規(guī)?；i場口蹄疫防控技術(shù)規(guī)范2015-02-19實施2015-02-19實施新疆維吾爾自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心提出。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆維吾爾自治區(qū)畜牧廳歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心、重慶市動物疫病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：李愛巧、蔡擴軍、陳發(fā)喜、吳星星、何生、王六合、范玉娟、楊小亮、王璐、王濤(女)、王濤(男)、郭亞軍、胡德江、左勇、楊啟元、李建玲、慶永興、周棕長、陳彪、王文秀、張婕、楊澤林、熊忠良。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB16548病害動物和病害動物產(chǎn)品GB/T17824.2規(guī)模豬場生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程GB/T18935口蹄疫診斷技術(shù)《中華人民共和國動物防疫法》《重大動物疫情應(yīng)急條例》農(nóng)業(yè)部《口蹄疫防治技術(shù)規(guī)范》具有一定規(guī)模、自繁自養(yǎng)存欄基礎(chǔ)母豬100頭以上，或單純從事育肥豬飼養(yǎng)年出欄商品豬2000頭用同一生產(chǎn)種子批和同一原料，在同一條件下生產(chǎn)的具有相同代碼、組成均一的全部2標(biāo)簽上標(biāo)定的疫苗對特定年齡家畜經(jīng)特定免疫途徑一次接種的用量。按生產(chǎn)商建議的方法使用疫苗后，在一定時間內(nèi)動物機體所產(chǎn)生的特異性免疫保護能力。根據(jù)各種疫(菌)苗的免疫特性及養(yǎng)殖場環(huán)境狀況和當(dāng)?shù)貏游锪餍胁W(xué)特點來合理地制訂預(yù)防接種通過使用各種獸用生物制品，使動物個體和群體獲得對疫病的特異性免疫力。利用高溫、好氧或厭氧等技術(shù)殺滅豬體或糞便中病原菌、寄生蟲的過程。4,1豬場應(yīng)距離居民區(qū)1000m以上，距離其他飼養(yǎng)場1500m以上，距離屠宰場廠或肉品加工廠2000m以上，距離主要交通干線500m以上。最好有4.3場內(nèi)布局符合動物防疫要求，設(shè)置有生活區(qū)、生產(chǎn)區(qū)，生活區(qū)內(nèi)設(shè)置辦公室、宿舍、食堂、洗浴4.4凈道和污道分開，不相互交叉。4.5具備完善的采光、通風(fēng)、保溫、防暑、隔熱、防蚊蠅、防老鼠設(shè)施，配置與豬場規(guī)模相配套、相4.6豬場的裝豬臺應(yīng)設(shè)在生產(chǎn)區(qū)邊，有專用出口。4.7配備疫苗冷凍(冷藏)、消毒和診療等設(shè)備的獸醫(yī)室或診療室。4.8建有隔離舍和患病動物隔離觀察室，隔離舍與原有豬群的距離不小于100m。4.9豬場的其他建設(shè)要求應(yīng)符合GB/T17824.1;生產(chǎn)技術(shù)要求應(yīng)符合GB/T17824.2;環(huán)境管5.1.1堅持自繁自養(yǎng)的原則，每圈(舍)實行全進全出制度，出欄后，豬舍要嚴(yán)格進行清掃、沖洗和消毒，并空圈14d以上。5.1.2保持圈舍衛(wèi)生，料糟、水槽用具干凈，地面清潔。經(jīng)常檢查飲水設(shè)備，觀察豬只健康狀態(tài)。5.1.3飼料要滿足豬只的營養(yǎng)需要，防止飼料污染腐敗，禁止飼喂泔水。更換飼料時每天以新料換舊料的1/4量，逐步過渡和讓豬適應(yīng)，用7d時間全部換完。5.2.2豬場應(yīng)有專業(yè)獸醫(yī)人員。有條件的場應(yīng)開展主要傳染病及免疫監(jiān)測工作。5.2.3建立完整的養(yǎng)殖和防疫檔案，包括免疫記錄、投入品使用記錄、疫病診療和衛(wèi)生消毒記錄、免疫抗體監(jiān)測和用藥記錄，并整理歸檔，檔案保存5年以上。5.2.4場外人員及車輛不得隨意進入生產(chǎn)區(qū)。不準(zhǔn)帶可能染疫的畜產(chǎn)品和其他物品進場。工作人員進5.2.5場區(qū)內(nèi)不能飼養(yǎng)其它動物，不能開展對外診療和配種工作，已出場豬不準(zhǔn)運回場區(qū)。發(fā)現(xiàn)病豬5.2.8出場豬應(yīng)出具經(jīng)縣級以上動物衛(wèi)生監(jiān)督機構(gòu)出具的檢疫證明。種豬還應(yīng)包括免疫證噴霧帶豬消毒可選用季銨鹽類消毒藥，洗手可使用碘豬場門口及生產(chǎn)區(qū)的門口要設(shè)置與大門等寬的消毒池，消毒池的長度4m,深度0,3m,內(nèi)置消毒液 (用3%的火堿溶液；每7d更換一次，下大雨后立即更換或添加適當(dāng)?shù)南舅?，保持消毒液有?;豬舍門口要設(shè)置寬1m,長0.5m,深0.2m的消毒池，或設(shè)置消毒盆、消毒墊，內(nèi)置消毒液，并按消毒液的豬場門口及生產(chǎn)區(qū)的門口要設(shè)消毒室，內(nèi)設(shè)消毒墊、紫外線燈、更衣間、淋浴間和洗手池等。4消毒前必須清除污物、糞便、飼料、墊料等減弱消毒作用的有機物；備置噴霧器或火焰噴射槍或消毒車輛、消毒防護器械(如口罩、手套、防護靴等)、消毒液容器。5.3.5消毒方法對金屬設(shè)施設(shè)備可采取火焰、噴灑、熏蒸方式消毒；豬舍、場地、車輛可采用消毒液清洗、噴灑方式消毒；飼養(yǎng)管理人員可采取淋浴、消毒液洗手方法消毒；衣、帽、鞋可能被污染的物品可采取消毒液浸泡或高壓滅菌方式消毒；辦公室、宿舍、公共食堂及豬舍帶畜消毒，可采用低毒、無刺激的消毒藥品噴霧消毒。5.3.6日常消毒頻率辦公場地每月消毒2次，生產(chǎn)場地每周消毒1次，畜舍每周消毒2次。疫病流行期間，應(yīng)增加消毒次數(shù)。5.3.7空置豬舍消毒豬只周轉(zhuǎn)后空置的豬舍、豬圈應(yīng)及時進行清掃、清洗、消毒。消毒需進行3次，前2次用不同的消毒藥進行噴霧消毒，空豬舍最后一次進行薰蒸消毒(將全部門窗關(guān)閉，用高錳酸鉀+福爾馬林或百毒殺加熱薰蒸2d,打開門窗敞4d),空豬圈最后一次用3%的火堿溶液進行噴灑消毒。5.3.8消毒記錄消毒記錄應(yīng)包括消毒日期、消毒場所、消毒劑名稱、消毒濃度、消毒方法、消毒人員簽字等內(nèi)容，要求保存2年以上。5.4廢棄物處理5.4,1豬場的污染飼料、墊料、糞便等進行堆積發(fā)酵21d,污水、污物、糞便等的處理要符合GB185965.4.2患傳染病死亡的畜體及其產(chǎn)品的處理應(yīng)符合GB16548的要求。5.4.3非傳染病死亡的豬只，要在無害化處理區(qū)進行深埋，坑的深度不應(yīng)小于2m,蓋土厚度不應(yīng)小于6免疫接種6.1接種豬的要求接種豬臨床表現(xiàn)健康，病、弱、孕豬暫不適合接種，但要及時補免。6.2疫苗要求6.2.1疫苗的選用選用目前國內(nèi)取得批準(zhǔn)文號的○型豬口蹄疫疫苗。一般一個區(qū)縣使用的疫苗盡量是一個生產(chǎn)廠家的疫苗，一次性免疫的疫苗最好用同一批次的疫苗。非免疫無規(guī)定動物疫病區(qū)則不進行免疫接種。6.2.2疫苗的貯存和運輸疫苗在2℃~8℃條件下避光貯存運輸，驗收合格的疫苗，應(yīng)迅速轉(zhuǎn)到規(guī)定的儲存環(huán)境中儲存。規(guī)模豬場配備不少于一臺專用冰箱和一個便攜式保溫箱或冷藏箱(包),專人進行管理和維護，并擱架不得放置疫苗，疫苗與箱壁、疫苗之間應(yīng)留有1cm~2cm的空隙，防止結(jié)冰影響疫苗質(zhì)量。淀物和顏色改變等變質(zhì)現(xiàn)象禁止使用。疫苗使用前，應(yīng)恢復(fù)室溫，使用時充分搖勻，使用過程中應(yīng)保持勻質(zhì)。疫苗啟封后，應(yīng)于24h內(nèi)用免疫器具使用前后和注射部位應(yīng)嚴(yán)格消毒，注射疫苗時1豬1個針頭，防止交叉感染。針頭大小以注射到肌肉為宜。在單獨注射豬口蹄疫時，在豬耳根后肌肉內(nèi)注射。在進行口蹄疫、豬瘟、高致病性豬藍耳病疫苗3針同時分點注射時，口蹄疫和豬瘟在豬兩側(cè)頸中部、高致病性豬藍耳病疫苗在臀部同時注射。操作人員應(yīng)按照疫苗使用說明書規(guī)定的方法進行操作使用。接種前、后3d內(nèi)不使用任何抗微生物藥和消毒藥。每次吸疫苗時必須輕輕搖均。注射疫苗時，不能漏打，不能打飛針，先進針，然后再推藥。接種疫苗的全過程樹立無6.4.2商品豬(仔豬和育肥豬)28日齡～35日齡首免口蹄疫，58日齡～65日齡(既首免后30d二免)強化免疫口蹄疫；或者免疫口蹄疫時與豬瘟、高致病性豬藍耳病同時3針分點注射。70日齡前的口蹄疫免疫程序同商品豬。配種前10d(或強化免疫后每4個月)再免口蹄疫疫苗，可同時免疫豬瘟和高致病性豬藍耳病疫苗。以后每隔4月～6月再強化免疫一次口蹄疫疫苗。670日齡前的免疫程序同商品豬，以后每隔4月～6月免疫一次口蹄疫疫苗。發(fā)生口蹄疫疫情時，要對疫區(qū)、受威脅區(qū)域的易感豬進行一次強化免疫，最近1個月內(nèi)已免疫口蹄疫的和在免疫期內(nèi)口蹄疫群體免疫抗體合格率達到70%的豬可以不強化免疫。6.5.1免疫標(biāo)識的佩戴免疫豬應(yīng)加施免疫標(biāo)識(如佩戴二維碼),并按照農(nóng)業(yè)部的要求在專門的數(shù)據(jù)中心內(nèi)錄入免疫和耳使用過的注射器具進行消毒，使用過的疫苗瓶免疫接種后，注意觀察豬的反應(yīng)。如豬出現(xiàn)體溫升高、發(fā)抖、嘔吐和減食等癥狀，一般1d～2d后可自行恢復(fù)；如有呼吸困難、震顫、驚厥抽搐、畜體僵直、可肌肉注射0.1%腎上腺素注射液0.2mL～1mL用以消除過敏性休克或肌肉內(nèi)注射地塞米松磷酸鈉5mg～10mg(懷孕豬不用)。疫苗反應(yīng)的解決措施應(yīng)符合NY/T1955的要求。豬場獸醫(yī)和飼養(yǎng)人員進行巡查制度，每天觀察豬的精神狀態(tài)、飲食、被毛、呼出物口蹄疫免疫28d后采集樣品檢測1次；對新購進的豬在并圈前，進行抽樣檢測。每次采樣比例1%~5%,單次不少于20頭份，每份血液樣品量為5mL。7.1.3.2樣品的采集、保存和運送樣品的采集、保存和運送按照附錄A的規(guī)定進行。滅活類疫苗采用液相阻斷一酶聯(lián)免疫吸附試驗(LpB-ELISA)(見附錄B)或正向間接血凝試驗(IHA)口蹄疫合成肽疫苗采用VP1結(jié)構(gòu)蛋白ELISA(見附錄D)。病毒中和試驗按照GB/T18935的要求操作。微量補體結(jié)合試驗按照GB/T18935的要求操作。0型口蹄疫滅活類疫苗抗體正向間接血凝試驗的抗體效價≥2?判定為合格。液相阻斷ELISA的抗體效價≥2?判定其他應(yīng)符合NY/T1955的要求。群體免疫抗體合格率達到70%為群體免疫合格。整個豬場每季度采樣檢測1次，單次至少20頭份。樣品的采集、保存和運送按照附錄A的規(guī)定進行。非結(jié)構(gòu)蛋白間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(見附錄F)口蹄疫病毒實施熒光RT-PCR檢測方法按照GB/T27528操作。間接夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗按照GB/T18935操作。反向間接血凝試驗(RIHA)按照GB/T18935操作。病毒分離鑒定按照GB/T18935操作。8符合該病的流行病學(xué)特點和臨床診斷或病理診斷指標(biāo)之一，可判定為疑似口蹄疫病例。7.2.2確診口蹄疫病例疑似口蹄疫病例，除非結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA檢測方法以外的其他病原學(xué)檢測方法任何一項陽性，可判定為確診口蹄疫病例；疑似口蹄疫病例，在未免疫家畜血清用非結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA檢測方法檢測抗體陽性的或免疫家畜非結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA檢測方法陽性的，至少用一種7.1.4.3中的其他病原學(xué)檢測方法檢測，檢測陽性的可判定為確診口蹄疫病例。7,3監(jiān)測結(jié)果處理7.3.1當(dāng)任何單位和個人發(fā)現(xiàn)豬臥地不起，唇部、蹄踵、蹄叉等部位出現(xiàn)水泡等臨床癥狀疑似病例的，要立即報告當(dāng)?shù)乜h級政府獸醫(yī)主管部門、動物疫病預(yù)防控制機構(gòu)或動物衛(wèi)生監(jiān)督機構(gòu)。7.3.2當(dāng)實驗室病原學(xué)檢測出現(xiàn)陽性時，按照《中華人民共和國動物防疫法》、《重大動物疫情應(yīng)急條例》、《口蹄疫防治技術(shù)規(guī)范》等國家規(guī)定進行疫情報告和疫情處置。7.3.3當(dāng)血清學(xué)監(jiān)測口蹄疫群體免疫抗體合格率達到70%為群體免疫合格；達不到70%時要分析和查找原因，進行加強免疫。7.3.4結(jié)合相關(guān)信息對每次監(jiān)測結(jié)果進行風(fēng)險分析，做好口蹄疫疫情預(yù)警預(yù)報。DB65/T3704—2015(規(guī)范性附錄)口蹄疫病料的采集、保存與運送采集、保存和運輸樣品須符合下列要求，并填寫樣品采集登記表。A.1樣品的采集和保存A.1.1組織樣品A.1.1.1樣品的選擇用于病毒分離、鑒定的樣品，以發(fā)病豬未破裂的舌面或蹄部、鼻鏡等部位的水泡皮和水泡液最好。對臨床健康但懷疑帶毒的豬可在撲殺后采集淋巴結(jié)、脊髓、肌肉等組織樣品作為檢測材料。A.1.1.2樣品的采集和保存水泡樣品采集部位可用清水清洗，切忌使用酒精、碘酒等消毒劑消毒、擦拭。A.1.1.2.1未破裂水泡中的水泡液用滅菌注射器采集至少1mL,裝入滅菌小瓶中(可加適量抗菌素),加蓋密封；盡快冷凍保存。A.1.1.2.2剪取新鮮水泡皮3g~5g放入滅菌小瓶中，加適量(2倍體積)50%甘油/磷酸鹽緩沖液(pH7.4),加蓋密封；盡快冷凍保存。A.1.1.2.3在無法采集水泡皮和水泡液時，可采集淋巴結(jié)、脊髓、肌肉等組織樣品3g～5g裝入潔凈的小瓶內(nèi)，加蓋密封；盡快冷凍保存。每份樣品的包裝瓶上均要貼上標(biāo)簽，寫明采樣地點、編號、時間等。懷疑曾有疫情發(fā)生的豬群，錯過組織樣品采集時機時，可無菌操作采集動物血液，每頭不少于10mL。自然凝固后無菌分離血清裝入滅菌小瓶中，可加適量抗菌素，加蓋密封后冷藏保存。每瓶貝占標(biāo)簽并寫明樣品編號，采集地點、時間等。通過抗體檢測，做出追溯性診斷。A.1.3采集樣品采集樣品時要填寫樣品采樣登記表。A.2樣品運送運送前將樣品進行封裝和貼上標(biāo)簽，已預(yù)冷或冰凍的樣品玻璃容器裝入金屬套筒中，套筒應(yīng)填充防震材料，加蓋密封，與采樣記錄一同裝入專用運輸容器中。專用運輸容器應(yīng)隔熱堅固，內(nèi)裝適當(dāng)冷凍劑和防震材料。外包裝上要加貼生物安全警示標(biāo)志。以最快方式，運送到檢測單位。為了能及時準(zhǔn)確地告知檢測結(jié)果，請寫明送樣單位名稱和聯(lián)系人姓名、聯(lián)系地址、郵編、電話、傳真。送檢材料必須附有詳細說明，包括采樣時間、地點、動物種類、樣品名稱、數(shù)量、保存方式及有關(guān)疫病發(fā)生流行情況、臨床癥狀。(規(guī)范性附錄)B.1材料釋劑后，滴定曲線上線大約1.5,稀釋劑為含0.05%吐溫-20,酚紅指示劑的PBS(PBST)。B.2試驗程序1表B.196孔酶標(biāo)板檢測10份樣品布局1ABCDEFGABCDEFG抗原對照抗原對照抗原對照抗原對照ADE表B.296孔酶標(biāo)板檢測20份樣品布局抗原對照抗原對照抗原對照抗原對照表B.396孔酶標(biāo)板檢測41份樣品布局ABCDEFGH抗原對照抗原對照抗原對照抗原對照B.2.9洗板：同B.2.3。B.2.10加底物：每孔加50μL底物溶液(含0.05%H?O?<3%質(zhì)量濃度>的鄰苯二胺OPD),37℃孵育15B.2.11加終止液：每孔加50μL終止液(H?SO?)。B.2.12酶標(biāo)儀讀數(shù)：15min內(nèi)，將ELISA板置于酶標(biāo)儀上，在492nm波長條件下讀取吸光值。B.3.1試驗成立條件：a)病毒抗原對照平均OD?nm值在1.0～2.0范圍內(nèi)；b)陽性對照血清抗體效價在1:1024±1滴度以內(nèi)；c)陰性對照血清抗體效價<1:8;試驗結(jié)果同時符合上述條件，試驗有效。病毒抗原對照平均OD?92nm值50%計算?？乖瓕φ帐?孔，棄去最高和最低OD492nm值，計算剩余2孔的平均OD?92nm值，再除以2,即50%對照值。該值即為臨界值，表示阻斷50%反應(yīng)的對照OD?92值。a)定量監(jiān)測中：被檢血清稀釋孔ODgnm值大于臨界值的孔為陰性孔，小于或等于臨界值的孔為陽性孔，陽性孔的0D?gnm值等于臨界值時所對應(yīng)的稀釋度為該份血清的抗體滴度。例如病毒抗原對照平均OD?anm值為1.2,則其50%為0.6。某一待檢血清在1:128時0Dagnm值為0.6,則該份待檢血清的抗體滴度為1:128。若臨界值處于兩個滴度之間，如處于1:64與1:128之間，則抗體滴度取中間值為1:90;b)定性檢測中，兩個重復(fù)孔只要有一孔為陽性孔，則抗體滴度判定為1:64,兩孔均為陽性孔，則判定為抗體滴度>1:64;c)ELISA抗體效價≥1:64,口蹄疫免疫抗體合格。(規(guī)范性附錄)不見。若將抗原吸附(致敏)在經(jīng)過特殊處理的紅細胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗體的C.3.8待檢血清(每頭約0.5mL血清即可)56℃水浴滅活30min。取1號待檢血清50μL加入第1排第1孔，與稀釋液混勻(避免產(chǎn)生過多的氣泡),從該孔吸取50μLDB65/T3704—2015在血凝板的第7排第1孔加陽性血清50μL,2倍系列稀釋至第10孔，混勻后從該孔取出50μL丟棄。C.4.4稀釋陰性對照血清在血凝板的第8排第1孔加陰性血清50μL,2倍系列稀釋至第4孔，混勻后從該孔取出50μL丟棄。此C.4.5加血凝抗原被檢血清各孔、陰性對照血清各孔、陽性對照血清各孔、稀釋液對照孔均各加○型血凝抗原(充分搖勻，瓶底應(yīng)無血球沉淀)25μL/孔。C.4.6振蕩混勻?qū)⒀逯糜谖⒘空袷幤魃?～3min,如無振蕩器，用手依次四邊輕拍混勻亦可，然后將血凝板放在白紙上觀察各孔紅血球是否混勻，不出現(xiàn)血球沉淀為合格。蓋上玻板，室溫下靜置2h～3h判定結(jié)果，也可延至翌日判定。C.4.7判定標(biāo)準(zhǔn)試驗成立條件：a)移去玻板，將血凝板放在白紙上，先觀察陰性對照血清1:16孔，稀釋液對照孔，均應(yīng)無凝集 (血球全部沉入孔底形成邊緣整齊的小圓點),或僅出現(xiàn)“+”凝集(血球大部沉于孔底，邊緣稍有少量血球懸浮),即陰性血清抗體效價≤1:16,稀釋液對照孔無自凝現(xiàn)象；b)陽性血清對照1:2～1:256各孔應(yīng)出現(xiàn)“++”～“+++”凝集為合格(少量血球沉入孔底，大部血球懸浮于孔內(nèi));,即陽性血清抗體效價≥1:256;試驗結(jié)果同時符合上述條件，試驗有效。結(jié)果判定：在對照孔合格的前提下，再觀察待檢血清各孔，以呈現(xiàn)“++”凝集的最大稀釋倍數(shù)為該份血清的抗體效價。例如1號待檢血清1-5孔呈現(xiàn)“++”～“+++”凝集，6～7孔呈現(xiàn)“++”凝集，第8孔呈現(xiàn)“+”凝集，第9孔無凝集，那么就可判定該份血清的口蹄疫抗體效價為1:128。接種口蹄疫疫苗的豬群免疫抗體效價達到1:32(即第5孔呈現(xiàn)“++”凝集)為免疫合格。C.5檢測試劑的性狀、規(guī)格C.5.1性狀C.5.1.1血凝抗原：搖勻呈棕紅色(或咖啡色),靜置后，血球逐漸沉入瓶底。C.5.1.2陰性對照血清：淡黃色清亮稍帶粘性的液體。C.5.1.3陽性對照血清：微紅或淡黃色稍混濁帶粘性的液體。C.5.1.4稀釋液：淡黃或無色透明液體，低溫下放置，瓶底易析出少量結(jié)晶，在水浴中加溫后即可全溶，不影響使用。C.6注意事項C.6.1為使檢測獲得正確結(jié)果，請在檢測前仔細閱讀說明書。C.6.2嚴(yán)重溶血或嚴(yán)重污染的血清樣品不宜檢測，以免發(fā)生非特異性反應(yīng)。C.6.3勿用90°和130°血凝板，嚴(yán)禁使用1次性血凝板，以免誤判結(jié)果。C.6.4用過的血凝板應(yīng)及時在水龍頭沖凈血球。再用蒸餾水或去離子水沖洗2次，甩干水份放37℃恒溫箱內(nèi)干燥備用。檢測用具應(yīng)煮沸消毒，37℃干燥備用。血凝板應(yīng)浸泡在洗液中，也可浸泡在5%鹽酸液內(nèi)，48h撈出后清水沖凈。C.6.5每次檢測只做一份陰性、陽性和稀釋液對照?！?”表示完全不凝集或0%～10%血球凝集?！?”表示10%～25%血球凝集；“++”表示50%血球凝集；“+++”表示75%血球凝集；“+++”表示90%～100%血球凝集。C.6.6用不同批次的血凝抗原檢測同一份血清時，應(yīng)事先用陽性血清準(zhǔn)確測定各批次血凝抗原的效價，取抗原效價相同或相近的血凝抗原檢測待檢血清抗體水平的結(jié)果是基本一致的，如果血凝抗原效價差別很大用來檢測同一血清樣品，肯定會出現(xiàn)檢測結(jié)果不一致。C.6.7收到本試劑盒時，應(yīng)立即打開包裝，取出血凝抗原瓶，用力搖動，使粘附在瓶蓋上的紅細胞搖下，否則易出現(xiàn)沉渣，影響使用效果。(規(guī)范性附錄)豬口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白(VP1)抗體ELISA試驗波長下測定吸光度(OD值),與CUTOFF值相比較，從而判定標(biāo)本中豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體 劑盒聯(lián)合使用，可區(qū)分口蹄疫0型病毒感染動物及疫苗免疫動物。D.3.2微量可調(diào)移液器(單道、12道),取液塑咀D.3.50型口蹄疫陰性對照血清、0型口蹄疫陽性對照血清D.4試驗方法或封膜后，置(37±2)℃下孵育(60±5)min。D.4.9每孔加入100μL酶結(jié)合物工作液，加蓋或封膜后，置(37±2)℃下孵育(30±2)min。D.4.12每孔加入100μLTMB底物工作液，加蓋或封膜后，置(37±2)℃下孵育(15±1)min。D.5.2S/P值的計算：S/P值=(樣品OD值-陰性對照血清平均OD值)/(陽性對照血清平均OD值-陰性對D.5.3.2被檢樣品孔S/P值<0.3時，判為陰性，即為抗口蹄疫病毒0型VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體陰性。D.5.3.4當(dāng)豬口蹄疫病毒0型VP1結(jié)構(gòu)蛋白ELISA抗體檢測試劑盒與豬口蹄疫病毒O型非結(jié)構(gòu)蛋白ELIS++正常動物組織樣品分組合成大樣，用組織搗碎機磨碎。然后加0.04mol/LPBS(pH7.4)制成1:5懸液。置室溫20E.1.2試劑b)2mol/L乙酸鈉(pH4.0);脫氧三磷酸鳥苷dGTP各1支。用DEPC-ddH?0配制成2.5mmol/L,dNTP,方法是4種脫氧核苷統(tǒng)(或紫外透射儀);可調(diào)移液器一套，包括1uL～20μL2支，20uL～200μL1支，200μL～1000μL1支；與移液器匹配的滴頭；1.5mL帶蓋塑料離心管(Eppendorf管);0.5mL或0.2mL(與擴增儀配套)帶蓋塑料管。E.1.4電泳緩沖液E.1.4.15×TBE級沖液三羥甲基氨基甲烷(Tris)硼酸0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)加雙蒸水(ddH?O)至1000.0mL。臨用時將5×TBE緩沖液1份加蒸餾水4份，混勻即可。E.1.4.3電泳加樣緩沖液澳酚藍0.25g甘油30.0mL雙蒸水70.0mLE.2操作程序E.2.1.1用1.5mL帶蓋塑料離心管。取300μL待檢樣品，再加300μL變性液混勻，冰水浴5min。E.2.1.2加60μL2mol/L乙酸鈉(pH4.0),混勻。E.2.1.3加800μL酚-三氯甲烷-異戊醇混和液，混勻，冰水浴5min。E.2.1.48000r/min離心