NGF對(duì)小鼠骨髓誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞成熟分化及功能的影響摘要本研究旨在探討神經(jīng)生長因子（NGF）對(duì)小鼠骨髓誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞（DCs）成熟分化及功能的影響。通過分離小鼠骨髓細(xì)胞，在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)DCs，并添加不同濃度的NGF進(jìn)行干預(yù)。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCs表面分子表達(dá)，MTT法檢測(cè)DCs刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力，ELISA法測(cè)定DCs分泌細(xì)胞因子的水平。結(jié)果顯示，NGF可顯著促進(jìn)DCs表面共刺激分子CD80、CD86和MHCII類分子的表達(dá)，增強(qiáng)DCs刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力，并調(diào)節(jié)DCs分泌細(xì)胞因子IL-12和IL-10的水平。本研究表明，NGF能夠促進(jìn)小鼠骨髓誘導(dǎo)的DCs成熟分化，增強(qiáng)其免疫激活功能，為進(jìn)一步理解NGF在免疫調(diào)節(jié)中的作用提供了理論依據(jù)。關(guān)鍵詞神經(jīng)生長因子；樹突狀細(xì)胞；成熟分化；免疫功能一、引言樹突狀細(xì)胞（Dendriticcells，DCs）是目前已知功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，在啟動(dòng)、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。DCs起源于骨髓多能造血干細(xì)胞，可分為髓系DCs和淋巴系DCs。在生理狀態(tài)下，未成熟DCs主要分布于外周組織，具有較強(qiáng)的抗原攝取和加工能力，但抗原呈遞能力較弱；當(dāng)受到病原體、炎癥因子等刺激后，DCs逐漸成熟，高表達(dá)共刺激分子和主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子，分泌多種細(xì)胞因子，從而有效激活T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。神經(jīng)生長因子（Nervegrowthfactor，NGF）最初被認(rèn)為是一種主要作用于神經(jīng)系統(tǒng)，參與神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化和存活的神經(jīng)營養(yǎng)因子。然而，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，NGF在免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。NGF及其受體廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。已有研究表明，NGF能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增殖、分化和功能，參與炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病和腫瘤免疫等多種病理生理過程。但NGF對(duì)DCs成熟分化及功能的影響尚未完全明確。因此，本研究通過體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源的DCs，觀察NGF對(duì)DCs成熟分化及功能的影響，為深入了解NGF在免疫調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。二、材料與方法（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6-8周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠，雄性，體重18-22g，購自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心名稱]，飼養(yǎng)于[飼養(yǎng)環(huán)境具體描述]，自由攝食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。（二）主要試劑與儀器試劑：RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司）、胎牛血清（FBS，Gibco公司）、重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rmGM-CSF）（PeproTech公司）、重組小鼠白細(xì)胞介素4（rmIL-4）（PeproTech公司）、神經(jīng)生長因子（NGF）（PeproTech公司）、抗小鼠CD11c-PE、抗小鼠CD80-FITC、抗小鼠CD86-PE-Cy7、抗小鼠MHCII-APC抗體（BD公司）、淋巴細(xì)胞分離液（Solarbio公司）、MTT試劑（Sigma公司）、CCK-8試劑盒（Dojindo公司）、小鼠IL-12和IL-10ELISA試劑盒（R&DSystems公司）、PBS緩沖液（Hyclone公司）、臺(tái)盼藍(lán)染色液（Solarbio公司）。儀器：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司）、超凈工作臺(tái)（ESCO公司）、倒置相差顯微鏡（Olympus公司）、流式細(xì)胞儀（BD公司）、酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）、低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司）。（三）小鼠骨髓來源DCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)頸椎脫臼處死小鼠，無菌條件下取股骨和脛骨，用PBS沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞。將骨髓細(xì)胞懸液置于淋巴細(xì)胞分離液上層，2000r/min離心20min，吸取中間白膜層細(xì)胞，即為單個(gè)核細(xì)胞。用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^6個(gè)/mL，接種于6孔板，每孔2mL，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，以去除貼壁的巨噬細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞。棄去上清，加入含10ng/mLrmGM-CSF和10ng/mLrmIL-4的RPMI1640完全培養(yǎng)基，每2天半量換液，培養(yǎng)至第6天，獲得未成熟DCs。（四）實(shí)驗(yàn)分組將未成熟DCs分為以下4組：對(duì)照組：加入等量的RPMI1640完全培養(yǎng)基。NGF低濃度組：加入終濃度為10ng/mL的NGF。NGF中濃度組：加入終濃度為50ng/mL的NGF。NGF高濃度組：加入終濃度為100ng/mL的NGF。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。（五）DCs表面分子表達(dá)的檢測(cè)收集各組DCs，用PBS洗滌2次，加入適量含5%FBS的PBS重懸細(xì)胞，分別加入抗小鼠CD11c-PE、抗小鼠CD80-FITC、抗小鼠CD86-PE-Cy7、抗小鼠MHCII-APC抗體，4℃避光孵育30min，用PBS洗滌2次，重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析DCs表面共刺激分子CD80、CD86和MHCII類分子的表達(dá)水平。（六）DCs刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)無菌條件下取小鼠脾臟，制備單細(xì)胞懸液，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離獲得脾淋巴細(xì)胞，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10^6個(gè)/mL。將各組DCs與脾淋巴細(xì)胞按1:10的比例混合，接種于96孔板，每孔200μL，同時(shí)設(shè)置DCs單獨(dú)培養(yǎng)組和脾淋巴細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組作為對(duì)照。培養(yǎng)48h后，每孔加入20μLMTT試劑（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀在570nm波長處測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算刺激指數(shù)（Stimulationindex，SI），SI=（實(shí)驗(yàn)組OD值-脾淋巴細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組OD值）/（DCs單獨(dú)培養(yǎng)組OD值-脾淋巴細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組OD值）。（七）DCs分泌細(xì)胞因子水平的檢測(cè)收集各組培養(yǎng)上清，按照小鼠IL-12和IL-10ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm波長處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算培養(yǎng)上清中IL-12和IL-10的濃度。（八）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（\bar{x}\pms）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用Tukey's檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、結(jié)果（一）NGF對(duì)DCs形態(tài)的影響在倒置相差顯微鏡下觀察，對(duì)照組未成熟DCs呈貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，表面僅有少量短小的突起；加入NGF培養(yǎng)24h后，各NGF處理組DCs逐漸懸浮生長，細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，表面伸出大量細(xì)長的樹突狀突起，且隨著NGF濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)變化更加明顯，樹突狀突起更為豐富（圖1）。（二）NGF對(duì)DCs表面分子表達(dá)的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各NGF處理組DCs表面共刺激分子CD80、CD86和MHCII類分子的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），且呈濃度依賴性。其中，NGF中濃度組和高濃度組的CD80、CD86和MHCII類分子表達(dá)水平顯著高于低濃度組（P<0.05），NGF高濃度組的表達(dá)水平最高（表1）。（三）NGF對(duì)DCs刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力的影響MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，各NGF處理組DCs刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力均顯著增強(qiáng)（P<0.05），刺激指數(shù)（SI）明顯升高。隨著NGF濃度的增加，DCs刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力逐漸增強(qiáng)，NGF高濃度組的刺激作用最為顯著（表2）。（四）NGF對(duì)DCs分泌細(xì)胞因子水平的影響ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NGF處理組DCs分泌IL-12的水平顯著升高（P<0.05），分泌IL-10的水平顯著降低（P<0.05），且呈濃度依賴性。NGF中濃度組和高濃度組的IL-12分泌水平顯著高于低濃度組（P<0.05），IL-10分泌水平顯著低于低濃度組（P<0.05），NGF高濃度組的IL-12分泌水平最高，IL-10分泌水平最低（表3）。四、討論本研究通過體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源的DCs，探討了NGF對(duì)DCs成熟分化及功能的影響。結(jié)果表明，NGF能夠促進(jìn)DCs的成熟分化，增強(qiáng)其免疫激活功能。在DCs的成熟分化過程中，細(xì)胞形態(tài)的改變是其重要特征之一。本研究發(fā)現(xiàn)，NGF能夠誘導(dǎo)DCs從貼壁生長轉(zhuǎn)變?yōu)閼腋∩L，細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，表面伸出大量細(xì)長的樹突狀突起，且隨著NGF濃度的增加，這種形態(tài)變化更加明顯。這一結(jié)果提示，NGF可能通過影響DCs的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞極性，促進(jìn)DCs的成熟和遷移。DCs表面共刺激分子和MHC分子的表達(dá)水平直接影響其抗原呈遞和激活T淋巴細(xì)胞的能力。本研究結(jié)果顯示，NGF能夠顯著上調(diào)DCs表面共刺激分子CD80、CD86和MHCII類分子的表達(dá)，且呈濃度依賴性。CD80和CD86是DCs表面重要的共刺激分子，它們與T淋巴細(xì)胞表面的CD28分子結(jié)合，為T淋巴細(xì)胞的激活提供第二信號(hào)；MHCII類分子則負(fù)責(zé)將抗原肽呈遞給CD4?T淋巴細(xì)胞。NGF上調(diào)DCs表面這些分子的表達(dá)，有助于增強(qiáng)DCs與T淋巴細(xì)胞之間的相互作用，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的激活和增殖。DCs的主要功能是激活T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。本研究通過MTT法檢測(cè)DCs刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力，發(fā)現(xiàn)NGF能夠顯著增強(qiáng)DCs刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力，且隨著NGF濃度的增加，刺激作用逐漸增強(qiáng)。這與NGF上調(diào)DCs表面共刺激分子和MHC分子表達(dá)的結(jié)果相一致，進(jìn)一步表明NGF能夠促進(jìn)DCs的成熟，增強(qiáng)其免疫激活功能。細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，DCs分泌的細(xì)胞因子能夠調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的分化和功能。IL-12是一種重要的促炎細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答；IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子，能夠抑制Th1細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)免疫平衡。本研究結(jié)果顯示，NGF能夠顯著上調(diào)DCs分泌IL-12的水平，下調(diào)IL-10的分泌水平，且呈濃度依賴性。這表明NGF可能通過調(diào)節(jié)DCs分泌細(xì)胞因子的水平，促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。綜上所述，本研究表明NGF能夠促進(jìn)小鼠骨髓誘導(dǎo)的DCs成熟分化，增強(qiáng)其免疫激活功能。NGF可能通過上調(diào)DCs表面共刺激分子和MHC分子的表達(dá)，調(diào)節(jié)DCs分泌細(xì)胞因子的水平，從而促進(jìn)DCs的成熟和功能發(fā)揮。本研究結(jié)果為進(jìn)一步理解NGF在免疫調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但NGF調(diào)節(jié)DCs功能