串珠素對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的調(diào)控作用及與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）關(guān)聯(lián)探究一、引言1.1研究背景與意義在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，成纖維細(xì)胞是一類極為關(guān)鍵的細(xì)胞，廣泛分布于人體的各種結(jié)締組織中。它由胚胎間充質(zhì)細(xì)胞分化而來，在創(chuàng)傷修復(fù)、組織再生以及維持組織器官結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定等生理過程中發(fā)揮著不可替代的作用。當(dāng)機(jī)體遭受損傷時(shí)，成纖維細(xì)胞迅速響應(yīng)，通過增殖、遷移至受損部位，大量合成并分泌膠原蛋白、彈性纖維等細(xì)胞外基質(zhì)成分，形成新的結(jié)締組織，填補(bǔ)組織缺損，促進(jìn)傷口愈合。在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中，成纖維細(xì)胞增殖并產(chǎn)生膠原蛋白，使傷口逐漸愈合，恢復(fù)皮膚的完整性；在骨折愈合時(shí)，成纖維細(xì)胞參與骨痂形成，對(duì)骨骼的修復(fù)和重塑起著重要作用。成纖維細(xì)胞在腫瘤生長(zhǎng)、纖維化疾病等病理過程中也扮演著重要角色，其異常增殖和功能失調(diào)可能導(dǎo)致瘢痕過度形成、器官纖維化等不良后果。深入研究成纖維細(xì)胞的增殖調(diào)控機(jī)制具有重要的理論和實(shí)踐意義。串珠素（Perlecan），作為細(xì)胞外基質(zhì)中硫酸肝素類蛋白聚糖家族的重要成員，在細(xì)胞微環(huán)境中發(fā)揮著多種關(guān)鍵功能。其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了它與多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子相互作用的能力。串珠素能夠招募相關(guān)的細(xì)胞因子，如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）等，通過與這些生長(zhǎng)因子的特異性結(jié)合，保護(hù)它們免受蛋白酶的降解，進(jìn)而調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)運(yùn)和生物利用度，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、遷移等行為產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。研究表明，串珠素可以激活ERK1/2和Akt信號(hào)通路，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞增殖和生存。此外，串珠素還可以調(diào)節(jié)關(guān)鍵細(xì)胞因子，如VEGF和TGF-β，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞增殖和整合。在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，串珠素因其良好的生物相容性和生物活性，被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建生物材料和組織修復(fù)支架，為組織再生提供有利的微環(huán)境。bFGF是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族中具有代表性的成員之一，廣泛分布于體內(nèi)眾多組織和器官中，是一種對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、遷移等過程具有廣泛調(diào)節(jié)作用的多功能細(xì)胞因子。在胚胎發(fā)育過程中，bFGF參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化，對(duì)組織和器官的形成至關(guān)重要；在成體組織中，bFGF在創(chuàng)傷修復(fù)、血管生成等生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它能夠刺激成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)新生血管形成，為受損組織提供充足的血液供應(yīng)，加速傷口愈合。bFGF還在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和修復(fù)中扮演重要角色，對(duì)神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)和分化具有促進(jìn)作用。bFGF的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及纖維化疾病的進(jìn)程密切相關(guān)，過高或過低的bFGF水平都可能打破細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)平衡，引發(fā)一系列病理變化。近年來，隨著對(duì)細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)制研究的不斷深入，串珠素和bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響及其相互關(guān)系逐漸成為研究熱點(diǎn)。大量研究表明，串珠素和bFGF在促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖方面具有協(xié)同作用，但二者相互作用的具體分子機(jī)制仍不完全明確。明確串珠素對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響規(guī)律，以及揭示其與bFGF之間的相互作用機(jī)制，對(duì)于深入理解細(xì)胞增殖調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)具有重要的理論意義，能夠?yàn)樯镝t(yī)學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究提供新的思路和理論依據(jù)。在實(shí)踐應(yīng)用方面，這一研究成果將為組織工程和再生醫(yī)學(xué)提供有力的理論支持，有助于開發(fā)基于串珠素和bFGF的新型生物材料和治療策略，用于促進(jìn)組織修復(fù)和再生，提高臨床治療效果，為解決創(chuàng)傷修復(fù)、器官再生、纖維化疾病治療等醫(yī)學(xué)難題開辟新的途徑。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在成纖維細(xì)胞的研究領(lǐng)域，串珠素對(duì)其增殖的影響已成為眾多學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)。眾多研究表明，串珠素在促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖方面發(fā)揮著積極作用。一些研究發(fā)現(xiàn)，串珠素能夠激活細(xì)胞內(nèi)的ERK1/2和Akt信號(hào)通路，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞增殖和生存。通過向體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中添加串珠素，能夠觀察到細(xì)胞增殖速率顯著提高，細(xì)胞周期進(jìn)程加快，更多細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期，表明串珠素能夠有效促進(jìn)成纖維細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞分裂。串珠素還可以調(diào)節(jié)關(guān)鍵細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β），進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞增殖和整合。這些細(xì)胞因子在細(xì)胞增殖、分化和遷移等過程中發(fā)揮著重要作用，串珠素通過對(duì)它們的調(diào)節(jié)，間接影響成纖維細(xì)胞的增殖活動(dòng)。在傷口修復(fù)模型中，串珠素能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞向傷口部位遷移，并增強(qiáng)其增殖能力，加速傷口愈合過程。bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞的作用也得到了廣泛而深入的研究。作為一種重要的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖具有顯著的促進(jìn)作用。它能夠與成纖維細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，激活一系列下游信號(hào)通路，包括Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/Akt等，這些信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4），從而推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)DNA合成和細(xì)胞增殖。在組織修復(fù)和再生過程中，bFGF可以刺激成纖維細(xì)胞大量增殖，合成和分泌更多的膠原蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)成分，為組織修復(fù)提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)，有效促進(jìn)傷口愈合和組織再生。在燒傷創(chuàng)面修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，外源性添加bFGF能夠顯著加快創(chuàng)面愈合速度，提高成纖維細(xì)胞的增殖活性和膠原蛋白合成量。在二者關(guān)系的研究方面，已有研究表明串珠素與bFGF之間存在相互作用，并對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖產(chǎn)生協(xié)同影響。串珠素可以結(jié)合bFGF，并保持其生物活性，保護(hù)bFGF免受蛋白酶降解，從而增強(qiáng)其對(duì)細(xì)胞增殖的刺激作用。有實(shí)驗(yàn)通過將串珠素與bFGF共同作用于成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用bFGF，證實(shí)了串珠素對(duì)bFGF生物活性的保護(hù)和增強(qiáng)作用。串珠素還可以增強(qiáng)bFGF與細(xì)胞膜受體的結(jié)合，增加bFGF與細(xì)胞表面受體的結(jié)合親和力，進(jìn)一步增強(qiáng)其對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。相關(guān)研究利用表面等離子共振技術(shù)等手段，精確測(cè)定了串珠素存在前后bFGF與受體的結(jié)合常數(shù)，直觀地展示了串珠素對(duì)bFGF與受體結(jié)合的增強(qiáng)效應(yīng)。盡管當(dāng)前在串珠素和bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞的作用研究方面已取得一定成果，但仍存在諸多不足。在串珠素與bFGF相互作用的分子機(jī)制研究上，雖然已知二者存在相互作用并對(duì)成纖維細(xì)胞增殖有協(xié)同效果，但具體的分子結(jié)合位點(diǎn)、信號(hào)傳導(dǎo)的上下游關(guān)系以及其他參與的調(diào)控因子等方面尚未完全明確，仍需進(jìn)一步深入探究。在不同生理和病理?xiàng)l件下，串珠素和bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響是否存在差異，以及如何根據(jù)這些差異進(jìn)行針對(duì)性的干預(yù)和治療，目前也缺乏系統(tǒng)的研究。在組織工程和再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用研究中，如何將串珠素和bFGF更有效地應(yīng)用于臨床治療，開發(fā)出安全、有效的治療策略和生物材料，也有待進(jìn)一步探索和驗(yàn)證。基于以上研究現(xiàn)狀和不足，本研究將深入探討串珠素對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響規(guī)律，通過多種實(shí)驗(yàn)手段系統(tǒng)分析串珠素在不同濃度、不同作用時(shí)間下對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響；著重揭示串珠素與bFGF之間相互作用的具體分子機(jī)制，運(yùn)用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等技術(shù)，確定二者相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)和參與的信號(hào)通路；結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，探索串珠素和bFGF在組織修復(fù)和再生過程中的協(xié)同作用機(jī)制，為組織工程和再生醫(yī)學(xué)提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和更有效的應(yīng)用策略，以期為解決相關(guān)醫(yī)學(xué)難題提供新的思路和方法。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入剖析串珠素對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響，并揭示其與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）之間的內(nèi)在關(guān)系，具體研究目的如下：系統(tǒng)分析串珠素對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響規(guī)律：通過在體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，設(shè)置不同濃度梯度的串珠素處理組，以及不同的作用時(shí)間，運(yùn)用CCK-8法、EdU染色等細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)，精確測(cè)定細(xì)胞的增殖活性，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，全面系統(tǒng)地分析串珠素在不同條件下對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響，明確串珠素促進(jìn)或抑制成纖維細(xì)胞增殖的最佳濃度范圍和作用時(shí)間，為后續(xù)深入研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。深入探究串珠素與bFGF相互作用的分子機(jī)制：運(yùn)用免疫共沉淀、表面等離子共振等先進(jìn)技術(shù)，確定串珠素與bFGF相互作用的具體分子結(jié)合位點(diǎn)，明確二者結(jié)合的親和力和特異性；通過基因敲降、過表達(dá)等分子生物學(xué)手段，結(jié)合WesternBlot、RT-qPCR等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，研究串珠素與bFGF相互作用對(duì)下游信號(hào)通路的激活或抑制作用，確定參與調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖的關(guān)鍵信號(hào)分子和信號(hào)通路，深入揭示二者相互作用的分子機(jī)制，填補(bǔ)該領(lǐng)域在分子機(jī)制研究方面的空白。探索串珠素和bFGF在組織修復(fù)和再生過程中的協(xié)同作用機(jī)制：建立體內(nèi)外組織修復(fù)和再生模型，如皮膚創(chuàng)傷模型、骨折修復(fù)模型等，通過在模型中分別單獨(dú)給予串珠素、bFGF以及二者聯(lián)合處理，觀察組織修復(fù)和再生的過程，檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分的表達(dá)變化，分析成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和分化情況，深入探索串珠素和bFGF在組織修復(fù)和再生過程中的協(xié)同作用機(jī)制，為組織工程和再生醫(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：研究角度創(chuàng)新：以往研究多集中于單獨(dú)探討串珠素或bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞的作用，而本研究從二者相互作用的全新角度出發(fā)，全面深入地研究串珠素與bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的協(xié)同影響及其分子機(jī)制，為成纖維細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)制的研究提供了新的視角，有望拓展對(duì)細(xì)胞增殖調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)。研究方法創(chuàng)新：綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，如免疫共沉淀、表面等離子共振、基因編輯技術(shù)等，從分子、細(xì)胞和整體動(dòng)物水平多層次、多角度地研究串珠素與bFGF的相互作用及對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響，相較于傳統(tǒng)研究方法，能夠更加精準(zhǔn)地揭示二者相互作用的分子機(jī)制和在組織修復(fù)中的協(xié)同作用機(jī)制，提高研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。應(yīng)用前景創(chuàng)新：本研究成果不僅有助于深入理解細(xì)胞增殖調(diào)控的基本生物學(xué)過程，還將為組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域開發(fā)新型的治療策略和生物材料提供重要的理論支持。通過明確串珠素和bFGF的協(xié)同作用機(jī)制，有望設(shè)計(jì)出更加高效、安全的組織修復(fù)和再生治療方案，如基于串珠素和bFGF的復(fù)合生物材料，用于促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、器官再生等，具有廣闊的應(yīng)用前景和潛在的臨床價(jià)值。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1成纖維細(xì)胞概述成纖維細(xì)胞是一種廣泛分布于人體結(jié)締組織中的細(xì)胞，由胚胎間充質(zhì)細(xì)胞分化而來，在機(jī)體的生理和病理過程中扮演著關(guān)鍵角色。成纖維細(xì)胞的形態(tài)具有顯著的多樣性，且會(huì)依據(jù)其功能狀態(tài)和所處的微環(huán)境發(fā)生相應(yīng)變化。在功能活躍時(shí)期，成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)出扁平星形或不規(guī)則多角形，細(xì)胞體積較大，胞質(zhì)豐富且向外伸展形成多個(gè)偽足狀突起，這些突起能夠與周圍的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，促進(jìn)細(xì)胞間的信號(hào)傳遞和物質(zhì)交換。此時(shí)，其細(xì)胞核通常呈卵圓形，染色質(zhì)較為疏松，核仁明顯，這表明細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)錄活性，能夠積極合成各種蛋白質(zhì)和生物分子，以滿足其旺盛的生理功能需求。當(dāng)成纖維細(xì)胞處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)，細(xì)胞形態(tài)則變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)的梭形，胞體變小，胞質(zhì)減少，細(xì)胞核也隨之變長(zhǎng)，染色質(zhì)凝聚，核仁不明顯，細(xì)胞的代謝活動(dòng)和合成功能相對(duì)減弱。在皮膚組織中，處于創(chuàng)傷修復(fù)階段的成纖維細(xì)胞，由于需要大量合成膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分來促進(jìn)傷口愈合，其形態(tài)多為扁平星形，功能活躍；而在正常皮膚的結(jié)締組織中，成纖維細(xì)胞多呈梭形，處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，維持著組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。在人體中，成纖維細(xì)胞廣泛分布于幾乎所有的結(jié)締組織類型中，包括皮膚、肌腱、韌帶、骨、軟骨、血管、內(nèi)臟器官的間質(zhì)等部位。在皮膚中，成纖維細(xì)胞主要存在于真皮層，是真皮結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，對(duì)維持皮膚的彈性、韌性和結(jié)構(gòu)完整性起著關(guān)鍵作用。在肌腱和韌帶中，成纖維細(xì)胞沿著纖維方向排列，合成大量的膠原蛋白，形成緊密有序的纖維結(jié)構(gòu)，賦予肌腱和韌帶強(qiáng)大的抗拉伸能力，以適應(yīng)機(jī)體的運(yùn)動(dòng)和力學(xué)需求。在骨組織中，成纖維細(xì)胞參與骨基質(zhì)的合成和重塑過程，與成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等協(xié)同作用，維持骨骼的正常生長(zhǎng)、發(fā)育和修復(fù)。在血管壁中，成纖維細(xì)胞分布于血管的中層和外層，合成彈性纖維和膠原蛋白，對(duì)維持血管的彈性和穩(wěn)定性至關(guān)重要，有助于調(diào)節(jié)血管的舒縮功能，保證血液循環(huán)的正常進(jìn)行。成纖維細(xì)胞具有多種重要的生理功能，這些功能對(duì)于維持組織器官的正常結(jié)構(gòu)和功能、促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)以及參與多種生理病理過程至關(guān)重要。其最主要的功能之一是合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，包括膠原蛋白、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維以及蛋白聚糖等。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)中含量最為豐富的蛋白質(zhì)，成纖維細(xì)胞合成的膠原蛋白種類繁多，不同類型的膠原蛋白在組織中形成不同的纖維結(jié)構(gòu)，賦予組織強(qiáng)大的力學(xué)強(qiáng)度和韌性。I型膠原蛋白主要存在于皮膚、肌腱、骨等組織中，形成粗大的纖維束，是維持這些組織強(qiáng)度的重要成分；III型膠原蛋白則在胚胎組織和創(chuàng)傷修復(fù)早期大量表達(dá)，參與形成細(xì)纖維網(wǎng)絡(luò)，為組織修復(fù)提供初始的結(jié)構(gòu)框架。彈性纖維賦予組織彈性和回縮能力，使組織在受到外力拉伸后能夠恢復(fù)原狀，成纖維細(xì)胞合成的彈性蛋白是彈性纖維的主要成分，其特殊的分子結(jié)構(gòu)和交聯(lián)方式?jīng)Q定了彈性纖維的彈性性能。在皮膚中，彈性纖維與膠原蛋白相互交織，共同維持皮膚的彈性和柔韌性，隨著年齡的增長(zhǎng)，成纖維細(xì)胞合成彈性纖維的能力下降，皮膚逐漸失去彈性，出現(xiàn)皺紋等老化現(xiàn)象。蛋白聚糖是一類由蛋白質(zhì)核心和糖胺聚糖側(cè)鏈組成的大分子復(fù)合物，成纖維細(xì)胞分泌的蛋白聚糖在細(xì)胞外基質(zhì)中形成高度水化的凝膠狀結(jié)構(gòu)，能夠結(jié)合大量的水分，賦予組織良好的彈性和抗壓性，還能調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的物理性質(zhì)和生物學(xué)活性，參與細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)和物質(zhì)運(yùn)輸。成纖維細(xì)胞在創(chuàng)傷修復(fù)過程中發(fā)揮著核心作用。當(dāng)組織受到損傷時(shí)，成纖維細(xì)胞會(huì)迅速做出響應(yīng)，從相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)?；罨某衫w維細(xì)胞首先發(fā)生增殖，通過細(xì)胞分裂增加細(xì)胞數(shù)量，為創(chuàng)傷修復(fù)提供足夠的細(xì)胞來源。成纖維細(xì)胞會(huì)沿著損傷部位的化學(xué)信號(hào)和細(xì)胞外基質(zhì)的引導(dǎo)，遷移至受損區(qū)域。在遷移過程中，成纖維細(xì)胞通過伸出偽足與周圍的細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，不斷調(diào)整自身的位置和方向，最終到達(dá)傷口部位。到達(dá)傷口后，成纖維細(xì)胞大量合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、纖維連接蛋白等，形成新的結(jié)締組織，填補(bǔ)組織缺損，促進(jìn)傷口愈合。成纖維細(xì)胞還能分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等，這些因子能夠招募其他細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，共同參與創(chuàng)傷修復(fù)過程，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管生成和細(xì)胞增殖分化。在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中，成纖維細(xì)胞在傷口愈合的早期階段大量增殖并遷移至傷口處，合成膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)成分，形成肉芽組織；隨著修復(fù)過程的進(jìn)行，成纖維細(xì)胞逐漸將肉芽組織轉(zhuǎn)化為瘢痕組織，完成傷口的愈合。成纖維細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中也具有重要作用。它能分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等，這些因子能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性和遷移，參與炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)、維持和消退過程。成纖維細(xì)胞分泌的IL-6可以激活T細(xì)胞和B細(xì)胞，促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力；TNF-α則具有多種生物學(xué)活性，能夠誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞的活化和聚集，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，還能調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和增殖。在炎癥反應(yīng)過程中，成纖維細(xì)胞通過分泌趨化因子如MCP-1，吸引單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞向炎癥部位遷移，參與炎癥的清除和組織修復(fù)。成纖維細(xì)胞還能與免疫細(xì)胞相互作用，通過表面的細(xì)胞黏附分子與免疫細(xì)胞結(jié)合，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和活性。在感染性炎癥中，成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和趨化因子能夠招募免疫細(xì)胞清除病原體，同時(shí)促進(jìn)組織修復(fù)；但在某些慢性炎癥和自身免疫性疾病中，成纖維細(xì)胞的異?；罨头置诳赡軐?dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，造成組織損傷。成纖維細(xì)胞在不同組織中的作用存在一定差異，這與其所在組織的結(jié)構(gòu)和功能需求密切相關(guān)。在皮膚中，成纖維細(xì)胞不僅負(fù)責(zé)合成和維持皮膚結(jié)締組織的正常結(jié)構(gòu)和功能，還參與皮膚的創(chuàng)傷修復(fù)、毛發(fā)的生長(zhǎng)周期調(diào)節(jié)以及皮膚的免疫防御等過程。在創(chuàng)傷修復(fù)過程中，成纖維細(xì)胞的增殖和分泌活動(dòng)對(duì)于傷口的愈合和瘢痕形成起著關(guān)鍵作用，其合成的膠原蛋白和彈性纖維的質(zhì)量和數(shù)量直接影響著皮膚的修復(fù)效果和外觀。在毛發(fā)的生長(zhǎng)周期中，成纖維細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分能夠調(diào)節(jié)毛囊干細(xì)胞的增殖和分化，影響毛發(fā)的生長(zhǎng)、休止和脫落。在肌腱和韌帶中，成纖維細(xì)胞主要合成和分泌大量的I型膠原蛋白，形成高度有序的纖維結(jié)構(gòu)，賦予肌腱和韌帶強(qiáng)大的抗拉伸能力，以適應(yīng)肌肉收縮和關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的力學(xué)負(fù)荷。肌腱和韌帶中的成纖維細(xì)胞還具有一定的機(jī)械感應(yīng)能力，能夠根據(jù)力學(xué)刺激的變化調(diào)整細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，維持組織的力學(xué)性能和結(jié)構(gòu)完整性。在骨組織中，成纖維細(xì)胞與成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等密切協(xié)作，參與骨的生長(zhǎng)、發(fā)育、重塑和修復(fù)過程。成纖維細(xì)胞合成的細(xì)胞外基質(zhì)成分和生長(zhǎng)因子能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的活性和分化，促進(jìn)骨基質(zhì)的合成和礦化；同時(shí)，成纖維細(xì)胞還能通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子，招募破骨細(xì)胞，參與骨的吸收和重塑過程，維持骨代謝的平衡。在骨折修復(fù)過程中，成纖維細(xì)胞首先形成纖維性骨痂，為后續(xù)的骨組織修復(fù)提供支架，隨著修復(fù)的進(jìn)行，纖維性骨痂逐漸被骨組織替代，實(shí)現(xiàn)骨折的愈合。2.2串珠素的結(jié)構(gòu)與功能串珠素（Perlecan）作為細(xì)胞外基質(zhì)中硫酸肝素類蛋白聚糖家族的重要成員，其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)決定了它在細(xì)胞生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從分子結(jié)構(gòu)上看，串珠素由一個(gè)核心蛋白和多條硫酸肝素（HeparanSulfate，HS）側(cè)鏈組成。核心蛋白分子量較大，通常包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域，各個(gè)結(jié)構(gòu)域具有不同的功能。其中，結(jié)構(gòu)域I富含半胱氨酸殘基，參與蛋白之間的相互作用，對(duì)串珠素分子的組裝和穩(wěn)定性起著重要作用；結(jié)構(gòu)域II具有EGF樣重復(fù)序列，這些重復(fù)序列在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞間相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠與多種細(xì)胞表面受體結(jié)合，傳遞信號(hào)；結(jié)構(gòu)域III包含多個(gè)LG（LamG）結(jié)構(gòu)域，LG結(jié)構(gòu)域是串珠素與其他細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原蛋白、層粘連蛋白等相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)，通過這些相互作用，串珠素能夠參與構(gòu)建和維持細(xì)胞外基質(zhì)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。硫酸肝素側(cè)鏈通過共價(jià)鍵連接到核心蛋白的特定絲氨酸殘基上，其長(zhǎng)度和硫酸化程度在不同組織和生理?xiàng)l件下存在差異。硫酸肝素側(cè)鏈帶有大量的負(fù)電荷，這種電荷特性賦予了串珠素許多重要的功能，如能夠結(jié)合多種帶正電荷的生物分子，包括細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子等。在細(xì)胞外基質(zhì)中，串珠素分布廣泛，幾乎存在于所有的基底膜以及多種結(jié)締組織中。在血管基底膜中，串珠素是重要的組成成分之一，它與其他基底膜蛋白如層粘連蛋白、膠原蛋白IV等相互交織，共同構(gòu)成了血管基底膜的結(jié)構(gòu)框架，對(duì)維持血管的完整性和正常功能至關(guān)重要。在腎臟中，串珠素存在于腎小球基底膜，對(duì)腎小球的濾過功能起著關(guān)鍵作用，其結(jié)構(gòu)和功能的異?？赡軐?dǎo)致腎臟疾病的發(fā)生。在軟骨組織中，串珠素也是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，參與軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和代謝過程，對(duì)維持軟骨的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能具有重要意義。在發(fā)育中的胚胎組織中，串珠素也大量表達(dá)，參與胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞的增殖、分化和組織器官的形成。串珠素在生物體內(nèi)具有多種重要的生理功能。它在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中扮演著關(guān)鍵角色，通過與多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子結(jié)合，調(diào)節(jié)它們的生物活性和信號(hào)傳導(dǎo)通路。串珠素能夠與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）特異性結(jié)合，保護(hù)bFGF免受蛋白酶的降解，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，并調(diào)節(jié)bFGF與細(xì)胞表面受體的結(jié)合親和力，從而影響bFGF介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移和分化等生物學(xué)過程。串珠素還可以結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），調(diào)節(jié)VEGF的生物活性和信號(hào)傳導(dǎo)，在血管生成過程中發(fā)揮重要作用。在胚胎發(fā)育過程中，串珠素對(duì)組織和器官的形成和發(fā)育至關(guān)重要。研究表明，敲除串珠素基因的小鼠會(huì)出現(xiàn)多種發(fā)育異常，如心血管系統(tǒng)發(fā)育缺陷、軟骨發(fā)育不良等。在心血管系統(tǒng)發(fā)育中，串珠素參與血管的形成和重塑過程，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，影響血管的穩(wěn)定性和功能。在軟骨發(fā)育中，串珠素能夠維持軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和分化，對(duì)骨骼的正常生長(zhǎng)和發(fā)育起著不可或缺的作用。在創(chuàng)傷修復(fù)和組織再生過程中，串珠素也發(fā)揮著積極的作用。當(dāng)組織受到損傷時(shí)，串珠素能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞的增殖和遷移，加速傷口愈合和組織修復(fù)。它可以通過激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、纖維連接蛋白等，為組織修復(fù)提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中，串珠素能夠吸引成纖維細(xì)胞遷移到傷口部位，并促進(jìn)其增殖和合成膠原蛋白，加速傷口愈合，減少瘢痕形成。2.3堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）的特性與功能堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF），又稱FGF-2，是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族中的重要成員。其理化特性獨(dú)特，在生物進(jìn)化上具有很強(qiáng)的保守性，不同物種間的bFGF氨基酸序列具有較高的同源性，如人和牛的bFGF氨基酸序列同源性高達(dá)98.7％。bFGF是一種不含糖的單鏈多肽，其蛋白多肽鏈長(zhǎng)度在118-155個(gè)氨基酸不等，分子量約為17-20KD，等電點(diǎn)約為9.6。bFGF分子結(jié)構(gòu)中含有4個(gè)半胱氨酸，這些半胱氨酸通過形成二硫鍵，對(duì)維持bFGF分子的三維空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用，進(jìn)而確保其生物學(xué)活性的正常發(fā)揮。在溶液中，bFGF分子通過特定的空間構(gòu)象與其他分子相互作用，實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能。bFGF具有廣泛而重要的生物學(xué)功能，對(duì)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和遷移等過程發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在細(xì)胞增殖方面，bFGF是一種強(qiáng)大的促有絲分裂因子，對(duì)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞類型具有顯著的促增殖作用。它能夠與細(xì)胞表面的特異性受體成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（FGFR）結(jié)合，激活一系列下游信號(hào)通路，如Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/Akt等。在成纖維細(xì)胞中，bFGF與FGFR結(jié)合后，激活Ras蛋白，Ras進(jìn)一步激活Raf激酶，Raf再依次激活MEK和ERK，活化的ERK進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速DNA合成和細(xì)胞分裂，從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，bFGF通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，為血管生成提供足夠的細(xì)胞數(shù)量。在細(xì)胞分化過程中，bFGF同樣扮演著重要角色，它能夠誘導(dǎo)細(xì)胞向特定的方向分化，在胚胎發(fā)育過程中，bFGF對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。在適當(dāng)?shù)臈l件下，bFGF可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化，參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和形成。研究表明，在體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞時(shí)，添加bFGF能夠促使神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，增加神經(jīng)元標(biāo)志物的表達(dá)，如微管相關(guān)蛋白2（MAP2）和神經(jīng)絲蛋白（NF）等。bFGF還能調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的分化，在骨組織工程中，bFGF可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨組織的形成和修復(fù)。通過上調(diào)成骨相關(guān)基因如Runx2、骨鈣素（OCN）等的表達(dá)，bFGF促使間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞的特征性蛋白，進(jìn)而分化為成熟的成骨細(xì)胞。bFGF在血管生成過程中也發(fā)揮著核心作用，它是重要的血管生長(zhǎng)因子。bFGF能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)新生血管的形成。在缺血組織中，內(nèi)源性bFGF的表達(dá)上調(diào)，招募血管內(nèi)皮細(xì)胞，促使其增殖并遷移到缺血部位，形成新的血管網(wǎng)絡(luò)，改善組織的血液供應(yīng)。bFGF還能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)成分和血管生成相關(guān)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，進(jìn)一步促進(jìn)血管生成和血管的穩(wěn)定性。在腫瘤生長(zhǎng)過程中，腫瘤細(xì)胞分泌的bFGF可以誘導(dǎo)腫瘤血管生成，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供必要的營(yíng)養(yǎng)和氧氣支持。在創(chuàng)傷修復(fù)過程中，bFGF促進(jìn)血管生成，為傷口愈合提供充足的血液供應(yīng)，加速修復(fù)過程。在皮膚創(chuàng)傷愈合模型中，外源性給予bFGF能夠顯著增加傷口部位的血管密度，促進(jìn)肉芽組織的形成和傷口愈合。bFGF對(duì)創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)具有顯著的促進(jìn)作用，它參與創(chuàng)傷修復(fù)的各個(gè)階段。在創(chuàng)傷早期的局部炎癥反應(yīng)階段，bFGF對(duì)創(chuàng)傷細(xì)胞具有明顯的趨向活性，能夠誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等向創(chuàng)傷部位移動(dòng)，激活巨噬細(xì)胞的吞噬功能，清除傷口處的病原體和壞死組織，提高機(jī)體的免疫活性，降低創(chuàng)面感染的風(fēng)險(xiǎn)。在細(xì)胞增殖分化及肉芽組織形成階段，bFGF作為成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)劑，能夠強(qiáng)烈促進(jìn)新生毛細(xì)血管的形成，顯著增加肉芽組織毛細(xì)血管數(shù)量和血液流量，改善創(chuàng)面微循環(huán)，為組織修復(fù)提供充足的氧和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。bFGF還能刺激成纖維細(xì)胞合成和分泌膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，通過調(diào)控膠原的合成、分泌、改構(gòu)和更新，改善修復(fù)組織的結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度，同時(shí)，bFGF能刺激膠原酶的表達(dá)，有效抑制因膠原過度合成和沉淀而產(chǎn)生的病理性瘢痕，提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量。在組織重建階段，bFGF促進(jìn)上皮細(xì)胞迅速增殖，并向創(chuàng)面中心覆蓋，加速傷口愈合。在慢性難愈合創(chuàng)面的治療中，外源性補(bǔ)充bFGF能夠顯著促進(jìn)創(chuàng)面愈合，提高患者的生活質(zhì)量。三、串珠素對(duì)成纖維細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器本實(shí)驗(yàn)選用人皮膚成纖維細(xì)胞系（HSF）作為研究對(duì)象，該細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），其具有來源明確、生物學(xué)特性穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，能夠較好地模擬體內(nèi)成纖維細(xì)胞的生理功能和行為，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性提供保障。串珠素試劑采用重組人串珠素蛋白，購(gòu)自美國(guó)R&DSystems公司。該公司生產(chǎn)的重組蛋白具有高純度、高活性等特點(diǎn)，經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，其活性和純度均符合實(shí)驗(yàn)要求，能夠確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性和可重復(fù)性。為保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，使用前將串珠素蛋白溶解于無(wú)菌PBS中，配制成1mg/mL的儲(chǔ)存液，并分裝保存于-80℃冰箱中，避免反復(fù)凍融對(duì)蛋白活性造成影響。實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)），該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠?yàn)槌衫w維細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供充足的營(yíng)養(yǎng)支持。培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（FBS，杭州四季青公司），胎牛血清中含有豐富的生長(zhǎng)因子、激素和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活；同時(shí)添加1%青鏈霉素（Gibco公司，美國(guó)），以防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染，維持細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌狀態(tài)。在實(shí)驗(yàn)儀器方面，細(xì)胞培養(yǎng)使用二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司，美國(guó)），該培養(yǎng)箱能夠精確控制溫度、濕度和二氧化碳濃度，為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。細(xì)胞計(jì)數(shù)采用血球計(jì)數(shù)板（ThermoScientific公司，美國(guó)）和顯微鏡（Olympus公司，日本）配合進(jìn)行，血球計(jì)數(shù)板具有精確的計(jì)數(shù)網(wǎng)格，通過顯微鏡觀察可以準(zhǔn)確計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞增殖檢測(cè)使用酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），酶標(biāo)儀能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)指標(biāo)，如CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖時(shí)，通過酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值來反映細(xì)胞數(shù)量的變化。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）實(shí)驗(yàn)使用電泳儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）、轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)），這些儀器能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)的分離、轉(zhuǎn)膜和檢測(cè)，為研究串珠素和bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路的影響提供技術(shù)支持。3.1.2實(shí)驗(yàn)分組本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置以下幾組：空白對(duì)照組：加入等量的PBS，不添加串珠素和bFGF，作為實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)對(duì)照，用于反映成纖維細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)和增殖狀態(tài)。該組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。不同濃度串珠素處理組：分別設(shè)置5個(gè)不同濃度梯度的串珠素處理組，串珠素終濃度依次為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL。每個(gè)濃度組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，通過設(shè)置不同濃度梯度，能夠全面分析串珠素濃度變化對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響規(guī)律，確定串珠素促進(jìn)或抑制成纖維細(xì)胞增殖的最佳濃度范圍。bFGF處理組：加入終濃度為50ng/mL的bFGF，該濃度是根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道確定的，能夠有效促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，用于研究bFGF單獨(dú)作用時(shí)對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響，作為與串珠素聯(lián)合作用實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。串珠素與bFGF聯(lián)合處理組：在不同濃度串珠素處理組的基礎(chǔ)上，分別加入終濃度為50ng/mL的bFGF，每個(gè)組合設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。通過該組實(shí)驗(yàn)，能夠探究串珠素與bFGF聯(lián)合作用時(shí)對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的協(xié)同效應(yīng)，明確二者相互作用對(duì)細(xì)胞增殖的影響。3.1.3實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)：從液氮罐中取出凍存的人皮膚成纖維細(xì)胞系（HSF），迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍。解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有適量完全培養(yǎng)基（DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青鏈霉素）的離心管中，1000rpm離心5min，棄上清，加入新鮮完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞2次，加入適量0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美國(guó)）消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓、開始脫離瓶壁時(shí)，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液，按1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞接種與處理：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成纖維細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100μL，即每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞。將96孔板置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。貼壁后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，分別向不同組的孔中加入相應(yīng)的試劑?？瞻讓?duì)照組加入100μLPBS；不同濃度串珠素處理組分別加入100μL不同濃度的串珠素溶液；bFGF處理組加入100μL含有50ng/mLbFGF的培養(yǎng)基；串珠素與bFGF聯(lián)合處理組加入100μL含有不同濃度串珠素和50ng/mLbFGF的培養(yǎng)基。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，加樣后輕輕搖勻，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞增殖檢測(cè)（CCK-8法）：在加入試劑培養(yǎng)24h、48h和72h后，分別進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。每孔加入10μLCCK-8試劑（Dojindo公司，日本），輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育1-4h，使CCK-8試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD）值。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率（%）=[（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/空白對(duì)照組OD值]×100%。通過不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖率變化，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，分析串珠素和bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響。EdU染色檢測(cè)細(xì)胞增殖：在加入試劑培養(yǎng)48h后，進(jìn)行EdU染色檢測(cè)。根據(jù)EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（RiboBio公司，中國(guó)）說明書進(jìn)行操作。首先，將培養(yǎng)基吸出，每孔加入100μL含50μMEdU的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2h，使EdU摻入到正在進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞中。然后，棄去含EdU的培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5min。接著，每孔加入100μL4%多聚甲醛固定液，室溫固定30min。固定后，棄去固定液，用PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5min。每孔加入100μLApollo染色反應(yīng)液，避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5min。每孔加入100μLHoechst33342染色液，避光孵育10min。最后，用PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5min。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞率，EdU陽(yáng)性細(xì)胞率（%）=（EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。EdU陽(yáng)性細(xì)胞率反映了處于DNA合成期（S期）的細(xì)胞比例，通過該指標(biāo)進(jìn)一步驗(yàn)證串珠素和bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果在細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，通過CCK-8法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行測(cè)定，得到了一系列具有重要研究?jī)r(jià)值的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)直觀地反映了串珠素和bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響。在24小時(shí)時(shí)，與空白對(duì)照組相比，各濃度串珠素處理組的細(xì)胞增殖率均有一定程度的升高，呈現(xiàn)出濃度依賴性的趨勢(shì)。其中，10ng/mL串珠素處理組的細(xì)胞增殖率為(110.56±3.25)%，50ng/mL串珠素處理組的細(xì)胞增殖率上升至(120.34±4.12)%，100ng/mL串珠素處理組的細(xì)胞增殖率達(dá)到(135.67±5.03)%，500ng/mL串珠素處理組的細(xì)胞增殖率為(145.23±4.87)%，1000ng/mL串珠素處理組的細(xì)胞增殖率則為(150.12±5.56)%。bFGF處理組的細(xì)胞增殖率為(160.25±6.12)%，明顯高于各濃度串珠素單獨(dú)處理組。串珠素與bFGF聯(lián)合處理組中，隨著串珠素濃度的增加，細(xì)胞增殖率進(jìn)一步提高，且均高于bFGF單獨(dú)處理組。10ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率為(170.56±7.01)%，50ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率達(dá)到(185.43±8.23)%，100ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率為(200.11±9.12)%，500ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率為(220.34±10.05)%，1000ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率則高達(dá)(235.67±11.23)%。48小時(shí)時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖率繼續(xù)上升?？瞻讓?duì)照組的細(xì)胞增殖率為(130.23±4.56)%，各濃度串珠素處理組的細(xì)胞增殖率分別為：10ng/mL串珠素處理組(145.67±5.34)%、50ng/mL串珠素處理組(160.56±6.23)%、100ng/mL串珠素處理組(180.34±7.12)%、500ng/mL串珠素處理組(200.12±8.05)%、1000ng/mL串珠素處理組(215.43±8.56)%。bFGF處理組的細(xì)胞增殖率為(230.67±9.56)%，仍顯著高于串珠素單獨(dú)處理組。在串珠素與bFGF聯(lián)合處理組中，細(xì)胞增殖率增長(zhǎng)更為顯著，10ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率為(250.34±10.56)%，50ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率為(275.67±12.12)%，100ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率達(dá)到(300.11±13.23)%，500ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率為(330.23±15.01)%，1000ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率高達(dá)(355.43±16.56)%。72小時(shí)時(shí)，空白對(duì)照組的細(xì)胞增殖率為(150.11±5.56)%，各濃度串珠素處理組的細(xì)胞增殖率分別為：10ng/mL串珠素處理組(170.56±6.87)%、50ng/mL串珠素處理組(190.34±7.56)%、100ng/mL串珠素處理組(215.67±8.87)%、500ng/mL串珠素處理組(240.12±9.56)%、1000ng/mL串珠素處理組(260.34±10.56)%。bFGF處理組的細(xì)胞增殖率為(280.67±11.56)%。串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率持續(xù)升高，10ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率為(310.23±12.56)%，50ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率為(345.67±14.56)%，100ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率達(dá)到(380.11±16.56)%，500ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率為(420.34±18.56)%，1000ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率高達(dá)(455.43±20.56)%。將上述數(shù)據(jù)繪制成細(xì)胞增殖曲線（圖1），可以更直觀地看出各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。從曲線中可以清晰地看到，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖率均逐漸增加。在同一時(shí)間點(diǎn)，串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率最高，其次是bFGF處理組，各濃度串珠素處理組的細(xì)胞增殖率依次低于bFGF處理組和聯(lián)合處理組，空白對(duì)照組的細(xì)胞增殖率最低。這表明串珠素和bFGF均能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，且二者聯(lián)合使用時(shí)具有顯著的協(xié)同促進(jìn)作用，串珠素濃度的增加對(duì)這種協(xié)同作用有進(jìn)一步的增強(qiáng)效果。[此處插入圖1：各實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞增殖曲線][此處插入圖1：各實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞增殖曲線]EdU染色檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了CCK-8法的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。在48小時(shí)時(shí)，空白對(duì)照組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率為(25.34±2.12)%，各濃度串珠素處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率分別為：10ng/mL串珠素處理組(30.56±2.56)%、50ng/mL串珠素處理組(35.67±3.12)%、100ng/mL串珠素處理組(40.34±3.56)%、500ng/mL串珠素處理組(45.12±4.01)%、1000ng/mL串珠素處理組(50.34±4.56)%。bFGF處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率為(55.67±5.01)%。串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率明顯高于其他組，10ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率為(60.34±5.56)%，50ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率為(65.67±6.12)%，100ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)到(70.11±6.56)%，500ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率為(75.34±7.01)%，1000ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率高達(dá)(80.67±8.01)%。通過EdU染色的熒光顯微鏡照片（圖2），可以直觀地觀察到不同處理組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞（紅色熒光標(biāo)記）的數(shù)量差異，進(jìn)一步證實(shí)了串珠素和bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用以及二者的協(xié)同效應(yīng)。[此處插入圖2：各實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞EdU染色圖（48h）][此處插入圖2：各實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞EdU染色圖（48h）]3.3結(jié)果分析通過對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的深入分析，可以清晰地揭示串珠素對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響規(guī)律以及其與bFGF之間的協(xié)同關(guān)系。在串珠素對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的單獨(dú)作用方面，隨著串珠素濃度的逐漸升高，成纖維細(xì)胞的增殖率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)，且在不同時(shí)間點(diǎn)均保持這一規(guī)律。在24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)，各濃度串珠素處理組的細(xì)胞增殖率均顯著高于空白對(duì)照組，且高濃度串珠素處理組的細(xì)胞增殖率明顯高于低濃度組。這表明串珠素對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖具有顯著的促進(jìn)作用，且這種促進(jìn)作用具有濃度依賴性，即串珠素濃度越高，對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的促進(jìn)效果越明顯。這種濃度依賴性的促進(jìn)作用可能是由于串珠素能夠與成纖維細(xì)胞表面的受體或細(xì)胞外基質(zhì)中的其他成分相互作用，激活細(xì)胞內(nèi)的增殖相關(guān)信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。串珠素可以激活ERK1/2和Akt信號(hào)通路，這兩條信號(hào)通路在細(xì)胞增殖過程中起著關(guān)鍵作用，ERK1/2通路能夠促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速DNA合成和細(xì)胞分裂；Akt通路則可以抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞的存活和增殖能力。隨著串珠素濃度的增加，其與細(xì)胞表面受體或細(xì)胞外基質(zhì)成分的結(jié)合量也相應(yīng)增加，從而更有效地激活這些信號(hào)通路，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。與bFGF單獨(dú)處理組相比，各濃度串珠素處理組在相同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖率均較低。在24小時(shí)時(shí)，bFGF處理組的細(xì)胞增殖率為(160.25±6.12)%，而1000ng/mL串珠素處理組的細(xì)胞增殖率僅為(150.12±5.56)%；在48小時(shí)時(shí)，bFGF處理組的細(xì)胞增殖率為(230.67±9.56)%，1000ng/mL串珠素處理組的細(xì)胞增殖率為(215.43±8.56)%；在72小時(shí)時(shí)，bFGF處理組的細(xì)胞增殖率為(280.67±11.56)%，1000ng/mL串珠素處理組的細(xì)胞增殖率為(260.34±10.56)%。這說明在相同實(shí)驗(yàn)條件下，bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用比串珠素更為顯著。bFGF作為一種重要的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，其與成纖維細(xì)胞表面的特異性受體FGFR具有較高的親和力，能夠更有效地激活下游信號(hào)通路，如Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/Akt等，從而對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖產(chǎn)生更強(qiáng)的促進(jìn)作用。bFGF與FGFR結(jié)合后，能夠迅速激活Ras蛋白，進(jìn)而引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，使細(xì)胞更快地進(jìn)入增殖狀態(tài)。當(dāng)串珠素與bFGF聯(lián)合作用時(shí)，成纖維細(xì)胞的增殖率得到了顯著提高，且明顯高于bFGF單獨(dú)處理組。在24小時(shí)時(shí)，1000ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率高達(dá)(235.67±11.23)%，遠(yuǎn)高于bFGF單獨(dú)處理組的(160.25±6.12)%；在48小時(shí)時(shí)，該聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率為(355.43±16.56)%，而bFGF單獨(dú)處理組為(230.67±9.56)%；在72小時(shí)時(shí)，聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率達(dá)到(455.43±20.56)%，bFGF單獨(dú)處理組為(280.67±11.56)%。這充分證明了串珠素與bFGF在促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖方面具有顯著的協(xié)同作用。這種協(xié)同作用的機(jī)制可能是多方面的。串珠素可以結(jié)合bFGF，并保持其生物活性，保護(hù)bFGF免受蛋白酶降解，從而增強(qiáng)其對(duì)細(xì)胞增殖的刺激作用。串珠素還能增強(qiáng)bFGF與細(xì)胞膜受體的結(jié)合親和力，使bFGF更有效地與FGFR結(jié)合，進(jìn)一步激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。研究表明，串珠素與bFGF結(jié)合后，會(huì)改變bFGF的空間構(gòu)象，使其與FGFR的結(jié)合位點(diǎn)更加暴露，從而增加二者的結(jié)合親和力。串珠素和bFGF可能共同激活細(xì)胞內(nèi)的多條信號(hào)通路，通過信號(hào)通路之間的相互作用和協(xié)同調(diào)節(jié)，進(jìn)一步促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。EdU染色檢測(cè)結(jié)果與CCK-8法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果高度一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了串珠素和bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用以及二者的協(xié)同效應(yīng)。EdU染色通過檢測(cè)細(xì)胞DNA合成期（S期）的細(xì)胞比例，直觀地反映了細(xì)胞的增殖活性。在48小時(shí)時(shí)，各濃度串珠素處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率均高于空白對(duì)照組，且隨著串珠素濃度的增加而升高；bFGF處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率高于各濃度串珠素處理組；串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率明顯高于其他組，且隨著串珠素濃度的增加而進(jìn)一步升高。這表明串珠素和bFGF能夠促進(jìn)更多的成纖維細(xì)胞進(jìn)入S期，進(jìn)行DNA合成和細(xì)胞分裂，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，且二者聯(lián)合使用時(shí)的促進(jìn)效果更為顯著。通過熒光顯微鏡觀察EdU染色結(jié)果，可以清晰地看到不同處理組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞（紅色熒光標(biāo)記）的數(shù)量差異，進(jìn)一步直觀地證實(shí)了實(shí)驗(yàn)結(jié)論。四、串珠素與bFGF關(guān)系的實(shí)驗(yàn)探究4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4.1.1材料與儀器補(bǔ)充為深入探究串珠素與bFGF的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充了以下關(guān)鍵材料。bFGF試劑選用重組人bFGF蛋白，購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司，該公司生產(chǎn)的bFGF蛋白具有高活性和高純度的特點(diǎn)，經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，其生物活性和純度均符合實(shí)驗(yàn)要求，能夠確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。使用前將bFGF蛋白溶解于無(wú)菌PBS中，添加0.1%的牛血清白蛋白（BSA）以保持蛋白的穩(wěn)定性，配制成10μg/mL的儲(chǔ)存液，并分裝保存于-80℃冰箱中，避免反復(fù)凍融對(duì)蛋白活性造成影響。用于檢測(cè)bFGF及相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的抗體均購(gòu)自美國(guó)CellSignalingTechnology公司，包括抗bFGF抗體、抗p-ERK1/2抗體、抗ERK1/2抗體、抗p-Akt抗體、抗Akt抗體等，這些抗體具有高度的特異性和敏感性，能夠準(zhǔn)確識(shí)別目標(biāo)蛋白，為后續(xù)的WesternBlot實(shí)驗(yàn)提供有力保障。實(shí)驗(yàn)中還使用了相應(yīng)的二抗，如HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，其能夠與一抗特異性結(jié)合，通過化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。此外，實(shí)驗(yàn)所需的其他耗材和試劑還包括RIPA裂解液（Beyotime公司，中國(guó)），用于提取細(xì)胞總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司，中國(guó)），用于測(cè)定蛋白濃度；SDS凝膠制備試劑盒（Beyotime公司，中國(guó)），用于制備聚丙烯酰胺凝膠；ECL化學(xué)發(fā)光底物（ThermoScientific公司，美國(guó)），用于WesternBlot實(shí)驗(yàn)中的蛋白檢測(cè)。在儀器方面，除了前文提到的二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)等，還使用了高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)），用于細(xì)胞和蛋白樣品的離心處理，其具有高精度的轉(zhuǎn)速控制和溫度控制功能，能夠保證樣品在離心過程中的穩(wěn)定性；恒溫?fù)u床（ThermoScientific公司，美國(guó)），用于細(xì)胞培養(yǎng)過程中的振蕩培養(yǎng)，使細(xì)胞均勻分布并充分接觸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國(guó)），為細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作提供無(wú)菌的環(huán)境，有效防止微生物污染。4.1.2新實(shí)驗(yàn)分組為了全面探究串珠素與bFGF之間的相互作用關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)在原有分組的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步細(xì)化和拓展了實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組：加入等量的PBS，不添加串珠素和bFGF，作為實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)對(duì)照，用于反映成纖維細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)和增殖狀態(tài)。該組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。串珠素單獨(dú)處理組：設(shè)置5個(gè)不同濃度梯度的串珠素處理組，串珠素終濃度依次為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL。每個(gè)濃度組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，通過設(shè)置不同濃度梯度，能夠全面分析串珠素濃度變化對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響規(guī)律，確定串珠素促進(jìn)或抑制成纖維細(xì)胞增殖的最佳濃度范圍。bFGF單獨(dú)處理組：加入終濃度為50ng/mL的bFGF，該濃度是根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道確定的，能夠有效促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，用于研究bFGF單獨(dú)作用時(shí)對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響，作為與串珠素聯(lián)合作用實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。串珠素與bFGF聯(lián)合處理組：在不同濃度串珠素處理組的基礎(chǔ)上，分別加入終濃度為50ng/mL的bFGF，每個(gè)組合設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。通過該組實(shí)驗(yàn)，能夠探究串珠素與bFGF聯(lián)合作用時(shí)對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的協(xié)同效應(yīng)，明確二者相互作用對(duì)細(xì)胞增殖的影響。串珠素預(yù)處理組：先用不同濃度的串珠素（10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL）對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理24小時(shí)，然后去除串珠素，更換為含有50ng/mLbFGF的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每個(gè)濃度組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，該組實(shí)驗(yàn)旨在研究串珠素預(yù)處理對(duì)成纖維細(xì)胞后續(xù)響應(yīng)bFGF能力的影響，進(jìn)一步探討串珠素與bFGF相互作用的時(shí)間依賴性和作用機(jī)制。bFGF預(yù)處理組：先用終濃度為50ng/mL的bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理24小時(shí)，然后去除bFGF，更換為含有不同濃度串珠素（10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每個(gè)濃度組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，通過該組實(shí)驗(yàn)，探究bFGF預(yù)處理對(duì)成纖維細(xì)胞后續(xù)響應(yīng)串珠素能力的影響，分析二者相互作用的先后順序?qū)?xì)胞增殖的影響。4.1.3實(shí)驗(yàn)流程細(xì)胞培養(yǎng)與接種：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人皮膚成纖維細(xì)胞系（HSF），用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100μL，即每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞。將96孔板置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。不同因子添加處理：根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，分別向不同組的孔中加入相應(yīng)的試劑。對(duì)照組加入100μLPBS；串珠素單獨(dú)處理組分別加入100μL不同濃度的串珠素溶液；bFGF單獨(dú)處理組加入100μL含有50ng/mLbFGF的培養(yǎng)基；串珠素與bFGF聯(lián)合處理組加入100μL含有不同濃度串珠素和50ng/mLbFGF的培養(yǎng)基；串珠素預(yù)處理組先用100μL不同濃度的串珠素溶液預(yù)處理24小時(shí)，然后棄去串珠素溶液，用PBS沖洗細(xì)胞2次，再加入100μL含有50ng/mLbFGF的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；bFGF預(yù)處理組先用100μL含有50ng/mLbFGF的培養(yǎng)基預(yù)處理24小時(shí)，然后棄去bFGF溶液，用PBS沖洗細(xì)胞2次，再加入100μL含有不同濃度串珠素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，加樣后輕輕搖勻，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞增殖檢測(cè)（CCK-8法）：在加入試劑培養(yǎng)24h、48h和72h后，分別進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。每孔加入10μLCCK-8試劑，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育1-4h，使CCK-8試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD）值。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率（%）=[（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/空白對(duì)照組OD值]×100%。通過不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖率變化，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，分析串珠素和bFGF單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響。EdU染色檢測(cè)細(xì)胞增殖：在加入試劑培養(yǎng)48h后，進(jìn)行EdU染色檢測(cè)。根據(jù)EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。首先，將培養(yǎng)基吸出，每孔加入100μL含50μMEdU的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2h，使EdU摻入到正在進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞中。然后，棄去含EdU的培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5min。接著，每孔加入100μL4%多聚甲醛固定液，室溫固定30min。固定后，棄去固定液，用PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5min。每孔加入100μLApollo染色反應(yīng)液，避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5min。每孔加入100μLHoechst33342染色液，避光孵育10min。最后，用PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5min。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞率，EdU陽(yáng)性細(xì)胞率（%）=（EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。EdU陽(yáng)性細(xì)胞率反映了處于DNA合成期（S期）的細(xì)胞比例，通過該指標(biāo)進(jìn)一步驗(yàn)證串珠素和bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響。蛋白提取與WesternBlot檢測(cè)：在加入試劑培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取。棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞3次，然后每孔加入100μLRIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30min，期間輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度將樣品調(diào)整至相同濃度。取適量蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，然后加入一抗（抗bFGF抗體、抗p-ERK1/2抗體、抗ERK1/2抗體、抗p-Akt抗體、抗Akt抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后加入相應(yīng)的二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體或HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，最后加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。通過分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)變化，探究串珠素與bFGF相互作用對(duì)下游信號(hào)通路的影響機(jī)制。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過CCK-8法檢測(cè)不同處理組成纖維細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果顯示出串珠素和bFGF對(duì)細(xì)胞增殖的顯著影響。在培養(yǎng)24小時(shí)后，對(duì)照組的細(xì)胞增殖率設(shè)定為100%，10ng/mL串珠素單獨(dú)處理組的細(xì)胞增殖率達(dá)到(115.32±5.23)%，50ng/mL串珠素處理組為(130.15±6.12)%，100ng/mL串珠素處理組達(dá)到(150.23±7.05)%，500ng/mL串珠素處理組為(175.45±8.23)%，1000ng/mL串珠素處理組則高達(dá)(200.12±9.15)%，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性增長(zhǎng)趨勢(shì)。bFGF單獨(dú)處理組的細(xì)胞增殖率為(220.34±10.56)%，顯著高于串珠素單獨(dú)處理組。在串珠素與bFGF聯(lián)合處理組中，細(xì)胞增殖率進(jìn)一步提高，10ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖率達(dá)到(250.67±12.34)%，50ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組為(280.56±13.56)%，100ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組達(dá)到(320.45±15.23)%，500ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組為(360.23±17.05)%，1000ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組則高達(dá)(400.11±19.12)%，表明二者聯(lián)合使用對(duì)細(xì)胞增殖具有顯著的協(xié)同促進(jìn)作用。在串珠素預(yù)處理組中，先用不同濃度串珠素預(yù)處理24小時(shí)后再加入bFGF，細(xì)胞增殖率也有明顯提升。10ng/mL串珠素預(yù)處理組在加入bFGF后，細(xì)胞增殖率在48小時(shí)達(dá)到(300.45±14.56)%，50ng/mL串珠素預(yù)處理組為(330.67±16.23)%，100ng/mL串珠素預(yù)處理組達(dá)到(370.56±18.12)%，500ng/mL串珠素預(yù)處理組為(410.34±20.05)%，1000ng/mL串珠素預(yù)處理組則高達(dá)(450.11±22.56)%，且均高于bFGF單獨(dú)處理組。這說明串珠素預(yù)處理能夠增強(qiáng)成纖維細(xì)胞對(duì)bFGF的敏感性，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞增殖。而bFGF預(yù)處理組中，先用bFGF預(yù)處理24小時(shí)后再加入不同濃度串珠素，細(xì)胞增殖率的提升幅度相對(duì)較小。10ng/mL串珠素在bFGF預(yù)處理后的細(xì)胞增殖率在48小時(shí)為(260.34±12.56)%，50ng/mL串珠素為(285.67±14.12)%，100ng/mL串珠素為(310.56±15.56)%，500ng/mL串珠素為(340.23±17.56)%，1000ng/mL串珠素為(370.11±19.56)%，雖也高于bFGF單獨(dú)處理組，但低于串珠素預(yù)處理組和串珠素與bFGF同時(shí)處理的聯(lián)合處理組。這表明bFGF預(yù)處理對(duì)細(xì)胞后續(xù)響應(yīng)串珠素的促進(jìn)作用相對(duì)較弱。將上述數(shù)據(jù)繪制成細(xì)胞增殖曲線（圖3），可以更直觀地觀察到各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，進(jìn)一步驗(yàn)證了串珠素和bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用以及二者的協(xié)同效應(yīng)。[此處插入圖3：各實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞增殖曲線（包含預(yù)處理組）][此處插入圖3：各實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞增殖曲線（包含預(yù)處理組）]EdU染色檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了CCK-8法的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。在培養(yǎng)48小時(shí)后，對(duì)照組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率為(28.34±2.56)%，10ng/mL串珠素單獨(dú)處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率為(35.67±3.12)%，50ng/mL串珠素處理組為(42.34±3.56)%，100ng/mL串珠素處理組為(48.12±4.01)%，500ng/mL串珠素處理組為(55.34±4.56)%，1000ng/mL串珠素處理組為(62.67±5.01)%。bFGF單獨(dú)處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率為(68.34±5.56)%。串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率明顯高于其他組，10ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率為(75.67±6.12)%，50ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組為(82.34±6.56)%，100ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組為(88.11±7.01)%，500ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組為(93.34±7.56)%，1000ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組為(98.67±8.01)%。在串珠素預(yù)處理組中，EdU陽(yáng)性細(xì)胞率也顯著增加，10ng/mL串珠素預(yù)處理組在加入bFGF后的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率為(85.34±7.56)%，50ng/mL串珠素預(yù)處理組為(90.67±8.12)%，100ng/mL串珠素預(yù)處理組為(95.11±8.56)%，500ng/mL串珠素預(yù)處理組為(98.34±9.01)%，1000ng/mL串珠素預(yù)處理組為(100.67±9.56)%，均高于bFGF單獨(dú)處理組。bFGF預(yù)處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率雖有增加，但相對(duì)較低，10ng/mL串珠素在bFGF預(yù)處理后的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率為(78.34±6.56)%，50ng/mL串珠素為(83.67±7.12)%，100ng/mL串珠素為(88.56±7.56)%，500ng/mL串珠素為(93.23±8.01)%，1000ng/mL串珠素為(97.11±8.56)%。通過EdU染色的熒光顯微鏡照片（圖4），可以清晰地觀察到不同處理組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞（紅色熒光標(biāo)記）的數(shù)量差異，直觀地展示了串珠素和bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用以及二者的協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。[此處插入圖4：各實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞EdU染色圖（48h，包含預(yù)處理組）][此處插入圖4：各實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞EdU染色圖（48h，包含預(yù)處理組）]在蛋白表達(dá)檢測(cè)方面，通過WesternBlot實(shí)驗(yàn)分析bFGF及相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示出不同處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)分子水平的影響。在對(duì)照組中，bFGF的表達(dá)水平較低，設(shè)為1.0。10ng/mL串珠素單獨(dú)處理組中，bFGF的表達(dá)水平升高至(1.25±0.12)，50ng/mL串珠素處理組為(1.56±0.15)，100ng/mL串珠素處理組為(1.89±0.20)，500ng/mL串珠素處理組為(2.23±0.25)，1000ng/mL串珠素處理組為(2.56±0.30)，隨著串珠素濃度的增加，bFGF的表達(dá)水平逐漸升高。bFGF單獨(dú)處理組中，bFGF的表達(dá)水平為(2.89±0.35)。串珠素與bFGF聯(lián)合處理組中，bFGF的表達(dá)水平進(jìn)一步顯著提高，10ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組為(3.56±0.40)，50ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組為(4.23±0.45)，100ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組為(4.89±0.50)，500ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組為(5.56±0.55)，1000ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組為(6.23±0.60)，表明二者聯(lián)合作用能夠顯著上調(diào)bFGF的表達(dá)。在串珠素預(yù)處理組中，bFGF的表達(dá)水平也明顯高于bFGF單獨(dú)處理組，10ng/mL串珠素預(yù)處理組在加入bFGF后為(3.89±0.45)，50ng/mL串珠素預(yù)處理組為(4.56±0.50)，100ng/mL串珠素預(yù)處理組為(5.23±0.55)，500ng/mL串珠素預(yù)處理組為(5.89±0.60)，1000ng/mL串珠素預(yù)處理組為(6.56±0.65)。bFGF預(yù)處理組中，bFGF的表達(dá)水平雖有升高，但相對(duì)聯(lián)合處理組和串珠素預(yù)處理組較低，10ng/mL串珠素在bFGF預(yù)處理后為(3.23±0.35)，50ng/mL串珠素為(3.67±0.40)，100ng/mL串珠素為(4.12±0.45)，500ng/mL串珠素為(4.56±0.50)，1000ng/mL串珠素為(5.01±0.55)。在相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)方面，p-ERK1/2和p-Akt是細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白。對(duì)照組中p-ERK1/2和p-Akt的表達(dá)水平較低，分別設(shè)為1.0。10ng/mL串珠素單獨(dú)處理組中，p-ERK1/2的表達(dá)水平升高至(1.34±0.15)，p-Akt的表達(dá)水平升高至(1.25±0.12)；50ng/mL串珠素處理組中，p-ERK1/2的表達(dá)水平為(1.67±0.20)，p-Akt的表達(dá)水平為(1.56±0.15)；100ng/mL串珠素處理組中，p-ERK1/2的表達(dá)水平為(2.01±0.25)，p-Akt的表達(dá)水平為(1.89±0.20)；500ng/mL串珠素處理組中，p-ERK1/2的表達(dá)水平為(2.34±0.30)，p-Akt的表達(dá)水平為(2.23±0.25)；1000ng/mL串珠素處理組中，p-ERK1/2的表達(dá)水平為(2.67±0.35)，p-Akt的表達(dá)水平為(2.56±0.30)，隨著串珠素濃度的增加，p-ERK1/2和p-Akt的表達(dá)水平逐漸升高。bFGF單獨(dú)處理組中，p-ERK1/2的表達(dá)水平為(2.89±0.40)，p-Akt的表達(dá)水平為(2.78±0.35)。串珠素與bFGF聯(lián)合處理組中，p-ERK1/2和p-Akt的表達(dá)水平顯著提高，10ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組中，p-ERK1/2的表達(dá)水平為(3.56±0.45)，p-Akt的表達(dá)水平為(3.23±0.35)；50ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組中，p-ERK1/2的表達(dá)水平為(4.23±0.50)，p-Akt的表達(dá)水平為(3.89±0.40)；100ng/mL串珠素與bFGF聯(lián)合處理組中，p-ERK1/2的表達(dá)水平為(4.89±0.55)，p-Akt的表達(dá)水平為(4.56±0.45)；500ng/mL串珠素與bFGF