1草莓尖孢鐮刀菌環(huán)介導等溫擴增（LAMP）快速檢測規(guī)程本標準規(guī)定了草莓中尖孢鐮刀菌環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)快速檢測規(guī)程。本標準適用于草莓病株中尖孢鐮刀菌的快速檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。T/WSWXH002-2022新疆主要果樹和防護林腐爛病菌檢測技術(shù)規(guī)程WS233-2002微生物和生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則SN/T3767.27-2014出口食品中轉(zhuǎn)基因成分環(huán)介導等溫擴增（LAMP）檢測方法SNT2965-2011植物病原真菌分子生物學檢測規(guī)范GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法DB22/T1820-2013糧食中串珠鐮刀菌的PCR檢測3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)：一種新型、快捷方便、靈敏度極高且廉價的核酸擴增方法。它依靠一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶與2對特殊設(shè)計的引物，在等溫條件下即可高效快速地完成擴增反應(yīng)。4原理2根據(jù)尖孢鐮刀菌特有的rDNA基因間間隔區(qū)IGS（intergenicspacer）序列（附錄A）設(shè)計特有的兩對內(nèi)外引物和一條環(huán)引物，即內(nèi)引物（FIP和BIP）、外引物（F3和B3）和環(huán)引物Loop組成，特異性識別靶序列上的五個獨立區(qū)域，利用IGS基因設(shè)計的LAMP引物具有特異性，能夠特異性識別草莓尖孢鐮刀菌，而不能識別其它鐮刀菌株。5儀器和設(shè)備試驗用部分儀器和設(shè)備符合SN/T3767.27-2014的要求，除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其它設(shè)備和耗材如下：冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、振蕩器、電子天平、高速離心機、水浴鍋、PCR擴增儀、微量移液、PCR反應(yīng)管。6試劑和材料除有特殊說明外，實驗所用試劑均為分析純或符合生化試劑標準；實驗用水應(yīng)符合GB/T6682-2008中一級水的要求。培養(yǎng)基制備按照T/WSWXH002-2022中的規(guī)定執(zhí)行，試劑按照WS233-2002和SN/T3767.27-2014中規(guī)定執(zhí)行。主要試劑：SYBRGreenI染料、PDA培養(yǎng)基、甜菜堿、MgSO4（50mmol/L）、BstDNA聚合酶（BstDNApolymerase）、10×BstDNA聚合酶緩沖液、無菌去離子水、dNTPs（10mmol/L）、LAMP引物（見材料：本標準用做陽性菌株為尖孢鐮刀菌菌株，陰性菌株為非尖孢鐮刀菌的其它病原菌菌株。7實驗步驟7.1樣品的制備和模板DNA獲得7.1.1病原菌基因組DNA的提?。簶悠凡≡?附錄C）的制備規(guī)范按照SNT2965-2011中執(zhí)行，挑取PDA平板培養(yǎng)的適量（2.0mg）病原菌菌絲，采用病原菌DNA提取試劑盒提取病原真菌基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?.1.2土壤基因組DNA提?。篜D液體培養(yǎng)基培養(yǎng)病原菌，待2～3天產(chǎn)孢，將經(jīng)血球計數(shù)板計數(shù)后的5×107個分生孢子與1g滅菌后的營養(yǎng)土混合，用土壤基因組DNA快速抽提試劑盒提取含病原菌分生孢子的土壤基因組DNA，未接孢子的滅菌營養(yǎng)土DNA作為空白對照。37.1.3發(fā)病草莓植株組織DNA的提?。簩⑾竞蟮挠社牭毒鸬目菸〔葺≈耆~片(50～100mg）置于液氮中充分研磨，并轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管中，用植物基因組DNA提取試劑盒提取植物病株基因組DNA，用本方法提取健康草莓植株組織DNA作為空白對照。7.2DNA濃度測定參照DB22/T1820-2013執(zhí)行。7.3空白對照、陰性對照、陽性對照設(shè)置試樣檢測過程應(yīng)同時設(shè)置陰性對照、陽性對照和空白對照。陰性對照為非尖孢鐮刀菌菌株DNA；空白對照設(shè)為以無菌去離子水替代DNA模板；陽性對照為尖孢鐮刀菌，根據(jù)試驗條件，選擇7.1步驟中的方法之一提取基因組DNA作為模板。7.4環(huán)介導等溫擴增檢測7.4.1LAMP反應(yīng)體系的配制LAMP反應(yīng)體系(25μL)包括:內(nèi)引物FIP和BIP、外引物F3和B3、環(huán)引物LB，MgSO4、脫氧核糖核苷酸(dNTPs)、甜菜堿、DNA模板、10×BstDNABuffer、BstDNA聚合酶，DNA(10ng～10ng×10-5)，無菌去離子水補足體系。反應(yīng)體系見附錄D。7.4.2反應(yīng)條件可根據(jù)實驗條件選擇水浴鍋或者PCR擴增儀，在65℃恒溫條件下,采用優(yōu)化的LAMP體系擴增45min。8結(jié)果觀察反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)管取出加入0.5μLSYBRGreenI（1000×)染料顯色劑觀察顯色。9結(jié)果判定和表述9.1空白對照管和陰性對照管反應(yīng)液呈橙色，陽性對照管反應(yīng)液呈綠色，檢測條件成立，反之本次實驗9.2樣品反應(yīng)管中液體呈橙色，被檢植株未檢出尖孢鐮刀菌；樣品反應(yīng)管中液體呈綠色，說明被檢植株中尖孢鐮刀菌確認為陽性（見附錄E）。（資料性）尖孢鐮刀菌IGS靶基因序列GCGGAATGGGAAGTCGATTCTCGGCTGGCGGATCTGACACTGTCGAAACGAGATGCGAGTGGTGTAGGGTAGGCTAGTTTCGTCCTCGCCAGGTTGCGATTTGGACGAGATATGTGGTCTAGGGTATGCTCTAGGGTAAGTAGAATTCGAGTTTCGTCGCCGACAGTTTTCTGTGGGTGTATGGTAGGTACAGGGTAGGCAAATCTCTCTCCGGCCGGTACTTGTCTGGTGGTCGTGAGTCGATTTTTTTGTTTTGCCATACTATTGAATTTTGCGGAAATTCAAAAGTGGCTCGGGAGTCCCGCCTGGCGTGCGTCCGACTCGAACATCGTCGGTGTACATATGAGAGGGAGTAATCCGGCCCGGCCGGGGCCCATCGCGAGCTGCCGGGTAGGTAAAAGTAAAAAAGTTGTTAAGAGGCGCGGTGTCGGCGTGCTTGTATTTGCGGGAGAGAATTATCTGGAGGTGCTGGGTAGCCGGGAAGACTTGGACGGATCTGGCCCGGGAATGGGTCTGGGCCTGGATTCTGGTGTGGTGTAGGATAAGCGTAGATAGATGAGTGGTCTAGGGTAGATACAGGGTAGCCAGAAGTCTGGTATATAGTATGGGGGTGTAGGGTAGGTCTGGACACCGTTTTCCACTTCGCCCTTCCCTTTACTCGAGGGAGGACGATCTTGGCTGGGATGGAGGTGTAGGGTAGGCTTAATTTACGATTACATGATCTGTGTCACTCTAGGGTAGGTGAAAATCCCATATATATCTGATCACATTTGGTGAAGAGGTGGTTTGGCTGGTGAGATGGACAAAAGTGCAATGTAGAATTATATGTGATTTTGCAAAAGTGGGTGTGAAATTGGGAAATCGGTTTTCCCGCACAGATGAGAGCATGTTTGAGGTGCCATGAGATGCACCTCTCCGAGACGACCTCAACGGTACCACCGATGGGTTGGTCGGGCTCCTGTGCGGCCGTCCAGGGCGGGATATGT（資料性）尖孢鐮刀菌IGS基因LAMP引物序列引物名稱序列(5’-3’)序列長度（bp）FIPBIPF3B3LBGCAACCTGGCGAGGACGAAACACTGTCGAAACGAGATGCGAATTCGAGTTTCGTCGCCGACAGCCGGAGAGAGATTTGCCTAGCGGAATGGGAAGTCGATTCTCACGACCACCAGACAAGTGTTTTCTGTGGGTGTATGGTAGGTA404220256（資料性附錄）草莓病原菌培養(yǎng)特征第一排從左至右依次為：茶炭疽菌，叢赤殼菌，惡疫霉菌，尖孢鐮刀菌第二排從左至右依次為：鏈格孢菌，輪紋鐮孢菌，土赤殼菌，鐘器腐霉菌（資料性附錄）尖孢鐮刀菌LAMP檢測的反應(yīng)體系試劑終濃度體積(μL）10×BstDNABuffer2.550mmol/LMgSO48mmol/L45mol/L甜菜堿0.8mol/L410mmol/LdNTPs1.4mmol/L3.540μmol/LFIP（內(nèi)引物1）140μmol/LBIP（內(nèi)引物2）120μmol/LF3（外引物1）0.20.2520μmol/LB3（外引物2）0.20.2540μmol/LLB（環(huán)引物）0.80.58U/μLBstDNA聚合酶0.3