聚酮合酶

PKS是由細(xì)菌、放線菌、真菌或植物產(chǎn)生的一大類天然產(chǎn)物，包括大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、蒽環(huán)類、聚醚類等化合物。

這些天然產(chǎn)物具有抗感染、抗真菌、抗腫瘤、免疫抑制等活性。

紅霉素（erythromycin）、

利福霉素（rifamycin）、

四環(huán)素（tetracycline）、

兩性霉素（amphotericin）

等用作抗生素；

多柔比星（doxorubicin）、

埃博霉素（epothilone）、

光輝霉素（mithramycin）、

等用作抗腫瘤藥物；洛伐他?。╨ovastatin）和普伐他汀（pravastatin）用作降血脂藥物；雷帕霉素(rapamycin）用作免疫抑制劑；阿弗菌素（avermectin）莫能霉素（monensin）泰樂菌素（tylosin）等在農(nóng)牧業(yè)中的應(yīng)用也較廣泛聚酮化合物在臨床上應(yīng)用廣泛Ⅰ型聚酮合酶一般是由呈線性排列并共價(jià)結(jié)合的幾個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的多功能蛋白其中每個(gè)結(jié)構(gòu)域在聚酮化合物鏈的延伸過程中只參與一次反應(yīng).而一輪反應(yīng)中所有的功能結(jié)構(gòu)域合成一個(gè)結(jié)構(gòu)單元編碼這個(gè)合成單元的DNA稱為模塊（module）Ⅰ型聚酮合酶的各個(gè)功能單元呈線性排列酰基轉(zhuǎn)移酶（acyltransferase，AT）、?；d體蛋白（acylcarrierprotein，ACP）、酮脂酰合酶（ketoacylsynthase，KS）、酮還原酶（ketoreductase，KR）、脫水酶（dehydratase，DH）、烯酰還原酶（enoylreductase，ER）和硫脂酶（thioesterase，TE）。分別為Ⅰ型聚酮合酶首先由ACP將乙酰輔酶A活化的起始單位或延伸單位作為底物，（乙酸、丙二酸和丁酸等多種簡單羧酸）經(jīng)過KS的縮合反應(yīng)，將不同的羧酸起始或延伸單位進(jìn)行組裝，不斷地從一個(gè)?；d體蛋白ACP到下一個(gè)模塊，聚酮鏈也不斷得到延伸。在鏈延伸過程中根據(jù)模塊組成的不同和指令要求，在其他不同的DH、ER的作用下相應(yīng)地進(jìn)行還原，形成β-羥酯鍵，或脫水形成α，β-烯醇酯鍵，或進(jìn)一步還原形成飽和亞甲基，直至達(dá)到終點(diǎn)，最后在TE的作用下，聚酮前體從PKS上脫落下來。屬于PKSⅠ的聚酮產(chǎn)物包括雷帕霉素、紅霉素、利福霉素、阿維菌素、洛伐他汀和埃博霉素盡管各種聚酮化合物結(jié)構(gòu)各異，PKS模塊的底物特異性決定了Ⅰ型PKS對起始單位和延長單位的選擇，而PKS每個(gè)模塊上還原結(jié)構(gòu)域的種類則使聚酮產(chǎn)物得到不同程度的還原。復(fù)合聚酮化合物結(jié)構(gòu)的多樣性來自聚酮骨架組成單位的多樣性和每個(gè)碳單位的不同還原程度。這意味著聚酮化合物的結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)大的可塑性。，故可通過模塊內(nèi)或模塊間的合理重組，設(shè)計(jì)出新基因（簇）組成或新的生物合成途徑，合成大量新的聚酮化合物，為新藥開發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。PKSⅡⅡ型聚酮合酶由幾個(gè)獨(dú)立的酶組成眾多的PKSⅡ基因簇研究顯示該聚酮合酶主要催化芳香聚酮化合物的生物合成Ⅱ型聚酮化合物的碳骨架部分是由最小迭代用酶（minimalPKS）催化的minimalPKS由2個(gè)酮酰合酶單元組成的異源二聚體（KSα和KSβ）和1個(gè)ACP構(gòu)成（圖C）。Ⅱ型聚酮合酶亞單位中還包括KR、環(huán)化酶（cyclase，CYC）和芳香化酶（aromatases，ARO）這些酶類決定了初始聚酮化合物的折疊模式。乙酰輔酶A通常作為Ⅱ型聚酮化合物的起始單位，丙二酰輔酶A則作為延伸單位。KSα和KSβ亞單位中，兩者顯示出高度序列相似性。然而，與KSα相比，KSβ結(jié)構(gòu)中缺乏一個(gè)半胱氨酸活性位點(diǎn)，該位點(diǎn)在聚酮化合物裝配過程中起關(guān)鍵作用；但KSβ在碳鏈長度方面起著重要的作用，因此被稱為鏈長因子（chainlengthfactor，CLF）PKSⅢⅢ型聚酮合酶是一種重復(fù)使用的亞基分子大小為40×10^3~47×10^3的同源二聚體自主式合酶（圖D），能直接催化泛酞輔酶A間的縮合，形成單環(huán)或雙環(huán)芳香類聚酮化合物。盡管Ⅲ型聚酮合酶的結(jié)構(gòu)簡單，但能合成種類廣泛的酮類化合物，如查爾酮類、吡喃酮類、丫啶酮類等Ⅲ型聚酮合酶廣泛存在于植物、細(xì)菌中，甚至真菌中也存在。對植物中Ⅲ型聚酮合酶的研究較為廣泛。查爾酮合成酶為經(jīng)典代表。（chalconesyn-thaw，CHS）CHS以4-香豆酰-CoA為起始單元，3分子丙二酸-CoA作為底物，連續(xù)完成3步脫羧醇醛縮合，形成的四酮中間體經(jīng)環(huán)化生成柚配基查爾酮（naringeninchalcone），該化合物是植物黃酮和花青苷類色素的前體。Ⅲ型聚酮合酶從次級代謝產(chǎn)物的信號分子到生物活性的天然產(chǎn)物的生物合成中發(fā)揮著重要作用。與Ⅰ、Ⅱ型聚酮合酶相比Ⅲ型聚酮合酶分子小、結(jié)構(gòu)簡單，同時(shí)仍然保持聚酮鏈的延伸和環(huán)化功能。對Ⅲ型聚酮合酶的深入研究，有可能揭示未知的生物合成途徑，并產(chǎn)生有用的天然產(chǎn)物。聚酮化合物的異源表達(dá)聚酮化合物是臨床上使用較廣泛的一類天然產(chǎn)物，主要用于抗微生物、抗腫瘤方面。由于該類化合物生物合成途徑中延伸單位、鏈長度、修飾水平的不同，導(dǎo)致了其結(jié)構(gòu)的多樣性和數(shù)量的極其龐大。2.1大環(huán)內(nèi)酯類大環(huán)內(nèi)酯類（macrolides）化合物由Ⅰ型聚酮合酶裝配合成。大環(huán)內(nèi)酯類化合物依據(jù)其內(nèi)酯環(huán)的原子數(shù)目可分為12、14、15和16環(huán)等。該類化合物在臨床上具有抗菌、抗腫瘤、免疫抑制等生物活性。2.2四環(huán)素類四環(huán)素類（tetracycline）藥物是抑制細(xì)菌蛋白合成的一大類廣譜抗生素，廣泛用于多種細(xì)菌及立克次體、衣原體、支原體等感染所致疾病。四環(huán)素類藥物由Ⅱ型聚酮合酶途徑合成，該類化合物的結(jié)構(gòu)多樣性主要源于聚酮合成后的修飾。2.3蒽環(huán)類蒽環(huán)類（anthracycine）化合物由Ⅱ型聚酮合酶合成。該類化合物在腫瘤治療方面發(fā)揮重要作用，例如在治療急性非淋巴細(xì)胞性白血病、惡性淋巴瘤、肉瘤、乳腺癌等方面具有良好的治療效果。2.4聚醚類聚醚類（polyether）化合物一般由Ⅰ型聚酮合酶合成。3異源表達(dá)宿主一般要求具備以下條件：①異源宿主本身不含或已缺失相應(yīng)聚酮合酶基因，避免宿主本身聚酮合酶的背景干擾；②宿主不能存在剪切外源表達(dá)酶的相關(guān)剪切酶；③宿主能大量表達(dá)相當(dāng)大的聚酮合酶蛋白（相對分子質(zhì)量≥300×10^3）；④宿主能翻譯后修飾蛋白；⑤宿主能提供大量的乙酰CoA、丙二酰CoA、甲基丙二酰CoA等聚酮合成起始單元。一些主要聚酮類化合物合成途徑參與土曲霉洛伐他汀合成途徑的酶包括:兩個(gè)多聚乙酰合成酶洛伐他汀二酮體合成酶（lovastatindiketonesynthetase，LDKS)和洛伐他汀九酮體合成酶（lovastatinnonaketidesynthetaseLNKS)〔分別由lovB和lovF基因編碼)、轉(zhuǎn)酯酶〔由lovD基因編碼)、烯酯酰還原酶〔由lovC基因編碼)和P450單加氧酶〔由lovA基因編碼)其具體合成途徑如圖1所示。LNKS和LDKS均含有酮合成酶（ketosynthase，KS)、酞基轉(zhuǎn)移酶（acyltransfarase，AT)、酮還原酶（ketoreductase，KR）、脫水酶（dehydratase，DH),酞基載體蛋白(acylcarrierprotein，ACP)及甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase，MeT)功能域，并分別參與合成洛伐他汀九酮主體和二酮側(cè)鏈，再由lovD編碼的轉(zhuǎn)酯酶將二者連接起來合成洛伐他汀紅曲色素廣泛應(yīng)用于腌制品和肉制品的著色防腐，具有保健功效和藥用價(jià)值，在世界各地都有巨大的市場，在東南亞國家的應(yīng)用尤為廣泛.G首先由1mol丁烯酰輔酶A(coenzymeA，CoA)和4mol丙二酰CoA在聚酮合酶的作用下生成六聚酮化合物，隨后由脂肪酸生物合成途徑產(chǎn)生的己酸與六酮聚酮化合物經(jīng)醛醇縮合。最后，經(jīng)脫水反應(yīng)生成紅曲玉紅素。在過去幾十年中，聚酮化合物的開發(fā)大多采用篩選環(huán)境微生物活性的傳統(tǒng)方法，其流程包括微生物分離純化、大量培養(yǎng)、培養(yǎng)物收集、目標(biāo)化合物抽提、鑒定及開發(fā)利用。但通過這種方法化合物重復(fù)發(fā)現(xiàn)的概率極高，且由于培養(yǎng)基配方引起活性次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量低下或者靶點(diǎn)局限造成漏篩的現(xiàn)象十分普遍。于是，人們通過基因定向篩選從自然界中獲得產(chǎn)生目標(biāo)活性化合物的菌種資源，并對不需要的重復(fù)的化合物產(chǎn)生菌進(jìn)行早期鑒別和定向剔除，既可節(jié)省大量的精制、結(jié)構(gòu)解析和分析時(shí)間，又能節(jié)約經(jīng)費(fèi)，大大提高工作效率。細(xì)菌是大量聚酮類、非核糖體肽類、萜類、黃酮類化合物的重要來源，發(fā)酵是獲得這些化合物的重要手段之一。通過原始菌株生產(chǎn)天然產(chǎn)物最大的挑戰(zhàn)是從微生物中分離原始菌株。許多產(chǎn)生天然產(chǎn)物的微生物不能從土壤中分離出來，原因是99%的微生物離開它們自然的環(huán)境就不能生長。因此，異源表達(dá)將解決這樣的問題。TheEnd

制作人：喬士達(dá)公司變更、合并與分立一、公司的變更

（一）公司章程的修改（二）公司注冊資本的變更（三）公司組織形式的變更二、公司合并

一、公司合并的概念、形式及特征二、比較公司合并與公司兼并三、公司合并的程序四、公司合并中相關(guān)主體的利益保護(hù)三、公司分立公司的變更一、公司變更的概念及原因

（一）公司變更的概念

有廣義和狹義兩種理解廣義的公司變更，是指公司設(shè)立登記事項(xiàng)中某一項(xiàng)或某幾項(xiàng)的改變。狹義的公司變更，主要是指公司組織形式的變更。應(yīng)從廣義的角度理解公司變更。公司的變更（二）公司變更的原因

1．消極原因指引起公司變更其設(shè)立登記事項(xiàng)是由于某些情勢變化或本身經(jīng)營管理不善，從而使公司不得不進(jìn)行某方面變更之原因。

2．積極原因積極原因，又稱主動原因，指引起公司變更其設(shè)立登記事項(xiàng)是由于公司主動采取積極競爭措施所致。公司的變更二、公司變更的主要內(nèi)容

（一）公司章程的修改1．公司章程修改的原則a、不得違背法律和行政法規(guī)b、不得損害股東利益，尤其注意防止大股東利用控股的優(yōu)勢對章程作出損害中小股東利益的修改c、不得損害債權(quán)人和其他第三人的利益，如通過減資以逃避債務(wù)

公司的變更2．公司章程修改的理由公司法對導(dǎo)致公司章程修改的原因未做限制，只規(guī)定公司可以修改章程。公司法有幾處特別規(guī)定：a、公司可以通過修改公司章程來改變公司經(jīng)營范圍（法第12條）b、當(dāng)出現(xiàn)章程規(guī)定的營業(yè)期限屆滿或章程規(guī)定的其他解散事由，可以通過修改章程使公司存續(xù)（法第75條第1款，第182條）

公司的變更3．公司章程的修改程序

修改公司章程是股東（大）會的一項(xiàng)重要權(quán)力，但股東大會行使權(quán)利時(shí)必須依照法定程序進(jìn)行才能保證修改有效。主要程序是：（1）由董事會擬定并提出修改章程的方案（2）董事會在股東（大）會召開前將方案通知各股東（3）股東(大）會審議通過，若需要報(bào)經(jīng)審批的要通過審批公司的變更（4）辦理變更登記，修改事項(xiàng)屬于法律、法規(guī)要求披露的信息，按規(guī)定公告。3．公司章程修改后的效力修改章程本身沒有登記生效的條件，因此修改章程在股東（大）會作出決議時(shí)生效（判斷：章程修改經(jīng)變更登記后生效）新修改的公司章程對公司、股東、董事、監(jiān)事及高管人員具有約束力（法第11條），公司的經(jīng)營活動不能違反公司章程。

公司的變更

（二）公司注冊資本的變更

1．注冊資本的增加

（1）股份公司增資的方法股份公司增加注冊資本的方法有以下3種：A．增加股份數(shù)額B．增加每股金額C．既增加股份數(shù)額，又增加每股金額公司的變更（2）有限責(zé)任公司的增資，主要可采用兩種方式：a、增加新股東以增加資本，但增加后的股東人數(shù)不得超過公司法規(guī)定的最高股東人數(shù)。b、由公司原股東增加出資額有限責(zé)任公司增加資本，須由股東會特別決議批準(zhǔn)，該特別決議須經(jīng)代表公司三分之二以上表決權(quán)的股東通過。公司的變更（3）公司增加注冊資本的程序A．由股東（大)會作出決議B．增量發(fā)行新股應(yīng)符合法定條件（證券法第13條）C．發(fā)行新股須進(jìn)行審批及公告D．股份有限公司經(jīng)股東大會決議將公積金轉(zhuǎn)為資本時(shí)，按股東原有股份比例派送新股或增加每股面值E．公司增加注冊資本后，應(yīng)依法向公司登記機(jī)關(guān)辦理變更登記。公司的變更

（4）解讀公司法第179條（準(zhǔn)用條款）1、有限公司股東認(rèn)繳新增資本的出資，還應(yīng)遵守下列條文：a、出資繳納及責(zé)任（法第28條）b、驗(yàn)資（法第29條）c、屬于特殊表決事項(xiàng)（法第44條）2、股份公司股東增加注冊資本發(fā)行新股時(shí)，還應(yīng)遵守下列條文：a、股東大會的決議事項(xiàng)（法第134條）b、公告、承銷、收款c、作價(jià)方案的確定（法第136條）d、登記及公告（法第137條)法第88、89、135條公司的變更2．注冊資本的減少

（1）股份公司減資的方法A．減少股份數(shù)股份合并，是將兩個(gè)以上的股份合并為一股，以減少資本；股份的注銷，是指公司取得自己的股份，從而使其注銷。B．減少股份金額C．同時(shí)減少股份金額與股份數(shù)公司的變更（2）公司減資程序A．召集股東（大）會作出減少注冊資本的決議B．編制資產(chǎn)負(fù)債表和財(cái)產(chǎn)清單C．通知和公告?zhèn)鶛?quán)人D．修改公司章程并辦理公司變更登記。注意：公司減資后的注冊資本不得低于法定的最低限額。法第178條法第178條第2款公司的變更（三）公司組織形式的變更

1．公司組織形式變更的概念和意義公司組織形式變更，又稱公司組織形式轉(zhuǎn)換，也稱公司轉(zhuǎn)型，是指不中斷公司的法人資格，而將公司由一種法定形態(tài)變?yōu)榱硪环N法定形態(tài)的行為。

2．公司組織形式變更的類型公司組織變更各國對此多采取限制主義。公司法只規(guī)定有限責(zé)任公司與股份有限公司之間的變更。法第9條公司的變更3．公司組織形式變更的條件(法第9條第2款，第96條）根據(jù)公司法的規(guī)定，有限公司變更為股份公司應(yīng)符合以下條件：（1）變更后的公司應(yīng)當(dāng)具備股份公司的條件（2）變更程序必須按照公司法關(guān)于設(shè)立股份公司的程序辦理（3）變更后的股份公司向原有限公司股東折合的實(shí)收股本總額不得高于原有限公司的凈資產(chǎn)額。（4）公司為實(shí)現(xiàn)組織變更的目的向社會公開募集股份時(shí)，應(yīng)依照公司法關(guān)于向社會公眾募股的規(guī)定辦理（5）原有限公司的債權(quán)、債務(wù)由變更后的股份公司承繼。公司的變更4．公司組織形式變更的程序

根據(jù)公司法的規(guī)定，具體程序?yàn)椋海?）擬定變更方案（2）通過變更決議（3）編制資產(chǎn)負(fù)債表和財(cái)產(chǎn)目錄，核定及認(rèn)繳出資額或股份（4）報(bào)政府主管部門批準(zhǔn)，股東會議決議修改公司章程（5）辦理變更登記公司合并一、公司合并的概念、形式及特征

（一）概念是指兩個(gè)或兩個(gè)以上公司達(dá)成協(xié)議，依法定程序歸并為其中的一個(gè)公司或創(chuàng)設(shè)另一個(gè)新公司的法律行為。

（二）形式

(法第173條）a．新設(shè)合并，指兩個(gè)或兩個(gè)以上公司合并成一個(gè)新的公司，參與合并各方均歸于消滅。A＋BCb．吸收合并，指兩個(gè)或兩個(gè)以上的公司合并后，其中有一個(gè)公司（吸收方）存續(xù)，而其余公司(被吸收方）均歸消滅的法律行為。A＋BA公司合并（三）特征:1、公司合并是公司之間“合二為一”或“合多為一”的法律行為，因此合并必須以兩個(gè)或兩個(gè)以上的公司存在為前提，可見，公司法意義上的合并必須是在公司（非股東）之間進(jìn)行2、公司合并是依約和依法進(jìn)行的法律行為，是當(dāng)事人“意思一致”的合同行為3、公司合并必然引起公司變更的法律后果，這種變更既有合并前主體資格的變更，也有合并前公司權(quán)利義務(wù)的變更，具體表現(xiàn)：

a．除吸收合并中吸收公司存續(xù)外，其他參與合并的公司和法人資格均歸于消失；

公司合并b．因合并而消失了的公司的權(quán)利、義務(wù)，均為存續(xù)公司或新設(shè)公司概括承受（法第175條，合同法第90條）；c．消失公司的股份全部轉(zhuǎn)換為存續(xù)公司或新設(shè)公司的股份、債券或現(xiàn)金；d.合并后的公司性質(zhì):股份公司之間合并后仍為股份公司，上市公司和有限公司合并后為股份公司，非上市的股份公司與有限公司合并后可以是股份公司，也可以是有限公司。公司合并

二、比較公司合并與公司兼并兼并，是指一個(gè)企業(yè)通過購買其他企業(yè)的產(chǎn)權(quán)或股份的方式，從而使其他企業(yè)失去法人資格或被控股的法律行為。根據(jù)《企業(yè)兼并的暫行辦法》：

承擔(dān)債務(wù)式合并購買式企業(yè)兼并吸收股份式收購控股式公司合并公司收購（證券法第4章《上市公司收購》，是指受讓公司通過購買出讓公司一定數(shù)額的股權(quán)（一般為50%以上），從而實(shí)際控制出讓公司（出讓公司繼續(xù)存在）的法律行為。公司合并與公司收購的區(qū)別：A、公司收購中收購方必須要向?qū)Ψ街Ц秾r(jià)，而公司合并則可以通過債權(quán)債務(wù)的概括承受整體接收被合并公司，合并方無需相對方支付對價(jià)；B、公司收購的主體無特別要求，除了被收購方為公司外，另一方主體則既可以是公司等企業(yè)法人組織，也可是自然人（如MBO管理層收購）、不具備法人資格的企業(yè)等，而公司合并的主體必須在公司之間。公司合并三、公司合并的程序合并屬于公司的重大法律行為，涉及公司的存續(xù)、公司股東、債權(quán)人的利益，因此各國公司法都對公司合并加以規(guī)制，設(shè)定了較嚴(yán)格的程序。我國公司法規(guī)定的合并程序主要包括：A、董事會制定合并方案（法第47、109條）；B、股東（大）會做出決議（法第44、104條第2款）；C、合并各方簽訂合并協(xié)議（法第174條）；

D、處理債權(quán)、債務(wù)等各項(xiàng)合并事項(xiàng)（法第174條）；E、向公司登記機(jī)關(guān)辦理變更登記、注銷登記和設(shè)立登記。（法第180條）公司合并四、公司合并中相關(guān)主體的利益保護(hù)（一）股東利益保護(hù)a、對公司股東的信息披露(為了防止大股東的“暗箱操作”），

美國，在合并協(xié)議通過前，董事會應(yīng)將合并方案或合并協(xié)議連同召開股東大會的通知，一起發(fā)送給每位股東；德國，合并合同及草案在股東大會召開之前必須提交商業(yè)登記簿登記注冊，并從大會召開之日起，公司業(yè)務(wù)室陳列合并材料供股東查閱；我國，有關(guān)公司的信息披露祥見于證券法，公司法的相關(guān)規(guī)定較為原則且條文數(shù)量少，對合并的相關(guān)信息披露制度也沒有作專門的規(guī)定，但透過其他條文可以找到這方面內(nèi)容（如法第34、98條）。公司合并b、異議股東股份回購請求權(quán)c、其他保障性法律制度：如：規(guī)定相關(guān)人員的義務(wù)，如規(guī)定董事和控制股東的誠信義務(wù)、表決權(quán)排除制度等，規(guī)定股東權(quán)益受到侵害時(shí)的救濟(jì)制度（如派生訴訟、直接訴訟等）（二）債權(quán)人利益保護(hù)1、對債權(quán)人的告知制度公司法第174條規(guī)定了合并的公司應(yīng)當(dāng)向債權(quán)人履行告知的義務(wù)，并涉及告知的時(shí)間和方式，但沒有具體規(guī)定告知的內(nèi)容和告知的效力，第205條還規(guī)定了公司未依法通知或公告?zhèn)鶛?quán)人的行政法律責(zé)任。公