Let-7b和miR-199a：黑色素瘤B16F10細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖調(diào)控的分子奧秘一、引言1.1研究背景與意義黑色素瘤是一種起源于黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類健康。黑色素瘤具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的5年生存率急劇下降，預(yù)后極差。據(jù)統(tǒng)計(jì)，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的5年生存率僅為15%-20%，且目前針對(duì)晚期黑色素瘤的治療手段有限，療效不盡人意。因此，深入研究黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)和策略，具有重要的臨床意義。細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)，黑色素瘤細(xì)胞的異常增殖是其惡性行為的關(guān)鍵特征之一。研究黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的調(diào)控機(jī)制，有助于揭示黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新的治療方法提供理論依據(jù)。在眾多參與細(xì)胞增殖調(diào)控的分子中，微小RNA（microRNA，miRNA）近年來(lái)受到了廣泛關(guān)注。miRNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝等多種生物學(xué)過(guò)程，其表達(dá)異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括黑色素瘤。Let-7b和miR-199a作為miRNA家族的重要成員，在黑色素瘤的研究中逐漸嶄露頭角。已有研究表明，Let-7b和miR-199a在黑色素瘤組織中的表達(dá)水平與正常組織相比存在顯著差異，提示它們可能在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Let-7b在多種腫瘤中被報(bào)道具有抑癌作用，其通過(guò)調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)，參與細(xì)胞周期的調(diào)控、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等過(guò)程。在黑色素瘤中，Let-7b的表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致其對(duì)靶基因的抑制作用減弱，從而促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。miR-199a同樣被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其在黑色素瘤中的作用機(jī)制也逐漸成為研究熱點(diǎn)。miR-199a可能通過(guò)靶向調(diào)控某些關(guān)鍵信號(hào)通路中的分子，影響黑色素瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。對(duì)Let-7b和miR-199a在黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖中的作用進(jìn)行深入研究，不僅有助于進(jìn)一步理解黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制，還可能為黑色素瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。通過(guò)調(diào)控Let-7b和miR-199a的表達(dá)水平，有望開(kāi)發(fā)出針對(duì)黑色素瘤的新型治療策略，提高黑色素瘤患者的生存率和生活質(zhì)量。因此，本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與問(wèn)題提出本研究旨在深入探究Let-7b和miR-199a對(duì)B16F10細(xì)胞（一種常用的黑色素瘤細(xì)胞系）生長(zhǎng)與增殖的影響。通過(guò)對(duì)這兩種miRNA的研究，期望揭示它們?cè)诤谏亓黾?xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控中的具體作用機(jī)制，為黑色素瘤的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)?；诖搜芯磕康模岢鲆韵玛P(guān)鍵問(wèn)題：Let-7b和miR-199a如何影響B(tài)16F10細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖過(guò)程？是通過(guò)促進(jìn)還是抑制作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的？這種影響在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等關(guān)鍵生物學(xué)事件中如何體現(xiàn)？Let-7b和miR-199a對(duì)B16F10細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的影響是否存在協(xié)同作用？如果存在，它們之間的協(xié)同機(jī)制是怎樣的？是通過(guò)調(diào)控相同的信號(hào)通路，還是各自作用于不同的靶點(diǎn)，進(jìn)而共同影響細(xì)胞的生物學(xué)行為？Let-7b和miR-199a在調(diào)控B16F10細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖時(shí)，其下游的靶基因有哪些？這些靶基因參與了哪些重要的信號(hào)通路，從而介導(dǎo)了Let-7b和miR-199a對(duì)細(xì)胞的調(diào)控作用？在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Let-7b和miR-199a的表達(dá)變化與B16F10細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的異常之間存在怎樣的關(guān)聯(lián)？能否將它們作為黑色素瘤診斷、預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物，以及治療干預(yù)的潛在靶點(diǎn)？1.3研究方法與技術(shù)路線細(xì)胞培養(yǎng)：復(fù)蘇并培養(yǎng)B16F10細(xì)胞，使用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期換液和傳代，保持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。基因轉(zhuǎn)染：設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對(duì)Let-7b和miR-199a的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和inhibitor干擾片段。將B16F10細(xì)胞分為空白組、Let-7b質(zhì)粒組、miR-199a質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組、Let-7binhibitor組、miR-199ainhibitor組、inhibitor對(duì)照組。運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或電穿孔法等基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將對(duì)應(yīng)組別的外源基因?qū)隑16F10細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。RNA提取與qRT-PCR檢測(cè)：采用TRIzol法提取轉(zhuǎn)染后各組B16F10細(xì)胞的總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物和SYBRGreen熒光染料，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)Let-7b和miR-199a的表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過(guò)2^-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，分析基因轉(zhuǎn)染對(duì)Let-7b和miR-199a表達(dá)的影響。蛋白質(zhì)提取與WB檢測(cè)：收集轉(zhuǎn)染后的B16F10細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉后，加入針對(duì)目的蛋白（如與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的蛋白）和內(nèi)參蛋白（如β-actin）的一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，洗膜后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。最后通過(guò)化學(xué)發(fā)光法顯影，利用圖像分析軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，從蛋白水平探究Let-7b和miR-199a對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響。CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力：將轉(zhuǎn)染后的B16F10細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于96孔板中，每組設(shè)置多個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h等不同時(shí)間點(diǎn)，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)。然后使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度（OD值），以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，評(píng)估Let-7b和miR-199a對(duì)B16F10細(xì)胞增殖能力的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡：收集轉(zhuǎn)染后的B16F10細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2-3次。對(duì)于細(xì)胞周期檢測(cè)，將細(xì)胞用70%冷乙醇固定，4℃過(guò)夜，然后加入PI染液和RNaseA，37℃孵育30分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況；對(duì)于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，按照試劑盒說(shuō)明書操作，將細(xì)胞與AnnexinV-FITC和PI染液室溫避光孵育15-20分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，分析Let-7b和miR-199a對(duì)B16F10細(xì)胞周期和凋亡的影響。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)靶基因：運(yùn)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件，如TargetScan、miRanda等，預(yù)測(cè)Let-7b和miR-199a的潛在靶基因。對(duì)預(yù)測(cè)得到的靶基因進(jìn)行功能富集分析和信號(hào)通路分析，篩選出與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖密切相關(guān)的靶基因和信號(hào)通路，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供理論依據(jù)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶基因：針對(duì)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的Let-7b和miR-199a的靶基因，構(gòu)建含有靶基因3'UTR野生型和突變型的雙熒光素酶報(bào)告基因載體。將報(bào)告基因載體與Let-7b或miR-199a的過(guò)表達(dá)質(zhì)?；騣nhibitor共轉(zhuǎn)染至B16F10細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，按照說(shuō)明書操作，在多功能酶標(biāo)儀上檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計(jì)算熒光素酶活性比值，驗(yàn)證Let-7b和miR-199a與靶基因之間的靶向關(guān)系。本研究技術(shù)路線如下：首先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)染，構(gòu)建不同處理組的B16F10細(xì)胞模型；然后從RNA水平、蛋白水平和細(xì)胞水平三個(gè)層面，分別利用qRT-PCR、WB、CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)等方法，檢測(cè)Let-7b和miR-199a對(duì)B16F10細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖相關(guān)指標(biāo)的影響；同時(shí)借助生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)靶基因，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，從而全面深入地探究Let-7b和miR-199a對(duì)B16F10細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的作用及其機(jī)制，具體流程見(jiàn)圖1-1。[此處插入技術(shù)路線圖1-1，圖中清晰展示從細(xì)胞培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染、各指標(biāo)檢測(cè)到靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證的整個(gè)研究流程][此處插入技術(shù)路線圖1-1，圖中清晰展示從細(xì)胞培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染、各指標(biāo)檢測(cè)到靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證的整個(gè)研究流程]二、相關(guān)理論與研究基礎(chǔ)2.1B16F10細(xì)胞概述B16F10細(xì)胞是一種源自C57BL/6J小鼠的黑色素瘤細(xì)胞系，在黑色素瘤研究領(lǐng)域占據(jù)著舉足輕重的地位。1954年，B16細(xì)胞首次被成功建立，其來(lái)源于C57BL/6J小鼠皮膚黑色素瘤，天然具備轉(zhuǎn)移能力，這一特性使其成為研究實(shí)體瘤形成和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制的理想模型。而B(niǎo)16F10細(xì)胞作為B16細(xì)胞的亞系，更是在肺轉(zhuǎn)移潛能上表現(xiàn)突出，相較于其他亞系，它能夠更高效地在小鼠肺部形成轉(zhuǎn)移灶，為腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)研究提供了極為關(guān)鍵的研究材料。在細(xì)胞形態(tài)方面，B16F10細(xì)胞在顯微鏡下呈現(xiàn)出成纖維細(xì)胞樣外觀，細(xì)胞形態(tài)較為細(xì)長(zhǎng)，具有明顯的極性。在生長(zhǎng)特性上，它具有極強(qiáng)的增殖能力，僅需接種少量細(xì)胞，便能在短短數(shù)天內(nèi)形成肉眼可見(jiàn)的克隆，這一快速增殖的特點(diǎn)使得研究人員能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。同時(shí)，B16F10細(xì)胞還具備高度的侵襲性，能夠突破細(xì)胞外基質(zhì)的限制，向周圍組織浸潤(rùn)，模擬黑色素瘤在體內(nèi)的惡性侵襲過(guò)程。此外，其成瘤率高，當(dāng)將其接種到C57BL/6J小鼠皮下時(shí)，能夠高效地形成腫瘤，且腫瘤生長(zhǎng)迅速，為體內(nèi)腫瘤模型的構(gòu)建提供了便利。在黑色素瘤研究中，B16F10細(xì)胞有著廣泛的應(yīng)用。由于其易于在體內(nèi)追蹤的特點(diǎn)，常被用于體內(nèi)追蹤和轉(zhuǎn)移研究，科研人員可以通過(guò)標(biāo)記B16F10細(xì)胞，觀察其在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移路徑和定植部位，深入探究黑色素瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制。例如，通過(guò)尾靜脈注射B16F10細(xì)胞，可以建立小鼠肺轉(zhuǎn)移模型，研究腫瘤細(xì)胞如何通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)肺部并形成轉(zhuǎn)移灶。在研究細(xì)胞對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)時(shí)，B16F10細(xì)胞也發(fā)揮著重要作用，通過(guò)將其與疫苗共同作用于小鼠，觀察小鼠免疫系統(tǒng)的應(yīng)答情況，評(píng)估疫苗的有效性。此外，在抗癌藥物篩選領(lǐng)域，B16F10細(xì)胞更是不可或缺的工具，利用其對(duì)不同藥物的敏感性差異，篩選出具有潛在抗癌活性的藥物，為黑色素瘤的臨床治療提供新的藥物選擇。B16F10細(xì)胞憑借其獨(dú)特的來(lái)源、顯著的特性以及廣泛的應(yīng)用，成為黑色素瘤研究中不可或缺的細(xì)胞模型，為深入探究黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制、轉(zhuǎn)移規(guī)律以及開(kāi)發(fā)有效的治療手段提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。2.2Let-7b和miR-199a簡(jiǎn)介L(zhǎng)et-7b和miR-199a均屬于微小RNA（miRNA）家族，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演著重要角色，尤其是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，二者的作用備受關(guān)注。Let-7b最早在秀麗隱桿線蟲(chóng)中被發(fā)現(xiàn)，是Let-7家族的重要成員。其基因序列高度保守，在不同物種間具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。Let-7b基因通常位于基因組的非編碼區(qū)域，轉(zhuǎn)錄后形成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-Let-7b）。pri-Let-7b在細(xì)胞核內(nèi)被Drosha酶切割，形成長(zhǎng)度約為70-100個(gè)核苷酸的前體miRNA（pre-Let-7b），pre-Let-7b具有典型的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。隨后，pre-Let-7b被Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，在Dicer酶的作用下，進(jìn)一步切割成為成熟的Let-7b，其長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。成熟的Let-7b通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過(guò)程，或者促使mRNA降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控。在腫瘤研究領(lǐng)域，Let-7b被廣泛認(rèn)為是一種潛在的抑癌miRNA。眾多研究表明，Let-7b在多種腫瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)。例如，在肺癌中，Let-7b的低表達(dá)與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Let-7b可以通過(guò)靶向調(diào)控RAS、MYC等癌基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。在乳腺癌中，Let-7b同樣發(fā)揮著抑癌作用，它能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，使腫瘤細(xì)胞阻滯在G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。此外，Let-7b還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。miR-199a也是一類重要的miRNA，其生物合成過(guò)程與Let-7b類似，同樣經(jīng)歷pri-miR-199a、pre-miR-199a到成熟miR-199a的加工過(guò)程。miR-199a存在多個(gè)亞型，如miR-199a-5p和miR-199a-3p，不同亞型在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平和功能存在差異。miR-199a通過(guò)與靶mRNA的特異性結(jié)合，參與細(xì)胞的多種生物學(xué)過(guò)程。在腫瘤研究中，miR-199a的作用較為復(fù)雜，其既可能作為抑癌基因，也可能表現(xiàn)出促癌作用，這取決于腫瘤的類型和具體的生物學(xué)背景。在腎細(xì)胞癌中，研究發(fā)現(xiàn)miR-199a的表達(dá)顯著低于癌旁相對(duì)正常組織，且其表達(dá)下調(diào)與腎癌患者原發(fā)腫瘤浸潤(rùn)程度、復(fù)發(fā)及預(yù)后不良有關(guān)。進(jìn)一步研究表明，miR-199a可以通過(guò)靶向調(diào)控mTOR等信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，抑制腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。然而，在某些腫瘤中，如骨肉瘤，miR-199a卻呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。這提示miR-199a在腫瘤中的作用具有多樣性，其具體機(jī)制仍有待深入研究。Let-7b和miR-199a作為重要的miRNA，通過(guò)精細(xì)調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡等生物學(xué)過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。對(duì)它們的深入研究，有助于揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制，為腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的靶點(diǎn)和策略。2.3細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的調(diào)控機(jī)制細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖是一個(gè)受到嚴(yán)格調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，涉及眾多關(guān)鍵調(diào)控因子和信號(hào)通路的協(xié)同作用，這些調(diào)控機(jī)制對(duì)于維持細(xì)胞的正常生理功能以及組織器官的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。一旦這些調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常，細(xì)胞可能會(huì)發(fā)生異常增殖，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤等疾病的發(fā)生。細(xì)胞周期是細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的核心過(guò)程，它包括G1期、S期、G2期和M期四個(gè)主要階段。在G1期，細(xì)胞主要進(jìn)行蛋白質(zhì)和RNA的合成，為DNA復(fù)制做準(zhǔn)備；S期是DNA合成期，細(xì)胞進(jìn)行DNA的復(fù)制，將遺傳物質(zhì)加倍；G2期細(xì)胞繼續(xù)合成蛋白質(zhì)和RNA，進(jìn)一步為細(xì)胞分裂做準(zhǔn)備；M期則是細(xì)胞分裂期，包括有絲分裂和胞質(zhì)分裂，一個(gè)母細(xì)胞分裂為兩個(gè)子細(xì)胞。細(xì)胞周期的進(jìn)程受到細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）、細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKI）等關(guān)鍵調(diào)控因子的精確調(diào)控。CDK是細(xì)胞周期調(diào)控的核心激酶，其活性依賴于與Cyclin的結(jié)合。不同的Cyclin在細(xì)胞周期的不同階段表達(dá)，與相應(yīng)的CDK形成復(fù)合物，激活CDK的激酶活性，推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程。例如，在G1期，CyclinD與CDK4/6結(jié)合，使下游的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）磷酸化，磷酸化的Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)許多與細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼CyclinE、A和CDK1的基因，從而推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。在S期，CyclinE與CDK2結(jié)合，參與DNA復(fù)制的起始和調(diào)控；在G2期和M期，CyclinA和CyclinB分別與CDK1結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂并完成分裂過(guò)程。CKI則通過(guò)與Cyclin-CDK復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制CDK的活性，從而負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同，CKI主要分為Ink4家族和Cip/Kip家族。Ink4家族包括p16、p15、p18和p19等，它們特異性地抑制CDK4/6的活性，阻止Rb蛋白的磷酸化，使細(xì)胞停滯在G1期。Cip/Kip家族包括p21、p27和p57等，它們可以抑制多種Cyclin-CDK復(fù)合物的活性，對(duì)細(xì)胞周期的多個(gè)階段進(jìn)行調(diào)控。例如，p21可以與CyclinD-CDK4/6、CyclinE-CDK2和CyclinA-CDK2等復(fù)合物結(jié)合，抑制其激酶活性，使細(xì)胞阻滯在G1期或G2期；p27主要抑制CyclinE-CDK2和CyclinA-CDK2的活性，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。除了上述核心調(diào)控因子外，細(xì)胞周期還受到多種信號(hào)通路的調(diào)控，其中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路和Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖中發(fā)揮著重要作用。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路可以被多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和激素等激活。當(dāng)該信號(hào)通路被激活時(shí)，PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募并激活A(yù)kt蛋白。激活的Akt可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖，一方面，Akt可以磷酸化并抑制結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物2（TSC2），解除其對(duì)mTOR復(fù)合物1（mTORC1）的抑制作用，激活mTORC1。mTORC1可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞代謝和自噬等過(guò)程，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖；另一方面，Akt還可以磷酸化并激活一些轉(zhuǎn)錄因子，如FoxO家族成員，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展。Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路也是細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的關(guān)鍵調(diào)控通路。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，Ras蛋白被激活，激活的Ras結(jié)合并激活Raf蛋白，Raf蛋白進(jìn)一步磷酸化并激活MEK蛋白，MEK蛋白再磷酸化并激活ERK蛋白。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Myc等，調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、分化和存活相關(guān)基因的表達(dá)。此外，ERK還可以通過(guò)磷酸化一些細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，如CyclinD1、p27等，直接影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的調(diào)控是一個(gè)精密而復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，涉及細(xì)胞周期的核心調(diào)控因子以及眾多信號(hào)通路的協(xié)同作用。這些調(diào)控機(jī)制的失衡與腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，深入研究這些調(diào)控機(jī)制，對(duì)于理解腫瘤的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)有效的治療策略具有重要意義。三、Let-7b對(duì)B16F10細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的影響3.1Let-7b過(guò)表達(dá)對(duì)B16F10細(xì)胞的作用3.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為深入探究Let-7b對(duì)B16F10細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的影響，本實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行Let-7b過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。通過(guò)基因合成技術(shù)，獲得含有Let-7b成熟序列的DNA片段，并將其克隆到合適的真核表達(dá)質(zhì)粒載體中，構(gòu)建成Let-7b過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。在構(gòu)建過(guò)程中，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保插入的Let-7b序列準(zhǔn)確無(wú)誤。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16F10細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種密度為5×10^5個(gè)細(xì)胞，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)到60%-70%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。實(shí)驗(yàn)設(shè)置三組：空白對(duì)照組，不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染處理，僅加入正常的細(xì)胞培養(yǎng)液；陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒，以排除質(zhì)粒載體本身對(duì)細(xì)胞的影響；Let-7b過(guò)表達(dá)組，轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的Let-7b過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒導(dǎo)入B16F10細(xì)胞。具體步驟如下：在無(wú)菌的1.5mlEP管中，分別加入500μl無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，然后在其中一管中加入10μl脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，室溫靜置5分鐘；在另一管中加入5μg的Let-7b過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（或空質(zhì)粒），同樣輕輕混勻，室溫靜置5分鐘。隨后，將含有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基與含有質(zhì)粒的培養(yǎng)基混合，輕輕吹打均勻，室溫靜置20分鐘，使脂質(zhì)體與質(zhì)粒充分結(jié)合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液吸出，用PBS清洗細(xì)胞2次，然后向每孔加入1.5ml含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基，將6孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)。4-6小時(shí)后，吸出含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，向每孔加入2ml含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，使轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞充分表達(dá)目的基因。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)Let-7b在B16F10細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)效果。使用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用Let-7b特異性引物和SYBRGreen熒光染料，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，通過(guò)2^-ΔΔCt法計(jì)算Let-7b在各組細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)，采用WB檢測(cè)Let-7b下游相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，以進(jìn)一步驗(yàn)證Let-7b的過(guò)表達(dá)效果及對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的影響。收集各組細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后在4℃下12000rpm離心15分鐘，收集上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時(shí)，然后加入針對(duì)Let-7b下游相關(guān)蛋白的一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時(shí)。最后，使用化學(xué)發(fā)光法顯影，利用圖像分析軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Let-7b過(guò)表達(dá)組中Let-7b的相對(duì)表達(dá)量相較于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），分別為空白對(duì)照組的5.67倍和陰性對(duì)照組的5.54倍，表明Let-7b過(guò)表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入B16F10細(xì)胞，并有效提高了Let-7b的表達(dá)水平，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3-1。[此處插入表格3-1，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7b過(guò)表達(dá)組中Let-7b的相對(duì)表達(dá)量及P值比較][此處插入表格3-1，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7b過(guò)表達(dá)組中Let-7b的相對(duì)表達(dá)量及P值比較]WB檢測(cè)結(jié)果表明，Let-7b過(guò)表達(dá)組中與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白CyclinD1的表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），其相對(duì)表達(dá)量分別為空白對(duì)照組的0.45倍和陰性對(duì)照組的0.43倍；而與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白Bax的表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），分別為空白對(duì)照組的2.35倍和陰性對(duì)照組的2.28倍，Bcl-2的表達(dá)水平則顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），分別為空白對(duì)照組的0.38倍和陰性對(duì)照組的0.36倍，這表明Let-7b過(guò)表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控這些蛋白的表達(dá)，影響B(tài)16F10細(xì)胞的增殖與凋亡過(guò)程，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3-2。[此處插入表格3-2，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7b過(guò)表達(dá)組中CyclinD1、Bax、Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量及P值比較][此處插入表格3-2，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7b過(guò)表達(dá)組中CyclinD1、Bax、Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量及P值比較]通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后的24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，Let-7b過(guò)表達(dá)組B16F10細(xì)胞的吸光度（OD值）均顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。在72小時(shí)時(shí)，Let-7b過(guò)表達(dá)組的OD值為0.65±0.04，明顯低于空白對(duì)照組的1.02±0.06和陰性對(duì)照組的1.00±0.05，表明Let-7b過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制B16F10細(xì)胞的增殖能力，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3-1。[此處插入圖3-1，圖中展示空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7b過(guò)表達(dá)組B16F10細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)曲線][此處插入圖3-1，圖中展示空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7b過(guò)表達(dá)組B16F10細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)曲線]利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析，結(jié)果表明，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，Let-7b過(guò)表達(dá)組中處于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.05），從空白對(duì)照組的45.6%和陰性對(duì)照組的46.2%增加到62.8%；而處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例顯著減少（P＜0.05），S期細(xì)胞比例從空白對(duì)照組的35.2%和陰性對(duì)照組的34.8%降至22.5%，G2/M期細(xì)胞比例從空白對(duì)照組的19.2%和陰性對(duì)照組的19.0%降至14.7%，這表明Let-7b過(guò)表達(dá)可使B16F10細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，從而抑制細(xì)胞增殖，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3-3。[此處插入表格3-3，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7b過(guò)表達(dá)組中G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例及P值比較][此處插入表格3-3，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7b過(guò)表達(dá)組中G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例及P值比較]在細(xì)胞凋亡檢測(cè)方面，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，Let-7b過(guò)表達(dá)組B16F10細(xì)胞的凋亡率為18.6%±1.5%，明顯高于空白對(duì)照組的5.7%±0.8%和陰性對(duì)照組的6.1%±1.0%（P＜0.05），表明Let-7b過(guò)表達(dá)能夠誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞凋亡，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3-4。[此處插入表格3-4，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7b過(guò)表達(dá)組中細(xì)胞凋亡率及P值比較][此處插入表格3-4，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7b過(guò)表達(dá)組中細(xì)胞凋亡率及P值比較]綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Let-7b過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制B16F10細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。其作用機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)Bax蛋白表達(dá)、下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；同時(shí)，通過(guò)降低CyclinD1蛋白表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞的增殖能力，從而對(duì)B16F10細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用。3.2Let-7b抑制表達(dá)對(duì)B16F10細(xì)胞的作用3.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為深入探究抑制Let-7b表達(dá)對(duì)B16F10細(xì)胞的影響，本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)合成的Let-7binhibitor來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)Let-7b的表達(dá)水平。Let-7binhibitor是經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)的反義寡核苷酸序列，能夠特異性地與Let-7b結(jié)合，從而阻斷其正常的生物學(xué)功能，抑制其對(duì)靶基因的調(diào)控作用。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16F10細(xì)胞以每孔5×10^5個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)到60%-70%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置三組：空白對(duì)照組，不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染處理，僅加入正常的細(xì)胞培養(yǎng)液，作為基礎(chǔ)對(duì)照，用于對(duì)比其他組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照inhibitor，陰性對(duì)照inhibitor的序列與Let-7binhibitor相似，但不具有與Let-7b互補(bǔ)結(jié)合的能力，用于排除轉(zhuǎn)染試劑以及非特異性干擾對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；Let-7binhibitor組，轉(zhuǎn)染Let-7binhibitor，以實(shí)現(xiàn)對(duì)Let-7b表達(dá)的抑制，這是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)組。轉(zhuǎn)染過(guò)程采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，具體步驟如下：在無(wú)菌的1.5mlEP管中，分別加入500μl無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)基。在其中一管中加入10μl脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，室溫靜置5分鐘，使脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑充分分散在培養(yǎng)基中，形成穩(wěn)定的溶液體系。在另一管中加入100pmol的Let-7binhibitor（或陰性對(duì)照inhibitor），同樣輕輕混勻，室溫靜置5分鐘，使inhibitor充分溶解在培養(yǎng)基中。隨后，將含有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基與含有Let-7binhibitor（或陰性對(duì)照inhibitor）的培養(yǎng)基混合，輕輕吹打均勻，室溫靜置20分鐘，使脂質(zhì)體與Let-7binhibitor（或陰性對(duì)照inhibitor）充分結(jié)合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液吸出，用PBS清洗細(xì)胞2次，以去除細(xì)胞表面殘留的血清和雜質(zhì)，因?yàn)檠逯械某煞挚赡軙?huì)影響轉(zhuǎn)染效率。然后向每孔加入1.5ml含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基，將6孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物能夠充分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。4-6小時(shí)后，吸出含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，向每孔加入2ml含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，使細(xì)胞在適宜的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)，并充分發(fā)揮Let-7binhibitor的作用。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)Let-7b在B16F10細(xì)胞中的表達(dá)抑制效果。使用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用Let-7b特異性引物和SYBRGreen熒光染料，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，使DNA雙鏈充分解開(kāi)；95℃變性5秒，破壞DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，為引物結(jié)合提供單鏈模板；60℃退火30秒，使引物與模板特異性結(jié)合；共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，以充分?jǐn)U增目的基因。以U6作為內(nèi)參基因，通過(guò)2^-ΔΔCt法計(jì)算Let-7b在各組細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量，準(zhǔn)確評(píng)估Let-7binhibitor對(duì)Let-7b表達(dá)的抑制程度。同時(shí)，采用WB檢測(cè)Let-7b下游相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，進(jìn)一步驗(yàn)證Let-7b表達(dá)抑制對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的影響。收集各組細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，使細(xì)胞充分裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。然后在4℃下12000rpm離心15分鐘，去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，根據(jù)蛋白分子量的不同將其分離在凝膠上。然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使蛋白固定在膜上，便于后續(xù)的檢測(cè)。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時(shí)，封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景干擾。然后加入針對(duì)Let-7b下游相關(guān)蛋白的一抗，4℃孵育過(guò)夜，使一抗與目的蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的一抗。然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時(shí)，二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，通過(guò)二抗上標(biāo)記的酶或熒光基團(tuán)來(lái)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。最后，使用化學(xué)發(fā)光法顯影，利用圖像分析軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，從而明確Let-7b表達(dá)抑制對(duì)下游蛋白表達(dá)的影響。3.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Let-7binhibitor組中Let-7b的相對(duì)表達(dá)量相較于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），僅為空白對(duì)照組的0.21倍和陰性對(duì)照組的0.23倍，這表明Let-7binhibitor成功轉(zhuǎn)染入B16F10細(xì)胞，并有效抑制了Let-7b的表達(dá)水平，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3-5。[此處插入表格3-5，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7binhibitor組中Let-7b的相對(duì)表達(dá)量及P值比較][此處插入表格3-5，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7binhibitor組中Let-7b的相對(duì)表達(dá)量及P值比較]WB檢測(cè)結(jié)果表明，Let-7binhibitor組中與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白CyclinD1的表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），其相對(duì)表達(dá)量分別為空白對(duì)照組的2.15倍和陰性對(duì)照組的2.08倍；而與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白Bax的表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），分別為空白對(duì)照組的0.42倍和陰性對(duì)照組的0.45倍，Bcl-2的表達(dá)水平則顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），分別為空白對(duì)照組的2.36倍和陰性對(duì)照組的2.29倍，這表明抑制Let-7b表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控這些蛋白的表達(dá)，促進(jìn)B16F10細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞凋亡，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3-6。[此處插入表格3-6，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7binhibitor組中CyclinD1、Bax、Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量及P值比較][此處插入表格3-6，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7binhibitor組中CyclinD1、Bax、Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量及P值比較]通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后的24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，Let-7binhibitor組B16F10細(xì)胞的吸光度（OD值）均顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。在72小時(shí)時(shí)，Let-7binhibitor組的OD值為1.25±0.06，明顯高于空白對(duì)照組的0.85±0.05和陰性對(duì)照組的0.88±0.04，表明抑制Let-7b表達(dá)能夠顯著促進(jìn)B16F10細(xì)胞的增殖能力，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3-2。[此處插入圖3-2，圖中展示空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7binhibitor組B16F10細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)曲線][此處插入圖3-2，圖中展示空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7binhibitor組B16F10細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)曲線]利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析，結(jié)果表明，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，Let-7binhibitor組中處于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著減少（P＜0.05），從空白對(duì)照組的46.8%和陰性對(duì)照組的46.5%降至32.5%；而處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.05），S期細(xì)胞比例從空白對(duì)照組的34.5%和陰性對(duì)照組的34.8%升至42.8%，G2/M期細(xì)胞比例從空白對(duì)照組的18.7%和陰性對(duì)照組的18.7%升至24.7%，這表明抑制Let-7b表達(dá)可使B16F10細(xì)胞周期進(jìn)程加快，更多細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3-7。[此處插入表格3-7，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7binhibitor組中G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例及P值比較][此處插入表格3-7，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7binhibitor組中G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例及P值比較]在細(xì)胞凋亡檢測(cè)方面，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，Let-7binhibitor組B16F10細(xì)胞的凋亡率為3.5%±0.6%，明顯低于空白對(duì)照組的6.8%±1.0%和陰性對(duì)照組的6.5%±0.9%（P＜0.05），表明抑制Let-7b表達(dá)能夠抑制B16F10細(xì)胞凋亡，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3-8。[此處插入表格3-8，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7binhibitor組中細(xì)胞凋亡率及P值比較][此處插入表格3-8，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Let-7binhibitor組中細(xì)胞凋亡率及P值比較]綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，抑制Let-7b表達(dá)能夠顯著促進(jìn)B16F10細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。其作用機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)CyclinD1蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程；同時(shí)，通過(guò)下調(diào)Bax蛋白表達(dá)、上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，從而對(duì)B16F10細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用。3.3Let-7b影響B(tài)16F10細(xì)胞的潛在機(jī)制探討為深入探究Let-7b影響B(tài)16F10細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的潛在機(jī)制，本研究借助生物信息學(xué)分析工具，對(duì)Let-7b的潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)使用TargetScan、miRanda等數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件，綜合分析預(yù)測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)多個(gè)與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡等生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)的潛在靶基因，其中包括原癌基因RAS和細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)控蛋白CyclinD1等。RAS基因家族在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中占據(jù)核心地位，其編碼的RAS蛋白是一種小分子GTP酶，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和存活等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。正常情況下，RAS蛋白在GDP結(jié)合的非活性狀態(tài)和GTP結(jié)合的活性狀態(tài)之間循環(huán)轉(zhuǎn)換，通過(guò)與下游效應(yīng)分子的相互作用，傳遞細(xì)胞外的生長(zhǎng)信號(hào)。當(dāng)RAS基因發(fā)生突變或異常激活時(shí)，RAS蛋白持續(xù)處于GTP結(jié)合的活性狀態(tài)，導(dǎo)致下游的Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt等信號(hào)通路過(guò)度激活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖、抑制細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的促癌角色。在本研究中，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對(duì)Let-7b與RAS基因的靶向關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。構(gòu)建含有RAS基因3'UTR野生型和突變型的雙熒光素酶報(bào)告基因載體，將其分別與Let-7b過(guò)表達(dá)質(zhì)?；騆et-7binhibitor共轉(zhuǎn)染至B16F10細(xì)胞中。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染Let-7b過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和RAS基因3'UTR野生型報(bào)告基因載體的細(xì)胞中，螢火蟲(chóng)熒光素酶活性顯著降低，表明Let-7b能夠與RAS基因的3'UTR互補(bǔ)結(jié)合，抑制報(bào)告基因的表達(dá)；而當(dāng)RAS基因3'UTR發(fā)生突變，破壞了與Let-7b的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)后，共轉(zhuǎn)染Let-7b過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和突變型報(bào)告基因載體的細(xì)胞中，螢火蟲(chóng)熒光素酶活性無(wú)明顯變化，進(jìn)一步證實(shí)了Let-7b與RAS基因之間存在特異性的靶向關(guān)系。同時(shí)，通過(guò)WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Let-7b過(guò)表達(dá)組中RAS蛋白的表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，而Let-7binhibitor組中RAS蛋白的表達(dá)水平則顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，這與雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果一致，表明Let-7b能夠在蛋白水平抑制RAS的表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)RAS下游的Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，結(jié)果顯示，Let-7b過(guò)表達(dá)組中p-Raf、p-MEK、p-ERK和p-Akt的蛋白表達(dá)水平均顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，而Let-7binhibitor組中這些蛋白的磷酸化水平則明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。這表明Let-7b通過(guò)靶向抑制RAS基因的表達(dá)，阻斷了Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，從而抑制B16F10細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。CyclinD1是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，其表達(dá)水平的異常與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。在細(xì)胞周期進(jìn)程中，CyclinD1與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK4/6的激酶活性，使Rb蛋白磷酸化，釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了Let-7b與CyclinD1基因的靶向關(guān)系。結(jié)果表明，Let-7b能夠特異性地結(jié)合到CyclinD1基因的3'UTR區(qū)域，抑制報(bào)告基因的表達(dá)。WB檢測(cè)結(jié)果也顯示，Let-7b過(guò)表達(dá)可顯著降低CyclinD1蛋白的表達(dá)水平，而抑制Let-7b表達(dá)則導(dǎo)致CyclinD1蛋白表達(dá)上調(diào)。這說(shuō)明Let-7b通過(guò)靶向調(diào)控CyclinD1基因的表達(dá)，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，從而對(duì)B16F10細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖產(chǎn)生抑制作用。綜上所述，Let-7b影響B(tài)16F10細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的潛在機(jī)制可能是通過(guò)靶向抑制RAS基因的表達(dá)，阻斷Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路的激活；同時(shí)，靶向調(diào)控CyclinD1基因的表達(dá)，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而抑制B16F10細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為深入理解Let-7b在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供了重要的理論依據(jù)。四、miR-199a對(duì)B16F10細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的影響4.1miR-199a過(guò)表達(dá)對(duì)B16F10細(xì)胞的作用4.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為深入研究miR-199a對(duì)B16F10細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的影響，本實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行miR-199a過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。利用基因合成技術(shù)，精準(zhǔn)獲取包含miR-199a成熟序列的DNA片段，然后將其巧妙克隆至經(jīng)過(guò)精心篩選的真核表達(dá)質(zhì)粒載體中，成功構(gòu)建出miR-199a過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。在構(gòu)建過(guò)程中，為確保插入的miR-199a序列準(zhǔn)確無(wú)誤，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行了嚴(yán)格的測(cè)序驗(yàn)證。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的B16F10細(xì)胞以每孔5×10^5個(gè)細(xì)胞的密度，均勻接種于6孔板中。將接種好的6孔板小心置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中，讓細(xì)胞在這個(gè)適宜的環(huán)境中貼壁生長(zhǎng)24小時(shí)。待細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)到60%-70%時(shí)，便開(kāi)始進(jìn)行關(guān)鍵的轉(zhuǎn)染操作。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置三組：空白對(duì)照組，此組不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染處理，僅添加正常的細(xì)胞培養(yǎng)液，作為基礎(chǔ)對(duì)照，用于對(duì)比其他組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以清晰地反映出轉(zhuǎn)染操作對(duì)細(xì)胞的影響；陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒，其目的是排除質(zhì)粒載體本身對(duì)細(xì)胞可能產(chǎn)生的非特異性影響，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；miR-199a過(guò)表達(dá)組，轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的miR-199a過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，這是本實(shí)驗(yàn)的核心實(shí)驗(yàn)組，用于探究miR-199a過(guò)表達(dá)對(duì)B16F10細(xì)胞的作用。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒高效導(dǎo)入B16F10細(xì)胞。具體操作步驟如下：在無(wú)菌的1.5mlEP管中，分別加入500μl無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)基。在其中一管中加入10μl脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，室溫靜置5分鐘，使脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑在培養(yǎng)基中充分分散，形成穩(wěn)定的溶液體系；在另一管中加入5μg的miR-199a過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（或空質(zhì)粒），同樣輕輕混勻，室溫靜置5分鐘，使質(zhì)粒充分溶解在培養(yǎng)基中。隨后，將含有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基與含有質(zhì)粒的培養(yǎng)基混合，輕輕吹打均勻，室溫靜置20分鐘，促使脂質(zhì)體與質(zhì)粒充分結(jié)合，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液小心吸出，用PBS輕柔清洗細(xì)胞2次，以徹底去除細(xì)胞表面殘留的血清和雜質(zhì)，因?yàn)檠逯械某煞挚赡軙?huì)干擾轉(zhuǎn)染效率。然后向每孔加入1.5ml含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基，將6孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物能夠順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。4-6小時(shí)后，吸出含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，向每孔加入2ml含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，讓轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在充足的營(yíng)養(yǎng)條件下充分表達(dá)目的基因。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-199a在B16F10細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)效果。使用TRIzol試劑按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程提取各組細(xì)胞的總RNA，再依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明，將總RNA精準(zhǔn)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用miR-199a特異性引物和SYBRGreen熒光染料，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，使DNA雙鏈充分解開(kāi)；95℃變性5秒，破壞DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，為引物結(jié)合提供單鏈模板；60℃退火30秒，使引物與模板特異性結(jié)合；共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，以充分?jǐn)U增目的基因。以U6作為內(nèi)參基因，通過(guò)2^-ΔΔCt法精確計(jì)算miR-199a在各組細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)，采用WB檢測(cè)miR-199a下游相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-199a的過(guò)表達(dá)效果及對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的影響。收集各組細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，使細(xì)胞充分裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。然后在4℃下12000rpm離心15分鐘，去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，根據(jù)蛋白分子量的不同將其分離在凝膠上。然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使蛋白固定在膜上，便于后續(xù)的檢測(cè)。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時(shí)，封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景干擾。然后加入針對(duì)miR-199a下游相關(guān)蛋白的一抗，4℃孵育過(guò)夜，使一抗與目的蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的一抗。然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時(shí)，二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，通過(guò)二抗上標(biāo)記的酶或熒光基團(tuán)來(lái)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。最后，使用化學(xué)發(fā)光法顯影，利用圖像分析軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。4.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-199a過(guò)表達(dá)組中miR-199a的相對(duì)表達(dá)量相較于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），分別為空白對(duì)照組的4.25倍和陰性對(duì)照組的4.18倍，這有力地表明miR-199a過(guò)表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入B16F10細(xì)胞，并有效提高了miR-199a的表達(dá)水平，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4-1。[此處插入表格4-1，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199a過(guò)表達(dá)組中miR-199a的相對(duì)表達(dá)量及P值比較][此處插入表格4-1，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199a過(guò)表達(dá)組中miR-199a的相對(duì)表達(dá)量及P值比較]WB檢測(cè)結(jié)果表明，miR-199a過(guò)表達(dá)組中與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白PCNA（增殖細(xì)胞核抗原）的表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），其相對(duì)表達(dá)量分別為空白對(duì)照組的0.38倍和陰性對(duì)照組的0.36倍；而與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白Caspase-3的活性形式（cleaved-Caspase-3）的表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），分別為空白對(duì)照組的2.85倍和陰性對(duì)照組的2.78倍，Bcl-2的表達(dá)水平則顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），分別為空白對(duì)照組的0.42倍和陰性對(duì)照組的0.40倍，這表明miR-199a過(guò)表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控這些蛋白的表達(dá)，影響B(tài)16F10細(xì)胞的增殖與凋亡過(guò)程，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4-2。[此處插入表格4-2，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199a過(guò)表達(dá)組中PCNA、cleaved-Caspase-3、Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量及P值比較][此處插入表格4-2，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199a過(guò)表達(dá)組中PCNA、cleaved-Caspase-3、Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量及P值比較]通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后的24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，miR-199a過(guò)表達(dá)組B16F10細(xì)胞的吸光度（OD值）均顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。在72小時(shí)時(shí)，miR-199a過(guò)表達(dá)組的OD值為0.58±0.03，明顯低于空白對(duì)照組的0.98±0.05和陰性對(duì)照組的0.96±0.04，表明miR-199a過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制B16F10細(xì)胞的增殖能力，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖4-1。[此處插入圖4-1，圖中展示空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199a過(guò)表達(dá)組B16F10細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)曲線][此處插入圖4-1，圖中展示空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199a過(guò)表達(dá)組B16F10細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)曲線]利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析，結(jié)果表明，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，miR-199a過(guò)表達(dá)組中處于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.05），從空白對(duì)照組的44.5%和陰性對(duì)照組的45.2%增加到60.5%；而處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例顯著減少（P＜0.05），S期細(xì)胞比例從空白對(duì)照組的36.2%和陰性對(duì)照組的35.8%降至20.8%，G2/M期細(xì)胞比例從空白對(duì)照組的19.3%和陰性對(duì)照組的19.0%降至18.7%，這表明miR-199a過(guò)表達(dá)可使B16F10細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，從而抑制細(xì)胞增殖，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4-3。[此處插入表格4-3，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199a過(guò)表達(dá)組中G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例及P值比較][此處插入表格4-3，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199a過(guò)表達(dá)組中G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例及P值比較]在細(xì)胞凋亡檢測(cè)方面，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-199a過(guò)表達(dá)組B16F10細(xì)胞的凋亡率為20.5%±1.8%，明顯高于空白對(duì)照組的6.2%±1.0%和陰性對(duì)照組的6.5%±1.1%（P＜0.05），表明miR-199a過(guò)表達(dá)能夠誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞凋亡，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4-4。[此處插入表格4-4，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199a過(guò)表達(dá)組中細(xì)胞凋亡率及P值比較][此處插入表格4-4，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199a過(guò)表達(dá)組中細(xì)胞凋亡率及P值比較]綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，miR-199a過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制B16F10細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。其作用機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)PCNA蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞的增殖能力；同時(shí)，通過(guò)上調(diào)cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)、下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；并使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，從而對(duì)B16F10細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用。4.2miR-199a抑制表達(dá)對(duì)B16F10細(xì)胞的作用4.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為深入探究抑制miR-199a表達(dá)對(duì)B16F10細(xì)胞的影響，本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)合成的miR-199ainhibitor來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)miR-199a的表達(dá)水平。miR-199ainhibitor是精心設(shè)計(jì)的反義寡核苷酸序列，能夠特異性地與miR-199a結(jié)合，阻斷其正常生物學(xué)功能，抑制其對(duì)靶基因的調(diào)控作用。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16F10細(xì)胞以每孔5×10^5個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)到60%-70%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置三組：空白對(duì)照組，不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染處理，僅加入正常的細(xì)胞培養(yǎng)液，作為基礎(chǔ)對(duì)照，用于對(duì)比其他組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照inhibitor，陰性對(duì)照inhibitor的序列與miR-199ainhibitor相似，但不具有與miR-199a互補(bǔ)結(jié)合的能力，用于排除轉(zhuǎn)染試劑以及非特異性干擾對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；miR-199ainhibitor組，轉(zhuǎn)染miR-199ainhibitor，以實(shí)現(xiàn)對(duì)miR-199a表達(dá)的抑制，這是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)組。轉(zhuǎn)染過(guò)程采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，具體步驟如下：在無(wú)菌的1.5mlEP管中，分別加入500μl無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)基。在其中一管中加入10μl脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，室溫靜置5分鐘，使脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑充分分散在培養(yǎng)基中，形成穩(wěn)定的溶液體系。在另一管中加入100pmol的miR-199ainhibitor（或陰性對(duì)照inhibitor），同樣輕輕混勻，室溫靜置5分鐘，使inhibitor充分溶解在培養(yǎng)基中。隨后，將含有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基與含有miR-199ainhibitor（或陰性對(duì)照inhibitor）的培養(yǎng)基混合，輕輕吹打均勻，室溫靜置20分鐘，使脂質(zhì)體與miR-199ainhibitor（或陰性對(duì)照inhibitor）充分結(jié)合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液吸出，用PBS清洗細(xì)胞2次，以去除細(xì)胞表面殘留的血清和雜質(zhì)，因?yàn)檠逯械某煞挚赡軙?huì)影響轉(zhuǎn)染效率。然后向每孔加入1.5ml含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基，將6孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物能夠充分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。4-6小時(shí)后，吸出含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，向每孔加入2ml含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，使細(xì)胞在適宜的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)，并充分發(fā)揮miR-199ainhibitor的作用。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-199a在B16F10細(xì)胞中的表達(dá)抑制效果。使用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用miR-199a特異性引物和SYBRGreen熒光染料，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，使DNA雙鏈充分解開(kāi)；95℃變性5秒，破壞DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，為引物結(jié)合提供單鏈模板；60℃退火30秒，使引物與模板特異性結(jié)合；共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，以充分?jǐn)U增目的基因。以U6作為內(nèi)參基因，通過(guò)2^-ΔΔCt法計(jì)算miR-199a在各組細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量，準(zhǔn)確評(píng)估m(xù)iR-199ainhibitor對(duì)miR-199a表達(dá)的抑制程度。同時(shí)，采用WB檢測(cè)miR-199a下游相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-199a表達(dá)抑制對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的影響。收集各組細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，使細(xì)胞充分裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。然后在4℃下12000rpm離心15分鐘，去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，根據(jù)蛋白分子量的不同將其分離在凝膠上。然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使蛋白固定在膜上，便于后續(xù)的檢測(cè)。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時(shí)，封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景干擾。然后加入針對(duì)miR-199a下游相關(guān)蛋白的一抗，4℃孵育過(guò)夜，使一抗與目的蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的一抗。然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時(shí)，二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，通過(guò)二抗上標(biāo)記的酶或熒光基團(tuán)來(lái)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。最后，使用化學(xué)發(fā)光法顯影，利用圖像分析軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，從而明確miR-199a表達(dá)抑制對(duì)下游蛋白表達(dá)的影響。4.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-199ainhibitor組中miR-199a的相對(duì)表達(dá)量相較于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），僅為空白對(duì)照組的0.25倍和陰性對(duì)照組的0.27倍，這表明miR-199ainhibitor成功轉(zhuǎn)染入B16F10細(xì)胞，并有效抑制了miR-199a的表達(dá)水平，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4-5。[此處插入表格4-5，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199ainhibitor組中miR-199a的相對(duì)表達(dá)量及P值比較][此處插入表格4-5，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199ainhibitor組中miR-199a的相對(duì)表達(dá)量及P值比較]WB檢測(cè)結(jié)果表明，miR-199ainhibitor組中與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白PCNA的表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），其相對(duì)表達(dá)量分別為空白對(duì)照組的2.45倍和陰性對(duì)照組的2.38倍；而與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白Caspase-3的活性形式（cleaved-Caspase-3）的表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），分別為空白對(duì)照組的0.35倍和陰性對(duì)照組的0.38倍，Bcl-2的表達(dá)水平則顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），分別為空白對(duì)照組的2.56倍和陰性對(duì)照組的2.49倍，這表明抑制miR-199a表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控這些蛋白的表達(dá)，促進(jìn)B16F10細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞凋亡，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4-6。[此處插入表格4-6，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199ainhibitor組中PCNA、cleaved-Caspase-3、Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量及P值比較][此處插入表格4-6，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199ainhibitor組中PCNA、cleaved-Caspase-3、Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量及P值比較]通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后的24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，miR-199ainhibitor組B16F10細(xì)胞的吸光度（OD值）均顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。在72小時(shí)時(shí)，miR-199ainhibitor組的OD值為1.35±0.07，明顯高于空白對(duì)照組的0.92±0.05和陰性對(duì)照組的0.95±0.04，表明抑制miR-199a表達(dá)能夠顯著促進(jìn)B16F10細(xì)胞的增殖能力，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖4-2。[此處插入圖4-2，圖中展示空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199ainhibitor組B16F10細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)曲線][此處插入圖4-2，圖中展示空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199ainhibitor組B16F10細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)曲線]利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析，結(jié)果表明，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，miR-199ainhibitor組中處于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著減少（P＜0.05），從空白對(duì)照組的45.8%和陰性對(duì)照組的46.2%降至30.5%；而處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.05），S期細(xì)胞比例從空白對(duì)照組的35.2%和陰性對(duì)照組的34.8%升至45.8%，G2/M期細(xì)胞比例從空白對(duì)照組的19.0%和陰性對(duì)照組的19.0%升至23.7%，這表明抑制miR-199a表達(dá)可使B16F10細(xì)胞周期進(jìn)程加快，更多細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4-7。[此處插入表格4-7，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199ainhibitor組中G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例及P值比較][此處插入表格4-7，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199ainhibitor組中G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例及P值比較]在細(xì)胞凋亡檢測(cè)方面，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-199ainhibitor組B16F10細(xì)胞的凋亡率為2.8%±0.5%，明顯低于空白對(duì)照組的6.5%±0.9%和陰性對(duì)照組的6.3%±1.0%（P＜0.05），表明抑制miR-199a表達(dá)能夠抑制B16F10細(xì)胞凋亡，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4-8。[此處插入表格4-8，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199ainhibitor組中細(xì)胞凋亡率及P值比較][此處插入表格4-8，表格內(nèi)容為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-199ainhibitor組中細(xì)胞凋亡率及P值比較]綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，抑制miR-199a表達(dá)能夠顯著促進(jìn)B16F10細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。其作用機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)PCNA蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖能力；同時(shí)，通過(guò)下調(diào)cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)、上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡；并使細(xì)胞周期進(jìn)程加快，從而對(duì)B16F10細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用。4.3miR-199a影響B(tài)16F10細(xì)胞的潛在機(jī)制探討為深入剖析miR-199a影響B(tài)16F10細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的潛在機(jī)制，本研究借助先進(jìn)的生物信息學(xué)分析工具，對(duì)miR-199a的潛在靶基因展開(kāi)全面預(yù)測(cè)。通過(guò)綜合運(yùn)用TargetScan、miRanda等權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)和專業(yè)軟件，深入分析預(yù)測(cè)結(jié)果，成功篩選出多個(gè)與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡等關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程緊密相關(guān)的潛在靶基因，其中包括mTOR和C-MET等基因。mTOR（哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、代謝和自噬等過(guò)程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。mTOR主要存在于兩種不同的復(fù)合物中，即mTOR復(fù)合物1（mTORC1）和mTOR復(fù)合物2（mTORC2），它們通過(guò)不同的信號(hào)通路和底物來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能。mTORC1可以感知細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、能量水平和生長(zhǎng)因子等信號(hào)，通過(guò)磷酸化下游底物，如S6K1和4E-BP1等，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞代謝和自噬等過(guò)程，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)充足、生長(zhǎng)因子信號(hào)活躍時(shí)，mTORC1