FoLin-CiocaLteu法多酚含量測(cè)定教程多酚類物質(zhì)是一類廣泛存在于植物中的重要次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性，其含量是評(píng)價(jià)許多植物源產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。FoLin-CiocaLteu法（簡(jiǎn)稱FoLin法）因其操作簡(jiǎn)便、靈敏度較高、適用性廣等特點(diǎn)，成為目前測(cè)定總多酚含量最常用的方法之一。本教程將詳細(xì)介紹FoLin-CiocaLteu法測(cè)定多酚含量的原理、試劑配制、操作步驟、數(shù)據(jù)處理及注意事項(xiàng)，旨在為相關(guān)科研人員和實(shí)驗(yàn)操作者提供一份專業(yè)、嚴(yán)謹(jǐn)且實(shí)用的參考指南。一、方法原理FoLin-CiocaLteu法的測(cè)定原理基于多酚類物質(zhì)的還原性。FoLin-CiocaLteu試劑（簡(jiǎn)稱F-C試劑）是一種由磷鉬酸和磷鎢酸組成的混合溶液。在堿性條件下，多酚類化合物作為還原劑，能將F-C試劑中的鉬（Ⅵ）和鎢（Ⅵ）還原為藍(lán)色的鉬（Ⅴ）和鎢（Ⅴ）的氧化物（或其復(fù)合物）。反應(yīng)生成的藍(lán)色物質(zhì)在特定波長(zhǎng)（通常為760nm左右）處有最大吸收峰，其吸光度與溶液中多酚的含量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。通過與已知濃度的多酚標(biāo)準(zhǔn)品（通常為沒食子酸）反應(yīng)所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，即可計(jì)算出樣品中總多酚的含量。二、主要試劑與儀器（一）主要試劑1.FoLin-CiocaLteu試劑：通常為商品化試劑，使用前需按說明書要求進(jìn)行適當(dāng)稀釋（一般稀釋十倍）。若無商品化試劑，也可實(shí)驗(yàn)室自行配制，但過程較為繁瑣，建議直接購買。2.碳酸鈉溶液（Na?CO?）：濃度通常為5%（w/v）。稱取一定量無水碳酸鈉，用蒸餾水溶解并定容至所需體積，搖勻后備用。該溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用或避光冷藏保存，若出現(xiàn)渾濁或沉淀則需重新配制。3.標(biāo)準(zhǔn)品：常用沒食子酸（Gallicacid）作為標(biāo)準(zhǔn)品。精確稱取干燥至恒重的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水或適當(dāng)濃度的乙醇（根據(jù)樣品提取溶劑選擇）溶解并定容，配制成一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。例如，可配制濃度為0、5、10、20、30、40、50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列。4.樣品提取液：根據(jù)樣品基質(zhì)特性，采用合適的溶劑（如水、甲醇、乙醇或其水溶液）和提取方法（如超聲提取、回流提取、浸提法等）制備得到的樣品溶液。提取液需經(jīng)過適當(dāng)稀釋，以確保其測(cè)定的吸光度落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。5.蒸餾水或超純水：用于試劑配制、稀釋及空白對(duì)照。（二）主要儀器設(shè)備1.可見分光光度計(jì)或紫外-可見分光光度計(jì)：用于測(cè)定反應(yīng)液的吸光度，需配備比色皿。2.分析天平：感量0.1mg，用于精確稱量標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。3.移液器：不同規(guī)格（如1mL、2mL、5mL、10mL等）的可調(diào)式移液器及配套吸頭，用于精確移取試劑和樣品。4.容量瓶：不同規(guī)格（如25mL、50mL、100mL、250mL、500mL等），用于試劑配制和溶液定容。5.燒杯、量筒、移液管：用于試劑配制和溶液轉(zhuǎn)移。6.渦旋混合器：用于混合反應(yīng)液。7.恒溫水浴鍋：用于控制反應(yīng)溫度（若實(shí)驗(yàn)要求恒溫反應(yīng)）。8.離心機(jī)（可選）：若樣品提取液渾濁，可用于離心分離沉淀，取上清液測(cè)定。9.pH計(jì)（可選）：用于檢查或調(diào)節(jié)溶液pH值。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1.取一系列潔凈的比色管或離心管（例如10mL或25mL規(guī)格），編號(hào)為0（空白）、1、2、3、...、n（對(duì)應(yīng)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液）。2.加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液：向各管中分別準(zhǔn)確加入0mL（空白管，以蒸餾水或提取溶劑代替）、0.1mL、0.2mL、...、XmL不同濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，確保各管中標(biāo)準(zhǔn)品的絕對(duì)含量形成梯度。3.加入蒸餾水：向各管中加入適量蒸餾水，使各管體積初步統(tǒng)一或達(dá)到一個(gè)便于后續(xù)操作的體積（例如，統(tǒng)一加至1mL或2mL，具體視F-C試劑加入量和反應(yīng)總體積而定）。4.加入F-C試劑：向各管中準(zhǔn)確加入一定體積（例如0.5mL或1mL）已稀釋的F-C試劑，立即或充分混勻。5.靜置反應(yīng)（可選）：某些操作規(guī)程會(huì)建議在此步驟靜置數(shù)分鐘（如3-5分鐘），使多酚與F-C試劑初步反應(yīng)。6.加入碳酸鈉溶液：向各管中準(zhǔn)確加入一定體積（例如1mL或2mL）的5%碳酸鈉溶液，迅速混勻。此時(shí)溶液會(huì)因堿性條件而顯色。7.定容與混勻（若使用容量瓶作為反應(yīng)容器）：用蒸餾水將各管反應(yīng)液定容至刻度（如10mL或25mL），蓋緊蓋子，充分顛倒混勻。若使用比色管且總體積較小，可直接用移液器加至指定體積后混勻。8.避光反應(yīng)：將各管反應(yīng)液置于室溫或指定溫度水浴中，避光反應(yīng)一定時(shí)間（通常為30分鐘至2小時(shí)，具體時(shí)間需根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，常見為60分鐘）。反應(yīng)時(shí)間和溫度對(duì)結(jié)果影響較大，需嚴(yán)格控制一致。9.測(cè)定吸光度：反應(yīng)結(jié)束后，以空白管溶液為參比，在760nm波長(zhǎng)處測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)液的吸光度（A760nm）。（二）樣品的測(cè)定1.樣品溶液準(zhǔn)備：確保樣品提取液澄清。若渾濁，需離心（如3000rpm，10分鐘）或過濾后取上清液或?yàn)V液。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果或樣品中多酚含量的大致估計(jì)，將樣品提取液用蒸餾水或適當(dāng)溶劑稀釋至合適濃度，使其吸光度落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。2.取潔凈比色管或離心管，編號(hào)為樣品1、樣品2、...、樣品m，并同時(shí)做樣品空白（若樣品提取溶劑對(duì)測(cè)定有干擾，可用提取溶劑代替樣品溶液，按樣品測(cè)定步驟操作）。3.加入樣品溶液：向各樣品管中準(zhǔn)確加入一定體積（例如與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時(shí)所加標(biāo)準(zhǔn)品溶液體積相同，如0.5mL或1mL）的樣品稀釋液。樣品空白管則加入等量的提取溶劑。4.后續(xù)步驟：重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制步驟中的3-9，即加入蒸餾水、F-C試劑、碳酸鈉溶液，混勻，反應(yīng)，測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品至少做3次平行實(shí)驗(yàn)。四、數(shù)據(jù)處理與結(jié)果計(jì)算（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（C，單位：μg/mL）或每管中沒食子酸的質(zhì)量（m，單位：μg）為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的吸光度（A）為縱坐標(biāo)，在Excel或其他數(shù)據(jù)分析軟件中繪制散點(diǎn)圖，并進(jìn)行線性回歸擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=a×C+b（或A=a×m+b），其中a為斜率，b為截距。記錄相關(guān)系數(shù)R2，R2應(yīng)大于0.99，以保證方法的線性關(guān)系良好。（二）樣品中總多酚含量計(jì)算1.計(jì)算樣品測(cè)定液中多酚濃度：根據(jù)樣品溶液測(cè)得的吸光度（A樣），扣除樣品空白的吸光度（A樣空，若有），得到凈吸光度A凈=A樣-A樣空。將A凈代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出樣品測(cè)定液中多酚的濃度C樣（μg/mL）或質(zhì)量m樣（μg）。2.計(jì)算樣品中總多酚含量：總多酚含量（以沒食子酸當(dāng)量計(jì)，GAE）通常有兩種表示方式：*若以質(zhì)量百分比（%，w/w）表示：\[總多酚含量(\%)=\frac{C_{樣}\timesV_{總}\timesD}{m_{樣品}\times10^6}\times100\%\]其中：\(C_{樣}\)：由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的樣品測(cè)定液中多酚濃度（μg/mL）；\(V_{總}\)：樣品反應(yīng)液的總體積（mL）；\(D\)：樣品的總稀釋倍數(shù)（無量綱）；\(m_{樣品}\)：稱取的樣品質(zhì)量（g）；\(10^6\)：將μg轉(zhuǎn)換為g的換算系數(shù)。*若以每克樣品中含有的多酚毫克數(shù)（mgGAE/g）表示：\[總多酚含量(mg\GAE/g)=\frac{C_{樣}\timesV_{總}\timesD}{m_{樣品}\times1000}\]其中：\(1000\)：將μg轉(zhuǎn)換為mg的換算系數(shù)。（若標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)為m樣，則公式需相應(yīng)調(diào)整，核心是計(jì)算出測(cè)定液中多酚的總量，再反推至原始樣品中的含量。）3.結(jié)果表示：計(jì)算所有平行樣品的測(cè)定結(jié)果的平均值（\(\bar{X}\)）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%），并以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”的形式表示樣品中總多酚的含量。五、注意事項(xiàng)1.試劑配制：*F-C試劑具有強(qiáng)酸性，需小心操作，避免接觸皮膚和衣物。其稀釋倍數(shù)和使用量需嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行，這是影響測(cè)定靈敏度的關(guān)鍵因素之一。*碳酸鈉溶液易吸收空氣中的二氧化碳而變質(zhì)，建議現(xiàn)用現(xiàn)配，或配制后密封冷藏，并在短期內(nèi)使用。2.反應(yīng)條件控制：*反應(yīng)時(shí)間和溫度：是影響顯色強(qiáng)度的重要因素。應(yīng)嚴(yán)格控制所有反應(yīng)管（標(biāo)準(zhǔn)品和樣品）在相同溫度下反應(yīng)相同的時(shí)間，建議使用恒溫水浴并避光。*混勻：每一步試劑加入后都應(yīng)充分混勻，以保證反應(yīng)均勻完全。3.樣品處理：*樣品提取應(yīng)盡可能完全，提取溶劑的選擇、提取時(shí)間、溫度等都會(huì)影響多酚的提取效率。*樣品溶液的濃度應(yīng)適當(dāng)，使其吸光度落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。若吸光度過高或過低，應(yīng)調(diào)整稀釋倍數(shù)重新測(cè)定。*若樣品中含有較多蛋白質(zhì)、還原性糖、維生素C等還原性物質(zhì)，可能會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生正干擾，需考慮采用適當(dāng)方法去除干擾。4.儀器校準(zhǔn)：分光光度計(jì)應(yīng)定期進(jìn)行校準(zhǔn)，確保波長(zhǎng)準(zhǔn)確性和吸光度精度。比色皿應(yīng)潔凈，使用時(shí)避免觸摸光程面。5.平行實(shí)驗(yàn)與空白實(shí)驗(yàn)：每個(gè)樣品做至少3次平行，以減少偶然誤差。空白實(shí)驗(yàn)（包括試劑空白和樣品空白）對(duì)于消除試劑本身和樣品基質(zhì)中非多酚還原性物質(zhì)的干擾至關(guān)重要。6.標(biāo)準(zhǔn)品選擇：雖然沒食子酸是最常用的標(biāo)準(zhǔn)品，但不同的多酚標(biāo)準(zhǔn)品（如綠原酸、咖啡酸等）對(duì)結(jié)果的數(shù)值影響較大。因此，在報(bào)告結(jié)果時(shí)必須注明所使用的標(biāo)準(zhǔn)品種類，如“總多酚含量以沒食子酸當(dāng)量計(jì)（mgGAE/g）”。7.操作安全：實(shí)驗(yàn)過程中注意個(gè)人防護(hù)，穿戴實(shí)驗(yàn)服、手套、護(hù)目鏡。F-C試劑和碳酸鈉溶液具有腐蝕性，操作時(shí)需小心。六、方法特點(diǎn)與適用范圍FoLin-CiocaLteu法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、快速、成本較低、靈敏度較高，適用于各類植物提取物、果蔬汁、茶葉、酒類、蜂蜜、中藥材等樣品中總多酚含量的快速篩查和測(cè)定。然而，該方法并非多酚類物質(zhì)的特異性方法，任何具有還原性的物質(zhì)都可能與之反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)果偏高。因此，在結(jié)果解釋時(shí)需考慮到方法的這一特性，并結(jié)合樣品基質(zhì)特點(diǎn)進(jìn)行綜合判斷。對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)樣品，若需更準(zhǔn)確的多酚含量，可