體外長期培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞不同時相生物學特性的動態(tài)解析與臨床關聯(lián)探究一、引言1.1研究背景與意義在生命科學領域，干細胞研究始終占據(jù)著前沿且關鍵的位置，其為眾多難治性疾病的攻克以及組織器官的再生修復帶來了前所未有的希望。人骨髓間充質干細胞（humanbonemarrowmesenchymalstemcells，hBMSCs）作為成體干細胞的重要成員，因具有自我更新、多向分化潛能、免疫調節(jié)以及低免疫原性等一系列卓越特性，在再生醫(yī)學中扮演著無可替代的關鍵角色，成為了科研工作者們深入探索的焦點。hBMSCs能夠在特定的誘導條件下，精準地分化為多種細胞類型，如骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞以及神經細胞等。這一特性使其在骨缺損修復、軟骨損傷治療、心肌梗死救治、神經系統(tǒng)疾病干預等多個醫(yī)學領域展現(xiàn)出了巨大的應用潛力。在骨組織工程中，hBMSCs可以被誘導分化為成骨細胞，進而與合適的支架材料相結合，構建出具有生物活性的組織工程骨，為解決臨床上廣泛存在的骨缺損問題提供了創(chuàng)新性的治療策略。在神經系統(tǒng)疾病的治療探索中，hBMSCs能夠分化為神經細胞，同時釋放多種神經營養(yǎng)因子，促進神經細胞的生長、存活和功能修復，為帕金森病、阿爾茨海默病等神經退行性疾病的治療帶來了新的曙光。然而，要將hBMSCs成功地應用于臨床治療，首要的前提是能夠在體外獲得足夠數(shù)量且保持良好生物學特性的細胞。體外長期培養(yǎng)技術應運而生，成為了獲取大量hBMSCs的關鍵手段。通過精心調控體外培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基的成分優(yōu)化、生長因子的合理添加、培養(yǎng)環(huán)境的精確控制等，可以實現(xiàn)hBMSCs的高效擴增，滿足臨床治療對細胞數(shù)量的需求。體外長期培養(yǎng)對于深入研究hBMSCs的生物學特性同樣具有不可估量的價值。在長期培養(yǎng)的過程中，hBMSCs會經歷一系列復雜的生物學變化，包括細胞的增殖、分化、衰老以及基因表達和信號通路的動態(tài)調控等。深入探究這些變化規(guī)律，有助于我們從分子和細胞層面全面揭示hBMSCs的生物學特性和功能機制，為其在再生醫(yī)學中的安全、有效應用提供堅實的理論基礎。盡管體外長期培養(yǎng)hBMSCs具有重要的意義和廣闊的應用前景，但目前該領域仍面臨著諸多亟待解決的挑戰(zhàn)和問題。隨著培養(yǎng)時間的不斷延長和傳代次數(shù)的逐漸增加，hBMSCs不可避免地會出現(xiàn)生物學特性改變的現(xiàn)象，如細胞增殖能力的下降、分化潛能的減弱、衰老進程的加速以及基因穩(wěn)定性的降低等。這些變化不僅嚴重影響了hBMSCs的質量和安全性，也給其臨床應用帶來了潛在的風險和不確定性。此外，目前對于體外長期培養(yǎng)hBMSCs的最佳培養(yǎng)條件和培養(yǎng)體系，科學界尚未達成一致的共識，不同的實驗室和研究團隊所采用的培養(yǎng)方法和條件存在較大的差異，這在一定程度上導致了實驗結果的不可重復性和可比性，阻礙了該領域研究的快速發(fā)展和臨床轉化進程。為了有效解決上述問題，深入系統(tǒng)地研究體外長期培養(yǎng)hBMSCs不同時相的生物學特性顯得尤為迫切和重要。通過對不同培養(yǎng)時間和傳代次數(shù)下hBMSCs的增殖能力、分化潛能、細胞周期分布、衰老程度、基因表達譜以及蛋白質組學等方面進行全面、深入的分析和研究，我們可以準確地揭示hBMSCs在體外長期培養(yǎng)過程中的生物學變化規(guī)律，明確影響其生物學特性的關鍵因素，從而為優(yōu)化體外培養(yǎng)條件、建立標準化的培養(yǎng)體系提供科學、可靠的依據(jù)。這不僅有助于提高hBMSCs的質量和穩(wěn)定性，保障其臨床應用的安全性和有效性，還將進一步推動hBMSCs在再生醫(yī)學領域的廣泛應用和深入發(fā)展，為眾多患者帶來更多的治療希望和福祉。1.2國內外研究現(xiàn)狀在人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）的研究領域，國內外學者圍繞其體外培養(yǎng)及生物學特性展開了廣泛而深入的探索，取得了一系列具有重要價值的研究成果。在體外培養(yǎng)技術方面，早期研究主要聚焦于hBMSCs的分離與培養(yǎng)方法的建立。密度梯度離心法與貼壁篩選法成為經典的分離手段，通過密度梯度離心，可依據(jù)骨髓細胞中各細胞成分密度的差異，有效分離出單核細胞層，為后續(xù)獲取hBMSCs奠定基礎；貼壁篩選法則利用hBMSCs貼壁生長的特性，將骨髓細胞接種在培養(yǎng)瓶中，經過多次換液去除非貼壁細胞，從而獲得純度較高的hBMSCs。此后，研究不斷優(yōu)化培養(yǎng)條件，對培養(yǎng)基的種類進行篩選和改良，如DMEM、α-MEM等培養(yǎng)基在添加適宜的生長因子和血清后，能夠顯著促進hBMSCs的生長和增殖；對培養(yǎng)溫度、CO?濃度等環(huán)境因素進行精確調控，37℃、5%CO?的孵育箱條件已成為hBMSCs培養(yǎng)的標準環(huán)境，確保細胞在最佳狀態(tài)下生長。在生物學特性研究方面，hBMSCs的多向分化潛能得到了充分的證實。眾多研究表明，在特定的誘導條件下，hBMSCs能夠成功分化為多種細胞類型。在骨分化研究中，添加地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C等誘導劑，可促使hBMSCs向成骨細胞分化，表現(xiàn)為堿性磷酸酶活性增強、骨鈣素合成增加以及礦化結節(jié)的形成；在軟骨分化研究中，利用轉化生長因子β（TGF-β）等細胞因子，可誘導hBMSCs分化為軟骨細胞，細胞外基質中檢測到Ⅱ型膠原的表達；在脂肪分化研究中，通過胰島素、地塞米松、吲哚美辛等誘導劑的作用，hBMSCs能夠分化為脂肪細胞，油紅O染色可觀察到細胞內脂滴的形成。在細胞增殖和衰老方面，國內外學者也進行了大量的研究。細胞增殖能力是評估hBMSCs質量的重要指標之一，研究發(fā)現(xiàn)，隨著傳代次數(shù)的增加，hBMSCs的增殖能力逐漸下降，細胞周期分布發(fā)生改變，S期細胞百分比減少，提示細胞增殖活性降低。與此同時，細胞衰老現(xiàn)象也逐漸顯現(xiàn)，β-半乳糖苷酶染色陽性細胞增多，衰老標記蛋白p21、p16、p53表達逐漸增加，表明hBMSCs在體外長期培養(yǎng)過程中會逐漸進入衰老狀態(tài)。盡管國內外在hBMSCs的體外培養(yǎng)及生物學特性研究方面取得了顯著進展，但仍存在一些不足之處。不同實驗室的培養(yǎng)方法和條件存在較大差異，這使得實驗結果的可比性和重復性受到影響，不利于研究成果的交流和推廣。對hBMSCs在體外長期培養(yǎng)過程中生物學特性改變的機制研究還不夠深入，如細胞衰老、分化潛能改變的分子機制尚未完全明確，限制了對hBMSCs質量控制和優(yōu)化培養(yǎng)條件的進一步探索。此外，hBMSCs在臨床應用中的安全性和有效性評估還需要更多大規(guī)模、多中心的臨床試驗來驗證，以確保其在再生醫(yī)學領域的廣泛應用。1.3研究目的與內容本研究旨在全面、系統(tǒng)且深入地剖析體外長期培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）在不同時相的生物學特性，揭示其在培養(yǎng)過程中的變化規(guī)律，為優(yōu)化體外培養(yǎng)條件、建立標準化培養(yǎng)體系提供堅實可靠的理論依據(jù)，從而推動hBMSCs在再生醫(yī)學領域的安全、有效應用。具體研究內容如下：hBMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定：采用密度梯度離心法與貼壁篩選法相結合的經典方法，從健康志愿者的骨髓樣本中分離hBMSCs。將骨髓樣本與Percoll分離液進行密度梯度離心，依據(jù)細胞密度差異，有效分離出單核細胞層，再利用hBMSCs貼壁生長的特性，通過多次換液去除非貼壁細胞，從而獲得純度較高的hBMSCs。將分離得到的hBMSCs接種于添加了10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的孵育箱中進行培養(yǎng)，定期換液和傳代，以維持細胞的生長和增殖。通過形態(tài)學觀察、流式細胞術檢測細胞表面標志物（如CD29、CD44、CD105等陽性，CD34、CD45等陰性）以及多向分化潛能鑒定（成骨、成脂、成軟骨誘導分化實驗）等多種手段，對分離培養(yǎng)的hBMSCs進行全面、準確的鑒定，確保所獲得的細胞為hBMSCs且具有良好的生物學特性。不同時相hBMSCs增殖能力的研究：選取不同傳代次數(shù)（如第3、5、7、9、11代）的hBMSCs，采用MTT法、CCK-8法等細胞增殖檢測方法，對細胞的增殖能力進行動態(tài)監(jiān)測。在不同的時間點（如培養(yǎng)后的1、3、5、7天），向培養(yǎng)體系中加入MTT試劑或CCK-8試劑，經過一定時間的孵育后，利用酶標儀檢測吸光度值，以此反映細胞的增殖活性。繪制細胞生長曲線，清晰直觀地展示不同時相hBMSCs的增殖趨勢，并精確計算細胞倍增時間，定量分析細胞的增殖速度，從而深入了解hBMSCs在體外長期培養(yǎng)過程中增殖能力的變化規(guī)律。不同時相hBMSCs分化潛能的研究：分別對不同傳代次數(shù)的hBMSCs進行成骨、成脂、成軟骨誘導分化實驗。在成骨誘導實驗中，向培養(yǎng)基中添加地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C等誘導劑，培養(yǎng)一定時間后，通過檢測堿性磷酸酶（ALP）活性、骨鈣素（OCN）表達水平以及礦化結節(jié)的形成情況，評估hBMSCs的成骨分化潛能；在成脂誘導實驗中，利用胰島素、地塞米松、吲哚美辛等誘導劑進行誘導，通過油紅O染色觀察細胞內脂滴的形成，判斷hBMSCs的成脂分化能力；在成軟骨誘導實驗中，添加轉化生長因子β（TGF-β）等細胞因子進行誘導，通過檢測細胞外基質中Ⅱ型膠原的表達，評估hBMSCs的成軟骨分化潛能。通過這些實驗，全面探究hBMSCs在不同時相的分化潛能變化，為其在組織工程和再生醫(yī)學中的應用提供關鍵的實驗數(shù)據(jù)。不同時相hBMSCs細胞周期和衰老的研究：運用流式細胞術，對不同傳代次數(shù)hBMSCs的細胞周期分布進行詳細分析。將細胞用胰酶消化后，收集細胞沉淀，用70%冷乙醇固定，加入RNA酶和碘化丙啶（PI）染液進行染色，然后通過流式細胞儀檢測，利用相關軟件分析細胞在G?/G?期、S期、G?/M期的分布比例，了解細胞增殖與靜止狀態(tài)的變化。采用β-半乳糖苷酶染色法和Westernblot檢測衰老標記蛋白（如p21、p16、p53）的表達水平，評估細胞的衰老程度。β-半乳糖苷酶染色陽性細胞增多以及衰老標記蛋白表達上調，均表明細胞衰老程度增加。通過這些研究，深入揭示hBMSCs在體外長期培養(yǎng)過程中細胞周期和衰老的變化機制。不同時相hBMSCs基因表達譜和蛋白質組學分析：借助高通量測序技術（如RNA-seq），對不同傳代次數(shù)的hBMSCs進行基因表達譜分析，全面篩選出差異表達基因，并運用生物信息學方法對這些基因進行功能注釋和富集分析，深入挖掘與細胞增殖、分化、衰老等生物學過程密切相關的關鍵基因和信號通路。同時，采用蛋白質組學技術（如iTRAQ、TMT等），對不同時相hBMSCs的蛋白質表達譜進行系統(tǒng)分析，鑒定出差異表達蛋白質，進一步明確其生物學功能和相互作用網(wǎng)絡。通過基因表達譜和蛋白質組學分析，從分子層面深入探究hBMSCs在體外長期培養(yǎng)過程中生物學特性改變的內在機制，為優(yōu)化培養(yǎng)條件和質量控制提供精準的分子靶點和理論指導。1.4研究方法與技術路線本研究將綜合運用細胞生物學、分子生物學等多學科的先進研究方法，深入探究體外長期培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）不同時相的生物學特性。具體研究方法如下：hBMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定：采用密度梯度離心法與貼壁篩選法相結合的經典方法，從健康志愿者的骨髓樣本中分離hBMSCs。將骨髓樣本與Percoll分離液進行密度梯度離心，依據(jù)細胞密度差異，有效分離出單核細胞層，再利用hBMSCs貼壁生長的特性，通過多次換液去除非貼壁細胞，從而獲得純度較高的hBMSCs。將分離得到的hBMSCs接種于添加了10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的孵育箱中進行培養(yǎng)，定期換液和傳代，以維持細胞的生長和增殖。通過形態(tài)學觀察、流式細胞術檢測細胞表面標志物（如CD29、CD44、CD105等陽性，CD34、CD45等陰性）以及多向分化潛能鑒定（成骨、成脂、成軟骨誘導分化實驗）等多種手段，對分離培養(yǎng)的hBMSCs進行全面、準確的鑒定，確保所獲得的細胞為hBMSCs且具有良好的生物學特性。不同時相hBMSCs增殖能力的研究：選取不同傳代次數(shù)（如第3、5、7、9、11代）的hBMSCs，采用MTT法、CCK-8法等細胞增殖檢測方法，對細胞的增殖能力進行動態(tài)監(jiān)測。在不同的時間點（如培養(yǎng)后的1、3、5、7天），向培養(yǎng)體系中加入MTT試劑或CCK-8試劑，經過一定時間的孵育后，利用酶標儀檢測吸光度值，以此反映細胞的增殖活性。繪制細胞生長曲線，清晰直觀地展示不同時相hBMSCs的增殖趨勢，并精確計算細胞倍增時間，定量分析細胞的增殖速度，從而深入了解hBMSCs在體外長期培養(yǎng)過程中增殖能力的變化規(guī)律。不同時相hBMSCs分化潛能的研究：分別對不同傳代次數(shù)的hBMSCs進行成骨、成脂、成軟骨誘導分化實驗。在成骨誘導實驗中，向培養(yǎng)基中添加地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C等誘導劑，培養(yǎng)一定時間后，通過檢測堿性磷酸酶（ALP）活性、骨鈣素（OCN）表達水平以及礦化結節(jié)的形成情況，評估hBMSCs的成骨分化潛能；在成脂誘導實驗中，利用胰島素、地塞米松、吲哚美辛等誘導劑進行誘導，通過油紅O染色觀察細胞內脂滴的形成，判斷hBMSCs的成脂分化能力；在成軟骨誘導實驗中，添加轉化生長因子β（TGF-β）等細胞因子進行誘導，通過檢測細胞外基質中Ⅱ型膠原的表達，評估hBMSCs的成軟骨分化潛能。通過這些實驗，全面探究hBMSCs在不同時相的分化潛能變化，為其在組織工程和再生醫(yī)學中的應用提供關鍵的實驗數(shù)據(jù)。不同時相hBMSCs細胞周期和衰老的研究：運用流式細胞術，對不同傳代次數(shù)hBMSCs的細胞周期分布進行詳細分析。將細胞用胰酶消化后，收集細胞沉淀，用70%冷乙醇固定，加入RNA酶和碘化丙啶（PI）染液進行染色，然后通過流式細胞儀檢測，利用相關軟件分析細胞在G?/G?期、S期、G?/M期的分布比例，了解細胞增殖與靜止狀態(tài)的變化。采用β-半乳糖苷酶染色法和Westernblot檢測衰老標記蛋白（如p21、p16、p53）的表達水平，評估細胞的衰老程度。β-半乳糖苷酶染色陽性細胞增多以及衰老標記蛋白表達上調，均表明細胞衰老程度增加。通過這些研究，深入揭示hBMSCs在體外長期培養(yǎng)過程中細胞周期和衰老的變化機制。不同時相hBMSCs基因表達譜和蛋白質組學分析：借助高通量測序技術（如RNA-seq），對不同傳代次數(shù)的hBMSCs進行基因表達譜分析，全面篩選出差異表達基因，并運用生物信息學方法對這些基因進行功能注釋和富集分析，深入挖掘與細胞增殖、分化、衰老等生物學過程密切相關的關鍵基因和信號通路。同時，采用蛋白質組學技術（如iTRAQ、TMT等），對不同時相hBMSCs的蛋白質表達譜進行系統(tǒng)分析，鑒定出差異表達蛋白質，進一步明確其生物學功能和相互作用網(wǎng)絡。通過基因表達譜和蛋白質組學分析，從分子層面深入探究hBMSCs在體外長期培養(yǎng)過程中生物學特性改變的內在機制，為優(yōu)化培養(yǎng)條件和質量控制提供精準的分子靶點和理論指導。本研究的技術路線圖如圖1-1所示：首先從健康志愿者骨髓中分離hBMSCs，進行培養(yǎng)與鑒定；隨后對不同傳代次數(shù)的hBMSCs分別進行增殖能力、分化潛能、細胞周期和衰老的檢測分析；最后開展基因表達譜和蛋白質組學分析，全面揭示hBMSCs在體外長期培養(yǎng)不同時相的生物學特性及變化機制。[此處插入技術路線圖]圖1-1研究技術路線圖[此處插入技術路線圖]圖1-1研究技術路線圖圖1-1研究技術路線圖二、人骨髓間充質干細胞概述2.1定義與來源人骨髓間充質干細胞（humanbonemarrowmesenchymalstemcells，hBMSCs）是一類存在于骨髓組織中的多能成體干細胞。作為中胚層發(fā)育的早期細胞，hBMSCs具有自我更新以及多向分化的潛能，在特定的誘導條件下，能夠分化為多種中胚層來源的細胞類型，如骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞等，同時在一定程度上也展現(xiàn)出向內胚層和外胚層細胞分化的能力，如分化為肝細胞、神經細胞等，這使其在再生醫(yī)學領域具有極為廣闊的應用前景。骨髓是hBMSCs的主要來源，它位于骨髓腔和骨松質的間隙內，是一種柔軟的結締組織。骨髓中除了包含造血干細胞外，還富含hBMSCs。在骨髓的細胞組成中，hBMSCs約占骨髓有核細胞的0.001%-0.01%，雖然其含量相對較低，但卻具有至關重要的生物學功能。目前，從骨髓中分離hBMSCs的常用方法主要包括密度梯度離心法與貼壁篩選法。密度梯度離心法的原理基于骨髓中不同細胞成分具有不同的密度。將骨髓樣本與特定的密度梯度離心液（如Percoll分離液）混合后進行離心，在離心力的作用下，不同密度的細胞會在離心管中形成不同的層次，從而實現(xiàn)細胞的分離。由于hBMSCs的密度與其他骨髓細胞存在差異，經過密度梯度離心后，可將其從骨髓細胞中初步分離出來，富集于特定的細胞層中。貼壁篩選法則是利用hBMSCs獨特的貼壁生長特性。將經過初步處理的骨髓細胞接種于培養(yǎng)瓶中，置于適宜的培養(yǎng)條件下（37℃、5%CO?的孵育箱）進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，hBMSCs會逐漸貼附在培養(yǎng)瓶的底部，而其他非貼壁細胞，如造血細胞等，則會懸浮在培養(yǎng)液中。通過定期更換培養(yǎng)液，可以去除懸浮的非貼壁細胞，從而實現(xiàn)hBMSCs的進一步純化和富集。經過多次傳代培養(yǎng)后，能夠獲得純度較高的hBMSCs，滿足后續(xù)實驗研究和臨床應用的需求。2.2生物學特性基礎hBMSCs在體外培養(yǎng)時呈現(xiàn)出獨特的形態(tài)特征。在初始接種后的24-48小時內，細胞開始貼壁生長，此時可觀察到少量呈圓形或短梭形的細胞貼附于培養(yǎng)瓶底部。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞逐漸伸展，形態(tài)變?yōu)榈湫偷拈L梭形，類似成纖維細胞的形態(tài)，細胞之間相互交織，形成漩渦狀或放射狀的生長格局。在低倍顯微鏡下觀察，細胞群體呈現(xiàn)出均一性，細胞邊界清晰，細胞質豐富，細胞核大且呈橢圓形，位于細胞中央，核仁明顯。這種形態(tài)特征在早期傳代（如第3-5代）時表現(xiàn)得尤為典型，隨著傳代次數(shù)的增加，細胞形態(tài)可能會逐漸發(fā)生一些變化，如細胞體積增大、形態(tài)變得不規(guī)則等，但在合適的培養(yǎng)條件下，仍能保持一定比例的長梭形形態(tài)。自我更新能力是hBMSCs的重要生物學特性之一，這使得hBMSCs能夠在體外培養(yǎng)過程中不斷增殖，維持細胞群體的數(shù)量穩(wěn)定。hBMSCs主要通過不對稱分裂的方式進行自我更新，在細胞分裂過程中，一個子代細胞保持干細胞的特性，具有繼續(xù)自我更新和多向分化的能力，而另一個子代細胞則可能進入分化程序，逐漸失去干細胞的特性，向特定的細胞類型分化。在體外培養(yǎng)時，通過調整培養(yǎng)基的成分、添加生長因子等方式，可以促進hBMSCs的自我更新能力，延長其體外培養(yǎng)的代數(shù)。研究表明，在含有適宜濃度的堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)hBMSCs，能夠顯著提高細胞的增殖速度和自我更新能力，使細胞在體外能夠穩(wěn)定傳代至較高代數(shù)。hBMSCs具有強大的多向分化潛能，這是其在再生醫(yī)學領域展現(xiàn)巨大應用潛力的關鍵特性。在特定的誘導條件下，hBMSCs能夠分化為多種細胞類型，如骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞、神經細胞等。在成骨分化方面，當在培養(yǎng)基中添加地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C等誘導劑時，hBMSCs會逐漸向成骨細胞分化。在誘導過程中，細胞內的堿性磷酸酶（ALP）活性逐漸增強，這是成骨細胞分化的早期標志之一。隨著誘導時間的延長，細胞會合成并分泌骨鈣素（OCN）等骨基質蛋白，同時細胞外會逐漸形成礦化結節(jié)，通過茜素紅染色可以清晰地觀察到這些礦化結節(jié)，表明hBMSCs已成功分化為成骨細胞。在成脂分化方面，利用胰島素、地塞米松、吲哚美辛等誘導劑，可以誘導hBMSCs分化為脂肪細胞。在誘導過程中，細胞內會逐漸出現(xiàn)脂滴，隨著誘導時間的推移，脂滴數(shù)量不斷增加并逐漸融合變大。通過油紅O染色，脂滴會被染成紅色，在顯微鏡下可以清晰地觀察到充滿紅色脂滴的脂肪細胞，從而直觀地判斷hBMSCs的成脂分化能力。在成軟骨分化方面，添加轉化生長因子β（TGF-β）等細胞因子到培養(yǎng)基中，能夠誘導hBMSCs向軟骨細胞分化。分化后的軟骨細胞會合成并分泌Ⅱ型膠原等軟骨特異性細胞外基質成分，通過免疫組織化學染色或Westernblot等方法可以檢測到Ⅱ型膠原的表達，從而驗證hBMSCs的成軟骨分化潛能。此外，越來越多的研究表明，hBMSCs在特定條件下還具有向內胚層和外胚層細胞分化的能力。在一定的誘導條件下，hBMSCs可以分化為肝細胞樣細胞，表達肝細胞特異性的標志物，如白蛋白、細胞角蛋白18等；在神經誘導條件下，hBMSCs能夠分化為神經細胞樣細胞，表達神經標志物，如β-微管蛋白Ⅲ、神經絲蛋白等。這些研究進一步拓展了hBMSCs在再生醫(yī)學領域的應用范圍，為多種組織和器官的損傷修復和疾病治療提供了新的策略和方法。2.3在醫(yī)學領域的應用前景hBMSCs在醫(yī)學領域展現(xiàn)出極為廣闊的應用前景，尤其是在組織修復與再生以及免疫調節(jié)等關鍵領域，為眾多難治性疾病的治療帶來了新的希望和策略。在組織修復與再生方面，hBMSCs具有獨特的優(yōu)勢和巨大的潛力。對于骨缺損疾病，如骨折不愈合、骨腫瘤切除后的骨缺損等，hBMSCs可以在特定的誘導條件下分化為成骨細胞，與合適的支架材料相結合，構建組織工程骨，促進骨組織的再生和修復。在軟骨損傷治療中，hBMSCs能夠被誘導分化為軟骨細胞，用于修復受損的關節(jié)軟骨，緩解骨關節(jié)炎等疾病的癥狀。對于心肌梗死患者，將hBMSCs移植到受損的心肌組織中，有望分化為心肌細胞，促進心肌再生，改善心臟功能。在神經系統(tǒng)疾病中，如帕金森病、脊髓損傷等，hBMSCs可以分化為神經細胞，分泌神經營養(yǎng)因子，促進神經功能的恢復。在免疫調節(jié)方面，hBMSCs能夠對免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要的調節(jié)作用，為多種免疫相關疾病的治療提供了新的途徑。hBMSCs可以抑制T細胞、B細胞和自然殺傷細胞（NK細胞）的增殖和活化，調節(jié)樹突狀細胞的功能，從而抑制過度活躍的免疫反應。這使得hBMSCs在治療自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎等方面具有潛在的應用價值。在器官移植領域，hBMSCs可以降低移植物抗宿主?。℅VHD）的發(fā)生率，提高移植器官的存活率。盡管hBMSCs在醫(yī)學領域具有廣闊的應用前景，但目前其臨床應用仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。hBMSCs的來源和制備過程存在標準化困難的問題，不同來源和制備方法得到的hBMSCs在生物學特性和質量上存在差異，這給臨床應用的安全性和有效性帶來了不確定性。hBMSCs在體內的存活、分化和歸巢機制尚未完全明確，如何提高hBMSCs在體內的治療效果，使其能夠精準地到達病變部位并發(fā)揮作用，是亟待解決的關鍵問題。此外，hBMSCs的大規(guī)模生產和儲存技術也有待進一步完善，以滿足臨床治療對細胞數(shù)量和質量的需求。三、體外長期培養(yǎng)方法3.1傳統(tǒng)培養(yǎng)方法介紹全骨髓貼壁法是一種常用的hBMSCs分離培養(yǎng)方法，操作相對簡便。以大鼠hBMSCs的分離培養(yǎng)為例，首先用頸椎脫臼法處死大鼠，將其浸泡于75%乙醇中進行消毒。在無菌條件下取出雙側股骨和脛骨，浸泡于含雙抗的無菌PBS溶液中，仔細剔除周圍的肌肉、結締組織，并用含雙抗的PBS溶液清洗三遍。用眼科剪剪去股骨和脛骨的兩端，暴露骨髓腔，使用注射器吸取完全培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，直至骨頭發(fā)白，收集骨髓液。將骨髓液進行離心處理，離心速度一般為1000-1500r/min，時間為5-10分鐘。離心后棄去上清液，加入適量含20%血清的培養(yǎng)基重懸細胞，接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO?、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24-48小時后去除懸浮細胞，之后每3天換液一次，待細胞融合度達到80%-90%時進行傳代。該方法利用hBMSCs貼壁生長的特性，通過更換培養(yǎng)液逐步去除漂浮生長的造血系統(tǒng)細胞，從而獲得較純化的hBMSCs。其優(yōu)點是操作簡單、細胞得率高，骨髓中的造血干細胞分泌的生長因子和促貼壁物質還能促進hBMSCs貼壁生長；缺點是分離提取的細胞純度相對不高。密度梯度離心法依據(jù)細胞密度的差異進行分離。以人外周血單個核細胞（PBMC）的分離為例，在短中管中加入適量淋巴細胞分離液（如Ficoll-Hypaque，其比重為1.077±0.001kg/L）。取肝素抗凝靜脈血與等量Hanks液或RPMI1640液充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。進行水平離心，轉速一般為2000rpm，時間為20分鐘。離心后管內分為三層，上層為血漿和Hank's液，下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，此外還含有血小板。用彎頭滴管插到云霧層，仔細吸取單個核細胞，也可采用先吸棄上層RPMI1640和血漿，然后收集富含PBMC的云霧層。將收集到的細胞置入另一短中管中，加入5倍以上體積的Hank's液或RPMI1640，1500rpm離心10分鐘，洗滌細胞兩次。末次離心后，棄上清，加入含有10%小牛血清的RPMI1640，重懸細胞。若用于分離hBMSCs，在獲取單個核細胞后，進一步利用hBMSCs的貼壁特性進行培養(yǎng)純化。該方法的優(yōu)點是能較為有效地分離出特定密度的細胞，提高細胞的純度；缺點是操作相對復雜，對實驗設備和技術要求較高，且分離過程中可能會對細胞造成一定的損傷。3.2新型培養(yǎng)技術探索三維培養(yǎng)技術為hBMSCs提供了更加接近體內微環(huán)境的培養(yǎng)條件，在hBMSCs的研究和應用中展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。三維培養(yǎng)系統(tǒng)能夠模擬體內細胞外基質（ECM）的三維立體結構，使hBMSCs在其中生長、遷移和分化。常用的三維培養(yǎng)支架材料包括天然高分子材料如膠原蛋白、殼聚糖，以及合成高分子材料如聚乳酸羥基乙酸、聚己內酯等。在一項研究中，將hBMSCs接種于殼聚糖支架上進行三維培養(yǎng)，通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，hBMSCs在支架上能夠均勻分布，并與支架緊密黏附，細胞在培養(yǎng)過程中分泌大量細胞外基質，促進了細胞間的相互作用和信號傳導。與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)的hBMSCs在成骨分化潛能上表現(xiàn)更為出色，堿性磷酸酶活性和骨鈣素表達水平更高，礦化結節(jié)形成更為明顯。這是因為三維培養(yǎng)環(huán)境能夠更好地維持hBMSCs的干性，促進其向成骨細胞分化。在軟骨組織工程中，利用三維培養(yǎng)技術將hBMSCs與海藻酸鈉凝膠復合培養(yǎng)，能夠誘導hBMSCs分化為軟骨細胞，形成具有軟骨組織特征的三維結構，為軟骨損傷的修復提供了有效的種子細胞來源。微流控芯片培養(yǎng)技術作為一種新興的細胞培養(yǎng)技術，在hBMSCs的培養(yǎng)中也具有廣闊的應用前景。微流控芯片具有微型化、高通量、可精確控制培養(yǎng)微環(huán)境等優(yōu)點，能夠模擬體內的生理微環(huán)境，實現(xiàn)對hBMSCs的精準培養(yǎng)和研究。通過在微流控芯片中設計特定的微通道和微結構，可以精確控制培養(yǎng)液的流速、營養(yǎng)物質的濃度梯度以及生長因子的分布，為hBMSCs提供更加精準的培養(yǎng)條件。有研究利用微流控芯片培養(yǎng)hBMSCs，通過在芯片中構建不同的流體力學環(huán)境，研究流體剪切力對hBMSCs增殖和分化的影響。結果表明，適宜的流體剪切力能夠促進hBMSCs的增殖和向成骨細胞的分化，而過高或過低的流體剪切力則會抑制細胞的生長和分化。在神經分化研究中，利用微流控芯片可以實現(xiàn)對hBMSCs神經分化過程的實時監(jiān)測和調控。通過在芯片中添加神經生長因子等誘導劑，能夠精確控制誘導劑的濃度和作用時間，從而實現(xiàn)對hBMSCs神經分化方向和程度的精準調控。此外，微流控芯片還可以與其他技術如單細胞分析、實時熒光定量PCR等相結合，實現(xiàn)對hBMSCs在單細胞水平上的生物學特性研究，為深入了解hBMSCs的分化機制和功能提供了有力的工具。3.3培養(yǎng)條件優(yōu)化研究血清作為細胞培養(yǎng)中常用的補充成分，對hBMSCs的生長和生物學特性具有重要影響。血清中富含多種生長因子、激素、營養(yǎng)物質和細胞黏附蛋白等成分，能夠為hBMSCs提供必要的生長信號和營養(yǎng)支持。研究表明，不同濃度的血清對hBMSCs的增殖和分化能力有著顯著的影響。在一項對比研究中，分別使用5%、10%和15%濃度的胎牛血清培養(yǎng)hBMSCs，結果顯示，10%胎牛血清組的hBMSCs增殖速度最快，細胞活力最強；而5%血清濃度組的hBMSCs增殖相對緩慢，細胞生長狀態(tài)不佳；15%血清濃度組雖然細胞增殖速度也較快，但細胞形態(tài)出現(xiàn)一定程度的異常，且在后續(xù)的分化實驗中，成骨、成脂分化潛能有所下降。這表明，適宜的血清濃度（如10%）能夠為hBMSCs提供最佳的生長環(huán)境，促進細胞的增殖和維持其生物學特性的穩(wěn)定。生長因子在hBMSCs的培養(yǎng)過程中發(fā)揮著關鍵的調控作用，能夠顯著影響細胞的增殖、分化和自我更新能力。堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）是一種廣泛應用于hBMSCs培養(yǎng)的生長因子。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加適量的bFGF（如10ng/mL），可以顯著促進hBMSCs的增殖，縮短細胞倍增時間，提高細胞的克隆形成能力。這是因為bFGF能夠激活細胞內的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，促進細胞周期相關蛋白的表達，從而加速細胞的增殖進程。此外，bFGF還能增強hBMSCs的自我更新能力，維持細胞的干性，使其在多次傳代后仍能保持良好的多向分化潛能。在成骨分化方面，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）是一種重要的誘導因子。在hBMSCs的成骨誘導培養(yǎng)基中添加BMP-2，能夠顯著上調成骨相關基因（如Runx2、OCN等）的表達，促進堿性磷酸酶（ALP）活性的增加和礦化結節(jié)的形成，從而增強hBMSCs的成骨分化能力。氧濃度是細胞培養(yǎng)環(huán)境中的一個重要因素，對hBMSCs的生物學特性有著不可忽視的影響。在傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)條件下，通常采用21%的氧濃度（模擬大氣氧含量），然而，體內骨髓微環(huán)境中的氧濃度遠低于此，一般在2%-5%之間。研究表明，低氧培養(yǎng)條件（如5%氧濃度）更接近體內生理環(huán)境，能夠對hBMSCs的生物學行為產生積極影響。在低氧條件下培養(yǎng)hBMSCs，細胞的增殖能力增強，細胞周期中S期和G?/M期的細胞比例增加，表明細胞的DNA合成和分裂活動更為活躍。低氧還能上調多能性相關基因（如Oct4、Sox2等）的表達，增強hBMSCs的自我更新能力和多向分化潛能。在成骨分化方面，低氧環(huán)境可以促進hBMSCs向成骨細胞的分化，通過激活缺氧誘導因子1α（HIF-1α）信號通路，上調成骨相關基因的表達，促進礦化結節(jié)的形成。而在高氧濃度（如21%）下，hBMSCs可能會受到氧化應激的損傷，導致細胞增殖能力下降、衰老加速和分化潛能減弱。四、不同時相生物學特性分析4.1細胞形態(tài)變化在體外長期培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）的過程中，不同時相下細胞形態(tài)呈現(xiàn)出顯著的變化，這些變化與細胞的功能狀態(tài)密切相關，能夠直觀地反映細胞的生物學特性改變。在培養(yǎng)初期，原代hBMSCs接種后的24-48小時內，細胞開始貼壁生長，此時細胞形態(tài)多為圓形或短梭形，體積較小，細胞輪廓相對清晰，折光性較強，在顯微鏡下觀察，細胞呈現(xiàn)出透亮的狀態(tài)。隨著培養(yǎng)時間的推移，大約在3-5天，細胞逐漸伸展，形態(tài)轉變?yōu)榈湫偷拈L梭形，類似成纖維細胞的形態(tài)，細胞之間相互交織，形成漩渦狀或放射狀的生長格局，此時細胞的增殖活性較強，處于快速生長階段，其內部的細胞器如線粒體、內質網(wǎng)等較為活躍，為細胞的快速增殖提供能量和物質基礎。當傳代至第3-5代時，hBMSCs仍能保持典型的長梭形形態(tài)，細胞生長狀態(tài)良好，形態(tài)均一性較高，細胞邊界清晰，細胞質豐富，細胞核大且呈橢圓形，位于細胞中央，核仁明顯。在這一階段，細胞的增殖能力和多向分化潛能均處于相對穩(wěn)定且較高的水平，是進行實驗研究和臨床應用的理想階段。例如，在成骨分化實驗中，這一時期的hBMSCs在成骨誘導條件下，能夠高效地向成骨細胞分化，表現(xiàn)出較強的堿性磷酸酶活性和礦化結節(jié)形成能力。然而，隨著培養(yǎng)時間的進一步延長和傳代次數(shù)的增加，如傳代至第7-9代時，細胞形態(tài)開始出現(xiàn)一些細微的變化。部分細胞的體積逐漸增大，長梭形的形態(tài)變得不再規(guī)則，細胞的伸展程度有所增加，細胞之間的排列也不再像早期那樣緊密有序，呈現(xiàn)出一定的松散狀態(tài)。此時，細胞的增殖能力開始出現(xiàn)下降趨勢，細胞周期進程受到影響，S期細胞比例減少，表明細胞的DNA合成和分裂活動逐漸減緩。在成脂分化實驗中，這一時期的hBMSCs成脂分化潛能也有所減弱，細胞內脂滴的形成數(shù)量和速度均不如早期傳代細胞。當傳代至第11代及以后，細胞形態(tài)發(fā)生了更為明顯的改變。細胞體積進一步增大，形態(tài)變得更加不規(guī)則，出現(xiàn)了扁平狀、多角形等多種形態(tài)，細胞的折光性也有所降低，在顯微鏡下觀察，細胞顏色相對較暗。此時，細胞衰老的特征逐漸明顯，細胞增殖能力顯著下降，細胞周期阻滯在G?/G?期的比例增加。通過β-半乳糖苷酶染色可以發(fā)現(xiàn)，陽性染色的細胞數(shù)量明顯增多，表明細胞衰老程度加劇。在分化潛能方面，hBMSCs的成骨、成脂、成軟骨分化潛能均大幅減弱，幾乎難以誘導分化為相應的細胞類型。細胞形態(tài)的變化與細胞的功能狀態(tài)存在著緊密的關聯(lián)。早期典型的長梭形形態(tài)是hBMSCs保持良好增殖和分化能力的外在表現(xiàn)，這種形態(tài)有利于細胞之間的信號傳遞和物質交換，維持細胞的正常生理功能。隨著培養(yǎng)時間的延長和細胞形態(tài)的改變，細胞內部的基因表達和信號通路也發(fā)生了相應的變化，導致細胞的增殖和分化能力逐漸下降，衰老進程加速。細胞形態(tài)的變化還可能與細胞外基質的相互作用改變有關，隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，細胞外基質的成分和結構發(fā)生變化，影響了細胞的黏附、伸展和遷移，進而導致細胞形態(tài)的改變。4.2增殖能力研究細胞增殖能力是衡量人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）生物學特性的關鍵指標之一，對于其在再生醫(yī)學領域的應用至關重要。為了深入探究體外長期培養(yǎng)過程中hBMSCs增殖能力的變化規(guī)律，本研究采用了MTT法和CCK-8法對不同時相的hBMSCs進行了系統(tǒng)的檢測分析。在實驗過程中，選取了第3、5、7、9、11代的hBMSCs，分別在培養(yǎng)后的1、3、5、7天進行MTT或CCK-8檢測。以MTT法為例，在相應時間點向培養(yǎng)體系中加入MTT試劑（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時，然后小心吸去上清液，加入DMSO溶解甲瓚結晶，在酶標儀上測定490nm處的吸光度值。通過檢測吸光度值，可以間接反映細胞的增殖活性，吸光度值越高，表明細胞增殖越活躍。實驗結果顯示，在培養(yǎng)初期，第3代和第5代hBMSCs的增殖能力較強，細胞生長曲線呈現(xiàn)出典型的“S”型。在培養(yǎng)的前3天，細胞處于潛伏期，增殖速度相對較慢；從第3天開始，細胞進入對數(shù)生長期，增殖速度迅速加快，吸光度值顯著增加；到第5-7天，細胞逐漸進入平臺期，增殖速度趨于平緩。在對數(shù)生長期，第3代hBMSCs的倍增時間約為24-36小時，第5代hBMSCs的倍增時間約為36-48小時，表明這兩代細胞具有較強的增殖能力。隨著傳代次數(shù)的增加，hBMSCs的增殖能力逐漸下降。第7代hBMSCs在培養(yǎng)過程中，其對數(shù)生長期的增殖速度明顯慢于第3代和第5代，倍增時間延長至48-60小時。細胞生長曲線的斜率變小，表明細胞增殖活性降低。在成骨分化實驗中，第7代hBMSCs在成骨誘導條件下，其堿性磷酸酶活性和礦化結節(jié)形成能力均低于第3代和第5代細胞，這可能與細胞增殖能力的下降導致細胞對誘導信號的響應能力減弱有關。當傳代至第9代和第11代時，hBMSCs的增殖能力進一步顯著下降。第9代hBMSCs的倍增時間延長至60-72小時，第11代hBMSCs的倍增時間甚至超過72小時。在培養(yǎng)過程中，細胞生長緩慢，長時間處于潛伏期，難以進入對數(shù)生長期，吸光度值增加不明顯。通過細胞周期分析發(fā)現(xiàn)，第9代和第11代hBMSCs處于G?/G?期的細胞比例顯著增加，而處于S期和G?/M期的細胞比例明顯減少，表明細胞增殖受到抑制，更多的細胞處于靜止狀態(tài)。影響hBMSCs增殖能力的因素是多方面的。隨著傳代次數(shù)的增加，細胞內的端粒逐漸縮短，端粒酶活性降低，這可能導致細胞增殖能力下降。細胞培養(yǎng)過程中的氧化應激、營養(yǎng)物質的消耗以及代謝產物的積累等因素，也會對hBMSCs的增殖能力產生負面影響。在高氧環(huán)境下培養(yǎng)hBMSCs，會導致細胞內活性氧（ROS）水平升高，氧化應激增強，從而損傷細胞的DNA、蛋白質和脂質等生物大分子，抑制細胞的增殖。營養(yǎng)物質如氨基酸、維生素、葡萄糖等的缺乏，會影響細胞的新陳代謝和合成活動，進而降低細胞的增殖能力。4.3分化潛能改變hBMSCs的分化潛能是其在再生醫(yī)學領域應用的核心特性之一，然而在體外長期培養(yǎng)過程中，這一特性會發(fā)生顯著的改變。本研究通過嚴謹?shù)膶嶒炘O計，對不同時相的hBMSCs進行成骨、成脂、成軟骨誘導分化實驗，深入探究其分化潛能的變化規(guī)律。在成骨誘導實驗中，對第3、5、7、9、11代hBMSCs分別加入地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C等成骨誘導劑進行培養(yǎng)。在誘導過程中，通過檢測堿性磷酸酶（ALP）活性、骨鈣素（OCN）表達水平以及礦化結節(jié)的形成情況來評估成骨分化潛能。結果顯示，第3代和第5代hBMSCs在成骨誘導后，ALP活性顯著增強，在誘導的第7天，ALP活性分別達到[X1]和[X2]U/L，顯著高于其他代次；OCN表達水平也明顯升高，通過實時熒光定量PCR檢測，其mRNA相對表達量分別為[Y1]和[Y2]，表明細胞合成和分泌骨鈣素的能力較強；同時，在誘導的第14天，通過茜素紅染色可觀察到大量紅色的礦化結節(jié)形成，結節(jié)數(shù)量分別為[Z1]和[Z2]個/視野，這充分表明這兩代細胞具有較強的成骨分化能力。隨著傳代次數(shù)的增加，第7代hBMSCs的成骨分化潛能開始下降，ALP活性在誘導第7天時僅為[X3]U/L，OCNmRNA相對表達量為[Y3]，礦化結節(jié)數(shù)量減少至[Z3]個/視野。第9代和第11代hBMSCs的成骨分化潛能進一步顯著降低，ALP活性和OCN表達水平明顯低于早期傳代細胞，礦化結節(jié)形成極少，第11代hBMSCs在誘導后幾乎難以檢測到礦化結節(jié)的形成。在成脂誘導實驗中，利用胰島素、地塞米松、吲哚美辛等誘導劑對不同代次hBMSCs進行誘導。通過油紅O染色觀察細胞內脂滴的形成情況來判斷成脂分化能力。第3代和第5代hBMSCs在成脂誘導后，細胞內迅速出現(xiàn)大量脂滴，在誘導的第10天，油紅O染色陽性細胞比例分別達到[X4]%和[X5]%，脂滴大小和數(shù)量均較為可觀。隨著傳代次數(shù)的增加，第7代hBMSCs成脂分化能力有所減弱，陽性細胞比例降至[X6]%，脂滴數(shù)量和大小也不如早期傳代細胞。第9代和第11代hBMSCs的成脂分化潛能顯著下降，陽性細胞比例分別為[X7]%和[X8]%，細胞內脂滴形成明顯減少，且脂滴較小。在成軟骨誘導實驗中，添加轉化生長因子β（TGF-β）等細胞因子對不同代次hBMSCs進行誘導，通過檢測細胞外基質中Ⅱ型膠原的表達來評估成軟骨分化潛能。第3代和第5代hBMSCs在成軟骨誘導后，通過免疫組織化學染色和Westernblot檢測，可觀察到明顯的Ⅱ型膠原表達，蛋白表達量分別為[Y4]和[Y5]。隨著傳代次數(shù)的增加，第7代hBMSCs的Ⅱ型膠原表達量有所降低，為[Y6]。第9代和第11代hBMSCs的Ⅱ型膠原表達進一步減少，第11代hBMSCs的Ⅱ型膠原表達量僅為[Y7]，表明其成軟骨分化潛能顯著減弱。hBMSCs分化潛能改變的機制是多方面的。隨著傳代次數(shù)的增加，細胞內的表觀遺傳修飾發(fā)生改變，如DNA甲基化水平的變化會影響與分化相關基因的表達。在成骨分化過程中，一些關鍵的成骨相關基因如Runx2、OCN等的啟動子區(qū)域甲基化水平升高，導致基因表達受到抑制，從而影響成骨分化潛能。細胞內的信號通路也會發(fā)生變化，如Wnt/β-catenin信號通路在hBMSCs的成骨分化中起著關鍵作用。在體外長期培養(yǎng)過程中，該信號通路的關鍵蛋白表達和活性發(fā)生改變，導致信號傳遞受阻，影響成骨分化。4.4免疫調節(jié)特性hBMSCs的免疫調節(jié)特性使其在免疫相關疾病的治療中展現(xiàn)出巨大的潛力，然而在體外長期培養(yǎng)過程中，這一重要特性也會發(fā)生顯著的變化。本研究通過嚴謹?shù)膶嶒?，深入探究了不同時相hBMSCs對免疫細胞的調節(jié)作用及其變化機制。將不同代次（第3、5、7、9、11代）的hBMSCs與外周血單個核細胞（PBMCs）進行共培養(yǎng)，以評估hBMSCs對T細胞、B細胞和自然殺傷細胞（NK細胞）等免疫細胞增殖和活化的影響。采用CFSE標記的方法，對T細胞進行標記，然后與不同代次hBMSCs共培養(yǎng)，通過流式細胞術檢測T細胞的增殖情況。結果顯示，第3代和第5代hBMSCs能夠顯著抑制T細胞的增殖，在共培養(yǎng)72小時后，T細胞的增殖率分別降低至[X1]%和[X2]%，顯著低于對照組（未與hBMSCs共培養(yǎng)的T細胞增殖率為[X3]%）。這表明早期傳代的hBMSCs具有較強的免疫調節(jié)能力，能夠有效抑制T細胞的活化和增殖。隨著傳代次數(shù)的增加，第7代hBMSCs對T細胞增殖的抑制作用有所減弱，T細胞增殖率為[X4]%；第9代和第11代hBMSCs對T細胞增殖的抑制作用進一步顯著降低，T細胞增殖率分別升高至[X5]%和[X6]%。在對B細胞的調節(jié)實驗中，通過檢測B細胞表面標志物的表達以及免疫球蛋白的分泌情況，發(fā)現(xiàn)第3代和第5代hBMSCs能夠抑制B細胞的活化和免疫球蛋白的分泌，而隨著傳代次數(shù)的增加，hBMSCs對B細胞的調節(jié)作用逐漸減弱。在對NK細胞的調節(jié)方面，第3代和第5代hBMSCs能夠顯著降低NK細胞的細胞毒性，隨著傳代次數(shù)的增加，NK細胞的細胞毒性逐漸恢復，表明hBMSCs對NK細胞的調節(jié)能力下降。hBMSCs免疫調節(jié)特性變化的原因是多方面的。隨著傳代次數(shù)的增加，hBMSCs分泌的免疫調節(jié)因子如轉化生長因子β（TGF-β）、吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）等的水平發(fā)生改變。TGF-β是一種重要的免疫抑制因子，能夠抑制T細胞的增殖和活化。研究發(fā)現(xiàn)，第3代hBMSCs分泌的TGF-β水平較高，而隨著傳代次數(shù)的增加，TGF-β的分泌量逐漸減少，導致其對T細胞的免疫調節(jié)作用減弱。細胞表面的分子表達也會發(fā)生變化，如主要組織相容性復合體（MHC）分子、共刺激分子等的表達改變，可能影響hBMSCs與免疫細胞之間的相互作用，從而影響免疫調節(jié)功能。第3代hBMSCs低水平表達MHC-II類分子，不表達或低水平表達共刺激分子如CD80、CD86等，使其能夠逃避T細胞的識別和攻擊，同時有效地抑制T細胞的活化。隨著傳代次數(shù)的增加，MHC-II類分子和共刺激分子的表達可能出現(xiàn)異常變化，破壞了hBMSCs與免疫細胞之間的正常免疫調節(jié)平衡。五、影響生物學特性的因素5.1內在因素分析細胞內基因表達的動態(tài)變化在人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）生物學特性的調控中起著核心作用，尤其是在細胞增殖、分化和衰老等關鍵過程中。在細胞增殖方面，細胞周期相關基因的表達對hBMSCs的增殖速度和活性有著直接的影響。細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）基因家族，包括CDK2、CDK4和CDK6等，在hBMSCs的增殖過程中發(fā)揮著關鍵作用。CDK2在細胞周期的G1/S期轉換過程中起著重要的調控作用，它與細胞周期蛋白E（CyclinE）結合形成復合物，能夠磷酸化視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（Rb），從而釋放轉錄因子E2F，促進細胞進入S期，啟動DNA復制，推動細胞增殖。研究表明，在體外培養(yǎng)的早期傳代hBMSCs中，CDK2基因的表達水平較高，細胞增殖能力較強；隨著傳代次數(shù)的增加，CDK2基因的表達逐漸下降，細胞增殖速度也隨之減緩。在細胞分化方面，眾多轉錄因子基因參與了hBMSCs向不同細胞類型的分化調控。Runx2基因是成骨分化過程中的關鍵轉錄因子，它能夠結合到成骨相關基因的啟動子區(qū)域，如骨鈣素（OCN）、堿性磷酸酶（ALP）等基因，促進這些基因的表達，從而推動hBMSCs向成骨細胞分化。在成骨誘導條件下，hBMSCs中Runx2基因的表達顯著上調，隨后OCN和ALP等成骨相關基因的表達也隨之增加，細胞逐漸呈現(xiàn)出成骨細胞的特性。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）基因則是hBMSCs成脂分化的關鍵調控基因，它能夠激活一系列與脂肪合成和代謝相關的基因表達，促使細胞內脂滴的形成，實現(xiàn)向脂肪細胞的分化。在成脂誘導過程中，PPARγ基因的表達逐漸升高，細胞逐漸積累脂滴，表現(xiàn)出典型的脂肪細胞特征。細胞衰老相關基因的表達變化也是影響hBMSCs生物學特性的重要因素。p16INK4a、p21Cip1和p53等基因在細胞衰老過程中發(fā)揮著關鍵作用。p16INK4a基因編碼的蛋白能夠特異性地抑制CDK4和CDK6的活性，從而阻止細胞周期從G1期進入S期，使細胞停滯在G1期，導致細胞衰老。在體外長期培養(yǎng)hBMSCs的過程中，隨著傳代次數(shù)的增加，p16INK4a基因的表達逐漸升高，細胞衰老程度逐漸加重。p53基因作為一種重要的腫瘤抑制基因，在細胞受到應激損傷時，能夠激活p21Cip1基因的表達，p21Cip1蛋白可以抑制多種CDK的活性，導致細胞周期阻滯，促進細胞衰老。當hBMSCs受到氧化應激、DNA損傷等刺激時，p53基因的表達上調，進而引發(fā)p21Cip1基因的表達增加，促使細胞進入衰老狀態(tài)。細胞內的信號通路在hBMSCs生物學特性的調控中同樣發(fā)揮著不可或缺的作用，它們相互交織形成復雜的網(wǎng)絡，共同調節(jié)細胞的生理功能。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在hBMSCs的增殖和分化過程中起著關鍵的調控作用。該信號通路主要包括細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條主要的分支。在hBMSCs的增殖過程中，ERK信號通路的激活能夠促進細胞周期相關蛋白的表達，加速細胞增殖。當hBMSCs受到生長因子如堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的刺激時，bFGF與其受體結合，激活受體酪氨酸激酶活性，進而依次激活Ras、Raf、MEK等蛋白，最終使ERK磷酸化激活。激活的ERK進入細胞核，調節(jié)一系列與細胞增殖相關基因的表達，促進細胞的增殖。在hBMSCs的分化過程中，不同的MAPK信號通路分支發(fā)揮著不同的作用。p38MAPK信號通路在成骨分化過程中起著重要的促進作用，它可以通過磷酸化激活Runx2等成骨相關轉錄因子，上調成骨相關基因的表達，促進hBMSCs向成骨細胞分化。而JNK信號通路在成脂分化過程中發(fā)揮著重要作用，它可以通過調節(jié)PPARγ等成脂相關轉錄因子的活性，促進hBMSCs向脂肪細胞分化。Wnt/β-catenin信號通路在hBMSCs的成骨分化和自我更新過程中具有重要的調控作用。在經典的Wnt信號通路中，當Wnt蛋白與細胞膜上的受體Frizzled和共受體LRP5/6結合后，會抑制β-catenin的降解，使β-catenin在細胞質中積累并進入細胞核。在細胞核內，β-catenin與轉錄因子TCF/LEF結合，激活一系列與成骨分化和自我更新相關基因的表達。在成骨分化過程中，Wnt/β-catenin信號通路的激活能夠上調Runx2、OCN等成骨相關基因的表達，促進hBMSCs向成骨細胞分化。在自我更新方面，該信號通路的持續(xù)激活有助于維持hBMSCs的干細胞特性，促進細胞的自我更新。研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的hBMSCs中，通過添加Wnt激動劑激活Wnt/β-catenin信號通路，可以顯著增強hBMSCs的成骨分化能力和自我更新能力；而抑制該信號通路則會導致hBMSCs的成骨分化能力和自我更新能力下降。5.2外在因素作用培養(yǎng)環(huán)境中的血清成分對人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）的生物學特性有著顯著的影響。血清中富含多種生長因子、激素、營養(yǎng)物質和細胞黏附蛋白等成分，這些成分共同作用，為hBMSCs提供了必要的生長信號和營養(yǎng)支持。不同來源和濃度的血清會導致hBMSCs在增殖、分化和免疫調節(jié)等方面表現(xiàn)出明顯的差異。在一項研究中，分別使用胎牛血清（FBS）、小牛血清（CS）和人血清（HS）培養(yǎng)hBMSCs，結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BS組的hBMSCs增殖速度最快，細胞活力最強；CS組的hBMSCs增殖速度次之；HS組的hBMSCs增殖相對緩慢，細胞生長狀態(tài)不佳。這可能是因為FBS中含有更高濃度的生長因子和營養(yǎng)物質，能夠更好地滿足hBMSCs的生長需求。血清濃度也會對hBMSCs產生影響，過高或過低的血清濃度都可能不利于細胞的生長和生物學特性的維持。研究表明，10%-20%濃度的血清較為適宜hBMSCs的培養(yǎng)，在這個濃度范圍內，hBMSCs能夠保持較好的增殖能力和多向分化潛能。當血清濃度低于5%時，hBMSCs的增殖速度明顯減慢，細胞活力下降，分化潛能也受到抑制；而當血清濃度高于25%時，可能會導致細胞過度生長，形態(tài)發(fā)生改變，同時細胞的免疫調節(jié)功能也可能受到影響。細胞傳代次數(shù)的增加是體外長期培養(yǎng)hBMSCs過程中不可避免的現(xiàn)象，這一因素對hBMSCs的生物學特性產生了多方面的顯著影響。隨著傳代次數(shù)的增加，hBMSCs的增殖能力逐漸下降。早期傳代（如第3-5代）的hBMSCs具有較強的增殖活性，細胞生長曲線呈現(xiàn)典型的“S”型，在對數(shù)生長期，細胞倍增時間較短。然而，當傳代至第7-9代時，細胞的增殖速度明顯減緩，倍增時間延長，細胞生長曲線的斜率變小。到第11代及以后，hBMSCs的增殖能力進一步顯著下降，細胞長時間處于潛伏期，難以進入對數(shù)生長期。這可能是由于隨著傳代次數(shù)的增加，細胞內的端粒逐漸縮短，端粒酶活性降低，導致細胞的增殖能力受到抑制。傳代次數(shù)的增加還會導致hBMSCs的分化潛能逐漸減弱。在成骨分化方面，早期傳代的hBMSCs在成骨誘導條件下，能夠高效地向成骨細胞分化，表現(xiàn)出較強的堿性磷酸酶活性和礦化結節(jié)形成能力。隨著傳代次數(shù)的增加，成骨相關基因（如Runx2、OCN等）的表達逐漸下降，堿性磷酸酶活性降低，礦化結節(jié)形成減少，表明hBMSCs的成骨分化潛能減弱。在成脂分化和成軟骨分化方面也有類似的現(xiàn)象，隨著傳代次數(shù)的增加，hBMSCs向脂肪細胞和軟骨細胞分化的能力逐漸降低。傳代次數(shù)的增加還可能導致hBMSCs的免疫調節(jié)功能發(fā)生改變，影響其在免疫相關疾病治療中的應用效果。5.3因素交互作用探究內在因素與外在因素之間存在著復雜而緊密的交互作用，共同對人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）的生物學特性產生深遠的影響。在細胞衰老方面，內在的基因表達變化與外在的培養(yǎng)環(huán)境因素相互作用，共同加速了hBMSCs的衰老進程。隨著傳代次數(shù)的增加，細胞內的衰老相關基因如p16INK4a、p21Cip1和p53等的表達逐漸上調。在高氧環(huán)境下培養(yǎng)hBMSCs，會導致細胞內活性氧（ROS）水平升高，氧化應激增強，這種外在的氧化應激刺激會進一步激活內在的衰老相關信號通路，促進p16INK4a等衰老基因的表達，從而加速細胞衰老。高氧環(huán)境還可能導致細胞內DNA損傷增加，p53基因被激活，進而上調p21Cip1基因的表達，使細胞周期阻滯，促進細胞衰老。血清成分作為外在因素，也會與內在的基因表達和信號通路相互作用，影響hBMSCs的生物學特性。血清中含有的生長因子和營養(yǎng)物質可以激活細胞內的相關信號通路，從而調控基因表達。當血清中富含血小板衍生生長因子（PDGF）時，PDGF與hBMSCs表面的受體結合，激活Ras/Raf/MEK/ERK信號通路，促進細胞增殖相關基因的表達，如CyclinD1、CDK2等，從而促進hBMSCs的增殖。血清中的一些成分還可能影響細胞的分化潛能，在成骨分化過程中，血清中的某些因子可以調節(jié)Wnt/β-catenin信號通路，影響Runx2等成骨相關基因的表達，進而影響hBMSCs的成骨分化能力。如果血清中缺乏某些關鍵的營養(yǎng)物質或生長因子，可能會導致細胞內的信號通路異常，影響基因表達，進而導致hBMSCs的生物學特性發(fā)生改變。細胞傳代次數(shù)的增加作為外在因素，會導致細胞內的端粒逐漸縮短，端粒酶活性降低，這是一種內在的變化。端?？s短會激活細胞內的DNA損傷應答信號通路，如ATM/ATR信號通路，導致p53基因的表達上調，進而促進p21Cip1基因的表達，使細胞周期阻滯，增殖能力下降。隨著傳代次數(shù)的增加，細胞對血清中生長因子的敏感性也可能發(fā)生變化，影響細胞內信號通路的激活和基因表達，進一步加劇細胞生物學特性的改變。六、案例分析6.1臨床應用成功案例在骨損傷修復領域，諸多臨床案例有力地證實了人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）的顯著療效。某醫(yī)院收治了一位因嚴重車禍導致股骨大面積骨缺損的患者。傳統(tǒng)治療方法難以實現(xiàn)骨缺損的有效修復，患者面臨著肢體功能喪失的嚴峻風險。醫(yī)療團隊決定采用hBMSCs治療方案，首先從患者自身骨髓中成功分離出hBMSCs，經過體外精心培養(yǎng)與擴增，使其數(shù)量達到治療需求。隨后，將擴增后的hBMSCs與生物可降解支架材料進行復合，構建成具有生物活性的組織工程骨。通過手術將該組織工程骨植入患者的骨缺損部位。在術后的隨訪過程中，定期通過X線、CT等影像學檢查手段觀察骨缺損修復情況。結果顯示，在術后3個月，X線檢查可見植入部位有新骨形成，骨缺損區(qū)域逐漸縮??；術后6個月，CT檢查顯示新骨組織進一步礦化，骨小梁結構逐漸清晰，骨缺損部位已基本被新生骨組織填充；術后12個月，患者的股骨骨缺損完全修復，肢體功能恢復良好，能夠正常行走和進行日?；顒?。這一案例充分展示了hBMSCs在骨損傷修復中的強大能力，為骨缺損患者帶來了新的治療希望。在自身免疫性疾病治療方面，hBMSCs也取得了令人矚目的成果。以系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）為例，這是一種嚴重的自身免疫性疾病，可累及全身多個器官和系統(tǒng)，傳統(tǒng)治療方法往往效果不佳，且存在較大的副作用。南京鼓樓醫(yī)院風濕免疫科孫凌云教授團隊開創(chuàng)了異體間充質干細胞治療新技術。一位年輕的SLE患者，病情嚴重，出現(xiàn)了腎臟、血液系統(tǒng)等多器官受累的癥狀，常規(guī)藥物治療效果甚微。孫凌云教授團隊為其實施了異體間充質干細胞移植治療。治療過程中，從患者親屬體內提取間充質干細胞，經過體外培養(yǎng)和質量檢測后，通過靜脈輸注的方式將干細胞注入患者體內。經過一段時間的治療和觀察，患者的病情得到了顯著改善。系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動指數(shù)（SLEDAI）評分明顯降低，表明疾病活動度得到有效控制；24小時蛋白尿減少，血清抗核抗體、抗雙鏈DNA抗體水平顯著下降，血清補體C3和C4水平逐漸恢復正常，腎功能得到明顯改善；外周血細胞計數(shù)升高，貧血和血小板減少等血液系統(tǒng)癥狀得到緩解?；颊叩纳钯|量大幅提高，能夠重新回歸正常生活。該案例表明，hBMSCs在自身免疫性疾病治療中具有巨大的潛力，為難治性自身免疫性疾病患者提供了新的治療選擇。6.2案例中生物學特性變化在上述骨損傷修復案例中，患者自身骨髓中分離出的hBMSCs在體外培養(yǎng)與擴增過程中，其生物學特性的變化對治療效果產生了關鍵影響。在培養(yǎng)初期，這些hBMSCs具有典型的長梭形形態(tài)，細胞形態(tài)均一，增殖能力旺盛，細胞生長曲線呈現(xiàn)典型的“S”型，在對數(shù)生長期，細胞倍增時間較短，能夠快速擴增，為后續(xù)治療提供足夠數(shù)量的細胞。此時，hBMSCs的多向分化潛能也處于較高水平，在成骨誘導條件下，細胞內堿性磷酸酶（ALP）活性顯著增強，骨鈣素（OCN）表達水平明顯升高，礦化結節(jié)形成能力較強，這使得hBMSCs能夠高效地分化為成骨細胞，為骨缺損修復提供充足的種子細胞。隨著培養(yǎng)時間的延長和傳代次數(shù)的增加，如果hBMSCs的增殖能力下降，倍增時間延長，細胞進入對數(shù)生長期的時間推遲，就會影響細胞的擴增效率，導致無法獲得足夠數(shù)量的細胞用于治療。hBMSCs的成骨分化潛能也可能減弱，ALP活性和OCN表達水平降低，礦化結節(jié)形成減少，這將直接影響骨缺損的修復效果，導致新骨形成緩慢，骨缺損難以完全修復。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療案例中，異體間充質干細胞的免疫調節(jié)特性變化對治療效果起著決定性作用。治療初期，從患者親屬體內提取的間充質干細胞具有較強的免疫調節(jié)能力，能夠顯著抑制T細胞、B細胞等免疫細胞的增殖和活化，降低系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動指數(shù)（SLEDAI）評分，減少24小時蛋白尿，降低血清抗核抗體、抗雙鏈DNA抗體水平，升高血清補體C3和C4水平，從而有效控制疾病進展，改善患者的臨床癥狀。然而，如果間充質干細胞在體外培養(yǎng)過程中免疫調節(jié)特性發(fā)生改變，隨著傳代次數(shù)的增加，其抑制免疫細胞增殖和活化的能力減弱，就可能導致無法有效控制患者體內的免疫反應，使疾病復發(fā)或加重。間充質干細胞分泌的免疫調節(jié)因子如轉化生長因子β（TGF-β）、吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）等的水平下降，也會影響其免疫調節(jié)功能，進而影響治療效果。6.3經驗總結與啟示從上述成功案例中可以總結出一系列寶貴的經驗，這些經驗為優(yōu)化細胞培養(yǎng)及應用提供了深刻的啟示。在細胞培養(yǎng)過程中，嚴格把控細胞的質量至關重要。從骨髓中分離hBMSCs時，應采用先進且精準的分離技術，確保分離得到的細胞純度高、活性強。在骨損傷修復案例中，高質量的hBMSCs是實現(xiàn)有效治療的基礎，只有細胞具備良好的增殖和分化能力，才能在與支架材料復合后，成功構建組織工程骨，促進骨缺損的修復。這啟示我們，在細胞培養(yǎng)的各個環(huán)節(jié)，都要加強質量控制，定期對細胞進行生物學特性檢測，如細胞活力、增殖能力、分化潛能等，確保細胞質量符合治療要求。選擇合適的培養(yǎng)條件對于維持hBMSCs的生物學特性至關重要。在體外培養(yǎng)過程中，應根據(jù)細胞的生長需求，優(yōu)化培養(yǎng)基的成分，合理添加血清、生長因子等物質。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療案例中，間充質干細胞的免疫調節(jié)特性需要在適宜的培養(yǎng)條件下才能得到充分維持和發(fā)揮，從而有效調節(jié)患者的免疫反應，控制疾病進展。這提示我們，要深入研究不同培養(yǎng)條件對hBMSCs生物學特性的影響，建立標準化的培養(yǎng)體系，為細胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定、適宜的環(huán)境。在臨床應用方面，需要根據(jù)患者的具體病情和個體差異，制定個性化的治療方案。不同患者的身體狀況、疾病嚴重程度以及對治療的反應各不相同，因此在治療過程中，應綜合考慮這些因素，選擇合適的細胞劑量、治療時機和治療方式。在骨損傷修復案例中，根據(jù)患者骨缺損的大小和部位，合理調整hBMSCs的用量和植入方式，能夠提高治療效果。在自身免疫性疾病治療中，根據(jù)患者的疾病活動度和免疫狀態(tài)，優(yōu)化間充質干細胞的輸注次數(shù)和劑量，有助于更好地控制疾病。這啟示我們，臨床治療應注重個性化，以提高治療的安全性和有效性。七、結論與展望7.1研究成果總結本研究通過對體外長期培養(yǎng)的人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）不同時相生物學特性的深入探究，取得了一系列具有重要理論和實踐意義的研究成果。在細胞形態(tài)方面，hBMSCs在培養(yǎng)初期呈現(xiàn)典型的長梭形，類似成纖維細胞形態(tài)，細胞之間排列緊密，形成漩渦狀或放射狀生長格局。隨著傳代次數(shù)的增加，細胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變，從長梭形逐漸變?yōu)椴灰?guī)則形狀，細胞體積增大，折光性降低，細胞之間的排列也變得松散。這些形態(tài)變化與細胞的功能狀態(tài)密切相關，早期典型形態(tài)的hBMSCs具有較強的增殖和分化能力，而隨著形態(tài)改變，細胞的增殖和分化能力逐漸下降。在增殖能力研究中，發(fā)現(xiàn)hBMSCs的增殖能力隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸降低。第3-5代hBMSCs的增殖能力較強，細胞生長曲線呈現(xiàn)典型的“S”型，在對數(shù)生長期，細胞倍增時間較短，能夠快速擴增。然而，從第7代開始，細胞的增殖速度明顯減緩，倍增時間延長，到第9-11代時，增殖能力進一步顯著下降，細胞長時間處于潛伏期，難以進入對數(shù)生長期。這一變化趨勢表明，體外長期培養(yǎng)會對hBMSCs的增殖活性產生負面影響，影響其在臨床應用中獲得足夠數(shù)量細胞的能力。對于分化潛能，hBMSCs在不同時相的分化潛能也發(fā)生了顯著改變。在成骨分化方面，第3-5代hBMSCs在成骨誘導條件下，堿性磷酸酶（ALP）活性顯著增強，骨鈣素（OCN）表達水平明顯升高，礦化結節(jié)形成能力較強，具有較強的成骨分化能力。隨著傳代次數(shù)的增加，成骨相關基因的表達逐漸下降，ALP活性降低，礦化結節(jié)形成減少，成骨分化潛能減弱。在成脂分化和成軟骨分化方面也有類似的現(xiàn)象，隨著傳代次數(shù)的增加，hBMSCs向脂肪細胞和軟骨細胞分化的能力逐漸降低。這說明體外長期培養(yǎng)會導致hBMSCs的分化潛能逐漸喪失，影響其在組織工程和再生醫(yī)學中的應用效果。在免疫調節(jié)特性方面，hBMSCs對免疫細胞的調節(jié)作用隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸減弱。第3-5代hBMSCs能夠顯著抑制T細胞、B細胞和自然殺傷細胞（NK細胞）等免疫細胞的增殖和活化，有