ICS65.020.30CCSB4352IDB52/T1869—2025前言 12規(guī)范性引用文件 13術語和定義 14縮略語 15基本要求 26體細胞采集 27體細胞體外培養(yǎng) 38冷凍保存 49復蘇和活力鑒定 4 附錄C（資料性）細胞凍存和復蘇登記表 7DB52/T1869—2025本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所提出。本文件由貴州省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。本文件起草單位：貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州省畜禽遺傳資源管理站、貴州省種畜禽種質測定中心、松桃苗族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、貴州省動物疫病預防控制中心、黔西市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、道真縣畜牧漁業(yè)發(fā)展服務中心、萬山區(qū)畜牧技術推廣站。本文件主要起草人：譚婭、楊齊心、吳玙彤、黃智宇、李晨、熊力、齊婧、石麗娟、楊阿明、邱家俊、裴國海、張正群、張靜、盧昱希、趙春萍、杜春林、姚敏、龍清孟、李平、楊紅文、申李、何潤霞、姚建軍。DB52/T1869—20251豬體細胞培養(yǎng)與冷凍保存技術規(guī)程本文件規(guī)定了基本要求、體細胞采集、體細胞體外培養(yǎng)、體細胞鑒定、冷凍保存、復蘇和活力鑒定的內容與方法。本文件適用于豬耳組織、脂肪組織、肌肉組織的體細胞采集、體外培養(yǎng)、冷凍保存及復蘇和活力鑒定方法。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T5458液氮生物容器GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1原代細胞primarycells直接從動物的組織或器官，將其分散成為單個細胞后，在人工條件下培養(yǎng)使其存活、生長、增殖并開始體外培養(yǎng)的細胞。3.2體細胞somaticcells來源于受精卵，并攜帶生物個體全部遺傳信息的一類細胞。3.3細胞冷凍保存cellscryopreservation將體外培養(yǎng)的細胞與細胞凍存液按一定的比例混合后，按照設定的降溫程序降溫，最后浸入液氮中進行長期保存的方法。4縮略語下列縮略語適用于本文件。PBS：磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferSaline），主要成分為磷酸鹽酸二氫鈉、磷酸鹽氫二鈉、氯化鈉，主要用來洗滌細胞。消化Buffer：消化緩沖液，多為濃度為20g/L的牛血清白蛋白，對細胞主要起到機械保護作用。2DB52/T1869—2025IF：免疫熒光染色（Immunofluorescence），基于抗原-抗體特異性反應，將熒光物質（最常用的是熒光素）標記于抗原或抗體上，當其與相應抗體或抗原結合后，就會在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)特異性的熒光反應。qPCR：實時熒光定量PCR（Real-timeQuantitativePCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。5基本要求實驗室符合GB19489要求。工作區(qū)應設置準備室、緩沖間、無菌間、細胞保存室等。其中，緩沖間面積不得小于3m2，應設置更衣柜和紫外燈，紫外燈強度不得低于1.5W/m3。紫外燈管距地面不應超過2.5m，每次照射時間不少于30min。無菌室的無菌等級最低標準應達到C級，操作區(qū)應達到B級，溫度應控制在20℃~24℃,濕度應控制在45%～60%為宜。5.2實驗準備5.2.1儀器設備儀器設備見附錄A.1。5.2.2耗材耗材見附錄A.2。5.2.3試劑與培養(yǎng)液試劑、藥品、培養(yǎng)液配置及要求見附錄B。6體細胞采集選取生長發(fā)育良好的健康豬只。6.2采集6.2.1耳組織采集用75%酒精擦洗耳組織邊緣部位，用消毒后的手術刀刮凈采樣部位的耳毛，再用75%的酒精消毒后用剪耳鉗采樣。6.2.2脂肪組織采集用75%酒精擦洗豬胴體后頸部皮下脂肪部位，用消毒后的手術刀刮凈皮膚上的毛發(fā)，取適量皮下組織，立即用生理鹽水沖洗干凈。6.2.3肌肉組織采集采集適量的豬胴體背最長肌部位，立即用生理鹽水沖洗干凈。DB52/T1869—202536.3組織處理將采集的肌肉組織樣品浸泡在盛有PBS的離心管中，封樣、標記并記錄樣本信息。6.4保存組織樣品保存至4℃采樣箱，并在12h內帶回至實驗室分離原代細胞。7體細胞體外培養(yǎng)在37.0℃、5%的CO2及100%濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。7.2原代細胞制作及培養(yǎng)7.2.1清洗：將采集的組織加入含有1%三抗的冷PBS中清洗3次，除去血管或結締組織，用眼科剪剪7.2.2消化：將碎塊移入離心管，加入膠原酶（2g/L）和消化Buffer（20g/L在37℃恒溫水浴鍋內消化1h，消化期間，每隔2min～3min進行搖勻，半小時進行一次吹打。7.2.3過篩和離心：消化結束后，用100μm濾網(wǎng)進行過濾，50ml離心管收集，經(jīng)離心8min（500g/min），棄上清，收集底部細胞。7.2.4裂解紅細胞（選做）：在底部細胞中加入5ml紅細胞裂解液，室溫裂解10min，經(jīng)離心5min（1000g/min），棄上清，收集底部細胞。7.2.5細胞培養(yǎng)：用20%完全培養(yǎng)基重懸細胞，并進行細胞計數(shù)，鋪瓶后放入培養(yǎng)箱。7.3傳代培養(yǎng)7.3.1清洗：待細胞增殖至培養(yǎng)瓶底面積的80%左右時，棄除原先的培養(yǎng)基，用37℃預熱的PBS清洗細胞。7.3.2消化：再加0.25%胰酶消化細胞，在顯微鏡觀察瓶底的細胞狀態(tài)，貼壁細胞變圓時立即添加完全培養(yǎng)基終止消化，反復吹打細胞，制成細胞懸液。7.3.3離心：將細胞懸液移至離心管中，經(jīng)離心5min（1000g/min）后棄上清，保留底部細胞。7.3.4鋪瓶：用10%完全培養(yǎng)基重懸底部細胞，并進行細胞計數(shù)，調整細胞密度約1.0×105個/mL鋪入新的細胞培養(yǎng)瓶。7,4體細胞鑒定7.4.1成纖維細胞從耳組織主要獲得成纖維細胞，成纖維細胞呈現(xiàn)的形態(tài)為梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質突起，生長時呈放射狀或漩渦狀；可利用IF或qPCR檢測鑒定成纖維細胞。7.4.2脂肪細胞從脂肪組織主要獲得基質血管成分細胞（含有脂肪來源干細胞其生長形態(tài)為長梭形，分化期逐漸變圓，細胞內產(chǎn)生脂滴，形成“脂環(huán)”，可利用油紅染色、IF或qPCR檢測鑒定脂肪細胞。DB52/T1869—202547.4.3肌衛(wèi)星細胞從肌肉組織獲得肌衛(wèi)星細胞，其形態(tài)為長梭形，在分化期排列整齊，各肌細胞融合成“肌管”；可利用IF或qPCR檢測鑒定肌衛(wèi)星細胞。8冷凍保存用細胞凍存液將培養(yǎng)的細胞制成單細胞懸液，并計數(shù)，密度為1.0×106/mL～3.0×106/mL。按1mL/每管分裝在凍存管中，標明細胞名稱、凍存管編號、性別、凍存日期、代次。8.3凍存按照細胞凍存程序（4℃10分鐘—-20℃1h～2h—-80℃過夜）或凍存盒處理后，投入符合GB/T5458規(guī)定的液氮罐（-196℃)中長久保存。8.4登記做好相應登記，細胞凍存登記表詳見附錄C.1。9復蘇和活力鑒定9.1.1水浴：從液氮中取出細胞凍存管，立即放入37℃水浴中不斷搖動1min取出，用75%酒精消毒凍存管外壁。9.1.2重懸和離心：吸出細胞懸液，放入離心管中，加入10倍體積的細胞培養(yǎng)基，混勻后離心5min（1000g/min），棄上清，再重復清洗一次。9.1.3接種和登記：將復蘇后的細胞接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，并做好相應登記，細胞復蘇登記表詳見9.2細胞活力鑒定9.2.1準備：每毫升細胞懸液中加入100μL0.4%臺盼藍溶液，濃度為0.04%。9.2.2觀察：混勻后靜置10min～15min，在光學顯微鏡下觀察。9.2.3計數(shù)：折光率強且未被染色的為活細胞，染成藍色的為死細胞，進行細胞計數(shù)。9.2.4重復：取3次計數(shù)的平均值即得到細胞活力。DB52/T1869—20255實驗準備A.1儀器設備——超凈工作臺；——CO2培養(yǎng)箱；——高壓蒸汽滅菌鍋；——鼓風干燥箱；——液氮罐；——離心機；——電子分析天平；——超純水制備系統(tǒng)；——熒光倒置顯微鏡；——冰箱（-20℃、-80℃):——恒溫采樣箱；——電熱恒溫水浴鍋；——移液器（2μL，10μL，100μL，200μL，1000μL）；——酒精燈；——血細胞計數(shù)器/細胞計數(shù)儀；——眼科剪；——凍存盒。A.2耗材——培養(yǎng)瓶（25mm，75mm）；——培養(yǎng)皿；——濾網(wǎng)（100μm）；——過濾器（0.22μm）：——移液器槍頭；——移液器槍頭盒；——巴氏吸管（10ml，20ml）：——脫脂棉；——封口膜；——標簽紙；——記號筆；——一次性乳膠手套或PE手套。DB52/T1869—20256試劑與要求B.1試劑名稱生理鹽水、磷酸緩沖鹽溶液（Phosphatebufferedsaline,PBSpH=7.2～7.4）、胎牛血清（Fetalbovineserum,FBS）、馬血清、基礎培養(yǎng)基（推薦使用DMEM/F12）、三抗（青霉素-鏈霉素-兩性霉素B）、胰酶（0.25%）、二甲基亞砜（Dimetalbumin，BSA）、地塞米松（DEX）、胰島素（Insulin）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-Isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）。B.2試劑要求所有試劑除特殊規(guī)定外，均為分析純及以上純度的化學試劑，符合組織細胞的培養(yǎng)要求；試驗用水符合GB/T6682規(guī)定；基礎培養(yǎng)基、血清建議選用細胞培養(yǎng)測試的產(chǎn)品。B.3血清的滅活新購的胎牛血清，已注明滅活處理的，用0.22μm濾器過濾滅菌后，可以直接使用；未注明滅活處理的，需56℃水浴滅活30min，用0.22μm濾器過濾滅菌后使用。血清經(jīng)滅活及過濾滅菌后，分裝并于-20℃或-80℃超低溫冰箱中長期保存?zhèn)溆谩.4細胞培養(yǎng)液B.4.120%細胞完全培養(yǎng)基推薦使用79%DMEM/F12（含15mMHEPES緩沖液、L-谷氨酰胺和酚紅）+20%FBS+1%三抗（100U/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素+0.25μg/ml兩性霉素B)；10%細胞完全培養(yǎng)基推薦使用89%DMEM/F12（含15mMHEPES緩沖液、L-谷氨酰胺和酚紅）+10%FBS+1%三抗（100U/ml青霉素+100μg/ml鏈