小反芻獸疫病毒與羊傳染性膿皰病毒雙重Detectionmethodofpestedespetitsruminantsvirusandorfvir2023-07-20發(fā)布2023-09-20實(shí)施新疆維吾爾自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布本文件按照GB/T1.1--2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站。蘇曉慧、薛文、秦菊、努爾麥麥提阿穆提、居馬別克夏拉巴依、馬亞珍、符玉涓、艾日登才次克、李璐、張丹、沙那瓦爾塔希、任娟、美熱木古麗巴依待拉提、烏那爾汗吉斯汗、孫曉明、馮冰、陳玲、高姍姍、顏成旭、陸桂麗、茹仙古麗木明、加米拉、加伊娜古力、特列克庫(kù)拉別克。維吾爾自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心(新疆烏魯木齊市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)藍(lán)病預(yù)防控制中心(北京市大興區(qū)天貴大街17號(hào))、北京億森寶生物科技有限公司(北京市北京經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)(通州)科創(chuàng)東五街2號(hào))、新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所(新疆畜牧科學(xué)院疆烏魯木齊市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)冬融街726號(hào))、新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站(新疆烏魯木齊市米東區(qū)米東南路2188號(hào)紅光雅居小區(qū)7號(hào)公建樓)、新疆維吾爾自治市新華南路167號(hào))。疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心(新疆烏魯木齊市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)藍(lán)疫病預(yù)防控制中心(北京市大興區(qū)天貴大街17號(hào))、新疆維吾爾自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督新疆維吾爾自治區(qū)畜牧獸醫(yī)局聯(lián)系電話(huà)傳真郵編：830004新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心聯(lián)系電話(huà)傳真郵編：中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心聯(lián)系電話(huà)傳真郵編：100125北京億森寶生物科技有限公司聯(lián)系電話(huà)傳真郵編：100176新疆維吾爾自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局聯(lián)系電話(huà)傳真郵編：830004工2規(guī)范性引用文件僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本4試劑和引物檢測(cè)引物探針見(jiàn)附錄B。5儀器用具與耗材6操作步驟選擇處于發(fā)熱期(體溫40℃~41℃)、排出膿性、漿液性眼分泌物、出現(xiàn)口腔潰瘍癥狀的活畜采工2(0.01mol/LpH7.4,PBS)中。將含有滲出物的棉拭子在微量振蕩器上去拭子。12000r/min離心5min,吸取上清300山于1.5mL滅菌離心管中，編號(hào)備用。選擇剛被撲殺或者死亡時(shí)間不超過(guò)24h的病畜采集組織樣品。無(wú)菌采集腸系膜和支氣管淋巴結(jié)各3個(gè)~4個(gè)，脾、胸腺、腸粘膜和肺組織各約25g~50g,分別置于50mL離心管或密封袋中。每份組織分別從三個(gè)不同位置取樣，稱(chēng)取樣品約1g,用手術(shù)剪剪碎的樣品混勻后取0.1g裝入研磨管，于高通量研磨儀中研磨，加入1.5mL0.01mol/LpH7.4PBS繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，12000樣品采集后，放置有冰盒的采樣箱里送至實(shí)驗(yàn)室，在24h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。6.3DNA/RNA的提取6.3.1取已處理的樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，分別加入裂解液600μ,充分顛倒混勻，室溫靜置36.3.2將液體吸入吸附柱中，12000r/min離心30s。6.3.3棄去收集管中液體，加入600μ洗滌液，12000r/min離心30s。6.3.4重復(fù)上述步驟6.3.3。6.3.5棄去收集管中液體，12000r/min離心2min,以除去殘留的洗滌液。6.3.6將吸附柱移入新的1.5mL無(wú)菌離心管中，向柱中央加入洗脫液60山。6.3.7室溫靜置2min,12000r/min離心1min,離心管中液體為核酸模板。得到的核酸模板盡量在2h內(nèi)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增，若需長(zhǎng)時(shí)間保存須放置-70℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。6.3.8若使用核酸提取儀提取核酸，則按DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。6.4.1試驗(yàn)前20min從-20℃冰箱中取出試劑盒等相應(yīng)試劑，使試劑完全溶解。6.4.2每個(gè)檢測(cè)反應(yīng)體系總量為15μ:14μ山的熒光PCR反應(yīng)液，1L的酶混合物。6.4.3蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本準(zhǔn)備區(qū)，剩余試劑放回-20℃冰箱冷凍保存。6.5加樣(樣本準(zhǔn)備區(qū))6.5.1分別向上述PCR反應(yīng)管中加入已提取樣本核酸模板各5μ,陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照核酸模板各加5μL,記錄加樣順序。36.5.2蓋緊管蓋，瞬時(shí)離心36.6.1開(kāi)機(jī)預(yù)熱，檢查儀器性能。6.6.2將PCR反應(yīng)管放在樣品槽中相為：45℃10min,1個(gè)循環(huán)；95℃10min,1個(gè)循環(huán)；95℃15s,60℃45s,40個(gè)循環(huán)，在每性膿皰病毒陽(yáng)性質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)以雙蒸水代替模板作為陰性對(duì)照。分別提取樣品和對(duì)照品的6.7.2.1陰性對(duì)照：無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)且Ct值>38或無(wú)Ct值。6.7.2.2陽(yáng)性：Ct值≤30,有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，呈典型的S型曲線(xiàn)。獸疫病毒和羊傳染性膿皰病毒核酸。若在“FAM”標(biāo)記下出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線(xiàn)且Ct值≤35,則判定樣本中小反芻獸疫病毒核酸陽(yáng)性。若在“HEX”標(biāo)記下出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線(xiàn)且Ct值≤35,則判定樣本中羊傳染性若被檢樣本的PCR反應(yīng)體系通道無(wú)典型擴(kuò)增曲線(xiàn)，且Ct值>38或無(wú)Ct值，則判定樣本小反芻獸疫病4(規(guī)范性)A.1pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)氯化鈉氯化鉀二水合磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀滅菌雙蒸水A.2EDTA-Na?(0.5mol/L,pH=8.0)溶液配制滅菌雙蒸水氫氧化鈉滅菌雙蒸水氯化鈉11.70g三羥甲基氨基甲烷9.46g0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液(EDTAA.4洗滌液磷酸二氫鉀氯化鈉滅菌雙蒸水A.5洗脫液磷酸二氫鉀滅菌雙蒸水5(規(guī)范性)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)B.1引物序列根據(jù)已報(bào)道的PPRV和ORFV的基因組序列各設(shè)計(jì)1套用于特異性擴(kuò)增的引物和探針，具體引物信息與基因片段大小見(jiàn)表B.1和B.2。表B.1小反芻獸醫(yī)病毒引物序列及目的片段長(zhǎng)度引物引物序列(5′→3)預(yù)期片段大小/bp引物探針FAM-CTCGGAAATCGCCTCGCAGGC表B.2羊傳染性膿皰病毒引物序列及目的片段長(zhǎng)度引物引物序列(5′→3)預(yù)期片段大小/bp引物探針HE