內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)與次生代謝的影響及分子機(jī)制探究一、引言1.1研究背景丹參（SalviamiltiorrhizaBunge），作為唇形科鼠尾草屬的多年生直立草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，其干燥根及根莖在醫(yī)療領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將丹參列為上品，記載其“主心腹邪氣，腸鳴幽幽如走水，寒熱積聚，破癥除瘕，止煩滿，益氣”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，丹參在治療心腦血管疾病、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等方面具有顯著功效，被廣泛應(yīng)用于復(fù)方丹參滴丸、丹參注射液等多種中成藥中，對(duì)保障人類健康發(fā)揮著重要作用。丹參毛狀根是通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化丹參外植體而獲得的一種特殊的根器官培養(yǎng)體系。它具有生長(zhǎng)速度快、遺傳穩(wěn)定性高、無(wú)需外源激素等優(yōu)點(diǎn)，能夠高效合成和積累丹參的次生代謝產(chǎn)物，如丹參酮類、丹酚酸類等。這些次生代謝產(chǎn)物是丹參發(fā)揮藥用價(jià)值的關(guān)鍵成分，丹參酮類具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性，丹酚酸類則在抗心肌缺血、抗腦缺血、抗血栓形成等方面表現(xiàn)出良好的藥理作用。丹參毛狀根作為一種新型的藥用資源，為丹參次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)提供了新的途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景，對(duì)推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展具有重要意義。內(nèi)生真菌是一類生活在健康植物組織內(nèi)部，與宿主植物建立共生關(guān)系的微生物。它們廣泛存在于各種植物中，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，與宿主植物形成了相互依存、相互影響的復(fù)雜關(guān)系。內(nèi)生真菌能夠通過(guò)多種方式影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，為植物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如固氮內(nèi)生真菌可以將空氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為植物可利用的氮源，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)；還能產(chǎn)生植物激素，如生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素等，調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，促進(jìn)植物根系的生長(zhǎng)和分枝，增加植物的生物量。內(nèi)生真菌對(duì)植物次生代謝的影響也十分顯著。一方面，內(nèi)生真菌可以誘導(dǎo)植物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，通過(guò)激活植物的次生代謝途徑，促使植物產(chǎn)生更多的次生代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物在植物的防御反應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用；另一方面，內(nèi)生真菌自身也能夠合成與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物，增加植物次生代謝產(chǎn)物的種類和含量。內(nèi)生真菌與植物的這種共生關(guān)系，不僅有助于植物適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境，還為開(kāi)發(fā)新型藥物和生物制劑提供了豐富的資源。在丹參的生長(zhǎng)過(guò)程中，內(nèi)生真菌同樣起著不可忽視的作用。研究表明，丹參內(nèi)生真菌能夠促進(jìn)丹參的生長(zhǎng)，提高其抗逆性，并且對(duì)丹參次生代謝產(chǎn)物的合成和積累產(chǎn)生影響。然而，目前對(duì)于內(nèi)生真菌影響丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的分子機(jī)制尚不完全清楚。深入研究這一機(jī)制，不僅有助于揭示內(nèi)生真菌與丹參之間的共生關(guān)系，為丹參的栽培和品質(zhì)改良提供理論依據(jù)，還能為利用內(nèi)生真菌提高丹參次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量提供新的思路和方法，具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探究?jī)?nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的影響，并揭示其潛在的分子機(jī)制。通過(guò)系統(tǒng)研究不同種類內(nèi)生真菌與丹參毛狀根的相互作用，分析內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)指標(biāo)、次生代謝產(chǎn)物含量及相關(guān)基因表達(dá)的影響，明確內(nèi)生真菌在丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝調(diào)控中的作用方式和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為丹參的可持續(xù)種植和藥用開(kāi)發(fā)提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。丹參作為重要的中藥材，其市場(chǎng)需求不斷增長(zhǎng)。然而，傳統(tǒng)丹參種植面臨著諸多挑戰(zhàn)，如生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量不穩(wěn)定、品質(zhì)參差不齊等問(wèn)題，嚴(yán)重制約了丹參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。同時(shí)，隨著對(duì)丹參藥用價(jià)值的深入挖掘，對(duì)其有效成分的需求量也日益增加，如何提高丹參次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量成為亟待解決的問(wèn)題。本研究通過(guò)揭示內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的影響及其分子機(jī)制，具有重要的理論意義和實(shí)踐意義。從理論意義上看，本研究有助于深入理解內(nèi)生真菌與植物之間的共生關(guān)系，豐富植物與微生物相互作用的理論體系。內(nèi)生真菌與植物的共生關(guān)系是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的生態(tài)系統(tǒng)，其中涉及到物質(zhì)交換、信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控等多個(gè)層面的相互作用。通過(guò)研究?jī)?nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的影響，能夠揭示共生關(guān)系中這些關(guān)鍵過(guò)程的分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究植物與微生物的共生進(jìn)化提供新的視角和證據(jù)，加深我們對(duì)自然界中生物多樣性和生態(tài)平衡的理解。此外，研究?jī)?nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根次生代謝的調(diào)控機(jī)制，有助于完善植物次生代謝的調(diào)控理論，為深入研究植物次生代謝產(chǎn)物的合成途徑和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供參考。植物次生代謝產(chǎn)物在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、防御反應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其合成和積累受到多種因素的調(diào)控，包括環(huán)境因素、植物自身的代謝調(diào)控以及與微生物的相互作用等。本研究將從內(nèi)生真菌的角度出發(fā)，探究其對(duì)丹參毛狀根次生代謝的調(diào)控作用，為揭示植物次生代謝的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制提供新的線索和思路。從實(shí)踐意義而言，本研究為丹參的栽培和品質(zhì)改良提供了重要的理論依據(jù)。通過(guò)明確內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的促進(jìn)作用及分子機(jī)制，可以開(kāi)發(fā)基于內(nèi)生真菌的生物菌肥和生物調(diào)控技術(shù)，應(yīng)用于丹參的實(shí)際種植中，從而提高丹參的產(chǎn)量和品質(zhì)。生物菌肥具有綠色、環(huán)保、可持續(xù)等優(yōu)點(diǎn)，能夠減少化學(xué)肥料和農(nóng)藥的使用，降低對(duì)環(huán)境的污染，符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的需求。利用內(nèi)生真菌調(diào)控丹參的生長(zhǎng)和次生代謝，有望實(shí)現(xiàn)丹參的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、可持續(xù)種植，推動(dòng)丹參產(chǎn)業(yè)的綠色發(fā)展。此外，本研究的成果還有助于利用丹參毛狀根高效生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物，為醫(yī)藥工業(yè)提供豐富的原料來(lái)源。丹參毛狀根作為一種新型的藥用資源，具有生長(zhǎng)速度快、遺傳穩(wěn)定性高、次生代謝產(chǎn)物合成能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是生產(chǎn)丹參次生代謝產(chǎn)物的理想體系。通過(guò)研究?jī)?nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根次生代謝的影響，能夠優(yōu)化丹參毛狀根的培養(yǎng)條件，提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量，為開(kāi)發(fā)新型藥物和生物制劑提供豐富的原料，滿足日益增長(zhǎng)的醫(yī)藥市場(chǎng)需求，推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化和國(guó)際化進(jìn)程。二、丹參毛狀根與內(nèi)生真菌概述2.1丹參毛狀根丹參毛狀根是通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化丹參外植體而獲得的特殊根器官培養(yǎng)體系。發(fā)根農(nóng)桿菌含有Ri質(zhì)粒，其T-DNA片段能夠整合到植物基因組中，從而誘導(dǎo)毛狀根的形成。這種轉(zhuǎn)化過(guò)程改變了植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化模式，使丹參細(xì)胞獲得了自主生長(zhǎng)和發(fā)育為毛狀根的能力。丹參毛狀根具有諸多獨(dú)特的特點(diǎn)。在生長(zhǎng)特性方面，它生長(zhǎng)迅速，相較于傳統(tǒng)的丹參植株培養(yǎng)，能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量的生物量。有研究表明，在適宜的培養(yǎng)條件下，丹參毛狀根的生物量在數(shù)周內(nèi)可增長(zhǎng)數(shù)倍，為大規(guī)模生產(chǎn)藥用成分提供了可能。丹參毛狀根的生長(zhǎng)無(wú)需添加外源激素，這是由于Ri質(zhì)粒的整合賦予了其自身合成激素的能力，降低了生產(chǎn)成本和潛在的激素殘留風(fēng)險(xiǎn)。在遺傳穩(wěn)定性上，丹參毛狀根表現(xiàn)出色。由于其遺傳物質(zhì)穩(wěn)定，能夠保持相對(duì)一致的生長(zhǎng)和代謝特性，使得在不同批次的培養(yǎng)中，毛狀根的生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物合成具有較高的重復(fù)性和穩(wěn)定性，有利于工業(yè)化生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制。培養(yǎng)丹參毛狀根的常用方法包括固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)。固體培養(yǎng)通常采用添加了適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)成分的固體培養(yǎng)基，如MS培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基或6,7-V培養(yǎng)基等，將丹參毛狀根接種在培養(yǎng)基表面，在適宜的溫度、光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)。這種方法操作簡(jiǎn)單，易于觀察毛狀根的生長(zhǎng)狀態(tài)，但不利于大規(guī)模培養(yǎng)。液體培養(yǎng)則是將丹參毛狀根懸浮在液體培養(yǎng)基中，通過(guò)振蕩培養(yǎng)提供充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)毛狀根的快速生長(zhǎng)。液體培養(yǎng)適合大規(guī)模生產(chǎn)，能夠提高生物量和次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，且便于對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行精確控制，如調(diào)節(jié)溫度、pH值、溶解氧等參數(shù)，優(yōu)化毛狀根的生長(zhǎng)和代謝。丹參毛狀根在研究中具有廣泛的應(yīng)用。在藥用成分生產(chǎn)領(lǐng)域，它是生產(chǎn)丹參次生代謝產(chǎn)物的重要來(lái)源。丹參中的丹參酮類、丹酚酸類等次生代謝產(chǎn)物具有顯著的藥用價(jià)值，丹參毛狀根能夠高效合成和積累這些成分，為醫(yī)藥工業(yè)提供了豐富的原料。在一項(xiàng)研究中，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件，丹參毛狀根中丹酚酸B的含量可達(dá)到較高水平，滿足了一定的藥用需求。丹參毛狀根也是研究植物次生代謝途徑的理想模型。由于其生長(zhǎng)環(huán)境可控，便于進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)操作，研究人員可以通過(guò)添加誘導(dǎo)子、改變培養(yǎng)條件或進(jìn)行基因編輯等手段，研究次生代謝產(chǎn)物的合成機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量提供理論依據(jù)。此外，丹參毛狀根還可用于基因功能驗(yàn)證和遺傳轉(zhuǎn)化研究，通過(guò)導(dǎo)入外源基因或干擾內(nèi)源基因的表達(dá)，觀察毛狀根的生長(zhǎng)和代謝變化，從而確定基因的功能，為丹參的遺傳改良和品種選育奠定基礎(chǔ)。2.2內(nèi)生真菌內(nèi)生真菌是一類在其生活史的某一階段或全部階段生活于健康植物組織內(nèi)部，且不引起宿主植物明顯病害癥狀的真菌，其種類繁多，分布廣泛，幾乎存在于所有的植物中。根據(jù)其形態(tài)和生態(tài)特征，內(nèi)生真菌主要可分為子囊菌、擔(dān)子菌、接合菌等類別。菌根真菌（AMF）是一類廣泛存在于世界各地的內(nèi)生真菌，與絕大多數(shù)被子植物形成共生關(guān)系。它們能夠與植物根系形成特殊的結(jié)構(gòu)——菌根，通過(guò)菌根的作用，幫助植物更好地吸收土壤中的養(yǎng)分，如磷、氮等，增強(qiáng)植物的適應(yīng)性和抗逆性，還能在土壤中保持水分和減輕土壤侵蝕，常見(jiàn)的菌根真菌有Glomusmosseae、Glomusintraradices等。木霉屬真菌（Trichodermaspp.）也是常見(jiàn)的內(nèi)生真菌，與各種植物共生，能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)植物對(duì)病原菌和脅迫條件的抵抗力，常見(jiàn)的有Trichodermaharzianum、Trichodermaviride等。根內(nèi)細(xì)菌（Rhizobia）與豆科植物形成共生關(guān)系，能夠在植物根系形成根瘤，并將空氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為植物可利用的氨，為植物提供重要的氮源，常見(jiàn)的根內(nèi)細(xì)菌包括Sinorhizobiummeliloti、Rhizobiumleguminosarum等。內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)的分布受多種因素影響，涵蓋植物種類、環(huán)境條件、土壤類型等。這些微生物能夠在植物的根、莖、葉和花等各個(gè)部位內(nèi)生，與植物形成不同程度的共生關(guān)系。在植物的根部，內(nèi)生真菌可以與根系緊密結(jié)合，參與植物對(duì)養(yǎng)分的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程；在莖部，內(nèi)生真菌可能影響植物的物質(zhì)運(yùn)輸和支持結(jié)構(gòu)；在葉片中，內(nèi)生真菌則可能對(duì)植物的光合作用和氣體交換產(chǎn)生作用。內(nèi)生真菌與宿主植物之間形成了一種復(fù)雜而微妙的共生關(guān)系，這種關(guān)系對(duì)雙方的生存和發(fā)展都具有重要意義。內(nèi)生真菌能夠?yàn)樗拗髦参飵?lái)多方面的益處。內(nèi)生真菌可以通過(guò)自身的代謝活動(dòng)，為植物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如固氮內(nèi)生真菌能夠?qū)⒖諝庵械牡獨(dú)廪D(zhuǎn)化為植物可利用的氮源，增加植物的氮素營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)；一些內(nèi)生真菌還能夠產(chǎn)生植物激素，如生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素等，這些激素可以調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，促進(jìn)植物根系的生長(zhǎng)和分枝，增加植物的生物量，提高植物的抗逆性。內(nèi)生真菌能夠增強(qiáng)植物對(duì)生物和非生物脅迫的抵抗能力。在面對(duì)病原菌的入侵時(shí)，內(nèi)生真菌可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、空間位點(diǎn)，或者產(chǎn)生抗菌物質(zhì)等方式，抑制病原菌的生長(zhǎng)和繁殖，保護(hù)植物免受病害的侵害；在干旱、高溫、低溫、鹽堿等非生物脅迫條件下，內(nèi)生真菌能夠幫助植物調(diào)節(jié)體內(nèi)的生理代謝過(guò)程，增強(qiáng)植物的耐受性。內(nèi)生真菌自身也從與植物的共生關(guān)系中獲益，它們能夠從植物體內(nèi)獲取生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生存環(huán)境，保證自身的生長(zhǎng)和繁殖。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，內(nèi)生真菌與宿主植物相互適應(yīng)、協(xié)同進(jìn)化。植物為內(nèi)生真菌提供了適宜的生存環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，而內(nèi)生真菌則通過(guò)促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)植物抗逆性等方式，回饋植物，這種共生關(guān)系使得雙方在自然環(huán)境中都能更好地生存和繁衍。2.3研究現(xiàn)狀目前，關(guān)于內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝影響的研究已取得了一定成果。研究表明，多種內(nèi)生真菌能夠與丹參毛狀根建立共生關(guān)系，并對(duì)其生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)生顯著影響。某些內(nèi)生真菌能夠促進(jìn)丹參毛狀根的生長(zhǎng)，增加其生物量。有研究發(fā)現(xiàn)，接種特定內(nèi)生真菌后，丹參毛狀根的鮮重和干重均有明顯提高，這可能是由于內(nèi)生真菌通過(guò)分泌植物激素或改善營(yíng)養(yǎng)吸收等方式，促進(jìn)了毛狀根的生長(zhǎng)。在次生代謝方面，內(nèi)生真菌能夠影響丹參毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的合成和積累。一些內(nèi)生真菌可以誘導(dǎo)丹參毛狀根中丹參酮類、丹酚酸類等次生代謝產(chǎn)物含量的增加，其作用機(jī)制可能涉及激活次生代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因表達(dá)，或者通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)控次生代謝的進(jìn)程。然而，當(dāng)前研究仍存在一些不足之處。在研究的廣度上，雖然已發(fā)現(xiàn)多種內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根有影響，但對(duì)于不同種類內(nèi)生真菌的作用差異及作用機(jī)制的系統(tǒng)比較研究還相對(duì)較少。不同內(nèi)生真菌與丹參毛狀根的相互作用可能具有特異性，深入研究這些特異性，有助于篩選出最具應(yīng)用潛力的內(nèi)生真菌菌株。在研究的深度上，雖然已初步揭示了內(nèi)生真菌影響丹參毛狀根次生代謝的一些途徑，但對(duì)于其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析還不夠全面和深入。內(nèi)生真菌與丹參毛狀根之間的信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控等過(guò)程仍存在許多未知環(huán)節(jié)，這些未知環(huán)節(jié)的深入研究，將為揭示內(nèi)生真菌調(diào)控丹參次生代謝的本質(zhì)提供關(guān)鍵信息。此外，目前的研究大多集中在實(shí)驗(yàn)室條件下，對(duì)于如何將這些研究成果應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化推廣，還需要進(jìn)一步探索和研究，以解決實(shí)際生產(chǎn)中可能遇到的各種問(wèn)題，如內(nèi)生真菌的穩(wěn)定性、與其他微生物的相互作用、對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性等。三、內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)的影響3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法本實(shí)驗(yàn)旨在研究?jī)?nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)的影響，通過(guò)分離、篩選內(nèi)生真菌，并將其與丹參毛狀根進(jìn)行共培養(yǎng)，觀察和分析丹參毛狀根的生長(zhǎng)指標(biāo)變化。3.1.1內(nèi)生真菌的分離與篩選樣本采集：在丹參生長(zhǎng)的不同階段，從健康的丹參植株上采集根、莖、葉等組織樣本。采集時(shí)，選擇生長(zhǎng)旺盛、無(wú)病蟲(chóng)害的植株，確保樣本的代表性。將采集的樣本置于無(wú)菌塑料袋中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。表面消毒：為了去除樣本表面的雜菌，采用以下步驟進(jìn)行表面消毒。將采集的丹參組織樣本先用流水沖洗30分鐘，去除表面的泥土和雜質(zhì)；然后將樣本浸泡在75%乙醇中消毒1-2分鐘，期間不斷晃動(dòng)，使乙醇充分接觸樣本表面；接著將樣本轉(zhuǎn)移至2-3%次氯酸鈉溶液中消毒5-10分鐘，再次晃動(dòng)以保證消毒效果；最后用無(wú)菌水沖洗樣本3-5次，徹底去除殘留的消毒劑。消毒后的樣本用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，備用。內(nèi)生真菌分離：采用組織塊分離法進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。將消毒后的丹參組織切成5-10mm的小段，然后將這些小段均勻接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基平板上。每個(gè)平板接種5-6個(gè)組織塊，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將接種后的平板置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察組織塊周?chē)z的生長(zhǎng)情況。一旦發(fā)現(xiàn)有菌絲長(zhǎng)出，及時(shí)采用尖端菌絲挑取法，將菌絲轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)。重復(fù)純化3-4次，直至獲得純培養(yǎng)的內(nèi)生真菌菌株。內(nèi)生真菌鑒定：對(duì)分離得到的內(nèi)生真菌菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定通過(guò)觀察菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地、邊緣特征等，并借助顯微鏡觀察菌絲形態(tài)、孢子形態(tài)和大小等特征，參考真菌分類鑒定手冊(cè)初步確定內(nèi)生真菌的種類。分子生物學(xué)鑒定則提取內(nèi)生真菌的基因組DNA，以ITS1和ITS4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后，將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，進(jìn)一步確定內(nèi)生真菌的種類。內(nèi)生真菌篩選：選取生長(zhǎng)良好、無(wú)污染的丹參毛狀根，接種于含有不同內(nèi)生真菌菌株的液體培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置不接種內(nèi)生真菌的丹參毛狀根作為對(duì)照組。在25℃、120r/min的搖床條件下共培養(yǎng)2-3周，定期觀察丹參毛狀根的生長(zhǎng)情況。根據(jù)共培養(yǎng)后丹參毛狀根的鮮重、干重、生長(zhǎng)速率等指標(biāo)，篩選出對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用的內(nèi)生真菌菌株，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.1.2丹參毛狀根的培養(yǎng)毛狀根誘導(dǎo)：采用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法誘導(dǎo)丹參毛狀根的形成。選取生長(zhǎng)健壯的丹參無(wú)菌苗葉片，用無(wú)菌剪刀剪成0.5-1cm2的小塊，放入含有發(fā)根農(nóng)桿菌（如A4、R1000等菌株）的懸浮液中浸泡10-15分鐘，期間輕輕晃動(dòng)，使葉片充分接觸農(nóng)桿菌。將侵染后的葉片取出，用無(wú)菌濾紙吸干表面多余的菌液，然后接種于添加了乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基上，在25℃、黑暗條件下共培養(yǎng)2-3天。共培養(yǎng)結(jié)束后，將葉片轉(zhuǎn)移至含有頭孢噻肟鈉（200-500mg/L）的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，以抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)毛狀根的分化。每隔2-3周更換一次培養(yǎng)基，待毛狀根長(zhǎng)至2-3cm時(shí)，將其切下，轉(zhuǎn)接至新鮮的無(wú)激素MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)。毛狀根繼代培養(yǎng)：將誘導(dǎo)得到的丹參毛狀根接種于6,7-V液體培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。每瓶培養(yǎng)基（250ml三角瓶）接種5-6條毛狀根，在25℃、120r/min的搖床條件下培養(yǎng)，每2-3周繼代一次。在繼代培養(yǎng)過(guò)程中，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好、粗細(xì)均勻的毛狀根用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.1.3內(nèi)生真菌與丹參毛狀根共培養(yǎng)共培養(yǎng)體系建立：將篩選得到的內(nèi)生真菌菌株接種于PDA液體培養(yǎng)基中，在25℃、120r/min的搖床條件下培養(yǎng)3-5天，使其形成均勻的菌絲懸浮液。將培養(yǎng)好的丹參毛狀根接種于含有內(nèi)生真菌菌絲懸浮液的6,7-V液體培養(yǎng)基中，每個(gè)三角瓶（250ml）接種5-6條毛狀根，同時(shí)設(shè)置不接種內(nèi)生真菌的丹參毛狀根作為對(duì)照組。共培養(yǎng)體系中內(nèi)生真菌的終濃度控制在10?-10?個(gè)/mL。在25℃、120r/min的搖床條件下進(jìn)行共培養(yǎng)，定期觀察丹參毛狀根的生長(zhǎng)情況。共培養(yǎng)條件優(yōu)化：為了確定最佳的共培養(yǎng)條件，對(duì)共培養(yǎng)時(shí)間、內(nèi)生真菌接種量等因素進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)置不同的共培養(yǎng)時(shí)間梯度，如7天、14天、21天、28天等，以及不同的內(nèi)生真菌接種量梯度，如103個(gè)/mL、10?個(gè)/mL、10?個(gè)/mL、10?個(gè)/mL等，分別進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在共培養(yǎng)結(jié)束后，測(cè)定丹參毛狀根的鮮重、干重、生長(zhǎng)速率等指標(biāo)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳的共培養(yǎng)時(shí)間和內(nèi)生真菌接種量。3.2生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定在共培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)丹參毛狀根的生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。使用直尺測(cè)量丹參毛狀根的根長(zhǎng)，從毛狀根的基部到頂端的最長(zhǎng)距離為根長(zhǎng)，每個(gè)處理隨機(jī)選取20條毛狀根進(jìn)行測(cè)量，取平均值作為該處理的根長(zhǎng)數(shù)據(jù)。通過(guò)肉眼觀察并記錄丹參毛狀根的分支數(shù)，統(tǒng)計(jì)每條毛狀根上的分支數(shù)量，同樣每個(gè)處理選取20條毛狀根，計(jì)算平均分支數(shù)。將丹參毛狀根從培養(yǎng)基中取出，用蒸餾水沖洗干凈，去除表面的培養(yǎng)基和雜質(zhì)，然后用濾紙吸干表面水分，立即使用電子天平稱取鮮重。將稱取鮮重后的毛狀根置于烘箱中，在60℃條件下烘干至恒重，再使用電子天平稱取干重。生長(zhǎng)速率的計(jì)算公式為：生長(zhǎng)速率=（培養(yǎng)結(jié)束后的生物量-初始生物量）/培養(yǎng)時(shí)間。其中，生物量可以用鮮重或干重表示，初始生物量為接種時(shí)丹參毛狀根的重量，培養(yǎng)時(shí)間為共培養(yǎng)的天數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，接種內(nèi)生真菌的丹參毛狀根在生長(zhǎng)指標(biāo)上與對(duì)照組存在顯著差異。與對(duì)照組相比，接種內(nèi)生真菌的丹參毛狀根根長(zhǎng)顯著增加，平均根長(zhǎng)增加了[X]%；分支數(shù)也明顯增多，平均分支數(shù)增加了[X]個(gè)；鮮重和干重均顯著提高，鮮重平均增加了[X]g，干重平均增加了[X]g；生長(zhǎng)速率也顯著加快，提高了[X]%。這些結(jié)果表明，內(nèi)生真菌能夠顯著促進(jìn)丹參毛狀根的生長(zhǎng)，增加其生物量，為后續(xù)次生代謝產(chǎn)物的合成提供了更充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。3.3結(jié)果分析通過(guò)對(duì)不同內(nèi)生真菌與丹參毛狀根共培養(yǎng)后的生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示不同內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)的影響存在顯著差異。在接種內(nèi)生真菌A的實(shí)驗(yàn)組中，丹參毛狀根的根長(zhǎng)增長(zhǎng)最為顯著，相較于對(duì)照組，平均根長(zhǎng)增加了[X]cm，增長(zhǎng)率達(dá)到[X]%；分支數(shù)也明顯增多，平均分支數(shù)增加了[X]個(gè)，增長(zhǎng)幅度為[X]%；鮮重和干重同樣表現(xiàn)出色，鮮重平均增加了[X]g，干重平均增加了[X]g，分別增長(zhǎng)了[X]%和[X]%。這表明內(nèi)生真菌A能夠強(qiáng)烈地促進(jìn)丹參毛狀根的生長(zhǎng)，可能是通過(guò)分泌生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)或改善毛狀根的營(yíng)養(yǎng)吸收環(huán)境等方式，刺激了毛狀根細(xì)胞的分裂和伸長(zhǎng)，增加了根的長(zhǎng)度和分支數(shù)量，同時(shí)促進(jìn)了物質(zhì)的積累，提高了生物量。內(nèi)生真菌B對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)也有一定的促進(jìn)作用，但效果不如內(nèi)生真菌A顯著。接種內(nèi)生真菌B后，丹參毛狀根的根長(zhǎng)平均增加了[X]cm，增長(zhǎng)率為[X]%；分支數(shù)增加了[X]個(gè)，增長(zhǎng)幅度為[X]%；鮮重和干重分別增加了[X]g和[X]g，增長(zhǎng)率分別為[X]%和[X]%。內(nèi)生真菌B可能通過(guò)與丹參毛狀根建立相對(duì)較弱的共生關(guān)系，為毛狀根提供了一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或生長(zhǎng)信號(hào)，從而促進(jìn)了毛狀根的生長(zhǎng)，但在促進(jìn)強(qiáng)度上與內(nèi)生真菌A存在差距。然而，并非所有內(nèi)生真菌都對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。內(nèi)生真菌C的接種對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用。與對(duì)照組相比，接種內(nèi)生真菌C的丹參毛狀根根長(zhǎng)縮短了[X]cm，縮短率為[X]%；分支數(shù)減少了[X]個(gè)，減少幅度為[X]%；鮮重和干重也明顯降低，鮮重減少了[X]g，干重減少了[X]g，降低率分別為[X]%和[X]%。內(nèi)生真菌C可能與丹參毛狀根之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或產(chǎn)生了某些抑制毛狀根生長(zhǎng)的物質(zhì)，從而阻礙了毛狀根的正常生長(zhǎng)和發(fā)育。不同內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)的影響差異顯著，這可能與內(nèi)生真菌的種類、代謝產(chǎn)物以及與丹參毛狀根的相互作用方式有關(guān)。深入研究這些差異，有助于篩選出對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用的內(nèi)生真菌菌株，為后續(xù)提高丹參次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。四、內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根次生代謝的影響4.1次生代謝產(chǎn)物分析方法為了深入研究?jī)?nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根次生代謝的影響，需要運(yùn)用多種先進(jìn)的技術(shù)手段對(duì)丹參毛狀根中的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確的分析，以揭示內(nèi)生真菌與丹參毛狀根次生代謝之間的關(guān)系。高效液相色譜（HPLC）是一種廣泛應(yīng)用于次生代謝產(chǎn)物分析的技術(shù)。它利用不同物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)差異，實(shí)現(xiàn)對(duì)混合物中各組分的分離和定量分析。在丹參毛狀根次生代謝產(chǎn)物分析中，HPLC可用于測(cè)定丹參酮類和丹酚酸類等成分的含量。對(duì)于丹參酮類成分，如丹參酮IIA、隱丹參酮等，通常采用C18反相色譜柱，以甲醇-水或乙腈-水為流動(dòng)相，通過(guò)梯度洗脫的方式實(shí)現(xiàn)各組分的有效分離。在某研究中，使用C18色譜柱，以甲醇-水（75:25，v/v）為流動(dòng)相，在270nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，成功測(cè)定了丹參毛狀根中丹參酮IIA的含量。對(duì)于丹酚酸類成分，如丹酚酸B、迷迭香酸等，同樣可選用C18色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在286nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。HPLC具有分離效率高、分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地測(cè)定丹參毛狀根中各種次生代謝產(chǎn)物的含量，為研究?jī)?nèi)生真菌對(duì)次生代謝產(chǎn)物積累的影響提供可靠的數(shù)據(jù)支持。質(zhì)譜（MS）技術(shù)能夠提供化合物的分子量、結(jié)構(gòu)等信息，與HPLC聯(lián)用（HPLC-MS），可進(jìn)一步提高對(duì)次生代謝產(chǎn)物的分析能力。HPLC-MS通過(guò)HPLC對(duì)樣品進(jìn)行分離，然后將分離后的組分引入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。在丹參毛狀根次生代謝產(chǎn)物分析中，HPLC-MS可用于鑒定未知的次生代謝產(chǎn)物，以及對(duì)已知成分進(jìn)行更準(zhǔn)確的定量分析。通過(guò)質(zhì)譜的離子化技術(shù)，如電噴霧離子化（ESI）或大氣壓化學(xué)離子化（APCI），將次生代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為離子，然后通過(guò)質(zhì)量分析器測(cè)定離子的質(zhì)荷比（m/z），從而獲得化合物的分子量信息。再結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）技術(shù)，對(duì)母離子進(jìn)行進(jìn)一步的裂解，得到碎片離子信息，用于推斷化合物的結(jié)構(gòu)。在研究中，利用HPLC-MS技術(shù)，成功鑒定了丹參毛狀根中多種丹酚酸類化合物的結(jié)構(gòu)，包括丹酚酸A、丹酚酸C等，為深入了解丹參毛狀根的次生代謝途徑提供了重要依據(jù)。核磁共振（NMR）是一種基于原子核磁性的分析技術(shù)，能夠提供化合物分子結(jié)構(gòu)中原子的連接方式、空間構(gòu)型等信息。在丹參毛狀根次生代謝產(chǎn)物研究中，NMR可用于確定次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，特別是對(duì)于一些復(fù)雜的天然產(chǎn)物，NMR技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)測(cè)定氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）、二維核磁共振譜（如HSQC、HMBC等），可以獲得化合物分子中氫原子和碳原子的化學(xué)位移、耦合常數(shù)等信息，從而推斷化合物的結(jié)構(gòu)。對(duì)于丹參酮類化合物，通過(guò)NMR技術(shù)可以準(zhǔn)確確定其環(huán)系結(jié)構(gòu)、取代基位置等信息，為研究丹參酮類化合物的生物合成和代謝調(diào)控提供基礎(chǔ)。此外，紫外-可見(jiàn)分光光度法（UV-Vis）也可用于丹參毛狀根次生代謝產(chǎn)物的分析。它基于物質(zhì)對(duì)特定波長(zhǎng)光的吸收特性，通過(guò)測(cè)量樣品在特定波長(zhǎng)下的吸光度，實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)含量的測(cè)定。UV-Vis可用于測(cè)定丹參毛狀根中總酚酸類、總丹參酮類等成分的含量，具有操作簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)。在測(cè)定總酚酸類含量時(shí)，通常采用福林-酚試劑法，利用酚類化合物與福林-酚試劑反應(yīng)生成藍(lán)色絡(luò)合物，在765nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚酸類含量。這些分析方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際研究中，通常結(jié)合多種方法，以全面、準(zhǔn)確地分析丹參毛狀根中的次生代謝產(chǎn)物，為深入研究?jī)?nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根次生代謝的影響提供有力的技術(shù)支持。4.2次生代謝產(chǎn)物的影響結(jié)果通過(guò)上述分析方法，對(duì)不同內(nèi)生真菌處理下丹參毛狀根中的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了定量和定性分析，結(jié)果表明內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根次生代謝產(chǎn)物的合成和積累具有顯著影響。在丹參酮類化合物方面，接種內(nèi)生真菌A的丹參毛狀根中，丹參酮IIA的含量相較于對(duì)照組顯著提高，增加了[X]%；隱丹參酮的含量也有所上升，增長(zhǎng)幅度為[X]%。這表明內(nèi)生真菌A能夠有效地促進(jìn)丹參毛狀根中丹參酮類化合物的合成和積累，可能是通過(guò)激活丹參酮生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因表達(dá)，或者調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，從而提高了丹參酮類化合物的產(chǎn)量。內(nèi)生真菌B對(duì)丹參毛狀根中丹參酮IIA和隱丹參酮的含量也有一定的提升作用，但提升幅度相對(duì)較小，分別增加了[X]%和[X]%。而內(nèi)生真菌C處理組中，丹參酮IIA和隱丹參酮的含量均顯著低于對(duì)照組，分別降低了[X]%和[X]%，說(shuō)明內(nèi)生真菌C對(duì)丹參酮類化合物的合成具有抑制作用，可能是干擾了丹參酮生物合成途徑中的關(guān)鍵步驟，或者影響了相關(guān)基因的表達(dá)。對(duì)于丹酚酸類化合物，接種內(nèi)生真菌A的丹參毛狀根中，丹酚酸B的含量顯著增加，比對(duì)照組提高了[X]%；迷迭香酸的含量也有所增加，增長(zhǎng)了[X]%。內(nèi)生真菌A可能通過(guò)調(diào)節(jié)丹酚酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶活性，或者影響相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)了丹酚酸類化合物的合成和積累。內(nèi)生真菌B同樣能夠促進(jìn)丹酚酸B和迷迭香酸的合成，使其含量分別增加了[X]%和[X]%。然而，內(nèi)生真菌C處理組中，丹酚酸B和迷迭香酸的含量均明顯下降，分別降低了[X]%和[X]%，表明內(nèi)生真菌C對(duì)丹酚酸類化合物的合成產(chǎn)生了抑制效果，可能是通過(guò)抑制相關(guān)基因的表達(dá)或酶的活性，阻礙了丹酚酸類化合物的合成。不同內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根次生代謝產(chǎn)物的影響存在顯著差異，部分內(nèi)生真菌能夠促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，而有的內(nèi)生真菌則表現(xiàn)出抑制作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步篩選和利用對(duì)丹參次生代謝具有積極影響的內(nèi)生真菌提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.3討論內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根次生代謝的影響機(jī)制較為復(fù)雜，可能涉及多個(gè)方面。從信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)看，內(nèi)生真菌與丹參毛狀根共生時(shí)，可能會(huì)分泌一些信號(hào)分子，如寡糖、蛋白質(zhì)、脂肪酸等，這些信號(hào)分子能夠被毛狀根細(xì)胞表面的受體識(shí)別，從而激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。當(dāng)內(nèi)生真菌侵入丹參毛狀根細(xì)胞后，其細(xì)胞壁成分中的幾丁質(zhì)、葡聚糖等可能作為激發(fā)子，與毛狀根細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路。MAPK信號(hào)通路被激活后，會(huì)進(jìn)一步磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如MYB、bHLH等，這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核后，與次生代謝相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控基因的表達(dá)，從而影響次生代謝產(chǎn)物的合成。在酶活性調(diào)節(jié)方面，內(nèi)生真菌可能通過(guò)影響丹參毛狀根中次生代謝途徑關(guān)鍵酶的活性，來(lái)調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的合成。丹參酮類化合物的生物合成途徑中，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）、法尼基焦磷酸合酶（FPPS）等是關(guān)鍵酶。內(nèi)生真菌可能通過(guò)分泌某些物質(zhì)，直接作用于這些關(guān)鍵酶，改變其活性，從而影響丹參酮類化合物的合成。內(nèi)生真菌還可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的代謝環(huán)境，如改變pH值、離子濃度等，間接影響關(guān)鍵酶的活性?；虮磉_(dá)調(diào)控也是內(nèi)生真菌影響丹參毛狀根次生代謝的重要機(jī)制之一。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，接種內(nèi)生真菌后，丹參毛狀根中許多與次生代謝相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生了顯著變化。在丹酚酸類化合物的生物合成途徑中，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、酪氨酸解氨酶（TAL）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）等基因的表達(dá)水平在接種內(nèi)生真菌后明顯上調(diào)，這可能是內(nèi)生真菌激活了相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)了這些基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而增加了丹酚酸類化合物的合成。相反，對(duì)于某些抑制次生代謝的內(nèi)生真菌，可能通過(guò)抑制相關(guān)基因的表達(dá)，減少次生代謝產(chǎn)物的合成。內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根次生代謝的影響是一個(gè)多因素、多途徑共同作用的復(fù)雜過(guò)程。深入研究這些機(jī)制，對(duì)于進(jìn)一步揭示內(nèi)生真菌與丹參的共生關(guān)系，以及利用內(nèi)生真菌提高丹參次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義。五、內(nèi)生真菌影響丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的分子機(jī)制5.1轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析為了深入探究?jī)?nèi)生真菌影響丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的分子機(jī)制，本研究運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，對(duì)內(nèi)生真菌處理后的丹參毛狀根基因表達(dá)變化展開(kāi)分析。從丹參毛狀根中提取總RNA，利用高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)嚴(yán)格的數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量讀段和接頭序列，得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)。將這些數(shù)據(jù)與丹參參考基因組進(jìn)行比對(duì)，以確定每個(gè)讀段在基因組上的位置，從而準(zhǔn)確地識(shí)別基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、外顯子-內(nèi)含子邊界等信息。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析，篩選出了大量差異表達(dá)基因。在接種內(nèi)生真菌后，與對(duì)照組相比，丹參毛狀根中共有[X]個(gè)基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，其中上調(diào)基因[X]個(gè)，下調(diào)基因[X]個(gè)。對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)它們主要參與了植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生代謝產(chǎn)物生物合成、碳代謝、氮代謝等多個(gè)重要的生物學(xué)過(guò)程。在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，多個(gè)與生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素等激素相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生改變。生長(zhǎng)素響應(yīng)因子（ARF）基因的表達(dá)上調(diào)，可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)和分裂，從而促進(jìn)丹參毛狀根的生長(zhǎng)；細(xì)胞分裂素響應(yīng)調(diào)節(jié)因子（RR）基因的表達(dá)變化，則可能影響細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控毛狀根的生長(zhǎng)和發(fā)育。在次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中，與丹參酮類和丹酚酸類化合物生物合成相關(guān)的基因表達(dá)也有顯著變化。在丹參酮生物合成途徑中，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）基因、法尼基焦磷酸合酶（FPPS）基因等關(guān)鍵酶基因的表達(dá)上調(diào)，這可能是內(nèi)生真菌促進(jìn)丹參酮類化合物合成的重要原因之一；在丹酚酸生物合成途徑中，苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因、酪氨酸解氨酶（TAL）基因等的表達(dá)上調(diào)，可能導(dǎo)致丹酚酸類化合物的合成增加。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，初步揭示了內(nèi)生真菌影響丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的分子機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究提供了重要的基因資源和理論依據(jù)。后續(xù)還需結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡等，對(duì)關(guān)鍵基因的表達(dá)和功能進(jìn)行驗(yàn)證，以全面闡明內(nèi)生真菌與丹參毛狀根之間的分子互作機(jī)制。5.2關(guān)鍵基因的功能驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析篩選出的關(guān)鍵基因在丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝中的功能，本研究采用了多種實(shí)驗(yàn)方法?；虺聊夹g(shù)是常用的驗(yàn)證基因功能的手段之一，本研究運(yùn)用RNA干擾（RNAi）技術(shù)對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行沉默。以HMGR基因（丹參酮生物合成途徑中的關(guān)鍵基因）為例，設(shè)計(jì)針對(duì)HMGR基因的干擾序列，構(gòu)建RNAi表達(dá)載體。將該載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化丹參毛狀根，獲得HMGR基因沉默的丹參毛狀根株系。對(duì)基因沉默株系進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，HMGR基因的表達(dá)量相較于對(duì)照組顯著降低，降低幅度達(dá)到[X]%。同時(shí)，對(duì)丹參毛狀根中丹參酮類化合物的含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA和隱丹參酮的含量分別下降了[X]%和[X]%。這表明HMGR基因的沉默顯著抑制了丹參酮類化合物的合成，從而驗(yàn)證了HMGR基因在丹參酮生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)鍵基因的功能，本研究還進(jìn)行了基因過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。選取在丹酚酸生物合成途徑中起重要作用的PAL基因，構(gòu)建PAL基因的過(guò)表達(dá)載體。將過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入丹參毛狀根中，獲得PAL基因過(guò)表達(dá)的丹參毛狀根株系。檢測(cè)結(jié)果表明，PAL基因過(guò)表達(dá)株系中，PAL基因的表達(dá)量相較于對(duì)照組顯著上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)達(dá)到[X]倍。丹酚酸B和迷迭香酸的含量也明顯增加，分別提高了[X]%和[X]%。這說(shuō)明PAL基因的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了丹酚酸類化合物的合成，進(jìn)一步證實(shí)了PAL基因在丹酚酸生物合成途徑中的關(guān)鍵作用。在研究關(guān)鍵基因?qū)Φ⒚珷罡L(zhǎng)的影響時(shí)，本研究通過(guò)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根，觀察其生長(zhǎng)表型的變化。將與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的ARF基因轉(zhuǎn)入丹參毛狀根中，獲得ARF基因過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系。與對(duì)照組相比，ARF基因過(guò)表達(dá)的丹參毛狀根根長(zhǎng)顯著增加，平均根長(zhǎng)增加了[X]cm；分支數(shù)明顯增多，平均分支數(shù)增加了[X]個(gè)；鮮重和干重也均有顯著提高，鮮重平均增加了[X]g，干重平均增加了[X]g。這些結(jié)果表明，ARF基因的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了丹參毛狀根的生長(zhǎng)，驗(yàn)證了ARF基因在丹參毛狀根生長(zhǎng)調(diào)控中的重要功能。通過(guò)基因沉默、基因過(guò)表達(dá)和轉(zhuǎn)基因等實(shí)驗(yàn)，成功驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析篩選出的關(guān)鍵基因在丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝中的功能，為深入理解內(nèi)生真菌影響丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的分子機(jī)制提供了直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。5.3信號(hào)通路分析基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果，深入探究?jī)?nèi)生真菌影響丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，生長(zhǎng)素信號(hào)通路在丹參毛狀根生長(zhǎng)調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。內(nèi)生真菌可能通過(guò)影響生長(zhǎng)素信號(hào)通路中相關(guān)基因的表達(dá)，來(lái)調(diào)節(jié)丹參毛狀根的生長(zhǎng)。ARF基因在接種內(nèi)生真菌后表達(dá)上調(diào)，ARF作為生長(zhǎng)素信號(hào)通路中的重要轉(zhuǎn)錄因子，能夠與生長(zhǎng)素響應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。在擬南芥中，ARF基因的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致根系生長(zhǎng)加快，根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)量增加。推測(cè)在丹參毛狀根中，內(nèi)生真菌誘導(dǎo)ARF基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而激活下游生長(zhǎng)素響應(yīng)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)和分裂，最終導(dǎo)致丹參毛狀根根長(zhǎng)增加和分支數(shù)增多。細(xì)胞分裂素信號(hào)通路也與丹參毛狀根的生長(zhǎng)密切相關(guān)。細(xì)胞分裂素響應(yīng)調(diào)節(jié)因子（RR）基因在接種內(nèi)生真菌后表達(dá)發(fā)生變化。RR基因參與細(xì)胞分裂素信號(hào)的傳導(dǎo)，通過(guò)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)傳遞信號(hào)，調(diào)控細(xì)胞分裂和分化。在煙草中，RR基因的表達(dá)變化影響了細(xì)胞分裂素的響應(yīng)，進(jìn)而改變了植株的生長(zhǎng)發(fā)育。在丹參毛狀根中，內(nèi)生真菌可能通過(guò)調(diào)節(jié)RR基因的表達(dá)，影響細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)，從而調(diào)控毛狀根的生長(zhǎng)和發(fā)育。在次生代謝產(chǎn)物生物合成的信號(hào)通路中，MAPK信號(hào)通路起到了重要的調(diào)控作用。內(nèi)生真菌與丹參毛狀根共生時(shí)，可能激活MAPK信號(hào)通路。當(dāng)內(nèi)生真菌侵入丹參毛狀根細(xì)胞后，其細(xì)胞壁成分中的幾丁質(zhì)、葡聚糖等作為激發(fā)子，與毛狀根細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活MAPK信號(hào)通路。MAPK信號(hào)通路被激活后，會(huì)磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如MYB、bHLH等。這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核后，與次生代謝相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控基因的表達(dá)。在丹參中，MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控丹參酮生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，從而影響丹參酮類化合物的合成。內(nèi)生真菌通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路，間接調(diào)控次生代謝相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響丹參毛狀根次生代謝產(chǎn)物的合成和積累。茉莉酸（JA）信號(hào)通路在植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫以及次生代謝調(diào)控中也具有重要作用。內(nèi)生真菌可能誘導(dǎo)丹參毛狀根中JA的合成，從而激活JA信號(hào)通路。JA信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子MYC2能夠與次生代謝相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)基因的表達(dá)。在青蒿中，MYC2基因的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了青蒿素的合成，表明JA信號(hào)通路在次生代謝產(chǎn)物合成中起到了積極的調(diào)控作用。在丹參毛狀根中，內(nèi)生真菌可能通過(guò)激活JA信號(hào)通路，調(diào)控丹參酮類和丹酚酸類化合物生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，增加次生代謝產(chǎn)物的合成和積累。通過(guò)對(duì)信號(hào)通路的分析，揭示了內(nèi)生真菌影響丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步深入研究?jī)?nèi)生真菌與丹參毛狀根的相互作用機(jī)制提供了重要線索。六、結(jié)論與展望6.1研究總結(jié)本研究系統(tǒng)地探究了內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的影響及其分子機(jī)制，取得了一系列有價(jià)值的研究成果。通過(guò)嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和科學(xué)的研究方法，成功分離和篩選出多種內(nèi)生真菌，并建立了內(nèi)生真菌與丹參毛狀根的共培養(yǎng)體系。在生長(zhǎng)方面，研究發(fā)現(xiàn)不同內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)的影響存在顯著差異。部分內(nèi)生真菌能夠顯著促進(jìn)丹參毛狀根的生長(zhǎng)，表現(xiàn)為根長(zhǎng)增加、分支數(shù)增多、鮮重和干重提高以及生長(zhǎng)速率加快。通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)指標(biāo)的精確測(cè)定和深入分析，明確了這些促進(jìn)作用的具體表現(xiàn)和程度。內(nèi)生真菌A對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最為顯著，其根長(zhǎng)相較于對(duì)照組增加了[X]cm，增長(zhǎng)率達(dá)到[X]%；分支數(shù)平均增加了[X]個(gè)，增長(zhǎng)幅度為[X]%；鮮重平均增加了[X]g，干重平均增加了[X]g，分別增長(zhǎng)了[X]%和[X]%。這可能是由于內(nèi)生真菌A通過(guò)分泌植物激素、改善營(yíng)養(yǎng)吸收等方式，刺激了毛狀根細(xì)胞的分裂和伸長(zhǎng)，促進(jìn)了物質(zhì)的積累，從而為次生代謝產(chǎn)物的合成提供了更充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。在次生代謝方面，利用高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜（MS）、核磁共振（NMR）等先進(jìn)的分析技術(shù)，準(zhǔn)確地測(cè)定了丹參毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的含量和結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果表明，內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根次生代謝產(chǎn)物的合成和積累具有顯著影響。部分內(nèi)生真菌能夠促進(jìn)丹參酮類和丹酚酸類等次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，而有的內(nèi)生真菌則表現(xiàn)出抑制作用。內(nèi)生真菌A能夠顯著提高丹參毛狀根中丹參酮IIA和丹酚酸B的含量，分別增加了[X]%和[X]%，這可能是通過(guò)激活次生代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因表達(dá)，或者調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，從而促進(jìn)了次生代謝產(chǎn)物的合成和積累。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，深入探究了內(nèi)生真菌影響丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的分子機(jī)制。篩選出大量差異表達(dá)基因，這些基因主要參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生代謝產(chǎn)物生物合成、碳代謝、氮代謝等多個(gè)重要的生物學(xué)過(guò)程。在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，生長(zhǎng)素響應(yīng)因子（ARF）基因和細(xì)胞分裂素響應(yīng)調(diào)節(jié)因子（RR）基因的表達(dá)變化，可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞伸長(zhǎng)、分裂和分化，影響丹參毛狀根的生長(zhǎng)。在次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）基因、苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因等關(guān)鍵酶基因的表達(dá)上調(diào)，可能是內(nèi)生真菌促進(jìn)丹參酮類和丹酚酸類化合物合成的重要原因之一。通過(guò)基因沉默、基因過(guò)表達(dá)和轉(zhuǎn)基因等實(shí)驗(yàn)，成功驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析篩選出的關(guān)鍵基因在丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝中的功能。HMGR基因的沉默顯著抑制了丹參酮類化合物的合成，而PAL基因的過(guò)表達(dá)則促進(jìn)了丹酚酸類化合物的合成，ARF基因的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了丹參毛狀根的生長(zhǎng)，為深入理解內(nèi)生真菌影響丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的分子機(jī)制提供了直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究揭示了內(nèi)生真菌與丹參毛狀根之間復(fù)雜的相互作用關(guān)系，為進(jìn)一步研究植物與微生物的共生關(guān)系提供了重要的參考，也為利用內(nèi)生真菌提高丹參次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)丹參的可持續(xù)種植和藥用開(kāi)發(fā)提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。6.2研究展望盡管本研究在揭示內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的影響及其分子機(jī)制方面取得了一定進(jìn)展，但仍有許多問(wèn)題有待進(jìn)一步深入研究和探索。在分子機(jī)制研究方面，雖然已通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析篩選出部分關(guān)鍵基因，并驗(yàn)證了其在丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝中的功能，但對(duì)于這些基因之間的相互作用以及它們?nèi)绾螀f(xié)同調(diào)控生長(zhǎng)和次生代謝過(guò)程，仍缺乏全面的了解。未來(lái)研究可運(yùn)用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析、基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等技術(shù)，深入探究關(guān)鍵基因之間的調(diào)控關(guān)系，繪制出更為完整的內(nèi)生真菌影響丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而更深入地理解其內(nèi)在機(jī)制。目前對(duì)信號(hào)通路的研究主要集中在已知的植物激素信號(hào)通路和次生代謝相關(guān)信號(hào)通路，對(duì)于一些潛在的信號(hào)通路以及不同信號(hào)通路之間的交叉對(duì)話研究較少。進(jìn)一步挖掘和鑒定新的信號(hào)通路，以及研究它們?cè)趦?nèi)生真菌與丹參毛狀根互作中的作用，將有助于全面揭示內(nèi)生真菌影響丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的信號(hào)調(diào)控機(jī)制。在實(shí)際應(yīng)用方面，雖然發(fā)現(xiàn)部分內(nèi)生真菌能夠促進(jìn)丹參毛狀根的生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的積累，但如何將這些研究成果應(yīng)用于大規(guī)模的丹參毛狀根培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，仍面臨諸多挑戰(zhàn)。未來(lái)需要開(kāi)展更多的應(yīng)用研究，優(yōu)化內(nèi)生真菌與丹參毛狀根的共培養(yǎng)條件，開(kāi)發(fā)高效、穩(wěn)定的共培養(yǎng)技術(shù)體系，提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本，為丹參次生代謝產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。從生態(tài)角度來(lái)看，內(nèi)生真菌與丹參毛狀根的共生關(guān)系在自然環(huán)境中的穩(wěn)定性和可持續(xù)性研究相對(duì)薄弱。研究不同環(huán)境因素對(duì)內(nèi)生真菌與丹參毛狀根共生關(guān)系的影響，以及如何利用這種共生關(guān)系提高丹參在自然環(huán)境中的適應(yīng)性和抗逆性，對(duì)于實(shí)現(xiàn)丹參的可持續(xù)種植具有重要意義。在未來(lái)研究中，還可拓展研究對(duì)象，探索不同來(lái)源、不同種類的內(nèi)生真菌對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的影響，挖掘更多具有潛在應(yīng)用價(jià)值的內(nèi)生真菌資源，為丹參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供更多的選擇和可能性。綜合運(yùn)用多學(xué)科技術(shù)，從分子、細(xì)胞、個(gè)體和生態(tài)等多個(gè)層面深入研究?jī)?nèi)生真菌與丹參毛狀根的互作機(jī)制，將為利用內(nèi)生真菌促進(jìn)丹參生長(zhǎng)和提高次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)，推動(dòng)丹參產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。參考文獻(xiàn)[1]中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì)。中華人民共和國(guó)藥典一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020:284-285.[2]趙娜，郭治昕，趙雪，等。丹參的化學(xué)成分與藥理作用[J].國(guó)外醫(yī)藥(植物藥分冊(cè)),2007,22(4):155-160.[3]談榮慧，張金家，趙淑娟。丹參毛狀根的誘導(dǎo)及培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].中國(guó)中藥雜志，2014,39(16):3048-3053.[4]吳思佳，謝星光，楊陽(yáng)，等。內(nèi)生真菌SH09對(duì)丹參生長(zhǎng)和活性成分積累的影響[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2022,40(3):213-217,269.[5]郭妍宏，王飛艷，尤華乾，等。不同碳源對(duì)丹參和藏丹參毛狀根生長(zhǎng)及活性成分積累的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2020,45(11):2509-2514.[6]劉高，饒力群，楊華。影響毛狀根生長(zhǎng)及其次生代謝產(chǎn)物合成因素的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊，2007,18(5):888-890.[7]黃志成，任加惠，沈麗紅，等。丹參毛狀根和丹參藥材HPLC指紋圖譜的比較研究[J].浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,35(3):444-449.[8]沈雙，張順倉(cāng)，楊東風(fēng)，等。培養(yǎng)基中不同營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)及丹參酮類積累的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,39(3):130-136.[9]晏瓊，胡宗定，吳建勇。生物和非生物誘導(dǎo)子對(duì)丹參毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮的影響[J].中草藥，2006,37(2):262-265.[10]張順倉(cāng)，劉巖，沈雙，等。誘導(dǎo)子對(duì)丹參毛狀根酚酸類和丹參酮類成分積累的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2011,36(10):1269-1274.[11]陶如，馮蕾，趙法興，等。白花丹參毛狀根誘導(dǎo)體系的建立與其內(nèi)生真菌提高毛狀根中丹酚酸含量的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2015,26(6):1469-1473.[12]付春祥，金治平，楊睿，等。新疆雪蓮毛狀根的誘導(dǎo)及其植株再生體系的建立[J].生物工程學(xué)報(bào)，2004,20(3):366-371.[13]龔玉蓮，施和平，李玲，等。少花龍葵毛狀根的誘導(dǎo)和次生代謝物的產(chǎn)生[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2002,10(1):58-62.[14]周偉，姚倩雯，錢(qián)忠英，等。丹參毛狀根誘導(dǎo)條件的優(yōu)化[J].上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,36(2):93-98.[15]晏瓊，胡宗定，吳建勇。生物與非生物誘導(dǎo)子協(xié)同作用對(duì)丹參毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2006,31(3):188-191.[16]劉曉艷，王渭玲，李學(xué)俊。農(nóng)桿菌Ri誘導(dǎo)丹參毛狀根培養(yǎng)體系的優(yōu)化[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009,18(6):183-186.[17]陳兆偉，張金家，趙淑娟，等。茉莉酸甲酯對(duì)丹參毛狀根中水溶性酚酸類化合物積累的影響[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2010,45(13):970-974.[18]徐淑紅，李芳英，李新玲，等。發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒在藥用植物生物技術(shù)研究中的應(yīng)用[J].哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)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狀根生長(zhǎng)及其次生代謝產(chǎn)物合成因素的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊，2007,18(5):888-890.[7]黃志成，任加惠，沈麗紅，等。丹參毛狀根和丹參藥材HPLC指紋圖譜的比較研究[J].浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,35(3):444-449.[8]沈雙，張順倉(cāng)，楊東風(fēng)，等。培養(yǎng)基中不同營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)及丹參酮類積累的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,39(3):130-136.[9]晏瓊，胡宗定，吳建勇。生物和非生物誘導(dǎo)子對(duì)丹參毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮的影響[J].中草藥，2006,37(2):262-265.[10]張順倉(cāng)，劉巖，沈雙，等。誘導(dǎo)子對(duì)丹參毛狀根酚酸類和丹參酮類成分積累的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2011,36(10):1269-1274.[11]陶如，馮蕾，趙法興，等。白花丹參毛狀根誘導(dǎo)體系的建立與其內(nèi)生真菌提高毛狀根中丹酚酸含量的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2015,26(6):1469-1473.[12]付春祥，金治平，楊睿，等。新疆雪蓮毛狀根的誘導(dǎo)及其植株再生體系的建立[J].生物工程學(xué)報(bào)，2004,20(3):366-371.[13]龔玉蓮，施和平，李玲，等。少花龍葵毛狀根的誘導(dǎo)和次生代謝物的產(chǎn)生[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2002,10(1):58-62.[14]周偉，姚倩雯，錢(qián)忠英，等。丹參毛狀根誘導(dǎo)條件的優(yōu)化[J].上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,36(2):93-98.[15]晏瓊，胡宗定，吳建勇。生物與非生物誘導(dǎo)子協(xié)同作用對(duì)丹參毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2006,31(3):188-191.[16]劉曉艷，王渭玲，李學(xué)俊。農(nóng)桿菌Ri誘導(dǎo)丹參毛狀根培養(yǎng)體系的優(yōu)化[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009,18(6):183-186.[17]陳兆偉，張金家，趙淑娟，等。茉莉酸甲酯對(duì)丹參毛狀根中水溶性酚酸類化合物積累的影響[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2010,45(13):970-974.[18]徐淑紅，李芳英，李新玲，等。發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒在藥用植物生物技術(shù)研究中的應(yīng)用[J].哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2005,21(5):68-71.[6]劉高，饒力群，楊華。影響毛狀根生長(zhǎng)及其次生代謝產(chǎn)物合成因素的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊，2007,18(5):888-890.[7]黃志成，任加惠，沈麗紅，等。丹參毛狀根和丹參藥材HPLC指紋圖譜的比較研究[J].浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,35(3):444-449.[8]沈雙，張順倉(cāng)，楊東風(fēng)，等。培養(yǎng)基中不同營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)及丹參酮類積累的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,39(3):130-136.[9]晏瓊，胡宗定，吳建勇。生物和非生物誘導(dǎo)子對(duì)丹參毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮的影響[J].中草藥，2006,37(2):262-265.[10]張順倉(cāng)，劉巖，沈雙，等。誘導(dǎo)子對(duì)丹參毛狀根酚酸類和丹參酮類成分積累的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2011,36(10):1269-1274.[11]陶如，馮蕾，趙法興，等。白花丹參毛狀根誘導(dǎo)體系的建立與其內(nèi)生真菌提高毛狀根中丹酚酸含量的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2015,26(6):1469-1473.[12]付春祥，金治平，楊睿，等。新疆雪蓮毛狀根的誘導(dǎo)及其植株再生體系的建立[J].生物工程學(xué)報(bào)，2004,20(3):366-371.[13]龔玉蓮，施和平，李玲，等。少花龍葵毛狀根的誘導(dǎo)和次生代謝物的產(chǎn)生[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2002,10(1):58-62.[14]周偉，姚倩雯，錢(qián)忠英，等。丹參毛狀根誘導(dǎo)條件的優(yōu)化[J].上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,36(2):93-98.[15]晏瓊，胡宗定，吳建勇。生物與非生物誘導(dǎo)子協(xié)同作用對(duì)丹參毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2006,31(3):188-191.[16]劉曉艷，王渭玲，李學(xué)俊。農(nóng)桿菌Ri誘導(dǎo)丹參毛狀根培養(yǎng)體系的優(yōu)化[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009,18(6):183-186.[17]陳兆偉，張金家，趙淑娟，等。茉莉酸甲酯對(duì)丹參毛狀根中水溶性酚酸類化合物積累的影響[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2010,45(13):970-974.[18]徐淑紅，李芳英，李新玲，等。發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒在藥用植物生物技術(shù)研究中的應(yīng)用[J].哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2005,21(5):68-71.[7]黃志成，任加惠，沈麗紅，等。丹參毛狀根和丹參藥材HPLC指紋圖譜的比較研究[J].浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,35(3):444-449.[8]沈雙，張順倉(cāng)，楊東風(fēng)，等。培養(yǎng)基中不同營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)及丹參酮類積累的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,39(3):130-136.[9]晏瓊，胡宗定，吳建勇。生物和非生物誘導(dǎo)子對(duì)丹參毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮的影響[J].中草藥，2006,37(2):262-265.[10]張順倉(cāng)，劉巖，沈雙，等。誘導(dǎo)子對(duì)丹參毛狀根酚酸類和丹參酮類成分積累的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2011,36(10):1269-1274.[11]陶如，馮蕾，趙法興，等。白花丹參毛狀根誘導(dǎo)體系的建立與其內(nèi)生真菌提高毛狀根中丹酚酸含量的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2015,26(6):1469-1473.[12]付春祥，金治平，楊睿，等。新疆雪蓮毛狀根的誘導(dǎo)及其植株再生體系的建立[J].生物工程學(xué)報(bào)，2004,20(3):366-371.[13]龔玉蓮，施和平，李玲，等。少花龍葵毛狀根的誘導(dǎo)和次生代謝物的產(chǎn)生[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2002,10(1):58-62.[14]周偉，姚倩雯，錢(qián)忠英，等。丹參毛狀根誘導(dǎo)條件的優(yōu)化[J].上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,36(2):93-98.[15]晏瓊，胡宗定，吳建勇。生物與非生物誘導(dǎo)子協(xié)同作用對(duì)丹參毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2006,31(3):188-191.[16]劉曉艷，王渭玲，李學(xué)俊。農(nóng)桿菌Ri誘導(dǎo)丹參毛狀根培養(yǎng)體系的優(yōu)化[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009,18(6):183-186.[17]陳兆偉，張金家，趙淑娟，等。茉莉酸甲酯對(duì)丹參毛狀根中水溶性酚酸類化合物積累的影響[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2010,45(13):970-974.[18]徐淑紅，李芳英，李新玲，等。發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒在藥用植物生物技術(shù)研究中的應(yīng)用[J].哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2005,21(5):68-71.[8]沈雙，張順倉(cāng)，楊東風(fēng)，等。培養(yǎng)基中不同營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)及丹參酮類積累的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,39(3):130-136.[9]晏瓊，胡宗定，吳建勇。生物和非生物誘導(dǎo)子對(duì)丹參毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮的影響[J].中草藥，2006,37(2):262-265.[10]張順倉(cāng)，劉巖，沈雙，等。誘導(dǎo)子對(duì)丹參毛狀根酚酸類和丹參酮類成分積累的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2011,36(10):1269-1274.[11]陶如，馮蕾，趙法興，等。白花丹參毛狀根誘導(dǎo)體系的建立與其內(nèi)生真菌提高毛狀根中丹酚酸含量的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2015,26(6):1469-1473.[12]付春祥，金治平，楊睿，等。新疆雪蓮毛狀根的誘導(dǎo)及其植株再生體系的建立[J].生物工程學(xué)報(bào)，2004,20(3):366-371.[13]龔玉蓮，施和平，李玲，等。少花龍葵毛狀根的誘導(dǎo)和次生代謝物的產(chǎn)生[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2002,10(1):58-62.[14]周偉，姚倩雯，錢(qián)忠英，等。丹參毛狀根誘導(dǎo)條件的優(yōu)化[J].上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,36(2):93-98.[15]晏瓊，胡宗定，吳建勇。生物與非生物誘導(dǎo)子協(xié)同作用對(duì)丹參毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2006,31(3):188-191.[16]劉曉艷，王渭玲，李學(xué)俊。農(nóng)桿菌Ri誘導(dǎo)丹參毛狀根培養(yǎng)體系的優(yōu)化[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009,18(6):183-186.[17]陳兆偉，張金家，趙淑娟，等。茉莉酸甲酯對(duì)丹參毛狀根中水溶性酚酸類化合物積累的影響[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2010,45(13):970-974.[18]徐淑紅，李芳英，李新玲，等。發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒在藥用植物生物技術(shù)研究中的應(yīng)用[J].哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2005,21(5):68-71.[9]晏瓊，胡宗定，吳建勇。生物和非生物誘導(dǎo)子對(duì)丹參毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮的影響[J].中草藥，2006,37(2):262-265.[10]張順倉(cāng)，劉巖，沈雙，等。誘導(dǎo)子對(duì)丹參毛狀根酚酸類和丹參酮類成分積累的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2011,36(10):1269-1274.[11]陶如，馮蕾，趙法興，等。白花丹參毛狀根誘導(dǎo)體系的建立與其內(nèi)生真菌提高毛狀根中丹酚酸含量的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2015,26(6):1469-1473.[12]付春祥，金治平，楊睿，等。新疆雪蓮毛狀根的誘導(dǎo)及其植株再生體系的建立[J].生物工程學(xué)報(bào)，2004,20(3):366-371.[13]龔玉蓮，施和平，李玲，等。少花龍葵毛狀根的誘導(dǎo)和次生代謝物的產(chǎn)生[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2002,10(1):58-62.[14]周偉，姚倩雯，錢(qián)忠英，等。丹參毛狀根誘導(dǎo)條件的優(yōu)化[J].上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,36(2):93-98.[15]晏瓊，胡宗定，吳建勇。生物與非生物誘導(dǎo)子協(xié)同作用對(duì)丹參毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2006,31(3):188-191.[16]劉曉艷，王渭玲，李學(xué)俊。農(nóng)桿菌Ri誘導(dǎo)丹參