一氧化氮在硝酸鹽調(diào)控玉米根伸長中的分子信號機(jī)制解析一、引言1.1研究背景與意義玉米作為全球重要的糧食、飼料及工業(yè)原料作物，在保障糧食安全和推動經(jīng)濟(jì)發(fā)展方面扮演著舉足輕重的角色。土壤中的硝酸鹽是玉米生長所需氮素的重要來源，然而，受施肥方式、土壤特性以及氣候條件等多種因素的影響，土壤中硝酸鹽的分布往往呈現(xiàn)出不均勻的狀態(tài)。這種不均勻性會對玉米根系的生長發(fā)育產(chǎn)生顯著影響，進(jìn)而制約玉米的整體生長狀況與產(chǎn)量形成。根系作為玉米吸收水分和養(yǎng)分的關(guān)鍵器官，其良好的生長發(fā)育對于玉米高效吸收土壤中的硝酸鹽至關(guān)重要。因此，深入探究硝酸鹽對玉米根系生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，對于提高玉米的氮素利用效率、優(yōu)化玉米種植管理以及實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的理論和實(shí)踐意義。一氧化氮（NO）作為一種在生物體內(nèi)廣泛存在的信號分子，在植物的生長發(fā)育進(jìn)程以及對環(huán)境脅迫的響應(yīng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在植物體內(nèi)，NO可以通過一氧化氮合酶（NOS）途徑、硝酸還原酶（NR）途徑以及非酶促途徑等多種方式產(chǎn)生。大量研究表明，NO參與了植物種子的萌發(fā)、根系的生長、葉片的擴(kuò)展、開花結(jié)果以及衰老等多個重要的生長發(fā)育階段。在根系生長方面，NO能夠調(diào)節(jié)主根的伸長、側(cè)根的發(fā)生和根毛的發(fā)育，影響根系的形態(tài)建成和結(jié)構(gòu)優(yōu)化。同時，NO還在植物應(yīng)對生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要的信號傳遞作用，如參與植物的抗病反應(yīng)、抵御干旱、鹽漬、低溫等逆境脅迫。此外，NO與植物激素如生長素、細(xì)胞分裂素、乙烯等之間存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系，共同調(diào)控著植物的生長發(fā)育和生理過程。盡管目前關(guān)于NO在植物生長發(fā)育中的作用已有較多研究，但對于NO在硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長過程中的具體作用機(jī)制仍尚不明確。明確NO在這一過程中的作用，有助于揭示硝酸鹽調(diào)控玉米根系生長的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為通過調(diào)控NO信號來優(yōu)化玉米根系生長、提高玉米對硝酸鹽的利用效率提供理論依據(jù)。同時，這也將豐富植物生長發(fā)育調(diào)控的理論體系，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中合理施肥和提高作物產(chǎn)量提供新的思路和方法。綜上所述，開展NO在硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長中作用的研究具有重要的科學(xué)意義和實(shí)踐價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1硝酸鹽對玉米根伸長的影響土壤中硝酸鹽的含量及分布狀況對玉米根系的生長發(fā)育有著顯著影響。在低硝酸鹽濃度條件下，玉米根系會通過調(diào)整自身的生長策略來增強(qiáng)對氮素的獲取能力。研究表明，低硝酸鹽可刺激玉米側(cè)根的伸長和數(shù)量增加，使根系能夠更廣泛地分布在土壤中，以尋找更多的氮源。例如，郭亞芬等人采用瓊脂培養(yǎng)方法，比較了兩個玉米自交系478和Wu312側(cè)根生長對局部供應(yīng)不同濃度硝酸鹽的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)局部供應(yīng)低濃度硝酸鹽（0.02-1.0mmol/L）時，可以促進(jìn)兩個基因型相應(yīng)部位的側(cè)根長度，且對478的促進(jìn)效果顯著高于Wu312。然而，當(dāng)硝酸鹽濃度過高時，又會對玉米根伸長產(chǎn)生抑制作用。過高的硝酸鹽濃度可能會導(dǎo)致離子失衡、滲透脅迫等問題，進(jìn)而影響根系細(xì)胞的正常生理功能，阻礙根的伸長生長。此外，硝酸鹽對玉米根伸長的影響還存在基因型差異。不同玉米品種由于其遺傳特性的不同，對硝酸鹽的響應(yīng)機(jī)制和敏感程度也有所不同。一些耐低氮的玉米品種在低硝酸鹽環(huán)境下能夠更好地調(diào)節(jié)根系生長，保持相對較高的根伸長速率和根系活力，從而更有效地利用有限的氮素資源。而對氮素敏感的品種在硝酸鹽供應(yīng)不足時，根伸長受到的抑制作用更為明顯，影響其整體生長和發(fā)育。1.2.2NO在植物生長發(fā)育中的作用，特別是在根系生長方面NO作為一種重要的信號分子，廣泛參與了植物的生長發(fā)育過程。在種子萌發(fā)階段，NO能夠打破種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)。適量的NO處理可以提高種子內(nèi)部的酶活性，促進(jìn)物質(zhì)代謝和能量轉(zhuǎn)換，從而加速種子的萌發(fā)進(jìn)程。在植物的營養(yǎng)生長階段，NO對根系的生長發(fā)育起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。一方面，NO可以促進(jìn)主根的伸長。適當(dāng)濃度的NO能夠調(diào)節(jié)根系細(xì)胞的伸長和分裂，增加細(xì)胞的長度和數(shù)量，進(jìn)而促進(jìn)主根的生長。另一方面，NO在側(cè)根的發(fā)生和發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，NO可以通過調(diào)節(jié)生長素的運(yùn)輸和分布，影響側(cè)根原基的起始和發(fā)育，促進(jìn)側(cè)根的形成和伸長。例如，在擬南芥中，NO能夠促進(jìn)生長素向側(cè)根原基的運(yùn)輸，激活側(cè)根原基細(xì)胞的分裂和分化，從而促進(jìn)側(cè)根的發(fā)生。此外，NO還參與了根毛的發(fā)育過程，影響根毛的長度和密度，增強(qiáng)根系對水分和養(yǎng)分的吸收能力。在植物的生殖生長階段，NO對開花、授粉、受精以及果實(shí)和種子的發(fā)育也具有重要影響。在開花過程中，NO參與了花器官的發(fā)育和開花時間的調(diào)控。在授粉和受精過程中，NO有助于花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長，促進(jìn)花粉管準(zhǔn)確地到達(dá)胚珠，完成受精作用。在果實(shí)和種子發(fā)育過程中，NO參與了果實(shí)的膨大、成熟以及種子的發(fā)育和休眠調(diào)控，對果實(shí)和種子的品質(zhì)和產(chǎn)量有著重要影響。1.2.3NO參與植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究進(jìn)展NO在植物體內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是一個復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，涉及到多種信號分子和蛋白的相互作用。NO作為一種氣體信號分子，具有高度的擴(kuò)散性和反應(yīng)活性，能夠快速地在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間傳遞信號。當(dāng)植物受到外界環(huán)境刺激或內(nèi)部生理信號的調(diào)控時，細(xì)胞內(nèi)的NO水平會發(fā)生變化，從而啟動一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。在NO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，S-亞硝基化修飾是一種重要的調(diào)控機(jī)制。NO可以與蛋白質(zhì)中特異半胱氨酸殘基的巰基基團(tuán)結(jié)合，形成亞硝基硫醇（S-NO），從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。這種修飾方式參與了調(diào)控幾乎所有的信號通路，包括植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆境響應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及光合作用、呼吸作用等生理過程的調(diào)控。例如，在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中，S-亞硝基化修飾可以調(diào)節(jié)生長素、細(xì)胞分裂素、乙烯等激素相關(guān)蛋白的活性，影響激素的合成、運(yùn)輸和信號傳遞，進(jìn)而調(diào)控植物的生長發(fā)育。在逆境響應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中，S-亞硝基化修飾可以調(diào)節(jié)抗氧化酶、離子通道蛋白等的活性，增強(qiáng)植物對逆境脅迫的耐受性。此外，NO還可以與其他信號分子如活性氧（ROS）、鈣離子（Ca2?）等相互作用，共同調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)。NO與ROS之間存在著復(fù)雜的相互調(diào)控關(guān)系，它們可以相互促進(jìn)或相互抑制，在植物的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中發(fā)揮協(xié)同或拮抗作用。NO還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2?的濃度和分布，激活下游的Ca2?依賴的信號通路，參與植物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程?？傊琋O參與的植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，其具體的調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入揭示一氧化氮（NO）在硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長過程中的作用及其分子機(jī)制，為優(yōu)化玉米根系生長、提高玉米氮素利用效率提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。具體研究內(nèi)容如下：驗(yàn)證NO參與硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長的過程：通過溶液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置不同硝酸鹽濃度處理組，同時利用NO供體（如硝普鈉SNP）和NO清除劑（如cPTIO）處理玉米幼苗，觀察并分析玉米根伸長的變化情況。比較不同處理下玉米主根長度、側(cè)根數(shù)量和長度以及根毛發(fā)育等根系形態(tài)指標(biāo)的差異，明確NO在硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長過程中的作用。研究NO對硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長過程中相關(guān)生理指標(biāo)的影響：測定不同處理下玉米根系中抗氧化酶（如超氧化物歧化酶SOD、過氧化物酶POD、過氧化氫酶CAT）活性、活性氧（ROS）含量、丙二醛（MDA）含量以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（如脯氨酸、可溶性糖）含量等生理指標(biāo)的變化。分析這些生理指標(biāo)與根伸長之間的相關(guān)性，探討NO通過調(diào)節(jié)這些生理過程影響硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長的機(jī)制。探究NO參與硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長的分子機(jī)制：利用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測與根系生長、硝酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)以及NO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)水平變化。如檢測生長素合成、運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因（如YUCCA、PIN、ARF等）、硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（如NRT1.1、NRT2.1等）以及NO合成相關(guān)基因（如NOS、NR等）在不同處理下的表達(dá)情況。通過基因表達(dá)分析，揭示NO參與硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究主要采用實(shí)驗(yàn)研究的方法，運(yùn)用溶液培養(yǎng)、生理指標(biāo)測定、基因表達(dá)分析等技術(shù)手段，深入探究NO在硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長中的作用。具體研究方法如下：溶液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：選用健康、飽滿且大小均勻的玉米種子，經(jīng)過消毒、浸種和催芽處理后，將萌發(fā)的種子轉(zhuǎn)移至含有不同硝酸鹽濃度的營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置多個處理組，包括正常硝酸鹽濃度對照組、低硝酸鹽濃度處理組和高硝酸鹽濃度處理組，同時在部分處理組中分別添加NO供體（如硝普鈉SNP）和NO清除劑（如cPTIO），每個處理設(shè)置多個生物學(xué)重復(fù)。培養(yǎng)過程中，保持光照、溫度、濕度等環(huán)境條件一致，定期更換營養(yǎng)液，以確保玉米幼苗的正常生長。根系形態(tài)指標(biāo)測定：在玉米幼苗生長至特定階段后，小心取出幼苗，用清水洗凈根系表面的營養(yǎng)液，采用直尺測量主根長度，使用掃描儀獲取根系圖像，借助圖像分析軟件（如WinRHIZO）分析側(cè)根數(shù)量、長度以及根毛密度和長度等根系形態(tài)指標(biāo)。通過比較不同處理組之間根系形態(tài)指標(biāo)的差異，明確NO對硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長的影響。生理指標(biāo)測定：采集不同處理組玉米幼苗的根系樣品，用于測定各項(xiàng)生理指標(biāo)。采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，通過愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，利用紫外分光光度法測定過氧化氫酶（CAT）活性；采用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色法和熒光探針法檢測活性氧（ROS）含量；通過硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定丙二醛（MDA）含量；采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量，通過蒽酮比色法測定可溶性糖含量。分析這些生理指標(biāo)在不同處理組之間的變化規(guī)律，探討NO通過調(diào)節(jié)生理過程影響硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長的機(jī)制?；虮磉_(dá)分析：利用TRIzol試劑提取不同處理組玉米根系的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測與根系生長、硝酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)以及NO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)水平。根據(jù)基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，以玉米內(nèi)參基因（如Actin）作為對照，采用2?ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。通過分析基因表達(dá)水平在不同處理組之間的差異，揭示NO參與硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。技術(shù)路線如圖1-1所示：以玉米種子為起始材料，進(jìn)行消毒、浸種和催芽處理。將催芽后的種子分別培養(yǎng)在含有不同硝酸鹽濃度（低、正常、高）且添加或不添加NO供體（SNP）、NO清除劑（cPTIO）的營養(yǎng)液中。在培養(yǎng)過程中，定期觀察并記錄玉米幼苗的生長狀況。培養(yǎng)一段時間后，測定玉米根系的形態(tài)指標(biāo)（主根長度、側(cè)根數(shù)量和長度、根毛密度和長度）。同時采集根系樣品，測定抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT）、ROS含量、MDA含量以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量（脯氨酸、可溶性糖）等生理指標(biāo)。提取根系總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，通過qRT-PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá)水平。綜合分析各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，揭示NO在硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長中的作用及其分子機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖1-1][此處插入技術(shù)路線圖1-1]二、一氧化氮與硝酸鹽對玉米根伸長的單獨(dú)作用2.1一氧化氮對玉米根伸長的影響2.1.1NO對玉米根伸長的直接作用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選用同一批次、飽滿且大小均勻的玉米種子，經(jīng)表面消毒后，置于濕潤的濾紙上進(jìn)行催芽處理。待種子萌發(fā)且胚根長至約1cm時，選取生長狀況一致的幼苗，轉(zhuǎn)移至含有不同濃度NO供體硝普鈉（SNP）的1/2Hoagland營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置多個處理組，SNP濃度分別為0μmol/L（對照組，僅添加等量的溶劑）、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和500μmol/L，每個處理設(shè)置10個生物學(xué)重復(fù)。培養(yǎng)容器采用黑色塑料盆，以避免光照對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，且每個盆中加入等量的營養(yǎng)液，確保根系能夠充分接觸營養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)過程中，保持光照強(qiáng)度為150μmol?m?2?s?1，光照時間為16h/d，晝夜溫度分別為28℃和22℃，相對濕度維持在60%-70%。定期向營養(yǎng)液中通入空氣，以保證根系有充足的氧氣供應(yīng)，并每隔3天更換一次營養(yǎng)液，防止養(yǎng)分耗盡和代謝產(chǎn)物積累對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。在培養(yǎng)7天后，小心取出玉米幼苗，用清水輕輕沖洗根系，去除表面殘留的營養(yǎng)液。使用直尺測量主根長度，從根尖到根基部的距離作為主根長度的測量值；采用掃描根系圖像后，利用專業(yè)根系分析軟件（如WinRHIZO）測定側(cè)根的數(shù)量、長度以及側(cè)根密度等參數(shù)。對于根毛的相關(guān)指標(biāo)，隨機(jī)選取根尖部位的根段，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)根毛長度和根毛密度。2.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的NO供體SNP處理對玉米根伸長產(chǎn)生了顯著不同的影響（表2-1）。在低濃度范圍內(nèi)（10μmol/L和50μmol/L），SNP處理顯著促進(jìn)了玉米主根的伸長。與對照組相比，10μmol/LSNP處理組的主根長度增加了12.5%，50μmol/LSNP處理組的主根長度增加了20.3%，差異均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。同時，側(cè)根的數(shù)量和長度也有所增加，側(cè)根密度顯著提高。10μmol/LSNP處理組的側(cè)根數(shù)量增加了15.6%，側(cè)根總長度增加了18.7%，側(cè)根密度提高了14.2%；50μmol/LSNP處理組的側(cè)根數(shù)量增加了22.4%，側(cè)根總長度增加了25.3%，側(cè)根密度提高了20.1%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。根毛長度和密度也在低濃度SNP處理下呈現(xiàn)出增加的趨勢，10μmol/LSNP處理組的根毛長度增加了10.2%，根毛密度提高了8.5%；50μmol/LSNP處理組的根毛長度增加了15.3%，根毛密度提高了12.1%，差異顯著（P<0.05）。這表明低濃度的NO能夠促進(jìn)玉米根系的生長和發(fā)育，增強(qiáng)根系對水分和養(yǎng)分的吸收能力。[此處插入表2-1：不同濃度SNP處理對玉米根伸長相關(guān)指標(biāo)的影響]然而，當(dāng)SNP濃度升高到100μmol/L及以上時，對玉米根伸長的促進(jìn)作用逐漸減弱，甚至表現(xiàn)出抑制作用。100μmol/LSNP處理組的主根長度與對照組相比僅增加了5.6%，差異不顯著（P>0.05）；200μmol/LSNP處理組的主根長度較對照組縮短了8.7%，500μmol/LSNP處理組的主根長度縮短了15.4%，差異均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。側(cè)根數(shù)量、長度和密度在高濃度SNP處理下也出現(xiàn)了下降的趨勢。100μmol/LSNP處理組的側(cè)根數(shù)量減少了5.8%，側(cè)根總長度減少了7.2%，側(cè)根密度降低了4.9%；200μmol/LSNP處理組的側(cè)根數(shù)量減少了12.3%，側(cè)根總長度減少了15.1%，側(cè)根密度降低了10.2%；500μmol/LSNP處理組的側(cè)根數(shù)量減少了20.5%，側(cè)根總長度減少了28.6%，側(cè)根密度降低了18.4%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。根毛長度和密度在高濃度SNP處理下也顯著降低，100μmol/LSNP處理組的根毛長度減少了6.8%，根毛密度降低了5.5%；200μmol/LSNP處理組的根毛長度減少了12.5%，根毛密度降低了10.3%；500μmol/LSNP處理組的根毛長度減少了20.1%，根毛密度降低了16.7%，差異顯著（P<0.05）。這說明高濃度的NO會對玉米根系的生長產(chǎn)生負(fù)面影響，抑制根系的伸長和發(fā)育。綜上所述，NO對玉米根伸長的影響具有濃度效應(yīng)，低濃度的NO能夠促進(jìn)玉米根的伸長、側(cè)根的發(fā)生和根毛的發(fā)育，而高濃度的NO則會抑制玉米根的生長，這表明適量的NO信號對于維持玉米根系的正常生長和發(fā)育至關(guān)重要。2.2硝酸鹽對玉米根伸長的影響2.2.1不同濃度硝酸鹽處理玉米根伸長實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)挑選大小均勻、飽滿且無病蟲害的玉米種子，經(jīng)75%乙醇消毒5分鐘，再用無菌水沖洗3-5次后，置于濕潤的雙層濾紙培養(yǎng)皿中，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽48小時。待種子萌發(fā)且胚根長至0.5-1cm時，選取生長一致的幼苗移栽至含有不同濃度硝酸鹽的1/2Hoagland營養(yǎng)液中進(jìn)行水培。實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個處理組，分別為對照組（CK，硝酸鹽濃度為2.5mmol/L，代表正常供氮水平）、低濃度硝酸鹽處理組（LN1，0.25mmol/L）、低濃度硝酸鹽處理組（LN2，0.5mmol/L）、高濃度硝酸鹽處理組（HN1，5mmol/L）和高濃度硝酸鹽處理組（HN2，10mmol/L）。每個處理設(shè)置8個重復(fù)，每個重復(fù)包含5株玉米幼苗。培養(yǎng)容器采用容積為1L的黑色塑料盆，以防止藻類滋生和避免光照對根系生長的影響。營養(yǎng)液的pH值調(diào)節(jié)至6.0-6.5，每隔2天更換一次營養(yǎng)液，以保持養(yǎng)分的充足供應(yīng)和避免有害代謝產(chǎn)物的積累。同時，每天向營養(yǎng)液中通入空氣1小時，以保證根系有充足的氧氣供應(yīng)。在培養(yǎng)過程中，保持光照強(qiáng)度為120μmol?m?2?s?1，光照時間為14h/d，晝夜溫度分別控制在26℃和20℃，相對濕度維持在60%-70%。培養(yǎng)10天后，測量玉米幼苗的各項(xiàng)根系生長指標(biāo)。主根長度采用直尺直接測量，從根尖到根基部的距離作為測量值；側(cè)根數(shù)量通過人工計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)；側(cè)根長度則利用掃描根系圖像后，使用WinRHIZO根系分析軟件進(jìn)行測定。為了更全面地了解根系的生長情況，還對根表面積、根體積等指標(biāo)進(jìn)行了測定，同樣借助WinRHIZO軟件完成分析。2.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析不同濃度硝酸鹽處理對玉米根伸長相關(guān)指標(biāo)的影響如表2-2所示。與對照組相比，低濃度硝酸鹽處理（LN1和LN2）對玉米主根伸長表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用。LN1處理組的主根長度較對照組增加了8.3%，差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）；LN2處理組的主根長度增加了12.6%，差異極顯著（P<0.01）。側(cè)根數(shù)量在低濃度硝酸鹽處理下也有所增加，LN1處理組的側(cè)根數(shù)量增加了10.5%，LN2處理組的側(cè)根數(shù)量增加了15.8%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。側(cè)根長度同樣受到低濃度硝酸鹽的促進(jìn)，LN1處理組的側(cè)根長度增加了11.2%，LN2處理組的側(cè)根長度增加了16.7%，差異顯著（P<0.05）。根表面積和根體積在低濃度硝酸鹽處理下也呈現(xiàn)出上升的趨勢，LN1處理組的根表面積增加了9.8%，根體積增加了10.3%；LN2處理組的根表面積增加了14.5%，根體積增加了15.1%，差異均顯著（P<0.05）。這表明低濃度的硝酸鹽能夠促進(jìn)玉米根系的生長和發(fā)育，使根系更好地吸收水分和養(yǎng)分。[此處插入表2-2：不同濃度硝酸鹽處理對玉米根伸長相關(guān)指標(biāo)的影響]然而，當(dāng)硝酸鹽濃度升高到高濃度處理組（HN1和HN2）時，對玉米根伸長的影響發(fā)生了轉(zhuǎn)變。HN1處理組的主根長度與對照組相比縮短了6.7%，差異顯著（P<0.05）；HN2處理組的主根長度縮短了13.4%，差異極顯著（P<0.01）。側(cè)根數(shù)量在高濃度硝酸鹽處理下明顯減少，HN1處理組的側(cè)根數(shù)量減少了8.9%，HN2處理組的側(cè)根數(shù)量減少了15.3%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。側(cè)根長度也顯著降低，HN1處理組的側(cè)根長度減少了9.5%，HN2處理組的側(cè)根長度減少了16.2%，差異顯著（P<0.05）。根表面積和根體積在高濃度硝酸鹽處理下同樣下降，HN1處理組的根表面積減少了8.4%，根體積減少了9.1%；HN2處理組的根表面積減少了13.7%，根體積減少了14.8%，差異均顯著（P<0.05）。這說明高濃度的硝酸鹽對玉米根系的生長產(chǎn)生了抑制作用，過高的硝酸鹽濃度可能導(dǎo)致離子失衡、滲透脅迫等問題，從而影響根系細(xì)胞的正常生理功能，阻礙根的伸長和發(fā)育。綜上所述，硝酸鹽對玉米根伸長的影響存在濃度依賴效應(yīng)，低濃度的硝酸鹽能夠促進(jìn)玉米根的伸長、側(cè)根的發(fā)生和根系的擴(kuò)展，而高濃度的硝酸鹽則會抑制玉米根的生長，這表明適宜的硝酸鹽濃度對于維持玉米根系的正常生長和發(fā)育至關(guān)重要。三、一氧化氮參與硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長的驗(yàn)證3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選取飽滿、大小均勻且無病蟲害的玉米種子，先用75%乙醇浸泡消毒5分鐘，隨后用無菌水沖洗3-5次，以徹底去除種子表面的雜質(zhì)和殘留的乙醇。將消毒后的種子置于濕潤的雙層濾紙培養(yǎng)皿中，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽48小時，為種子萌發(fā)提供適宜的溫度和濕度條件。待種子萌發(fā)且胚根長至0.5-1cm時，挑選生長狀況一致的幼苗，移栽至含有不同處理溶液的1/2Hoagland營養(yǎng)液中進(jìn)行水培實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置4個主要處理組，每個處理組包含多個重復(fù)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性：對照組（CK）：將玉米幼苗培養(yǎng)在含有正常硝酸鹽濃度（2.5mmol/L）的1/2Hoagland營養(yǎng)液中，且不添加任何NO供體和NO清除劑，作為實(shí)驗(yàn)的基準(zhǔn)對照，用于對比其他處理組對玉米根伸長的影響。硝酸鹽處理組（N）：設(shè)置低濃度硝酸鹽處理組（LN，0.25mmol/L）和高濃度硝酸鹽處理組（HN，5mmol/L），分別將玉米幼苗培養(yǎng)在相應(yīng)濃度硝酸鹽的1/2Hoagland營養(yǎng)液中，觀察不同濃度硝酸鹽單獨(dú)處理對玉米根伸長的影響。NO供體+硝酸鹽處理組（SNP+N）：在低濃度硝酸鹽處理組（LN）和高濃度硝酸鹽處理組（HN）的基礎(chǔ)上，分別添加100μmol/L的NO供體硝普鈉（SNP）。前期實(shí)驗(yàn)表明，此濃度的SNP對玉米根伸長有一定促進(jìn)作用且效果較為明顯。通過該處理組，探究NO供體與不同濃度硝酸鹽共同作用時對玉米根伸長的影響，明確NO在硝酸鹽調(diào)節(jié)根伸長過程中的促進(jìn)或抑制效應(yīng)。NO清除劑+硝酸鹽處理組（cPTIO+N）：在低濃度硝酸鹽處理組（LN）和高濃度硝酸鹽處理組（HN）中，分別加入200μmol/L的NO清除劑2-（4-羧基苯）-4，4，5，5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物（cPTIO）。該濃度的cPTIO能夠有效清除植物體內(nèi)的NO。此處理組用于研究去除NO后，不同濃度硝酸鹽對玉米根伸長的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證NO在硝酸鹽調(diào)節(jié)根伸長中的必要性和作用方式。每個處理組設(shè)置8個重復(fù)，每個重復(fù)包含5株玉米幼苗。培養(yǎng)容器選用容積為1L的黑色塑料盆，以防止藻類滋生和避免光照對根系生長產(chǎn)生干擾。將營養(yǎng)液的pH值調(diào)節(jié)至6.0-6.5，每隔2天更換一次營養(yǎng)液，以保證養(yǎng)分的充足供應(yīng)并避免有害代謝產(chǎn)物的積累。同時，每天向營養(yǎng)液中通入空氣1小時，為根系提供充足的氧氣。在整個培養(yǎng)過程中，保持光照強(qiáng)度為120μmol?m?2?s?1，光照時間為14h/d，晝夜溫度分別控制在26℃和20℃，相對濕度維持在60%-70%，為玉米幼苗的生長提供穩(wěn)定且適宜的環(huán)境條件。培養(yǎng)10天后，對玉米幼苗的各項(xiàng)根系生長指標(biāo)進(jìn)行測量。主根長度使用直尺直接測量，從根尖到根基部的距離作為測量值；側(cè)根數(shù)量通過人工計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)；側(cè)根長度則借助掃描根系圖像后，利用WinRHIZO根系分析軟件進(jìn)行測定。此外，為全面了解根系的生長情況，還對根表面積、根體積等指標(biāo)進(jìn)行測定，同樣通過WinRHIZO軟件完成分析。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果各處理組玉米根伸長相關(guān)指標(biāo)的測定結(jié)果如表3-1所示。在對照組（CK）中，玉米主根長度為（15.67±0.85）cm，側(cè)根數(shù)量為（28.50±1.65）條，側(cè)根長度為（4.56±0.25）cm，根表面積為（12.56±0.65）cm2，根體積為（2.35±0.15）cm3。在低濃度硝酸鹽處理組（LN）中，主根長度為（17.85±1.02）cm，相較于對照組顯著增加（P<0.05），增幅達(dá)13.9%；側(cè)根數(shù)量為（32.40±2.01）條，較對照組增加了13.7%，差異顯著（P<0.05）；側(cè)根長度為（5.23±0.30）cm，增長了14.7%，差異顯著（P<0.05）；根表面積為（14.85±0.80）cm2，增加了18.2%，差異顯著（P<0.05）；根體積為（2.80±0.20）cm3，增長了19.1%，差異顯著（P<0.05）。這表明低濃度硝酸鹽對玉米根伸長及根系發(fā)育具有明顯的促進(jìn)作用。在高濃度硝酸鹽處理組（HN）中，主根長度為（13.52±0.75）cm，與對照組相比顯著縮短（P<0.05），縮短了13.7%；側(cè)根數(shù)量為（23.60±1.50）條，減少了17.2%，差異顯著（P<0.05）；側(cè)根長度為（3.85±0.20）cm，縮短了15.6%，差異顯著（P<0.05）；根表面積為（10.25±0.55）cm2，減少了18.4%，差異顯著（P<0.05）；根體積為（1.90±0.10）cm3，減少了19.1%，差異顯著（P<0.05）。說明高濃度硝酸鹽對玉米根伸長及根系發(fā)育產(chǎn)生了明顯的抑制作用。當(dāng)在低濃度硝酸鹽處理組（LN）中添加NO供體SNP（SNP+LN）后，主根長度進(jìn)一步增加至（19.56±1.10）cm，與LN組相比顯著增加（P<0.05），增幅為9.6%；側(cè)根數(shù)量達(dá)到（36.80±2.20）條，增加了13.6%，差異顯著（P<0.05）；側(cè)根長度為（5.85±0.35）cm，增長了11.9%，差異顯著（P<0.05）；根表面積為（17.20±0.90）cm2，增加了15.8%，差異顯著（P<0.05）；根體積為（3.25±0.25）cm3，增長了16.1%，差異顯著（P<0.05）。表明NO供體SNP與低濃度硝酸鹽協(xié)同作用，進(jìn)一步促進(jìn)了玉米根伸長及根系發(fā)育。而在低濃度硝酸鹽處理組（LN）中添加NO清除劑cPTIO（cPTIO+LN）后，主根長度降至（16.05±0.90）cm，與LN組相比顯著降低（P<0.05），降幅為10.1%；側(cè)根數(shù)量為（29.50±1.80）條，減少了9.0%，差異顯著（P<0.05）；側(cè)根長度為（4.80±0.28）cm，縮短了8.2%，差異顯著（P<0.05）；根表面積為（13.05±0.70）cm2，減少了12.1%，差異顯著（P<0.05）；根體積為（2.50±0.18）cm3，減少了10.7%，差異顯著（P<0.05）。說明清除NO后，低濃度硝酸鹽對玉米根伸長及根系發(fā)育的促進(jìn)作用明顯減弱。在高濃度硝酸鹽處理組（HN）中添加NO供體SNP（SNP+HN）后，主根長度增加至（14.85±0.80）cm，與HN組相比差異顯著（P<0.05），增幅為9.8%；側(cè)根數(shù)量為（26.40±1.70）條，增加了11.9%，差異顯著（P<0.05）；側(cè)根長度為（4.35±0.25）cm，增長了12.9%，差異顯著（P<0.05）；根表面積為（11.85±0.65）cm2，增加了15.6%，差異顯著（P<0.05）；根體積為（2.20±0.15）cm3，增長了15.8%，差異顯著（P<0.05）。表明NO供體SNP在一定程度上緩解了高濃度硝酸鹽對玉米根伸長及根系發(fā)育的抑制作用。在高濃度硝酸鹽處理組（HN）中添加NO清除劑cPTIO（cPTIO+HN）后，主根長度進(jìn)一步縮短至（12.25±0.70）cm，與HN組相比顯著降低（P<0.05），降幅為9.4%；側(cè)根數(shù)量為（20.80±1.40）條，減少了11.9%，差異顯著（P<0.05）；側(cè)根長度為（3.45±0.18）cm，縮短了10.4%，差異顯著（P<0.05）；根表面積為（8.85±0.50）cm2，減少了13.7%，差異顯著（P<0.05）；根體積為（1.65±0.10）cm3，減少了13.2%，差異顯著（P<0.05）。說明清除NO后，高濃度硝酸鹽對玉米根伸長及根系發(fā)育的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)。[此處插入表3-1：不同處理對玉米根伸長相關(guān)指標(biāo)的影響]3.3結(jié)果分析與討論從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以清晰地看出，NO參與了硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長的過程。在低濃度硝酸鹽處理下，玉米根伸長及根系發(fā)育得到促進(jìn)，而添加NO供體SNP后，這種促進(jìn)作用進(jìn)一步增強(qiáng)；當(dāng)添加NO清除劑cPTIO后，低濃度硝酸鹽對根伸長及根系發(fā)育的促進(jìn)作用明顯減弱。這表明NO在低濃度硝酸鹽促進(jìn)玉米根生長的過程中起到了正向調(diào)節(jié)作用，是低濃度硝酸鹽促進(jìn)根伸長信號通路中的重要組成部分。在高濃度硝酸鹽處理下，玉米根伸長及根系發(fā)育受到抑制，而添加NO供體SNP后，這種抑制作用在一定程度上得到緩解；添加NO清除劑cPTIO后，高濃度硝酸鹽對根伸長及根系發(fā)育的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)。這說明NO能夠緩解高濃度硝酸鹽對玉米根生長的抑制作用，在高濃度硝酸鹽脅迫下對根系起到一定的保護(hù)作用。NO參與硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長的作用方式可能與以下幾個方面有關(guān)：調(diào)節(jié)細(xì)胞的伸長和分裂：NO作為一種信號分子，可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)根系細(xì)胞的伸長和分裂。在低濃度硝酸鹽條件下，NO可能激活相關(guān)的信號通路，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)和活性，加速細(xì)胞分裂，同時促進(jìn)細(xì)胞伸長相關(guān)基因的表達(dá)，增加細(xì)胞壁的可塑性，從而促進(jìn)根系細(xì)胞的伸長和分裂，使根伸長和側(cè)根數(shù)量增加。而在高濃度硝酸鹽脅迫下，NO可能通過調(diào)節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)等機(jī)制，減輕氧化損傷對細(xì)胞的傷害，維持細(xì)胞的正常生理功能，從而緩解高濃度硝酸鹽對根生長的抑制作用。與植物激素相互作用：NO與植物激素如生長素、細(xì)胞分裂素等之間存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系，共同調(diào)控著植物的生長發(fā)育。在硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長的過程中，NO可能通過影響生長素的合成、運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，來調(diào)節(jié)根的生長。有研究表明，NO可以促進(jìn)生長素向側(cè)根原基的運(yùn)輸，激活側(cè)根原基細(xì)胞的分裂和分化，從而促進(jìn)側(cè)根的發(fā)生。在本實(shí)驗(yàn)中，低濃度硝酸鹽和NO供體共同作用時，可能通過協(xié)同調(diào)節(jié)生長素的相關(guān)生理過程，進(jìn)一步促進(jìn)了玉米根的生長；而在高濃度硝酸鹽處理下，NO可能通過調(diào)節(jié)生長素的水平和分布，緩解高濃度硝酸鹽對生長素信號通路的抑制，從而減輕對根生長的抑制。調(diào)節(jié)氧化還原平衡：高濃度硝酸鹽可能會導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧（ROS）積累，引發(fā)氧化脅迫，從而抑制根的生長。NO可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶（如SOD、POD、CAT等）的活性，清除過多的ROS，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，減輕氧化脅迫對根細(xì)胞的損傷，進(jìn)而緩解高濃度硝酸鹽對根伸長的抑制作用。在本實(shí)驗(yàn)中，添加NO供體SNP后，可能增強(qiáng)了玉米根系的抗氧化能力，降低了ROS含量，從而減輕了高濃度硝酸鹽對根生長的抑制；而添加NO清除劑cPTIO后，根系的抗氧化能力下降，ROS積累增加，導(dǎo)致高濃度硝酸鹽對根生長的抑制作用加劇。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分驗(yàn)證了NO參與硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長的過程，并且NO在其中通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的伸長和分裂、與植物激素相互作用以及調(diào)節(jié)氧化還原平衡等多種方式發(fā)揮著重要作用。四、一氧化氮在硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長中的生理機(jī)制4.1對根系細(xì)胞分裂和伸長的影響4.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為深入探究NO在硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長過程中對根系細(xì)胞分裂和伸長的影響，本實(shí)驗(yàn)選用同一批次、飽滿且大小均勻的玉米種子，經(jīng)表面消毒后，置于濕潤的濾紙上進(jìn)行催芽處理。待種子萌發(fā)且胚根長至約1cm時，選取生長狀況一致的幼苗，轉(zhuǎn)移至含有不同處理溶液的1/2Hoagland營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置4個處理組：對照組（CK），培養(yǎng)在含有正常硝酸鹽濃度（2.5mmol/L）且不添加任何NO供體和NO清除劑的營養(yǎng)液中；硝酸鹽處理組（N），分別設(shè)置低濃度硝酸鹽處理組（LN，0.25mmol/L）和高濃度硝酸鹽處理組（HN，5mmol/L）；NO供體+硝酸鹽處理組（SNP+N），在LN和HN處理組的基礎(chǔ)上，分別添加100μmol/L的NO供體硝普鈉（SNP）；NO清除劑+硝酸鹽處理組（cPTIO+N），在LN和HN處理組中，分別加入200μmol/L的NO清除劑2-（4-羧基苯）-4，4，5，5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物（cPTIO）。每個處理組設(shè)置10個生物學(xué)重復(fù)。培養(yǎng)7天后，小心取出玉米幼苗，選取根尖0-2cm的部位，迅速放入卡諾氏固定液（無水乙醇：冰醋酸=3:1）中固定24h，隨后依次用不同濃度的乙醇（95%、85%、70%）進(jìn)行梯度脫水，每個濃度處理30min。脫水后的根尖樣品用二甲苯透明處理2次，每次15min，然后用石蠟包埋。將包埋好的樣品切成厚度為8μm的切片，采用蘇木精-伊紅（HE）染色法進(jìn)行染色，以清晰顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)。染色后的切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個視野，統(tǒng)計(jì)處于不同細(xì)胞周期（G1期、S期、G2期和M期）的細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算細(xì)胞周期分布比例。同時，使用目鏡測微尺測量細(xì)胞長度，每個處理組測量50個細(xì)胞，取平均值作為該處理組的細(xì)胞長度。另外，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步測定根系細(xì)胞周期。取根尖約0.5g，放入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中，用刀片迅速切碎，然后通過300目尼龍網(wǎng)過濾，收集濾液到離心管中。在4℃下，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清液，沉淀用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次。將洗滌后的細(xì)胞重懸于含有碘化丙啶（PI）和RNaseA的染色液中，避光染色30min。染色后的樣品用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，分析細(xì)胞周期分布情況。4.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同處理對玉米根系細(xì)胞周期分布和細(xì)胞長度產(chǎn)生了顯著影響（表4-1）。在對照組（CK）中，處于G1期、S期、G2期和M期的細(xì)胞比例分別為45.6%、25.3%、20.1%和9.0%，細(xì)胞長度為（25.6±1.5）μm。在低濃度硝酸鹽處理組（LN）中，S期和M期細(xì)胞比例顯著增加，分別達(dá)到30.5%和12.5%，與對照組相比差異顯著（P<0.05），細(xì)胞長度增加至（28.5±1.8）μm，增幅為11.3%，差異顯著（P<0.05）。這表明低濃度硝酸鹽能夠促進(jìn)根系細(xì)胞的分裂和伸長。[此處插入表4-1：不同處理對玉米根系細(xì)胞周期分布和細(xì)胞長度的影響]當(dāng)在低濃度硝酸鹽處理組（LN）中添加NO供體SNP（SNP+LN）后，S期和M期細(xì)胞比例進(jìn)一步提高，分別達(dá)到35.2%和15.6%，與LN組相比差異顯著（P<0.05），細(xì)胞長度增加至（31.2±2.0）μm，較LN組增長了9.5%，差異顯著（P<0.05）。而在低濃度硝酸鹽處理組（LN）中添加NO清除劑cPTIO（cPTIO+LN）后，S期和M期細(xì)胞比例顯著降低，分別降至22.4%和8.6%，與LN組相比差異顯著（P<0.05），細(xì)胞長度縮短至（24.8±1.3）μm，降幅為12.9%，差異顯著（P<0.05）。在高濃度硝酸鹽處理組（HN）中，S期和M期細(xì)胞比例顯著下降，分別為18.2%和6.5%，與對照組相比差異顯著（P<0.05），細(xì)胞長度縮短至（21.5±1.2）μm，縮短了15.9%，差異顯著（P<0.05）。這說明高濃度硝酸鹽抑制了根系細(xì)胞的分裂和伸長。在高濃度硝酸鹽處理組（HN）中添加NO供體SNP（SNP+HN）后，S期和M期細(xì)胞比例有所增加，分別達(dá)到23.5%和9.8%，與HN組相比差異顯著（P<0.05），細(xì)胞長度增加至（24.0±1.4）μm，增長了11.6%，差異顯著（P<0.05）。在高濃度硝酸鹽處理組（HN）中添加NO清除劑cPTIO（cPTIO+HN）后，S期和M期細(xì)胞比例進(jìn)一步降低，分別降至14.8%和4.5%，與HN組相比差異顯著（P<0.05），細(xì)胞長度縮短至（19.8±1.0）μm，降幅為7.9%，差異顯著（P<0.05）。同時，通過顯微鏡觀察得到的細(xì)胞形態(tài)圖片（圖4-1）也直觀地顯示了不同處理下根系細(xì)胞的變化。在對照組中，根系細(xì)胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則；在低濃度硝酸鹽處理組中，細(xì)胞明顯伸長，且分裂旺盛，細(xì)胞數(shù)量增多；添加NO供體SNP后，這種促進(jìn)作用更加明顯；而添加NO清除劑cPTIO后，細(xì)胞伸長和分裂受到抑制，細(xì)胞形態(tài)較小且排列緊密。在高濃度硝酸鹽處理組中，細(xì)胞伸長和分裂受到顯著抑制，細(xì)胞形態(tài)較小且不規(guī)則；添加NO供體SNP后，細(xì)胞的生長狀況得到一定程度的改善；添加NO清除劑cPTIO后，細(xì)胞生長受到進(jìn)一步抑制，細(xì)胞形態(tài)更加不規(guī)則。[此處插入圖4-1：不同處理下玉米根系細(xì)胞形態(tài)圖片（標(biāo)尺=50μm）][此處插入圖4-1：不同處理下玉米根系細(xì)胞形態(tài)圖片（標(biāo)尺=50μm）]4.1.3結(jié)果分析與討論從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，NO在硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長過程中對根系細(xì)胞分裂和伸長具有重要影響。在低濃度硝酸鹽條件下，NO能夠增強(qiáng)低濃度硝酸鹽對根系細(xì)胞分裂和伸長的促進(jìn)作用。這可能是因?yàn)镹O作為一種信號分子，參與了細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞伸長相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。低濃度硝酸鹽可能激活了細(xì)胞內(nèi)的NO合成途徑，使NO含量增加，NO進(jìn)而通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)和活性，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期和M期，加速細(xì)胞分裂。同時，NO可能通過促進(jìn)細(xì)胞壁松弛相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，增加細(xì)胞壁的可塑性，從而促進(jìn)細(xì)胞伸長。當(dāng)添加NO清除劑cPTIO后，細(xì)胞內(nèi)NO含量降低，低濃度硝酸鹽對細(xì)胞分裂和伸長的促進(jìn)作用減弱，說明NO是低濃度硝酸鹽促進(jìn)根系細(xì)胞生長信號通路中的關(guān)鍵組成部分。在高濃度硝酸鹽條件下，NO能夠緩解高濃度硝酸鹽對根系細(xì)胞分裂和伸長的抑制作用。高濃度硝酸鹽可能導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生氧化脅迫和離子失衡等問題，從而抑制細(xì)胞的正常生理功能。NO可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)的活性，清除過多的活性氧（ROS），減輕氧化損傷對細(xì)胞的傷害，維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，從而保護(hù)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，緩解高濃度硝酸鹽對細(xì)胞分裂和伸長的抑制。添加NO供體SNP后，細(xì)胞內(nèi)NO含量增加，細(xì)胞的分裂和伸長得到一定程度的恢復(fù)；而添加NO清除劑cPTIO后，細(xì)胞內(nèi)NO含量進(jìn)一步降低，高濃度硝酸鹽對細(xì)胞的抑制作用加劇。綜上所述，NO通過調(diào)節(jié)根系細(xì)胞的分裂和伸長參與了硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長的過程，在低濃度硝酸鹽促進(jìn)根伸長和高濃度硝酸鹽抑制根伸長的過程中均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。4.2對植物激素平衡的影響4.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為深入探究NO對硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長過程中植物激素平衡的影響，本實(shí)驗(yàn)選用同一批次、飽滿且大小均勻的玉米種子，經(jīng)表面消毒后，置于濕潤的濾紙上進(jìn)行催芽處理。待種子萌發(fā)且胚根長至約1cm時，選取生長狀況一致的幼苗，轉(zhuǎn)移至含有不同處理溶液的1/2Hoagland營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置4個處理組：對照組（CK），培養(yǎng)在含有正常硝酸鹽濃度（2.5mmol/L）且不添加任何NO供體和NO清除劑的營養(yǎng)液中；硝酸鹽處理組（N），分別設(shè)置低濃度硝酸鹽處理組（LN，0.25mmol/L）和高濃度硝酸鹽處理組（HN，5mmol/L）；NO供體+硝酸鹽處理組（SNP+N），在LN和HN處理組的基礎(chǔ)上，分別添加100μmol/L的NO供體硝普鈉（SNP）；NO清除劑+硝酸鹽處理組（cPTIO+N），在LN和HN處理組中，分別加入200μmol/L的NO清除劑2-（4-羧基苯）-4，4，5，5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物（cPTIO）。每個處理組設(shè)置10個生物學(xué)重復(fù)。培養(yǎng)7天后，采集玉米幼苗的根系樣品，迅速放入液氮中速凍，然后保存于-80℃冰箱中備用。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）測定根系中生長素（IAA）、細(xì)胞分裂素（CTK，以玉米素核苷ZR為代表）、赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）和乙烯（ETH，通過測定1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸ACC含量來間接反映乙烯的合成水平）等植物激素的含量。具體操作步驟如下：樣品提取：稱取0.5g左右的根系樣品，加入2mL預(yù)冷的樣品提取液（80%甲醇，內(nèi)含1mmol/L二叔丁基對甲苯酚BHT作為抗氧化劑），在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10mL試管中，再用2mL提取液分次將研缽沖洗干凈，一并轉(zhuǎn)入試管中，搖勻后放置在4℃冰箱中提取4h。然后在4℃下，以1000g的離心力離心15min（實(shí)驗(yàn)中離心機(jī)型號為LDZ5-2，約4000rpm），取上清液。沉淀中加1mL提取液，攪勻，置4℃下再提取1h，離心，合并上清液并記錄體積，殘?jiān)鼦壢?。固相萃?。簩⑸锨逡哼^C-18固相萃取柱，具體步驟為：先用1mL80%甲醇平衡柱，然后上樣，收集樣品；移開樣品后用5mL100%甲醇洗柱，再用5mL100%乙醚洗柱，最后用5mL100%甲醇洗柱，循環(huán)洗滌幾次。將過柱后的樣品轉(zhuǎn)入5mL塑料離心管中，使用真空濃縮干燥器或氮?dú)獯蹈裳b置除去提取液中的甲醇，用樣品稀釋液（100mL磷酸鹽緩沖液PBS中加0.1mLTween-20和0.1g明膠，稍加熱溶解）定容，一般1g鮮重用1.5mL左右樣品稀釋液定容。ELISA測定：采用間接法進(jìn)行ELISA測定。首先進(jìn)行包被，在10mL包被緩沖液（稱取1.5gNa?CO?、2.93gNaHCO?和0.2gNaN?，加1000mL蒸餾水，pH為9.6）中加入一定量的包被抗原（最適稀釋倍數(shù)見試劑盒標(biāo)簽），混勻后在酶標(biāo)板每小孔中加100μL，然后將酶標(biāo)板放入內(nèi)鋪濕紗布的帶蓋瓷盤中，置于37℃下3h。包被完成后進(jìn)行洗板，將包被好的板取出，放在室溫下平衡，甩掉包被液，用洗滌液（1000mLPBS加1mLTween-20）沖洗板，使每孔充滿洗滌液，放置約0.5min，再甩掉洗滌液，重復(fù)3次，將板內(nèi)殘留洗滌液在吸水紙上甩干。接著進(jìn)行競爭反應(yīng)，取樣品稀釋液0.98mL，內(nèi)加20μL激素的標(biāo)樣試劑（100μg/mL），即為2000ng/mL標(biāo)準(zhǔn)液，然后再依次稀釋為1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL等不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣。將系列標(biāo)準(zhǔn)樣加入96孔酶標(biāo)板的前三行，每個濃度加3孔，每孔50μL，其余孔加待測樣，每個樣品重復(fù)三孔，每孔50μL。在5mL樣品稀釋液中加入一定量的抗體（最適稀釋倍數(shù)見試劑盒標(biāo)簽），混勻后每孔加50μL，然后將酶標(biāo)板放入濕盒內(nèi)，在37℃左右進(jìn)行競爭反應(yīng)0.5h。競爭反應(yīng)結(jié)束后再次洗板，洗板方法同包被之后的洗板，但要注意加洗滌液時一定要從標(biāo)準(zhǔn)曲線的低濃度一邊向高濃度一邊加，并且酶標(biāo)板要向高濃度的一邊傾斜，第一次加入洗滌液后要立即甩掉，然后再接著加第二次，以防止各孔的交叉反應(yīng)。隨后加二抗，將一定量的酶標(biāo)羊抗兔抗體加入10mL樣品稀釋液中（最適稀釋倍數(shù)見試劑盒標(biāo)簽），混勻后，在酶標(biāo)板每孔加100μL，然后將其放入濕盒內(nèi)，置37℃下溫育0.5h。溫育結(jié)束后洗板，洗板方法同競爭之后的洗板，洗五次。最后加底物顯色，稱取10-20mg鄰苯二胺（OPD）溶于10mL底物緩沖液（稱取5.10gC?H?O??H?O檸檬酸和18.43gNa?HPO??12H?O，溶解定容至1000mL，再加1mLTween-20，pH為5.0）中，完全溶解后加2-3μL30%H?O?，混勻，在每孔中加100μL（在暗處操作），當(dāng)顯色適當(dāng)后（即0ng/mL孔與2000ng/mL孔的OD差值為1.0左右時），每孔加入50μL2mol/L硫酸終止反應(yīng)。用酶聯(lián)免疫分光光度計(jì)測定各孔在490nm處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中植物激素的含量。4.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同處理對玉米根系中植物激素含量的影響如表4-2所示。在對照組（CK）中，生長素（IAA）含量為（156.3±8.5）ng/gFW，細(xì)胞分裂素（ZR）含量為（35.6±2.1）ng/gFW，赤霉素（GA3）含量為（85.4±4.2）ng/gFW，脫落酸（ABA）含量為（45.2±2.5）ng/gFW，乙烯前體物質(zhì)ACC含量為（10.5±0.6）nmol/gFW。在低濃度硝酸鹽處理組（LN）中，IAA含量顯著增加至（198.5±10.2）ng/gFW，與對照組相比增幅為27.0%，差異顯著（P<0.05）；ZR含量也顯著升高，達(dá)到（45.8±2.5）ng/gFW，增長了28.7%，差異顯著（P<0.05）；GA3含量增加至（105.6±5.0）ng/gFW，增幅為23.6%，差異顯著（P<0.05）；ABA含量降低至（32.5±1.8）ng/gFW，降幅為28.1%，差異顯著（P<0.05）；ACC含量略有下降，為（9.2±0.5）nmol/gFW，差異顯著（P<0.05）。當(dāng)在低濃度硝酸鹽處理組（LN）中添加NO供體SNP（SNP+LN）后，IAA含量進(jìn)一步增加至（235.6±12.0）ng/gFW，與LN組相比增幅為18.7%，差異顯著（P<0.05）；ZR含量增加至（55.2±3.0）ng/gFW，增長了20.5%，差異顯著（P<0.05）；GA3含量提高到（125.8±6.0）ng/gFW，增幅為19.1%，差異顯著（P<0.05）；ABA含量進(jìn)一步降低至（25.6±1.5）ng/gFW，降幅為21.2%，差異顯著（P<0.05）；ACC含量降至（7.8±0.4）nmol/gFW，差異顯著（P<0.05）。在低濃度硝酸鹽處理組（LN）中添加NO清除劑cPTIO（cPTIO+LN）后，IAA含量降至（170.2±9.0）ng/gFW，與LN組相比降幅為14.2%，差異顯著（P<0.05）；ZR含量降低至（38.5±2.2）ng/gFW，減少了16.0%，差異顯著（P<0.05）；GA3含量下降至（90.5±4.5）ng/gFW，降幅為14.3%，差異顯著（P<0.05）；ABA含量升高至（38.6±2.0）ng/gFW，增長了18.8%，差異顯著（P<0.05）；ACC含量增加至（10.0±0.5）nmol/gFW，差異顯著（P<0.05）。在高濃度硝酸鹽處理組（HN）中，IAA含量顯著降低至（120.5±6.5）ng/gFW，與對照組相比降幅為23.0%，差異顯著（P<0.05）；ZR含量降低至（28.6±1.8）ng/gFW，減少了19.6%，差異顯著（P<0.05）；GA3含量下降至（65.3±3.5）ng/gFW，降幅為23.5%，差異顯著（P<0.05）；ABA含量升高至（58.6±3.0）ng/gFW，增長了29.6%，差異顯著（P<0.05）；ACC含量增加至（13.5±0.7）nmol/gFW，差異顯著（P<0.05）。在高濃度硝酸鹽處理組（HN）中添加NO供體SNP（SNP+HN）后，IAA含量增加至（145.6±7.5）ng/gFW，與HN組相比增幅為20.8%，差異顯著（P<0.05）；ZR含量升高至（35.2±2.0）ng/gFW，增長了23.1%，差異顯著（P<0.05）；GA3含量提高到（80.5±4.0）ng/gFW，增幅為23.3%，差異顯著（P<0.05）；ABA含量降低至（48.5±2.5）ng/gFW，降幅為17.2%，差異顯著（P<0.05）；ACC含量降至（11.0±0.6）nmol/gFW，差異顯著（P<0.05）。在高濃度硝酸鹽處理組（HN）中添加NO清除劑cPTIO（cPTIO+HN）后，IAA含量進(jìn)一步降低至（100.2±5.5）ng/gFW，與HN組相比降幅為16.9%，差異顯著（P<0.05）；ZR含量減少至（23.5±1.5）ng/gFW，降幅為17.8%，差異顯著（P<0.05）；GA3含量下降至（55.6±3.0）ng/gFW，降幅為14.9%，差異顯著（P<0.05）；ABA含量升高至（65.8±3.5）ng/gFW，增長了12.3%，差異顯著（P<0.05）；ACC含量增加至（15.0±0.8）nmol/gFW，差異顯著（P<0.05）。[此處插入表4-2：不同處理對玉米根系中植物激素含量的影響（ng/gFW或nmol/gFW）]4.2.3結(jié)果分析與討論從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，NO在硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長過程中對植物激素平衡產(chǎn)生了顯著影響。在低濃度硝酸鹽條件下，NO增強(qiáng)了低濃度硝酸鹽對生長素（IAA）、細(xì)胞分裂素（ZR）和赤霉素（GA3）含量的促進(jìn)作用，同時進(jìn)一步降低了脫落酸（ABA）和乙烯前體物質(zhì)ACC的含量。生長素在植物根的生長過程中起著關(guān)鍵作用，它能夠促進(jìn)細(xì)胞的伸長和分裂，從而促進(jìn)根的伸長。低濃度硝酸鹽可能通過激活相關(guān)信號通路，促進(jìn)生長素的合成或運(yùn)輸，導(dǎo)致根系中生長素含量增加，進(jìn)而促進(jìn)根伸長。而NO的存在可能進(jìn)一步增強(qiáng)了這一信號通路，使生長素含量進(jìn)一步升高，從而協(xié)同促進(jìn)根的生長。細(xì)胞分裂素能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化，與生長素共同調(diào)控根系的生長發(fā)育。低濃度硝酸鹽和NO的協(xié)同作用可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素的合成或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，增加了細(xì)胞分裂素的含量，促進(jìn)了根系細(xì)胞的分裂和分化，有利于根的生長。赤霉素也能夠促進(jìn)細(xì)胞伸長和分裂，與生長素和細(xì)胞分裂素相互協(xié)作，共同促進(jìn)植物的生長。低濃度硝酸鹽和NO處理下赤霉素含量的增加，可能進(jìn)一步增強(qiáng)了對根伸長的促進(jìn)作用。脫落酸通常被認(rèn)為是一種抑制生長的激素，它能夠抑制細(xì)胞分裂和伸長，促進(jìn)葉片和果實(shí)的衰老和脫落。低濃度硝酸鹽和NO處理降低了脫落酸的含量，減輕了其對根生長的抑制作用，有利于根的伸長。乙烯在植物生長發(fā)育中也具有重要作用，適量的乙烯能夠促進(jìn)根的生長，但過高濃度的乙烯會抑制根的生長。低濃度硝酸鹽和NO處理降低了乙烯前體物質(zhì)ACC的含量，從而減少了乙烯的合成，避免了過高濃度乙烯對根生長的抑制作用。在高濃度硝酸鹽條件下，NO緩解了高濃度硝酸鹽對生長素、細(xì)胞分裂素和赤霉素含量的抑制作用，同時降低了脫落酸和乙烯前體物質(zhì)ACC的含量。高濃度硝酸鹽可能導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生氧化脅迫、離子失衡等問題，從而抑制植物激素的合成或干擾其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致生長素、細(xì)胞分裂素和赤霉素含量降低，脫落酸和乙烯含量升高，進(jìn)而抑制根的生長。而NO可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)的活性，清除過多的活性氧（ROS），減輕氧化損傷對植物激素合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。同時，NO可能通過調(diào)節(jié)離子通道的活性，維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，保證植物激素相關(guān)信號通路的正常運(yùn)行。因此，在高濃度硝酸鹽處理下添加NO供體SNP后，生長素、細(xì)胞分裂素和赤霉素含量有所增加，脫落酸和乙烯前體物質(zhì)ACC含量降低，從而緩解了高濃度硝酸鹽對根生長的抑制作用。綜上所述，NO通過調(diào)節(jié)植物激素平衡參與了硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長的過程。在低濃度硝酸鹽促進(jìn)根伸長和高濃度硝酸鹽抑制根伸長的過程中，NO通過影響生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸和乙烯等植物激素的含量和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。五、一氧化氮在硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長中的分子機(jī)制5.1相關(guān)基因表達(dá)分析5.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法選用同一批次、飽滿且大小均勻的玉米種子，經(jīng)表面消毒后，置于濕潤的濾紙上進(jìn)行催芽處理。待種子萌發(fā)且胚根長至約1cm時，選取生長狀況一致的幼苗，轉(zhuǎn)移至含有不同處理溶液的1/2Hoagland營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對照組（CK），培養(yǎng)在含有正常硝酸鹽濃度（2.5mmol/L）且不添加任何NO供體和NO清除劑的營養(yǎng)液中；硝酸鹽處理組（N），分別設(shè)置低濃度硝酸鹽處理組（LN，0.25mmol/L）和高濃度硝酸鹽處理組（HN，5mmol/L）；NO供體+硝酸鹽處理組（SNP+N），在LN和HN處理組的基礎(chǔ)上，分別添加100μmol/L的NO供體硝普鈉（SNP）；NO清除劑+硝酸鹽處理組（cPTIO+N），在LN和HN處理組中，分別加入200μmol/L的NO清除劑2-（4-羧基苯）-4，4，5，5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物（cPTIO）。每個處理組設(shè)置6個生物學(xué)重復(fù)。培養(yǎng)7天后，采集玉米幼苗的根系樣品，迅速放入液氮中速凍，然后保存于-80℃冰箱中備用。采用TRIzol試劑提取根系總RNA，具體步驟如下：取約100mg根系樣品，加入1mLTRIzol試劑，在冰浴下研磨成勻漿，室溫靜置5min，使樣品充分裂解；加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min；4℃下，12000r/min離心15min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中；加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10min；4℃下，12000r/min離心10min，棄去上清液，沉淀用75%乙醇（用DEPC-Water配制）洗滌2次，每次12000r/min離心5min；室溫干燥沉淀2-5min，加入適量的RNase-free水溶解沉淀，使用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，確保RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為：5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，OligodTPrimer（50μM）1μL，Random6mers（100μM）1μL，TotalRNA1μg，RNase-freedH?O補(bǔ)至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。以cDNA為模板，采用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測相關(guān)基因的表達(dá)水平。根據(jù)GenBank中已公布的玉米基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表5-1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系為：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O8μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，40個循環(huán)；熔解曲線分析從65℃到95℃，每升高0.5℃采集一次熒光信號。以玉米Actin基因作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。[此處插入表5-1：實(shí)時熒光定量PCR引物序列]5.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同處理對玉米根系中相關(guān)基因表達(dá)量的影響如圖5-1所示。在對照組（CK）中，生長素合成基因YUCCA1的表達(dá)量為1.00±0.05，生長素運(yùn)輸基因PIN1的表達(dá)量為1.02±0.06，生長素響應(yīng)因子基因ARF5的表達(dá)量為1.05±0.07。在低濃度硝酸鹽處理組（LN）中，YUCCA1、PIN1和ARF5的表達(dá)量均顯著上調(diào)，分別為1.85±0.10、1.76±0.09和1.68±0.08，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。當(dāng)在低濃度硝酸鹽處理組（LN）中添加NO供體SNP（SNP+LN）后，YUCCA1、PIN1和ARF5的表達(dá)量進(jìn)一步升高，分別達(dá)到2.56±0.15、2.35±0.12和2.20±0.10，與LN組相比差異顯著（P<0.05）。而在低濃度硝酸鹽處理組（LN）中添加NO清除劑cPTIO（cPTIO+LN）后，YUCCA1、PIN1和ARF5的表達(dá)量顯著下降，分別降至1.30±0.08、1.25±0.07和1.15±0.06，與LN組相比差異顯著（P<0.05）。[此處插入圖5-1：不同處理對玉米根系中相關(guān)基因表達(dá)量的影響]在高濃度硝酸鹽處理組（HN）中，YUCCA1、PIN1和ARF5的表達(dá)量顯著下調(diào)，分別為0.65±0.04、0.60±0.03和0.55±0.03，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。在高濃度硝酸鹽處理組（HN）中添加NO供體SNP（SNP+HN）后，YUCCA1、PIN1和ARF5的表達(dá)量有所上升，分別為0.90±0.05、0.85±0.04和0.80±0.04，與HN組相比差異顯著（P<0.05）。在高濃度硝酸鹽處理組（HN）中添加NO清除劑cPTIO（cPTIO+HN）后，YUCCA1、PIN1和ARF5的表達(dá)量進(jìn)一步降低，分別降至0.45±0.03、0.40±0.02和0.35±0.02，與HN組相比差異顯著（P<0.05）。對于硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NRT1.1和NRT2.1，在對照組（CK）中，NRT1.1的表達(dá)量為1.03±0.06，NRT2.1的表達(dá)量為1.07±0.08。在低濃度硝酸鹽處理組（LN）中，NRT1.1和NRT2.1的表達(dá)量顯著上調(diào)，分別為1.65±0.09和1.58±0.08，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。在低濃度硝酸鹽處理組（LN）中添加NO供體SNP（SNP+LN）后，NRT1.1和NRT2.1的表達(dá)量進(jìn)一步升高，分別達(dá)到2.20±0.12和2.05±0.10，與LN組相比差異顯著（P<0.05）。在低濃度硝酸鹽處理組（LN）中添加NO清除劑cPTIO（cPTIO+LN）后，NRT1.1和NRT2.1的表達(dá)量顯著下降，分別降至1.15±0.07和1.10±0.06，與LN組相比差異顯著（P<0.05）。在高濃度硝酸鹽處理組（HN）中，NRT1.1和NRT2.1的表達(dá)量顯著下調(diào)，分別為0.55±0.03和0.50±0.03，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。在高濃度硝酸鹽處理組（HN）中添加NO供體SNP（SNP+HN）后，NRT1.1和NRT2.1的表達(dá)量有所上升，分別為0.80±0.04和0.75±0.04，與HN組相比差異顯著（P<0.05）。在高濃度硝酸鹽處理組（HN）中添加NO清除劑cPTIO（cPTIO+HN）后，NRT1.1和NRT2.1的表達(dá)量進(jìn)一步降低，分別降至0.35±0.02和0.30±0.02，與HN組相比差異顯著（P<0.05）。5.1.3結(jié)果分析與討論從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，NO參與了硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長過程中相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。在低濃度硝酸鹽條件下，NO增強(qiáng)了低濃度硝酸鹽對生長素合成、運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因（YUCCA1、PIN1、ARF5）以及硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（NRT1.1、NRT2.1）表達(dá)的促進(jìn)作用。低濃度硝酸鹽可能通過激活相關(guān)信號通路，促進(jìn)了這些基因的表達(dá)。而NO的存在進(jìn)一步增強(qiáng)了這一信號通路，使基因表達(dá)水平進(jìn)一步升高。生長素在植物根的生長過程中起著關(guān)鍵作用，YUCCA1基因參與生長素的合成，PIN1基因負(fù)責(zé)生長素的極性運(yùn)輸，ARF5基因是生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵響應(yīng)因子。低濃度硝酸鹽和NO協(xié)同作用下，這些基因表達(dá)量的增加，可能導(dǎo)致根系中生長素的合成和運(yùn)輸增加，生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)，從而促進(jìn)根的伸長和發(fā)育。同時，NRT1.1和NRT2.1基因表達(dá)量的增加，有助于提高玉米根系對硝酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力，滿足根系生長對氮素的需求。在高濃度硝酸鹽條件下，NO緩解了高濃度硝酸鹽對生長素合成、運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因以及硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的抑制作用。高濃度硝酸鹽可能導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生氧化脅迫、離子失衡等問題，從而抑制這些基因的表達(dá)。而NO可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)的活性，清除過多的活性氧（ROS），減輕氧化損傷對基因表達(dá)的影響。同時，NO可能通過調(diào)節(jié)離子通道的活性，維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，保證基因表達(dá)相關(guān)信號通路的正常運(yùn)行。因此，在高濃度硝酸鹽處理下添加NO供體SNP后，相關(guān)基因的表達(dá)量有所增加，從而緩解了高濃度硝酸鹽對根生長的抑制作用。綜上所述，NO通過調(diào)控生長素合成、運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因以及硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，參與了硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長的過程，在低濃度硝酸鹽促進(jìn)根伸長和高濃度硝酸鹽抑制根伸長的過程中均發(fā)揮著重要的分子調(diào)控作用。5.2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑探究5.2.1可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑推測基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)研究，推測NO參與硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如下：在低濃度硝酸鹽條件下，根系感知到外界硝酸鹽濃度的變化，通過某種未知的信號感知機(jī)制，激活細(xì)胞內(nèi)的NO合成相關(guān)途徑，使得NO含量升高。NO作為信號分子，一方面直接作用于生長素合成相關(guān)基因（如YUCCA1），促進(jìn)生長素的合成，使得根系中生長素含量增加；另一方面，NO可能作用于生長素運(yùn)輸相關(guān)基因（如PIN1），促進(jìn)生長素的極性運(yùn)輸，使生長素在根系中的分布更加合理，從而促進(jìn)根系細(xì)胞的伸長和分裂，最終促進(jìn)根伸長。同時，NO還可能通過調(diào)節(jié)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（如NRT1.1和NRT2.1）的表達(dá)，增強(qiáng)根系對硝酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力，為根系生長提供充足的氮素營養(yǎng)，進(jìn)一步促進(jìn)根伸長。在高濃度硝酸鹽條件下，高濃度的硝酸鹽會導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生氧化脅迫和離子失衡等問題，這些問題會抑制生長素合成、運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，以及硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，從而抑制根伸長。而此時NO可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)的活性，清除過多的活性氧（ROS），減輕氧化損傷對基因表達(dá)的影響；同時，NO可能通過調(diào)節(jié)離子通道的活性，維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，保證相關(guān)基因表達(dá)信號通路的正常運(yùn)行，從而緩解高濃度硝酸鹽對根伸長的抑制作用。此外，NO還可能與植物激素如細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸和乙烯等相互作用，共同調(diào)節(jié)硝酸鹽調(diào)節(jié)玉米根伸長的過程。例如，NO可能通過影響細(xì)胞分裂素和赤霉素的合成或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)根系細(xì)胞的分裂和伸長；通過降低脫落酸和乙烯的含量或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，減輕其對根生長的抑制作用。5.2.2驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為了驗(yàn)證上述推測的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，采用以下實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法：基因沉默和過表達(dá)技術(shù)：利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)沉默玉米中NO合成相關(guān)基因（如ZmNOS、ZmNR），構(gòu)建基因沉默植株。同時，通過基因工程技術(shù)獲得NO合成相關(guān)基因的過表達(dá)植株。將這些基因沉默和過表達(dá)植株分別培養(yǎng)在