脊髓灰質炎病毒型內鑒定規(guī)程Codeofpracticeforintratypicdifferentiationo2023-07-20發(fā)布2023-09-20實施新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件由新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心提出。本文件由新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會歸口。本文件起草單位：新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心、新疆維吾爾自治區(qū)標準化研究院。不都熱依木、翟嘯虎、沙吾拉西·熱加甫、朱蕓、王唯佳。本文件實施應用中的疑問，請咨詢新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心。對本文件的修改意見建議，請反饋至新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會(烏魯木齊市天山區(qū)龍泉街191號)、新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心(新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市天山區(qū)堿泉一街380號)、新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局(烏魯木齊市新華南路167號)。新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會聯(lián)系電話傳真郵編：830000新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心聯(lián)系電話傳真郵編：新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局聯(lián)系電話傳真郵編：830000本文件規(guī)定了脊髓灰質炎病毒(PolioVirus,PV)型內鑒定(IntratypicDifferentiation,ITD)僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的型內鑒定intratypicdifferentiation,ITD編碼區(qū)核苷酸變異<5個，則稱為疫苗類似株。疫苗衍生脊灰病毒vaccunederiv與原始疫苗病毒Sabin株相比，I型和Ⅲ型脊灰病毒VP1編碼區(qū)核苷酸變異≥10個，且<135個(變異率≥1%,且<15%);Ⅱ型脊灰病毒VP1編碼區(qū)核苷酸變異≥6個，且<135個(變異率>0.6%,且<15%),則稱為疫苗衍生脊灰病毒。工2與原始疫苗病毒Sabin株相比，當脊灰病毒VP1編碼區(qū)核苷酸變異≥135個(變異率≥15%),則稱為脊灰野病毒。疫苗衍生脊灰病毒篩查VDPVscreening對鑒定為疫苗類似株的脊灰病毒進行進疫苗衍生脊灰病毒的篩查。4鑒定規(guī)程4.1鑒定對象脊灰病毒。4.2鑒定對象來源急性弛緩性麻痹病例監(jiān)測系統(tǒng)病例和接觸者糞便標本、特定條件下采集的健康兒童糞便標本或外環(huán)境污水標本。4.3鑒定程序脊灰病毒型內鑒定程序見圖1。做VDPV篩查圖1脊灰病毒型內鑒定程序4.4鑒定方法4.4.1脊髓灰質炎實驗室網絡進行脊灰病毒的型內鑒定多采用的是rRT-PCR方法。包括ITDrRT-PCR和VDPVrRT-PCR,可對脊髓灰質炎病毒進行血清型和基因型的鑒定。4.4.2根據兩者檢測的目的不同，設計了多套不同的引物(見附錄A)和探針，每套引物和探針均高度特異對應于不同血清型和基因型的病毒檢測，不同引物和探針既可用于3種血清型病毒單獨檢測，也可用于3種混合血清型病毒的同時檢測，使用更加靈活，并且單獨檢測與同時檢測效果沒有顯著差異。4.4.3ITDrRT-PCR結果為疫苗類似株時，需要進行下一步的VDPV篩查。596孔板的合理使用及布局簡介ITDrRT-PCR時，在96孔板上，第1、7列、2、8列、3、9列、4、10列、5、11列、6、12列分別做PV2、WPV3-1、WPV3-2引物和探針的鑒定，A1～A6為試劑盒陰性對照，B2～B6為試劑盒陽性對照，C1~3C6為標本1,D1~D6為標本2……·依次類推，即每份標本要同時做組(含10對)引物的鑒定，每塊96孔板可鑒定14份標本，96孔板的布局示意圖見圖2。標本10標本25標本11標本12標本41標本13標本5標本1BF2圖296孔板的布局示意圖696孔板的陰、陽性判定6.1脊髓灰質炎病毒型內鑒定在熒光定量PCR系統(tǒng)上鑒定(儀器使用方法參照儀器使用說明書),試劑配置方法和擴增條件按試劑盒說明書進行。待測反應孔檢測結果若循環(huán)閾值(Cyclethreshold,Ct)≤28,曲線呈S型且有明顯指數增長期，則判斷該孔為陽性(+)(陽性擴增曲線示意圖見圖3)。0十圖3陽性(+)擴增曲線示意圖46.2若28<Ct<32,就需要提取樣本核酸，進行重新檢測。如重讀結果Ct值仍然在28～32范圍，曲線呈S型且有明顯指數增長期，則判斷該孔為陽性(+),否則判斷為陰性(一)(陰性擴增曲線示意圖見圖4);若Ct>38或未檢出，則該孔判斷為陰性(一)。圖4陰性(一)擴增曲線示意圖7最終結果的判定規(guī)則7.1同一個標本不同引物鑒定出的陰性或陽性結果有標準的表述規(guī)則，脊灰病毒型內鑒定結果表述規(guī)則見附錄B。7.2結合ITDrRT-PCR和VDPVrRT-PCR的結果形成最終的結果判定，脊灰病毒型內鑒定結果判定規(guī)則見附錄C。5(資料性)引物名稱/中文釋義包含的引物/中文釋義SOASWPV1/非洲分支I型野病毒引物6(資料性)出現結果的情形結果表述I型疫苗類似株和(或)Ⅲ型疫苗類似株I型非疫苗類似株和(或)Ⅲ型非疫苗類似株Ⅱ型脊灰病毒性不確定的非脊灰腸道病毒無效的非腸道病毒1型疫苗類似株或(和)Ⅲ型疫苗類似株1型非疫苗類似株或(和)Ⅲ型非疫苗類似株注：脊灰病毒型內鑒定的結果表述規(guī)則會根據消滅脊灰進展的實際情況而改7(資料性)脊灰病毒型內鑒定結果判定規(guī)則脊灰病毒型內鑒定結果判定規(guī)則見表C.1。表C.1脊灰病毒型內鑒定結果判定規(guī)則ITD結果表述ITD結果判定最終結果判定直接報告直接報告不做疫苗衍生脊灰病毒一非脊灰腸道病毒直接報告不做疫苗