能對周圍環(huán)境造成污染和恒溫培養(yǎng)箱：5℃~60℃。厭氧培養(yǎng)裝置：5℃~60℃。冰箱：4℃冰箱、超低溫冰箱（-50℃~-86℃)。光學(xué)顯微鏡：4×~100×。水浴鍋：0℃~100℃。126.2稀釋液：稱取氯化鈉8.5g,溶于1000mL蒸餾水中，分裝后，121℃高壓滅菌30min。6.3所用試劑均為分析純，水符合GB/T6682三級水規(guī)格。以無菌操作稱取10g樣品置于盛有90mL無菌生理鹽水的聚乙烯均質(zhì)袋內(nèi)，用拍打式無菌均質(zhì)器拍打2min,制成1:10的樣品菌液。用1mL無菌吸管(移液槍)吸取1:10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于裝有9mL無菌水的無菌試管×102、1→1×103、1→1×10?,1→1×10?稀釋的樣品菌液(每個(gè)稀釋度應(yīng)更換移液管或槍頭)。 (可包括原液),吸取20μL樣品菌液于制備好養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)，倒置于恒溫培養(yǎng)箱(乳酸菌：30℃厭氧條件下培養(yǎng)72h)。過革蘭氏染色(呈陽性)和過氧化氫(呈陰性)試驗(yàn)，初步判斷乳酸菌種類。用接種環(huán)挑取典型菌落1~2于MRS瓊脂斜面培養(yǎng)基上，用接種環(huán)從底部自下而上劃密“之”字形線，在30℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h～72h,重復(fù)劃線分離培養(yǎng)3次，得到純化的單菌株。乳酸菌菌種分離及篩選程序見圖1。將分離純化的乳酸菌菌液混勻并提取其懸液以6%的濃度接種至MRS培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)(37℃)將乳酸菌菌株以3%的濃度接種于MRS液體培養(yǎng)基，分別在4℃,10℃,30℃,45℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，其中4℃培養(yǎng)10d,10℃與30℃培養(yǎng)3d,45℃培養(yǎng)7d,培養(yǎng)結(jié)束后觀察乳酸菌菌株對溫度3的響應(yīng)情況。分別在pH值為3.0,3.5,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0以及濃度為3.0%和6.5%NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)48h,觀察乳酸菌菌株對酸堿與鹽的耐受能力。采用紫外可見分光光度計(jì)測生長：0.5小于OD值小于0.1,不生長：OD值小于0.2,生長好：OD值大于1.0)。用細(xì)菌微量生化鑒定管檢測乳酸菌菌株對49種碳源的利用情況，均重復(fù)測定3次。樣品采集10g樣品+90mL無菌水，利用拍打式無菌均質(zhì)器提取浸提液10倍系列稀釋樣品采集10g樣品+90mL無菌水，利用拍打式無菌均質(zhì)器提取浸提液10倍系列稀釋菌種分離選擇2~3個(gè)適宜稀釋度的樣品浸提液，各取20μL分別加入無菌配備好的固體培養(yǎng)皿中培養(yǎng)根據(jù)菌落形態(tài)特征和生長狀況選擇并分離純化乳酸菌菌株形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色、過氧化氫實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初檢乳酸菌的篩選生理生化特性和耐受性試驗(yàn)產(chǎn)酸能力和生長繁殖能力測定耐酸和耐鹽試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn)MgSO4?7H2OMnSO4?4H2O4B.3.3保藏期間要定期檢查菌種存放的房間、冰箱、冷庫等的溫度、濕度，不可使培養(yǎng)基干枯，如發(fā)B.3.4在傳代過程中，將保藏菌種在營養(yǎng)貧乏和豐富的新鮮培養(yǎng)基中作交替培養(yǎng)，有利于保持菌種的B.3.5每次移植培養(yǎng)后，應(yīng)于原保藏菌株及其登記卡片（包含菌株名稱、編號、所用培養(yǎng)基等信息）B.3.6保藏菌種的移植不宜頻繁，每按照GB/T4789.28和SN/T15用接種環(huán)從斜面底部自下而上劃稀“之”字形線。用接種鏟挖取菌絲體連同少量瓊脂培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接到），挑取少量固體斜面菌種或用無菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養(yǎng)基將接種后的培養(yǎng)基放入30℃~38℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至良好狀態(tài)，根據(jù)菌種類別確定設(shè)定溫培養(yǎng)好的菌種于4℃~6℃保藏，有些菌種（如：部分弧菌、假單胞菌等）4℃~6℃容易死亡，基中，在30℃~38℃培養(yǎng)，根據(jù)菌種類別確定設(shè)定溫度。6本方法適用于大多數(shù)需要長期保藏的細(xì)菌、真菌、放線菌、C.3.3注意低溫冰箱的故障和停電事故，可以在低溫槽內(nèi)留有一定的空間，如果發(fā)生使低溫冰箱溫度min，備用。也可使用商品化的菌種保藏管。注意凍存管不能有裂紋。5mm～10mm